EP3938831A1 - Dispositif et procede pour l'observation de microparticules et de nanoparticules - Google Patents

Dispositif et procede pour l'observation de microparticules et de nanoparticules

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Publication number
EP3938831A1
EP3938831A1 EP20714876.8A EP20714876A EP3938831A1 EP 3938831 A1 EP3938831 A1 EP 3938831A1 EP 20714876 A EP20714876 A EP 20714876A EP 3938831 A1 EP3938831 A1 EP 3938831A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
image
microscope
particles
histogram
nanoparticles
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP20714876.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Matthieu GREFFET
Luc Talini
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Myriade
Original Assignee
Myriade
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Filing date
Publication date
Application filed by Myriade filed Critical Myriade
Publication of EP3938831A1 publication Critical patent/EP3938831A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N23/00—Cameras or camera modules comprising electronic image sensors; Control thereof
    • H04N23/70—Circuitry for compensating brightness variation in the scene
    • H04N23/72—Combination of two or more compensation controls
    • G—PHYSICS
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
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    • G02B21/0056—Optical details of the image generation based on optical coherence, e.g. phase-contrast arrangements, interference arrangements
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    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
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    • G06T5/40—Image enhancement or restoration using histogram techniques
    • G—PHYSICS
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    • G06T5/00—Image enhancement or restoration
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    • G06T5/92—Dynamic range modification of images or parts thereof based on global image properties
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N2015/0038—Investigating nanoparticles
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    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image

Definitions

  • This presentation relates to the field of microscopy applied to the visualization of natural mixtures, in the sense of unfiltered, of particles, these natural mixtures comprising in an unpredictable way, particles resolved by an optical microscope or microparticles, and unresolved particles. by an optical microscope or nanoparticles.
  • the present disclosure relates to the visualization, via a microscope and a camera, of such mixtures, composed in particular of biological particles, constituting phase objects, in particular in Brownian motion in a liquid medium, in particular aqueous.
  • This presentation also concerns the visualization of mixtures containing micro-objects or nano-objects of intensity, attenuating the light which they transmit or reflect or absorb, such as for example gold microparticles and gold nanoparticles, especially in Brownian motion in a liquid medium.
  • This presentation thus relates, in general, to the visualization of mixtures of phase or intensity objects, micro-objects or nano-objects, in particular subjected to Brownian motion, but also the visualization of particles of all sizes which may be stationary. .
  • the prior art knows the resolved optical microscopy, in bright field ("brigthfield microscopy" in English) which makes it possible to form an image in intensity of an object resolved by the microscope, that is to say whose lateral dimension is greater than the lateral resolution limit of the microscope, for an illumination light source (in particular thermal source, light-emitting diode, laser, etc.) collected by the microscope.
  • an illumination light source in particular thermal source, light-emitting diode, laser, etc.
  • unresolved particles are in general invisible and therefore cannot be visualized at the same time as resolved particles.
  • the prior art also knows, for example from the document published under the number FR3027107 (BOCCARA), a method and a device for optical interference detection of nanoparticles in an unnatural fluid sample, because filtered beforehand to contain only unresolved particles. .
  • the prior art also knows operations for increasing the contrast of images and in particular images of phase objects, resolved, whether they are in Brownian motion or not.
  • these operations of increasing the contrast of an image consist of transformations of a histogram of the image.
  • histogram transformations modify images by processing each pixel independently. These transformations appear in almost all image processing and analysis processes.
  • these transformations are common for digital images taken by a camera recording the images in the form of pixels each assigned a gray level or several gray levels associated with colors: in pre-processing to normalize the image, before recording, or in post-processing to improve visualization, after recording.
  • Normalization of an image Extension of the histogram of an image, before or after its recording, so that this histogram presents gray levels extending over the entire range of gray levels of the sensor used for the recording or screen used for viewing, or the eye of an observer, to maximize contrast for a human observer.
  • Brown motion Spontaneous movement of particles in a liquid or viscous medium, caused by thermal agitation and preventing the sedimentation of particles under the effect of gravity.
  • Robotscope Device for limiting the duration of an image acquisition by a camera and allowing movement to be frozen; a strobe image is heard as an image short enough in duration to freeze a particular movement.
  • Digital contrast enhancement Set of digital methods making it possible to increase the number of details visible in an image, by a human observer or a system capable of implementing such methods, in particular by normalization of the image and making it possible to correct overexposure in a digital image.
  • the present disclosure relates to a method for obtaining an image, using a microscope, of a set of particles, conjugated from a digital camera via the microscope, the set of particles comprising nanoparticles not resolved by the microscope and microparticles resolved by the microscope, in which the particles are illuminated by a light source, in which the light source illuminates the digital camera through the microscope.
  • This process includes the following steps:
  • the method may include the following characteristics, considered alone or combined with one another (except for major technical incompatibility):
  • nanoparticles include viruses and microparticles include aggregates of viruses
  • the digital correction of the overexposure is obtained by transforming the histogram of the image
  • the transformation of the image histogram is an extension of the image histogram
  • the transformation of the histogram of the image is a translation of the histogram of the image
  • the transformation of the image histogram includes a translation of the image histogram and an extension of the image histogram
  • the extension of the histogram of the image is non-linear.
  • the present disclosure also relates to a device for the implementation of the above method, in which the light source is of sufficient light intensity to overexpose an image recorded by the digital camera via the microscope, showing variations light intensity for a nanoparticle conjugated from the digital camera through the microscope.
  • the device includes digital means for correcting the exposure of an image recorded by the camera.
  • FIG 1 represents an example of a device for the observation of particles.
  • the device of FIG. 1 comprises a microscope 1; a light source 2 illuminating the field of the microscope; a camera 3.
  • the camera is arranged in a conjugate image plane of the object focal plane of the microscope 1 and collects direct light from the illumination source 2 through the microscope to form a bright field image.
  • a strobe (not shown in this figure) or any other means to limit the acquisition time and digital image processing means for improving the contrast of the acquired image can be provided.
  • the bright field configuration is carried out so as to collect on the one hand the variations in intensity, due to the resolved phase objects located in the field of the microscope and on the other hand, to collect the light scattered by the non-phase objects. solved also located in the field of the microscope.
  • Modulation of direct light by resolved objects is used to visualize resolved objects and modulation due to scattered light interference from unresolved objects in the vicinity of the conjugate object focal plane of the camera is used to visualize unresolved objects .
  • the device shown therefore makes it possible to visualize on the same image and in the same frame of reference resolved and unresolved objects located in a section extending over the depth of field of the microscope, from the object focal plane of the microscope, or more generally from a section extending through the depth of field of the microscope from the object plane conjugated to the plane of the camera by the microscope.
  • the camera is assumed to be planar, although a camera conforming to the field curvature of the microscope can be envisioned without departing from the teaching of this paper.
  • the device comprises a microscope 1 or optical system, a light source 2 or lighting source or source and a camera 3.
  • the invention thus comprises the illumination source 2 collected by the microscope 1 and the camera 3.
  • An object to be observed is placed in the object space of the microscope 1 and is thus illuminated and imaged on the camera 3 in a bright field.
  • a collimated illumination of the source 2 is preferred to maximize the contrast of the interference signals observed for conjugated nanoparticles of the camera 3.
  • a source 2 of the highest possible light power or in any case sufficiently powerful to fill the capacity or well depth of the camera during the exposure time is preferred. This may be a source 2 with the lowest possible bandwidth to wavelength.
  • source 2 a visible light-emitting diode (for example an imperial blue LED from the Thorlabs brand marketed under the reference M405LP1) with a wavelength centered on 405nm.
  • a visible light-emitting diode for example an imperial blue LED from the Thorlabs brand marketed under the reference M405LP1
  • a white light-emitting diode or white LED for example an LED of the Thorlabs brand sold under the reference MWWHLP1
  • NPs nanoparticles
  • NA numerical aperture
  • the lighting conditions can either be defined by the propagation in free space of the source, or defined by a condenser making it possible to change the lighting conditions (Kohler lighting, critical lighting or any other type of lighting, in particular collimated) .
  • the magnification of the optical system, the size of the pixels of the camera 3 and the acquisition rate of the camera 3, in number of images per second, are chosen so that the displacement, between two images acquired or recorded, a nanoparticle is quantifiable.
  • a bright field image is, in all cases, collected via the microscope 1, on a camera 3 of great dynamic range, ie of great depth of well, by example a CMOS camera of the Photon Focus brand marketed under the reference PHF-MV-D1024E-160-CL-12.
  • CMOS camera of the Photon Focus brand marketed under the reference PHF-MV-D1024E-160-CL-12.
  • Another camera having more pixels and a lesser well depth can also be used by grouping (in English “binning”) pixels.
  • the camera 3 is preferably arranged in a conjugate image plane of the object focal plane of the microscope 1, according to an optical configuration for which the optical correction of the aberrations is optimized and the limit imposed by the diffraction is generally reached.
  • the microscope 1 forms a bright field image of a sample containing resolved particles and laterally unresolved particles, for example an unfiltered natural sample.
  • a sample containing resolved particles and laterally unresolved particles for example an unfiltered natural sample.
  • the resolution limit is in a known manner close to 200nm.
  • a test sample can be used in which both resolved and unresolved immobile particles are present.
  • a sample consisting of natural unfiltered water and containing a priori viruses and virus aggregates, forming a population of phase objects, with dimensions between 10 nm and 10 ⁇ m can in particular be visualized with the invention.
  • Any liquid sample containing biological particles can also be observed with the device and the method of the invention.
  • the invention is particularly useful in general for observing natural media containing phase objects in Brownian motion.
  • an acquisition rate of the camera of the order of approximately 130 images per second or more and on the other hand, on each image or strobe image, taken by the camera. camera, apply a contrast increase operation suitable for overexposed images (whose exposure was maximized without saturating the image) obtained with a bright field microscope. Any increase in the rate of the camera compatible with an imposed signal-to-noise ratio is therefore favorable to the visualization of increasingly small unresolved objects, in the presence of resolved objects.
  • the acquisition rate is in all cases chosen as high as possible to allow the Brownian motion of the particles to be followed as well as possible, while completely filling the wells of the camera in order to minimize shot noise, which is a major source of noise in certain embodiments.
  • the operation of increasing the contrast can be applied in real time if the image processing means allow it or a posteriori on a sequence of stroboscopic images, recorded in an image memory.
  • An advantage of the invention is that the representations of the two types of particles by interferometric imaging and intensity imaging share the same spatial reference, having been obtained strictly with the same device in bright field. Subject to mechanically stabilizing the distance between the microscope and the object plane conjugated with the camera by the microscope, there is therefore a quantitative means of imaging on particles of dimensions smaller or greater than the resolution limit of the microscope, of sectioned way.
  • An advantage of the invention is to be able to obtain the two types of imaging with the same instrument and therefore to naturally share the same spatial reference for the two types of imaging, interferometry between scattered and direct light and conventional intensity imaging, carried out automatically by the microscope according to the particle size. It is therefore possible not only to make distance measurements between two resolved particles or between two unresolved particles but also to make distance measurements between a resolved particle and an unresolved particle, reliably, thanks to the method of embodiment described above.
  • This embodiment therefore makes it possible to obtain a sectioned imaging of resolved and unresolved natural particles, in a section of thickness equal to the depth of field of the microscope.
  • the duration can be chosen to freeze the Brownian motion of the fastest moving particles, i.e. to ensure that the movement of the smallest particles to be imaged is not resolved by the microscope in the duration of acquisition of the strobe image.
  • a minimum size of the particles that it is possible to image with the device and the method of this embodiment, can also be calculated, that is to say the power of interferometric resolution. of the device of the invention.
  • the adjustment of the lighting in the image satisfies the condition of maximizing or overexposing to the maximum, the brightfield under the constraints of not saturating the interferometric image nor the intensity image, which is a classic adjustment in microscopy .
  • This adjustment can be made on the strobe image viewed on a screen by a human observer.
  • the illumination source can be a source of any type such as a heat source of the lamp type, a light-emitting diode (LED) or a laser.
  • the resulting illumination for the microscope can be spatially consistent or inconsistent, temporally consistent or inconsistent.
  • the device of this embodiment therefore makes it possible to carry out with the same microscope in a bright field, a common interferometric (in diffused and direct light) and intensity (in direct light attenuation) imaging.
  • a histogram extension or expansion also known as image normalization
  • the stroboscopic image being due to its bright field particularly saturated towards the whites and not revealing to the naked eye, in general no visible detail.
  • the distribution over the entire range of the image levels of its histogram is thus particularly effective in increasing its contrast. It should be noted that this situation corresponds in classical or resolved microscopy on phase objects to a defective microscopy experiment, in which the lighting conditions have not been optimized, and in which a wide range of gray levels them. lower camera is unnecessary.
  • non-linear normalization operations of the histogram of the stroboscopic image, depending on the type of particles observed.
  • intensities of the resolved / unresolved particles generally change from sample to sample
  • non-linear normalization may be sample-specific. Any other method making it possible to remove a background from the stroboscopic image and to improve its contrast can also be used with the invention.
  • the invention is particularly suitable for the visualization, by an observer, of populations of particles, in the case where the size of each particle of the population is between 10nm and 10 microns or even comprises both unresolved particles and particles. particles resolved by an optical microscope, operating in the visible.
  • a “histogram” refers to the distribution of light intensities or "gray levels" in a digital image.
  • the invention is capable of industrial application or usable in the field of microscopy.

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Abstract

Procédé pour obtenir une image, à l'aide d'un microscope (1), d'un ensemble de particules, conjuguées d'une caméra numérique (3) via le microscope (1), l'ensemble de particules comprenant des nanoparticules non résolues par le microscope (1) et des microparticules résolues par le microscope (1), dans lequel les particules sont éclairées par une source de lumière (2), dans lequel la source de lumière (2) éclaire la caméra numérique (3) via le microscope (1). Le procédé comprenant les étapes suivantes : - surexposer une image enregistrée par la caméra numérique (3), au moyen de la source de lumière (2) pour faire apparaître dans l'image enregistrée, pour un observateur, des variations d'intensité lumineuse pour les nanoparticules; - corriger numériquement la surexposition de l'image enregistrée, pour faire apparaître dans l'image enregistrée, pour l'observateur, des variations d'intensité lumineuse pour les microparticules simultanément aux variations d'intensité lumineuse pour les nanoparticules.

Description

DESCRIPTION
DISPOSITIF ET PROCEDE POUR L’OBSERVATION DE MICROPARTICULES ET DE NANOPARTICULES
DOMAINE DE L'INVENTION
Le présent exposé concerne le domaine de la microscopie appliquée à la visualisation de mélanges naturels, au sens de non filtrés, de particules, ces mélanges naturels comprenant de façon non prévisible, des particules résolues par un microscope optique ou microparticules, et des particules non résolues par un microscope optique ou nanoparticules.
ARRIERE PLAN
Plus précisément, le présent exposé concerne la visualisation via un microscope et une caméra, de tels mélanges, composés notamment de particules biologiques, constituant des objets de phase, notamment en mouvement brownien dans un milieu liquide, notamment aqueux.
Le présent exposé concerne aussi la visualisation de mélanges contenant des micro-objets ou des nano-objets d’intensité, atténuant la lumière qu’ils transmettent ou réfléchissent ou absorbent, comme par exemple des microparticules d’or et des nanoparticules d’or, notamment en mouvement brownien dans un milieu liquide.
Le présent exposé concerne ainsi, de façon générale, la visualisation de mélanges d’objets de phase ou d’intensité, micro-objets ou nano-objets, notamment soumis à un mouvement brownien mais aussi la visualisation des particules de toutes tailles pouvant être immobiles.
L’art antérieur connaît la microscopie optique résolue, en champ clair (« brigthfield microscopy » en anglais) qui permet de former une image en intensité d’un objet résolu par le microscope, c’est-à-dire dont la dimension latérale est supérieure à la limite de résolution latérale du microscope, pour une source lumineuse d’éclairage (notamment source thermique, diode électroluminescente, laser, ... ) collectée par le microscope. Dans ce système, les particules non résolues sont en général, invisibles et ne peuvent donc être visualisées en même temps que des particules résolues. L’art antérieur connaît aussi, par exemple du document publié sous le numéro FR3027107 (BOCCARA), une méthode et un dispositif de détection optique interférentielle de nanoparticules dans un échantillon fluide non naturel, car filtré au préalable pour ne contenir que des particules non résolues. Ce document mentionne en effet une méthode interférom étriqué de visualisation via un microscope et une caméra, de nanoparticules biologiques en mouvement brownien dans un milieu aqueux. De plus, la méthode interférométrique en champ clair, divulguée dans ce document est présentée, notamment en page 6 de ce document, comme nécessitant dans tous les cas un échantillon filtré préalablement et ne contenant plus que des particules inférieures à quelques centaines de nanomètres. Compte tenu de la résolution d’un microscope optique dans le visible utilisé dans ce document, qui est justement de quelques centaines de nanomètres, ce document enseigne donc que les échantillons observés ne doivent contenir que des particules non-résolues. Dans ce système, des particules résolues, qui sont soustraites de l’objet à observer par filtrage physique préalable, sont ainsi, par principe, absentes de toute image de l’objet observé, et ne peuvent donc être visualisées en même temps que des particules non-résolues.
Dans l’art antérieur, le problème technique de visualiser sur une même image au moyen d’un microscope et d’une caméra, un mélange de particules résolues par le microscope et de particules non résolues par le microscope ou mélange naturel, est donc un problème difficile, tout spécialement pour des particules qui sont des objets de phase en mouvement brownien dans une matrice liquide.
L’art antérieur connaît aussi des opérations d’augmentation du contraste des images et notamment d’images des objets de phase, résolus, qu’ils soient en mouvement brownien ou non. Notamment, ces opérations d’augmentation du contraste d’une image consistent en des transformations d’un histogramme de l’image. En traitement d’image, les transformations d’histogramme modifient les images en traitant chaque pixel indépendamment. Ces transformations apparaissent dans presque tous les processus de traitement et d’analyse d’images. Notamment ces transformations sont courantes pour les images numériques prises par une caméra enregistrant les images sous forme de pixels affectés chacun d’un niveau de gris ou de plusieurs niveaux de gris associés à des couleurs : en prétraitement pour normaliser l’image, avant enregistrement, ou en post-traitement pour améliorer la visualisation, après enregistrement.
Aux fins du présent document, les définitions suivantes s’appliquent :
« Normalisation d’une image » : Extension de l’histogramme d’une image, avant ou après son enregistrement, pour que cet histogramme présente des niveaux de gris s’étendant sur toute la gamme de niveaux de gris du capteur servant à l’enregistrement ou d’un écran servant à la visualisation, ou de l’œil d’un observateur, afin de maximiser le contraste pour un observateur humain.
« Mouvement brownien » : Déplacement spontané de particules en milieu liquide ou visqueux, provoqué par l’agitation thermique et faisant obstacle à la sédimentation des particules sous l’effet de la gravité.
« Stroboscope » : Dispositif pour limiter la durée d’acquisition d’une image par une caméra et permettant de figer un mouvement ; une image stroboscopique est entendue comme image d’une durée suffisamment courte pour figer un mouvement particulier.
« Amélioration numérique de contraste » : Ensemble de méthodes numériques permettant d’augmenter le nombre des détails visibles dans une image, par un observateur humain ou système apte à mettre en œuvre de telles méthodes, notamment par normalisation de l’image et permettant de corriger une surexposition dans une image numérique.
PRESENTATION DE L'INVENTION
Le présent exposé a pour objet un procédé pour obtenir une image, à l’aide d’un microscope, d’un ensemble de particules, conjuguées d’une caméra numérique via le microscope, l’ensemble de particules comprenant des nanoparticules non résolues par le microscope et des microparticules résolues par le microscope, dans lequel les particules sont éclairées par une source de lumière, dans lequel la source de lumière éclaire la caméra numérique via le microscope. Ce procédé comprend les étapes suivantes :
- surexposer une image enregistrée par la caméra numérique, au moyen de la source de lumière pour faire apparaître dans l’image enregistrée, pour un observateur, des variations d’intensité lumineuse pour les nanoparticules ;
- corriger numériquement la surexposition de l'image enregistrée, pour faire apparaître dans l’image enregistrée, pour l’observateur, des variations d’intensité lumineuse pour les microparticules simultanément aux variations d’intensité lumineuse pour les nanoparticules.
Dans des variantes, le procédé peut comprendre les caractéristiques suivantes, considérées seules ou combinées entre elles (sauf incompatibilité technique majeure):
les nanoparticules comprennent des virus et les microparticules comprennent des agrégats de virus;
la correction numérique de la surexposition est obtenue par transformation de l'histogramme de l'image;
la transformation de l'histogramme de l’image est une extension de l'histogramme de l'image;
la transformation de l'histogramme de l’image est une est une translation de l'histogramme de l'image;
la transformation de l'histogramme de l’image comprend une translation de l'histogramme de l'image et une extension de l’histogramme de l’image;
l’extension de l'histogramme de l'image est linéaire;
l’extension de l'histogramme de l'image est non-linéaire.
Le présent exposé a aussi pour objet un dispositif pour la mise en œuvre du procédé ci-dessus, dans lequel la source de lumière est d’intensité lumineuse suffisante pour surexposer une image enregistrée par la caméra numérique via le microscope, en faisant apparaître des variations d’intensité lumineuse pour une nanoparticule conjuguée de la caméra numérique via le microscope. Le dispositif comprend des moyens numériques de correction de l’exposition d’une image enregistrée par la caméra. L’enseignement du présent exposé s’applique à toute combinaison des procédés, variantes et dispositifs mentionnés.
Les caractéristiques et avantages précités, ainsi que d'autres, apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit, d'exemples de réalisation du dispositif et de la méthode proposée. Cette description détaillée fait référence aux dessins annexés.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Le dessin annexé est schématique et n’est pas nécessairement à l'échelle, il vise avant tout à illustrer les principes de l'invention.
La FIG 1 représente un exemple de dispositif pour l’observation de particules. DESCRIPTION DETAILLEE
Des exemples de réalisation de l’invention proposée sont décrits en détail ci- après, en référence au dessin annexé. Ces exemples illustrent les caractéristiques et les avantages de l'invention. Il est toutefois rappelé que l'invention ne se limite pas à ces exemples.
Le dispositif de la figure 1 comprend un microscope 1 ; une source lumineuse 2 éclairant le champ du microscope ; une caméra 3. La caméra est disposée dans un plan image conjugué du plan focal objet du microscope 1 et recueille la lumière directe de la source d’éclairage 2 via le microscope pour former une image en champ clair. Un stroboscope (non représenté sur cette figure) ou tout autre moyen pour limiter la durée d’acquisition et des moyens numériques de traitement d’images pour une amélioration du contraste de l’image acquise peut être prévu. La configuration en champ clair est réalisée de façon à collecter d’une part les variations d’intensité, dues aux objets de phase résolus situés dans le champ du microscope et d’autre part, à collecter la lumière diffusée par les objets de phase non résolus aussi situés dans le champ du microscope.
La modulation de la lumière directe par les objets résolus est utilisée pour visualiser les objets résolus et la modulation due aux interférences en lumière diffusée des objets non résolus au voisinage du plan focal objet conjugué de la caméra, est utilisée pour visualiser les objets non-résolus.
Le dispositif représenté permet donc de visualiser sur une même image et dans un même référentiel des objets résolus et non résolus situés dans une section s’étendant sur la profondeur de champ du microscope, à partir du plan focal objet du microscope, ou plus généralement d’une section s’étendant sur la profondeur de champ du microscope à partir du plan objet conjugué du plan de la caméra par le microscope. La caméra est supposée plane, bien qu’une caméra épousant la courbure de champ du microscope puisse être envisagée sans sortir de l’enseignement du présent exposé.
Dans un premier mode de réalisation, illustré par l’exemple de la figure 1 , le dispositif comprend un microscope 1 ou système optique, une source de lumière 2 ou source d’éclairage ou source et une caméra 3. Dans tous les modes de réalisation, l’invention comprend ainsi la source d’éclairage 2 collectée par le microscope 1 et la caméra 3. Un objet à observer est placé dans l’espace objet du microscope 1 et est ainsi éclairé et imagé sur la caméra 3 en champ clair. Un éclairage collimaté de la source 2 est préféré pour maximiser le contraste des signaux interférentiels observés pour des nanoparticules conjuguées de la caméra 3.
Une source 2 de puissance lumineuse la plus élevée possible ou en tous cas, suffisamment puissante pour remplir la capacité ou profondeur de puits de la caméra durant le temps d’exposition est préférée. Il peut s’agir d’une source 2 de largeur de bande en longueur d’onde la plus faible possible.
On peut ainsi prendre comme source 2 une diode électroluminescente visible (par exemple une LED bleue impérial de la marque Thorlabs commercialisée sous la référence M405LP1 ) de longueur d’onde centrée sur 405nm.
Toutefois on peut aussi utiliser d’autres sources lumineuses de spectre plus large, en vérifiant simplement qu’elles permettent de détecter des nanoparticules de tailles données, compte-tenu du rapport signal sur bruit qu’elles permettent d’atteindre. Ainsi, une diode électroluminescente blanche ou LED blanche (par exemple une LED de la marque Thorlabs commercialisée sous la référence MWWHLP1 ), a été utilisée en éclairage collimaté dans un exemple de réalisation. Bien que moins bien adaptée que la LED bleue ci-dessus, plus étroite en spectre, une telle LED blanche peut néanmoins permettre de discerner des nanoparticules (NPs) de 100 nm, donc non résolues dans le visible (au lieu de 10 nm avec la LED bleue).
Un objectif à grande ouverture numérique (NA) est préféré, de façon à collecter le maximum de lumière diffusée par des nanoparticules (NP).
On peut prendre ainsi un microscope 1 muni d’un objectif à immersion dans l’huile, par exemple un objectif x100 commercialisé sous la marque Olympus. Les conditions d’éclairage peuvent être soit définies par la propagation en espace libre de la source, soit définies par un condenseur permettant de changer les conditions d’éclairage (Eclairage de Kohler, éclairage critique ou tout autre type d’éclairage, notamment collimaté).
Dans tous les modes de réalisation, le grossissement du système optique, la taille des pixels de la caméra 3 et la cadence d’acquisition de la caméra 3, en nombre d’images par seconde, sont choisis de manière à ce que le déplacement, entre deux images acquises ou enregistrées, d'une nanoparticule soit quantifiable.
Une image en champ clair est, dans tous les cas, recueillie via le microscope 1 , sur une caméra 3 de grande dynamique, i.e. de grande profondeur de puits, par exemple une caméra CMOS de la marque Photon Focus commercialisée sous la référence PHF-MV-D1024E-160-CL-12. Une autre caméra possédant plus de pixels et une profondeur de puits moindre peut être aussi utilisée en regroupant (en anglais « binning ») des pixels.
La caméra 3 est, de préférence, disposée dans un plan image conjugué du plan focal objet du microscope 1 , selon une configuration optique pour laquelle la correction optique des aberrations est optimisée et la limite, imposée par la diffraction est généralement atteinte.
Pour régler l’éclairage par la source 2, on s’assure que le microscope 1 forme une image en champ clair d’un échantillon contenant des particules résolues et des particules non résolues latéralement, par exemple un échantillon naturel non filtré. Pour une longueur d’onde visible minimale, soit 400nm et un objectif d’ouverture numérique égale à 1 , la limite de résolution est de façon connue proche de 200nm. On peut aussi utiliser un échantillon test dans lequel des particules immobiles résolues et non résolues sont présentes.
Un échantillon constitué d’eau naturelle non filtrée et contenant a priori des virus et de agrégats de virus, formant une population d’objets de phase, de dimensions comprises entre 10nm et 10 pm peut notamment être visualisée avec l’invention. Tout échantillon liquide contenant des particules biologiques peut aussi bien être observé avec le dispositif et le procédé de l’invention. L’invention est particulièrement utile d’une façon générale pour observer des milieux naturels contenant des objets de phase en mouvement brownien.
Dans certains modes de réalisation, on peut d’une part définir une cadence d’acquisition de la caméra de l’ordre d’environ 130 images par seconde ou plus et d’autre part, sur chaque image ou image stroboscopique, prise par la caméra, appliquer une opération d’augmentation du contraste adaptée à des images surexposées (dont l’exposition a été maximisée sans saturer l’image) obtenues avec un microscope en champ clair. Toute augmentation de cadence de la caméra compatible avec un rapport signal à bruit imposé est donc favorable à la visualisation d’objets de plus en plus petits non-résolus, en présence d’objets résolus. La cadence d’acquisition est dans tous les cas, choisie la plus élevée possible pour permettre de suivre au mieux le mouvement brownien des particules, tout en remplissant complètement les puits de la caméra afin de minimiser le bruit de grenaille (en anglais « Shot noise »), source de bruit majoritaire dans certains modes de réalisation.
L’opération d’augmentation du contraste peut être appliquée en temps réel si les moyens de traitement d’image le permettent ou a postériori sur une séquence d’images stroboscopiques, enregistrées dans une mémoire d’images.
On peut ainsi faire apparaître pour un œil humain sur une image obtenue avec un seul dispositif, les systèmes d’interférences entre la lumière directe et la lumière diffusée des particules non résolues par le microscope, améliorés en contraste, et les images optiques des particules résolues par le microscope, rendues contrastées et avec des détails visibles pour un observateur humain au lieu d’être saturées.
Un avantage de l’invention est que les représentations des deux types de particules par imagerie interférométrique et imagerie d’intensité partagent une même référence spatiale, ayant été obtenues strictement avec le même dispositif en champ clair. Sous réserve de stabiliser mécaniquement la distance entre le microscope et le plan objet conjugué de la caméra par le microscope, on dispose donc d’un moyen quantitatif d’imagerie sur des particules de dimensions inférieures ou supérieures à la limite de résolution du microscope, de façon sectionnée.
Il est notamment possible d’observer des ensembles de particules résolues ou non résolues, dont l’extension est spatiale c’est-à-dire un ensemble de particules distinctes certaines résolues et d’autre non résolues, mais aussi dont l’extension est temporelle, c’est-à-dire un ensemble de différentes dimensions d’une même particule comme par exemple les différentes tailles d’une bulle dont la dimension croît depuis un diamètre non-résolu jusqu’à un diamètre résolu, de façon continue. La définition d’un ensemble de particules pour tous les modes de l’invention sera entendue au sens de la présente demande comme couvrant au moins ces deux cas d’extension.
Un avantage de l’invention est de pouvoir obtenir les deux types d’imagerie avec le même instrument et donc de partager naturellement une même référence spatiale pour les deux types d’imagerie, interférométrie entre lumière diffusée et directe et imagerie d’intensité classique, effectués automatiquement par le microscope en fonction de la taille des particules. Il est donc possible non seulement de faire des mesures de distance entre deux particules résolues ou entre deux particules non-résolues mais aussi de faire des mesures de distance entre une particule résolue et une particule non-résolue, de façon fiable, grâce au procédé du mode de réalisation précédemment décrit.
Ce mode de réalisation permet donc d’obtenir une imagerie sectionnée de particules naturelles résolues et non résolues, dans une section d’épaisseur égale à la profondeur de champ du microscope.
Il est aussi possible d’appliquer les étapes d’acquisition et d’augmentation de contraste optique de l’image, de façon simultanée dans le temps, pour obtenir une imagerie en temps réel ou bien de façon décalée dans le temps, pour obtenir une imagerie en temps différé après un traitement temporel de l’image en vue de réduire le bruit.
Pour des particules de taille supérieure à 10 nm, on peut choisir une durée d’acquisition inférieure ou égale à 1/130ième de seconde. De façon générale, la durée peut être choisie pour figer le mouvement brownien des particules les plus rapides à se déplacer, c’est-à-dire d’assurer que le déplacement des particules les plus petites à imager n’est pas résolu par le microscope dans la durée d’acquisition de l’image stroboscopique.
Pour une durée minimum d’acquisition, une taille minimum des particules qu’il est possible d’imager avec le dispositif et la méthode de ce mode de réalisation, peut être aussi calculée, c’est-à-dire le pouvoir de résolution interférométrique du dispositif de l’invention.
Le réglage de l’éclairage dans l’image satisfait la condition de maximiser ou surexposer au maximum, le fond clair sous les contraintes de ne pas saturer l’image interférométrique ni l’image d’intensité, ce qui est un réglage classique en microscopie. Ce réglage peut être effectué sur l’image stroboscopique visualisée sur un écran par un observateur humain.
Dans ce dispositif en champ clair, la source d’éclairage peut être une source de tout type comme une source thermique de type lampe, une diode électroluminescente (DEL) ou un laser. L’éclairage en résultant pour le microscope peut être spatialement cohérent ou incohérent, temporellement cohérent ou incohérent. Le dispositif de ce mode de réalisation permet donc de réaliser avec un même microscope en champ clair, une imagerie commune interférométrique (en lumière diffusée et directe) et d’intensité (en atténuation de lumière directe).
Pour améliorer le contraste de l’image stroboscopique ou d’une moyenne temporelle de celle-ci, il est possible notamment d’appliquer une extension ou expansion d’histogramme, aussi connue sous le nom de normalisation d’image, l’image stroboscopique étant du fait de son champ clair particulièrement saturée vers les blancs et ne laissant apparaître à l’œil nu, en général aucun détail visible. La répartition sur toute la gamme des niveaux de l’image de son histogramme est ainsi particulièrement efficace pour en augmenter le contraste. Il est à noter que cette situation correspond en microscopie classique ou résolue sur des objets de phase à une expérience de microscopie défectueuse, dans laquelle les conditions d’éclairage n’ont pas été optimisées, et dans laquelle une large plage des niveaux de gris les plus bas de la caméra est inutile.
Avec un système comprenant seulement un microscope opéré en champ clair, un système permettant d’acquérir des images de façon stroboscopique, notamment une caméra, et des moyens de traitement d’image pour l’amélioration du contraste d’une image, on obtient donc un dispositif capable lorsqu’on l’applique à l’observation d’un échantillon naturel de fournir une image simultanée d’objets de phase en mouvement brownien, sans filtrage physique des particules en fonction de leur taille.
Il est à noter que l’opération de normalisation améliore le contraste des interférences des particules non-résolues et des figures d’intensité des particules résolues.
De nombreuses variantes de réalisation sont possibles notamment en utilisant une translation de l’histogramme de l’image stroboscopique, avec un résultat moins contrasté de l’image stroboscopique après traitement.
On peut aussi utiliser des opérations de normalisation linéaires ou non- linéaires de l’histogramme de l’image stroboscopique, en fonction du type de particules observées. Notamment, comme les intensités des particules résolues/non résolues changent, généralement, d'un échantillon à un autre, une normalisation non linéaire peut être propre à l'échantillon. Toute autre méthode permettant de supprimer un fond de l’image stroboscopique et d’améliorer son contraste peut aussi être utilisée avec l’invention.
Dans tous les modes de l’invention, on commencera donc par provoquer une surexposition de l’image enregistrée par une caméra via un microscope au moyen d’une source utilisée à sa puissance maximum, pour ensuite corriger cette surexposition numériquement. Cette méthode permet d’obtenir dans une seule image, des variations d’intensité, visibles par un œil humain, pour les nanoparticules non résolues par le microscope, en même temps que des variations d’intensité, visibles par un œil humain, pour les microparticules résolues par le microscope. En d'autres termes, cette méthode permet d’obtenir dans une seule image, des variations d’intensité lumineuse liées à un phénomène d’interférences en lumière diffusée résultant de la présence de nanoparticules non-résolues dans le milieu observé, en même temps que des variations d’intensité lumineuse liées à la présence de microparticules résolues dans le même milieu.
L’invention est particulièrement adaptée à la visualisation, par un observateur, de populations de particules, dans le cas où la dimension de chaque particule de la population est comprise entre 10nm et 10 microns ou encore comprend à la fois des particules non résolues et des particules résolues par un microscope optique, fonctionnant dans le visible.
Aux fins de l’invention, un « histogramme » s’entend de la distribution des intensités lumineuses ou des « niveaux de gris » dans une image numérique.
L’invention est susceptible d’application industrielle ou utilisable dans le domaine de la microscopie.
Les modes ou exemples de réalisation décrits dans le présent exposé sont donnés à titre illustratif et non limitatif, une personne du métier pouvant facilement, au vu de cet exposé, modifier ces modes ou exemples de réalisation, ou en envisager d'autres, tout en restant dans la portée de l'invention.
En particulier, une personne du métier peut facilement envisager des variantes ne comprenant qu'une partie des caractéristiques des modes ou exemples de réalisation précédemment décrits, si ces caractéristiques à elles seules suffisent pour procurer un des avantages de l'invention. De plus, les différentes caractéristiques de ces modes ou exemples de réalisation peuvent être utilisées seules ou être combinées entre elles. Lorsqu'elles sont combinées, ces caractéristiques peuvent l'être comme décrit ci-dessus ou différemment, l'invention ne se limitant pas aux combinaisons spécifiques décrites dans le présent exposé. En particulier, sauf précision contraire, une caractéristique décrite en relation avec un mode ou exemple de réalisation peut être appliquée de manière analogue à un autre mode ou exemple de réalisation.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour obtenir une image, à l’aide d’un microscope (1 ), d’un ensemble de particules, conjuguées d’une caméra numérique (3) via le microscope (1 ), l’ensemble de particules comprenant des nanoparticules non résolues par le microscope (1 ) et des microparticules résolues par le microscope (1 ), dans lequel les particules sont éclairées par une source de lumière (2), et dans lequel la source de lumière (2) éclaire la caméra numérique (3) via le microscope (1 ), le procédé comprenant les étapes suivantes :
surexposer une image enregistrée par la caméra numérique (3), au moyen de la source de lumière (2), pour faire apparaître dans l’image enregistrée, pour un observateur, des variations d’intensité lumineuse pour les nanoparticules ; et, corriger numériquement la surexposition de l'image enregistrée, pour faire apparaître dans l’image enregistrée, pour l’observateur, des variations d’intensité lumineuse pour les microparticules simultanément aux variations d’intensité lumineuse pour les nanoparticules.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel les nanoparticules comprennent des virus et dans lequel les microparticules comprennent des agrégats de virus.
3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel la correction numérique de la surexposition est obtenue par transformation de l'histogramme de l'image.
4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel la transformation de l'histogramme de l’image est une extension de l'histogramme de l'image.
5. Procédé selon la revendication 3 dans lequel la transformation de l'histogramme de l’image est une translation de l'histogramme de l'image.
6. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l’extension de l'histogramme de l'image est linéaire.
7. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l’extension de l'histogramme de l'image est non-linéaire.
8. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la transformation de l'histogramme l’image comprend une extension de l’histogramme de l’image et une translation de l’histogramme de l’image.
9. Dispositif d'imagerie comprenant un microscope (1 ), une source de lumière (2) et une caméra numérique (3), le dispositif d'imagerie étant configuré pour obtenir une image, à l’aide du microscope (1 ), d’un ensemble de particules, conjuguées de la caméra numérique (3) via le microscope (1 ), l’ensemble de particules comprenant des nanoparticules non résolues par le microscope (1 ) et des microparticules résolues par le microscope (1 ),
dans lequel les particules sont éclairées par la source de lumière (2), dans lequel la source de lumière (2) éclaire la caméra numérique (3) via le microscope (1 ), et,
dans lequel la source de lumière (2) est d’intensité lumineuse suffisante pour surexposer une image enregistrée par la caméra numérique (3) via le microscope (1 ) et faire apparaître dans l'image enregistrée, pour un observateur, des variations d’intensité lumineuse pour une nanoparticule conjuguée de la caméra numérique (3) via le microscope (1 ),
le dispositif comprenant, en outre, des moyens numériques de correction de la surexposition de l'image enregistrée par la caméra (3), pour faire apparaître dans l’image enregistrée, pour l’observateur, des variations d’intensité lumineuse pour les microparticules simultanément aux variations d’intensité lumineuse pour les nanoparticules.
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