WO2019135060A1 - Système d'imagerie holographique et procédé d'analyse par imagerie holographique avec détection de défauts dans la chambre d'observation - Google Patents

Système d'imagerie holographique et procédé d'analyse par imagerie holographique avec détection de défauts dans la chambre d'observation Download PDF

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WO2019135060A1
WO2019135060A1 PCT/FR2019/050034 FR2019050034W WO2019135060A1 WO 2019135060 A1 WO2019135060 A1 WO 2019135060A1 FR 2019050034 W FR2019050034 W FR 2019050034W WO 2019135060 A1 WO2019135060 A1 WO 2019135060A1
Authority
WO
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image
alarm
imaging system
holographic imaging
distribution
Prior art date
Application number
PCT/FR2019/050034
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English (en)
Inventor
Anaïs Ali Cherif
Lyonel JUNILLON
Original Assignee
Horiba Abx Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Horiba Abx Sas filed Critical Horiba Abx Sas
Publication of WO2019135060A1 publication Critical patent/WO2019135060A1/fr

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
    • G01N15/0227—Investigating particle size or size distribution by optical means using imaging; using holography
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
    • G01N15/0227—Investigating particle size or size distribution by optical means using imaging; using holography
    • G01N2015/0233—Investigating particle size or size distribution by optical means using imaging; using holography using holography

Definitions

  • the invention relates to holographic imaging systems, preferably without a lens. Such systems are used in particular for identifying or estimating the concentration of dispersed objects (for example biological cells) in a medium (such as a blood medium).
  • a medium such as a blood medium
  • the observation of biological particles or other objects dispersed by lenticular holographic imaging consists in inserting a sample, placed in an observation chamber, between a light source and a matrix photodetector or image sensor.
  • the resulting wave observed by the photodetector results from interference between the incident wave emitted by the light source and the wave diffracted by the particles making up the sample. It is known to recognize and / or count particles in a sample from a complex image of the sample obtained by holographic reconstruction of the sample at a distance z from the detection plane of the sensor.
  • WO2016 / 151248 provides another method for identifying particles, also based on holography technology.
  • the estimation of the concentration, or more generally the observation, of scattered objects (for example red blood cells) in a liquid medium (for example blood) using known holographic imaging systems is reliable only if the sample volume containing the objects scattered over the sensor is controlled.
  • the presence of air bubbles in the sample volume appearing during the filling of the observation chamber can lead to erroneous results, as is explained below in connection with FIGS. 2 to 6.
  • complete or partial defusing of said observation chamber leads to measurement errors.
  • the medium analyzed is the product of reagents, for example a reagent whose constitution is to be established (such as the blood of a patient) and a dilution reagent
  • a lack of homogeneity of the medium introduced into the observation chamber leads to an erroneous characterization of the reagent whose constitution is to be established. It is therefore important to be able to discard any image acquired from a too heterogeneous product so that the results relating to this image are not counted.
  • Another source of error may be the presence of dust or other impurities that can be counted among the objects sought.
  • An object of the invention is to provide a simple and fast device and method, requiring limited digital processing. Another object of the invention is to provide this device and this method in the context of a holographic imaging system intended in particular to estimate the concentration of objects dispersed in a liquid medium.
  • the invention proposes a method for analyzing a medium by holographic imaging (more simply called “imaging method holographic "thereafter) for the observation of objects scattered in the medium (the term” observation “covering here including the search, identification, characterization, counting, etc., of said objects), which process is put implemented in a holographic imaging system comprising a light source, a photosensitive sensor, an observation chamber receiving the medium, and computer means comprising a holographic analysis module, the observation chamber being arranged between the light source and the photosensitive sensor, the photosensitive sensor being configured to provide an image of a medium sample present in the observation chamber illuminated by the light source
  • the method according to the invention comprises: a step of illuminating the sample with the aid of the light source, an acquisition step, using the photosensitive sensor, of an image of the sample, this image representing the intensity of an resulting light striking the photosensitive sensor, a holographic analysis of the image acquired by the holographic analysis module.
  • the method according to the invention is characterized in that it comprises, after each acquisition step, a defect detection phase, for the detection of a possible defect present in the observation chamber such as a foreign body (air bubble or dust for example) or a possible lack of homogeneity of the medium, which defect detection phase uses the gray levels of the acquired image and comprises: a step of partition of the image acquired in a predetermined number N of thumbnails, the term "vignette” here simply designating a portion (partition) of the acquired image, the evaluation for each vignette and for the entire image, of a statistical parameter characterizing the distribution of the levels gray in the thumbnail and in the entire image, respectively, calculating a factor, called alarm factor, from the statistical parameter of the entire image and the statistical parameters of the N vignettes previously evaluated,
  • the alarm threshold the comparison of the alarm factor obtained with a predetermined value, called the alarm threshold
  • the acquired image is considered valid and is analyzed or defective and is not analyzed.
  • the defect detection phase focuses on analyzing the dispersion or the shape of the grayscale distribution in each vignette and in the entire image, and not locating the locations where the gray levels vary greatly.
  • the inventors have indeed established that all the images of the same medium acquired in the absence of defects in the observation chamber have similar gray level distributions, which approach a reference curve which can, for example and depending on the medium analyzed, be substantially Gaussian and / or symmetrical, and that a distribution that moves away from this reference curve is characteristic of the presence of a defect.
  • a reference curve which can, for example and depending on the medium analyzed, be substantially Gaussian and / or symmetrical, and that a distribution that moves away from this reference curve is characteristic of the presence of a defect.
  • the method and the system according to the invention exploit this property discovered by the inventors, without it being necessary to determine the reference curve.
  • the sensor may alternatively be polychromatic.
  • the defect detection phase using the "gray levels" of the acquired image can be performed for each RGB channel or for one of them only, the expression “gray level” then designating the color level (red, green or blue) in the considered channel.
  • the realization of a detection phase in a single channel is sufficient to achieve the objectives of the invention because the presence of a defect in the observation chamber impacts the color levels in the three channels.
  • the gray levels can be distributed, for example, along a substantially Gaussian curve around an average value.
  • the presence of a bubble because of the meniscuses created that reflect the light, causes an increase in gray levels of low intensity and therefore a deformation (for example a dissymmetry) of the distribution of gray levels, or even a displacement of this distribution and therefore its average.
  • the invention is thus based on a global and basic analysis of the gray levels of the image, and not on an image analysis aimed at precisely locating the contours of the bubbles or other defects. Unlike the analyzes proposed by the previous detection methods, the analysis according to the invention can be carried out with basic and limited computer resources, in a very short time.
  • the entire image consists of a very large number of pixels, for example 10 Mpixel, it is however difficult to detect this increase in low gray levels (or any other deformation of the distribution of gray levels with respect to a curve). reference) directly on this image from the grayscale distribution of the entire image. Indeed, on the histogram of the entire image, these pixels are negligible.
  • the subdivision of the image into vignettes overcomes this disadvantage by increasing the contribution of these dark areas on the distribution of gray levels.
  • the invention extends to a holographic imaging system for the holographic analysis of a medium for the purpose of observing scattered objects in the medium, the system comprising:
  • observation chamber receiving a sample of the medium, which observation chamber is arranged between the light source and a photosensitive sensor, the photosensitive sensor and an associated processor, configured to acquire an image of the sample present in the observation chamber illuminated by the light source,
  • computer means comprising a holographic analysis module for the holographic analysis of the images acquired by the photosensitive sensor.
  • the imaging system is characterized by further comprising a fault detection module, which uses the gray levels of the acquired image, and that the fault detection module is configured to:
  • the alarm factor a factor, called the alarm factor, from the statistical parameter of the entire image and the statistical parameters of the N vignettes previously evaluated, comparing the alarm factor obtained with a predetermined value, called the alarm threshold,
  • an alarm (sound and / or visual for example) is emitted.
  • the statistical parameter evaluated for each vignette and for the entire image is chosen from: a position parameter of the distribution of gray levels such that the arithmetic mean or a fractile (quartile, decile, percentile, etc.), a scatter parameter of the grayscale distribution such as the standard deviation (2nd order central moment root), a shape parameter of the gray level distribution such as the coefficient of variation (or relative standard deviation), the asymmetry coefficient (moment reduced center of order 3, "skewness" in English) or kurtosis (or flattening coefficient, corresponding to the reduced central moment of order 4) of the distribution of gray levels, one or more parameters of a function of fit adjusted to grayscale distribution
  • the alarm factor is defined by the following formula:
  • PS V igniter denotes the statistical parameter of each vignette
  • PS image denotes the statistical parameter of the whole image
  • F has ⁇ weapon denotes the alarm factor
  • An acquisition is then considered to be defective if the calculated alarm factor is greater than the predetermined alarm threshold.
  • the invention is not limited to the alarm factor above, which corresponds to the relative difference of the statistical parameter of a sticker having a defect and the statistical parameter of the entire image.
  • This alarm factor is even unsuitable for certain statistical parameters, for example if the statistical parameter of the whole image tends to tend towards zero, as is the case with the asymmetry coefficient.
  • the alarm factor can thus be chosen from, for example:
  • Falarme.3 YR ⁇ x (a.bs (P ⁇ PSvignette image f) F is the weapon max (abs (PS sticker / PS image))
  • the alarm threshold Saiarme and the number N of vignettes used by the defect detection module are predetermined according to the sensitivity and / or the desired specificity (s). ) for the fault detection module, and based on a minimum size of defects to be detected by the fault detection module which takes into account not only the minimum size of the scattered objects sought by the imaging system but also of one or more noise contributions such as an imperfection of illumination homogeneity, an imperfection of dimensional homogeneity of the observation chamber (for example a slight variation of the thickness or height of the observation chamber), a Imperfection of homogeneity of the sensor.
  • noise contribution means an imperfection small enough not to have an impact (or only a negligible impact) on the counting or the observation of the objects ultimately sought by the system and the holographic imaging process.
  • the qualification of an imperfection as a source of noise therefore depends on the destination of the imaging system, that is to say in particular the size of the objects that the imaging system is intended to search, identify and / or count in fine.
  • the alarm threshold and the number of thumbnails must be set according to the desired sensitivity for the fault detection module as it is common in some applications to have small air bubbles in the observation chamber that do not impact the counting results of the objects searched by the imaging system.
  • the sensitivity of a classifier measures its ability to give a positive result when a desired object is present. It is opposed to specificity, which measures the ability of the classifier to give a negative result when the hypothesis (here the presence of a desired object) is not verified.
  • the sensitivity of the defect detection module or the imaging system is its ability to detect all the desired objects (white and red cells for example for the imaging system, defects such as air bubbles or impurities for the imaging system). fault detection module), while the specificity is its ability to detect only the objects sought.
  • the sensitivity of the defect detection module or the imaging system is its ability to have the least false negatives, while the specificity is its ability to have the least false positives.
  • a preliminary calibration phase is advantageously carried out to predetermine an alarm threshold torque (S alarm, N) and the number of tags to be used for the fault detection module.
  • This calibration phase includes:
  • an image bank these images being acquired by performing a degraded injection of a medium (10) into the observation chamber (14) in order to create bubbles, the images then being analyzed by using any known image analysis method so as to characterize the defect (s) possibly present on each of them, the classification of each of the images of the image bank as a valid image or defective according to the result of the preceding characterization; this ranking is referred to as a reference ranking.
  • this image is classified in the defective images, for which an alarm must be issued. If no the defect is not identified, or if the only defects identified are insignificant (that is, they are smaller than the aforementioned threshold diameter), the image is classified as a valid image;
  • the classification by the defect detection module of each of the images of the image bank as a valid or defective image this classification being by definition carried out according to the invention it is that is, by comparing the alarm factor with the alarm threshold, for each pair (alarm, N), the calculation of the sensitivity and the specificity of the fault detection module, by comparing the classification of the images as performed by the defect detection module in the reference classification,
  • ROC curves sensitivity / specificity curve
  • Each ROC curve preferably corresponds to a fixed value of the number N of vignettes and to variable values of the alarm threshold (this could be the opposite, ie a fixed value of the alarm threshold and variable values of the number N, but that would require more calculations and would therefore be less practical).
  • Each point of the curve is therefore given by the sensitivity and specificity obtained for the defect detection module with this fixed value of the number of thumbnails and a value of the alarm threshold.
  • the inventors have established, using a series of preliminary calibration analyzes as previously described, that for a imaging system with a sensor providing images of 3840x2748 pixels 2 used for the identification and / or counting of disperse objects of size between 2 ⁇ m (such as platelets) and 15 ⁇ m (such as white blood cells) , more generally between 1 pm and 20 pm, or even between 1 pm and 1000 pm, and provided with a fault detection module using the alarm factor Faiarme. i defined above (relative difference), the best results are obtained for a number N of thumbnails equal to 64 and an alarm threshold S alarm equal to 7.5%.
  • the preliminary calibration phase is performed during the design of the imaging system; it is not, strictly speaking, part of the holographic imaging analysis method according to the invention in that it is not repeated before each holographic analysis, the use of the imaging system. If we consider that this calibration phase is a step in the holographic analysis method according to the invention, it should be borne in mind that the same calibration phase is common to all the holographic analyzes then carried out with the same imaging system.
  • the invention extends to a computer program comprising a series of instructions for the execution of the defect detection phase of a method according to the invention when it is read by a processor of a computer system. imaging.
  • the invention also extends to a method, a holographic imaging system and a computer program characterized in combination by all or some of the features mentioned above and hereinafter.
  • all possible combinations from the characteristics described in the present application are in accordance with the invention since there is no incompatibility between the combined characteristics.
  • FIG. 1 is a schematic view of an imaging system according to the invention, in section along a plane containing the Z axis.
  • Figures 2 to 4 are acquired images of samples having a defect.
  • FIGS. 5A to 5C illustrate a sample containing a small bubble leading to counting errors (underestimation) of the scattered objects and to a poor evaluation of the sample volume analyzed:
  • FIG. 5A is an acquired image of the 5B is a holographic reconstruction
  • Figure 5C is a bit mask resulting from the segmentation of Figure 5B.
  • FIGS. 6A to 6C illustrate a sample containing a large compartmentalized bubble leading to counting errors (overestimation) of the scattered objects and to a poor evaluation of the sample volume analyzed:
  • FIG. 6B is an acquired image of the sample Figure 6B is a holographic reconstruction
  • Figure 6C is a bit mask resulting from the segmentation of Figure 6B.
  • FIG. 7A is an image acquired by an imaging system according to the invention of a sample without a bubble;
  • Fig. 7B is a curve showing the distribution of gray levels of the acquired image 7A.
  • Figure 8A is an image acquired by an imaging system according to the invention of a bubble sample;
  • Fig. 8B is a curve showing the distribution of gray levels of the entire acquired image 8A.
  • Figure 9A corresponds to the acquired image 8A subdivided into thumbnails;
  • Fig. 9B is a curve showing the distribution of gray levels of the dotted framed vignette of Fig. 9A.
  • FIG. 10 represents the ROC curves of detection modules according to the invention using as a statistical parameter the coefficient of variation and as alarm factor the factor 1 (relative difference F alarm l ) defined above, and configured not to count the bubbles of diameter less than 50 pm and to make a partition of the acquired image respectively in 4, 16, 36, 64 and 100 thumbnails.
  • FIG. 11 represents the ROC curves of detection modules according to the invention, using as a statistical parameter the coefficient of variation and as an alarm factor the factor 1 (relative difference F alarm l ) defined above, and configured to count the bubbles. diameter less than 50 pm and to partition the acquired image respectively into 4, 16, 36, 64 and 100 thumbnails.
  • FIG. 12 represents the ROC curves of detection modules according to the invention, configured to partition the image into 64 images and to use respectively the alarm factors 1 to 4 (F alarm I to F alarm A ) defined supra with the same statistical parameter, namely the coefficient of variation.
  • FIG. 13 represents the ROC curves of detection modules according to the invention, configured to partition the image into 64 images and to use the alarm factor 1 (F alarm I ) defined above with, respectively, the average , standard deviation, coefficient of variation, asymmetry and flattening as a statistical parameter.
  • F alarm I the alarm factor 1
  • FIG. 14 represents the ROC curves of detection modules according to the invention, configured to partition the image into 64 images and to use the alarm factor 2 (F alarm 2 ) defined above with, respectively, the average , standard deviation, coefficient of variation, asymmetry and flattening as a statistical parameter.
  • F alarm 2 the alarm factor 2
  • FIG. 15 shows the ROC curves of detection modules according to the invention, configured to partition the image into 64 images and to use the alarm factor 3 (F alarm 3 ) defined above with, respectively, the average , standard deviation, coefficient of variation, asymmetry and flattening as a statistical parameter.
  • F alarm 3 the alarm factor 3
  • FIG. 16 represents the ROC curves of detection modules according to the invention, configured to partition the image into 64 images and to use the alarm factor 4 (F aiarmeA ) defined above with, respectively, the average, standard deviation, coefficient of variation, asymmetry and flattening as a statistical parameter.
  • the defect detection means according to the invention are particularly suitable for a holographic imaging system for evaluating the concentration of particles having a size of between 1 and 1000 ⁇ m in a liquid medium, such as the holographic imaging system which is subject to International Patent Application WO2016 / 151248, which is incorporated by reference in the present application.
  • Such an imaging system is illustrated in Figure 1 appended hereto. It comprises computer means including a microprocessor 20, a memory 23, a screen 26 and a holographic analysis module comprising a series of instructions 25 executable by the microprocessor 20 for performing a holographic analysis of the images acquired by a photosensitive sensor 16.
  • This imaging system also comprises a light source 11 capable of producing an incident light wave 12 along an axis of propagation Z, in the direction of an observation chamber 14.
  • the observation chamber 14 contains a sample of a medium 10, for example a biological fluid, comprising particles or cells 1, 2, 3, 4, 5, ..., 9, which it is desired to identify among predetermined types of particles.
  • a medium for example a biological fluid, comprising particles or cells 1, 2, 3, 4, 5, ..., 9, which it is desired to identify among predetermined types of particles.
  • a particle may be a red blood cell, a white blood cell or a wafer.
  • a particle may also be an organic or inorganic microbead, for example a metal microbead, a polymer or glass microbead, this type of microbead being commonly used in the production of biological protocols.
  • a particle may also be a droplet, for example a lipid droplet, bathed in the medium 10. It may also be a microorganism, for example a bacterium or a yeast.
  • the term “particle” refers to both endogenous cells, initially present in the examined sample, and exogenous particles, added to this sample prior to analysis.
  • the medium is most frequently a liquid medium, and especially a body fluid, but it can also act as an agar.
  • the method for detecting defects in the observation chamber, which is the subject of the invention, is advantageously implemented in the context of a holographic imaging process making it possible to identify each particle observed.
  • the distance D between the light source 11 and the observation chamber 14 is preferably greater than 1 cm. It is preferably between 2 and 30 cm.
  • the light source 11, seen by the sample is considered as point. This means that its diameter (or diagonal) is preferably less than one-tenth, better one-hundredth of the distance between the sample and the light source. Thus, the light arrives at the sample in the form of plane waves 12 or which can be considered as such.
  • the light source 11 may be punctual, or be associated with a diaphragm or spatial filter, not shown in Figure 1, so as to appear as punctual.
  • the opening of the diaphragm is typically between 5 ⁇ m and 1 mm, preferably between 50 ⁇ m and 500 ⁇ m.
  • the diaphragm may be replaced by an optical fiber having a first end facing a light source and a second end facing the sample. In this case, the second end can be likened to a point light source 11.
  • the light source may also be a laser diode, for example a laser diode emitting at a wavelength of 405 nm in the case of an imaging system for detecting and counting biological cells of the globule or platelet type in a blood environment.
  • the light source is of small spectral width, for example less than 100 nm, preferably less than 20 nm, or even 5 nm.
  • spectral width refers to the width at half height of the emission peak (curve as a function of the wavelength) of the light source.
  • the observation chamber 14 is delimited by an enclosure, comprising a bottom 15 and a cover 13. The side walls of the enclosure are not shown.
  • the chamber is a microfluidic glass chamber 100 ⁇ m thick (distance between the bottom 15 and the lid). 13). It could be, as a variant of Countess TM reference chamber C10228.
  • the thickness of the observation chamber, along the axis of propagation Z is less than a few cm, for example less than 1 cm, or even less than 1 mm, for example between 50 ⁇ m and 500 pm.
  • the observation chamber 14 is here arranged at a distance of 15 cm from the light source 1 1, between the latter and a photodetector matrix or photosensitive sensor 16.
  • the latter preferably extends substantially parallel to the bottom 15 of the chamber observation.
  • the light source 11, the observation chamber 14 and the photosensitive sensor 16 are arranged in line, aligned along the Z axis of propagation of the incident wave 12 emitted by the light source 11 (it there are therefore no return members, such as mirrors, in the path of this incident wave 12 or of the resulting wave 22 resulting from the sample to be analyzed).
  • the photosensitive sensor 16 has a detection plane P which, preferably, is orthogonal to the propagation axis Z of the incident light wave 12.
  • the photosensitive sensor 16 may be a matrix photodetector, of the CCD type or a CMOS, whose the detection plane P is formed by a pixel matrix covered with a protection window.
  • CMOS are the preferred sensors because the size of the pixels is smaller, which makes it possible to acquire images whose spatial resolution is more favorable. Sensors whose inter-pixel pitch is less than 3 ⁇ m are preferred, in order to improve the spatial resolution of the image.
  • an IDS TM Ul-1492LE-M sensor which is a 3840x2748 12-bit monochrome CMOS sensor with an inter-pixel pitch of 1.67 ⁇ m, manufactured by Aptina TM (reference MT9J003STM), can be used.
  • the distance d between the particles 1, 2, ... 9 and the pixel matrix of the photosensitive sensor 16 depends on the thickness of the observation chamber 14 and the distance between the bottom of the latter and the plane of observation. detection of the photosensitive sensor 16.
  • the observation chamber and the sensor are sized and arranged so that the distance d between a particle and the pixels of the sensor is between 50 ⁇ m and 1 cm, preferably between 100 ⁇ m and 2 mm.
  • the illustrated system is called a system without lens ("lensfree" in English). This does not prevent the possible presence of microlenses focusing at each pixel of the sensor 16.
  • a biological fluid it is usual to observe a biological fluid, to prepare it by adding one or more reagents.
  • a blood sample can be diluted with a dilution reagent to count red blood cells.
  • the tests described in this patent application were performed on blood samples thus diluted.
  • FIG. 2 shows a defused chamber, with important zones 40 devoid of medium and therefore objects to be accounted for.
  • FIG. 3 shows a sample of medium comprising a bubble 41 of large size.
  • Figure 4 shows a sample with a small bubble 42.
  • FIGS. 5A to 5C and 6A to 6C makes it possible to understand this: the presence of a small or medium sized bubble (FIGS. 5A to 5C) will result in a zone 30 without cells (see FIG. leading to a poor estimate of the imaged sample volume with an underestimation of the number of objects counted; in some cases, this may lead, on the contrary (Fig.
  • the imaging system comprises a fault detection module comprising a series of instructions 24 stored in the memory 23 and executable by the microprocessor 20 to perform a defect detection phase after acquisition.
  • a fault detection module comprising a series of instructions 24 stored in the memory 23 and executable by the microprocessor 20 to perform a defect detection phase after acquisition.
  • an image by the photosensitive sensor 16 and before holographic analysis of this image (the analysis here comprising the holographic reconstruction of the image and, for example, the counting of the particles 1, 2, 3, ... 9).
  • FIGS. 7A, 8A and 9A show images acquired by the photosensitive sensor 16, on which the defect detection phase can be applied.
  • FIG. 7A corresponds to a valid acquisition 100, that is to say without bubbles, without defusing the observation chamber and with an acceptable white level (characteristic of a homogeneous medium).
  • FIG. 7B represents the distribution curve of the gray levels of this acquired image 100. It can be seen that the gray levels measured range from 29 to 255 with an average of 98.87, in a substantially Gaussian and symmetrical distribution whose coefficient of variation is 12.70%.
  • FIG. 8A corresponds to an acquisition 101 of the same medium as the previous acquisition 100 but with bubbles.
  • Figure 8B shows the gray level distribution curve of this acquired whole image.
  • the gray levels measured range from 21 to 255 with a mean of 97.15, according to a distribution which, at first sight, seems substantially Gaussian and whose coefficient of variation is 13.50%.
  • FIG. 9A shows the image acquired with bubbles 101 of FIG. 8A, segmented into 64 vignettes 32 of the same size.
  • Figure 9B shows the curve grayscale distribution of the vignette 33 corresponding to a bubble area.
  • the gray levels measured on this single vignette 33 range from 21 to 255 with an average of 87.11, according to a distribution which has nothing left of a Gaussian and whose coefficient of variation is 35.09%.
  • the work of the inventors thus revealed that the coefficient of variation of the vignette in which the bubble is located is very different from the coefficient of variation of the valid whole image: 35.09% against 12.70%, an increase of a factor 2.7.
  • the invention proposes to use an alarm factor constructed from the coefficients of variation of the whole image and the coefficients of variation of the vignettes according to the following formula, which proves to be both representative of the presence of defects and practical use:
  • This alarm factor takes into account the coefficient of variation of each vignette to finally retain, through the use of the maximum, only the data relating to the sticker containing a defect (or most likely to contain one). The use of this factor thus makes it possible to detect the impact of the presence of a defect on the distribution of the gray levels of the image without knowing which are the vignettes containing bubbles, that is to say without having to analyze the image to locate the flaw or faults.
  • the alarm factor above is calculated and compared to a predetermined alarm threshold.
  • the image is automatically rejected (classified as defective) and this image is not analyzed so that the particle count results it would have provided are not took into consideration.
  • an alarm is also issued.
  • the performance of the imaging system is therefore directly related to that of its defect detection module.
  • the fault detection module should therefore be set up so that it is as efficient as possible, taking into account the destination of the imaging system, ie the type and size of the objects that the imaging system is intended to search.
  • the inventors conducted a series of preliminary calibration analyzes from a blood sample with the illustrated imaging system, degrading the injection into the chamber. observation to voluntarily create bubbles. Of the forty-one acquisitions made, a visual and optical analysis of the acquisitions made it possible to identify twenty-one acquisitions presenting bubbles or a defusing of the observation chamber. Of the twenty acquisitions deemed acceptable, four had a small bubble, the size of which was considered low because it was less than 30 pixels in diameter after reconstruction, ie 50 ⁇ m. These microbubbles are common with the reagents used which contain surfactant molecules, and bubbles smaller than this size can be neglected because they have little or no influence on the results obtained. In addition, their detection by the defect detection module is tricky because they can be confused with noise (a slight inhomogeneity of lighting, for example, can indeed impact the distribution of gray levels to a degree comparable to a very small bubble).
  • An alarm threshold set at 7.5% on the alarm factor therefore makes it possible to obtain a sensitivity and a specificity respectively of 1 and 0.95 for the defect detection module using 64 vignettes.
  • a second series of calculations was carried out, similar to the previous one but in which bubbles smaller than 50 pm were taken into account. Again, it was the alarm threshold of 7.5% that gave the best results.
  • FIG. 10 shows the ROC curves of defect detection modules which do not take into account bubbles smaller than 50 ⁇ m and use a number of vignettes respectively equal to 4, 16, 36, 64 and 100.
  • FIG. ROC curves of fault detection modules configured to count bubbles smaller than 50 pm, for a number of thumbs respectively equal to 4, 16, 36, 64 and 100.
  • an ROC curve (ROC is the acronym for "Receiver Operating Characteristic” that could be translated by operating characteristic of the receiver) represents on the ordinate axis the sensitivity of a classifier. function, on the abscissa axis, of the anti-specificity (that is, 1 minus the specificity) of the classifier.
  • An ROC curve is also sometimes called "performance characteristic” or "sensitivity / specificity curve”. The Classifier performance is given by the area under the ROC curve. The larger this area, the more the curve deviates from the random classifier line and approaches the elbow of the ideal classifier (which goes from (0, 0) to (0, 1) and then (1, 1)).
  • the fault detection module with detection of bubbles less than 50 ⁇ m is less efficient (curve 64 thumbnails of FIG. 11) than the module for detecting defects without detecting bubbles smaller than 50 ⁇ m. 50 pm (ROC curve 64 thumbnails of Figure 10), probably due to system imperfections that compete with the defects that are to be detected.
  • FIG. 12 compares the efficiency of various alarm factors calculated from the same statistical parameter, in this case the coefficient variation of the distribution of gray levels.
  • This figure shows the ROC curves of fault detection modules configured to subdivide the image into 64 thumbnails, using the coefficient of variation as a statistical parameter with, respectively, the alarm factors 1 to 4 defined above. The best performances are obtained with the relative difference (Faiarme. I) and the ratio (Faiarme.4) which give here superimposed curves.
  • the threshold values that make it possible to have a sensitivity of 1 and a specificity of 0.95 are in the first case 6% and in the second case 107%.
  • FIG. 13 represents the ROC curves of the defect detection modules obtained with a subdivision of the image into 64 vignettes, with the alarm factor 1 defined above and with, respectively, various statistical parameters, namely the average, standard deviation, coefficient of variation, asymmetry ("skewness") and flattening (kurtosis).
  • skewness asymmetry
  • kurtosis flattening
  • FIG. 14 represents the ROC curves of the fault detection modules obtained with a subdivision of the image into 64 vignettes, with the alarm factor 2 defined above and with various statistical parameters respectively, namely the average, the difference -type, the coefficient of variation, the asymmetry and flattening.
  • the coefficient of variation gives the best performance.
  • the sensitivity obtained is equal to 0.95 and the specificity to 0.74 for an alarm threshold set at 12%.
  • the alarm factor 2 therefore seems less effective than the other modes of comparison of the statistical parameters tested here.
  • Figure 15 shows the ROC curves of fault detection modules configured to subdivide the image into 64 thumbnails, use the alarm factor 3 defined above and use, respectively, the following statistical parameters: mean, standard deviation, coefficient of variation, asymmetry and flattening. This figure shows that for alarm factor 3, asymmetry gives the best performance: sensitivity obtained equal to
  • Figure 16 shows the ROC curves of fault detection modules configured to subdivide the image into 64 thumbnails, use the alarm factor 4 defined above and use respectively the following statistical parameters: mean, standard deviation, coefficient of variation , asymmetry and flattening. This figure shows that for the alarm factor 4, it is still the coefficient of variation that gives the best performance: sensitivity obtained equal to 1 and specificity equal to 0.95 for an alarm threshold of 107%.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'analyse d'un milieu par imagerie holographique et un système d'imagerie correspondant, dans lesquels une image (101) d'un échantillon de milieu présent dans une chambre d'observation illuminée par une source lumineuse est acquise par un capteur photosensible, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend de plus, après chaque acquisition, une phase de détection de défauts utilisant les niveaux de gris de l'image acquise, cette phase de détection de défauts comprenant : une partition de l'image acquise (101) en un nombre prédéterminé N de vignettes (32, 33); l'évaluation pour chaque vignette et pour l'image entière d'un paramètre statistique caractérisant la distribution des niveaux de gris dans la vignette et dans l'image entière, respectivement; le calcul d'un facteur d'alarme à partir des paramètres statistiques précédemment évalués; la comparaison du facteur d'alarme obtenu à un seuil d'alarme prédéterminé et le classement de l'image acquise en image défectueuse ou valide selon le résultat de la comparaison précédente.

Description

Système d'imagerie holographique et procédé d'analyse par imagerie holographique avec détection de défauts dans la chambre d'observation
L'invention concerne les systèmes d'imagerie holographique, de préférence sans lentille. De tels systèmes sont notamment utilisés pour l'identification ou l'estimation de la concentration d'objets dispersés (par exemple des cellules biologiques) dans un milieu (tel qu'un milieu sanguin).
L'observation de particules biologiques ou autres objets dispersés par imagerie holographique sans lentille consiste à intercaler un échantillon, placé dans une chambre d'observation, entre une source lumineuse et un photodétecteur matriciel ou capteur d'images. L'onde résultante observée par le photodétecteur résulte d'interférences entre l'onde incidente émise par la source lumineuse et l'onde diffractée par les particules composant l'échantillon. Il est connu de reconnaître et/ou comptabiliser des particules dans un échantillon à partir d'une image complexe de l'échantillon obtenue par reconstruction holographique de l'échantillon à une distance z du plan de détection du capteur. WO2016/151248 fournit une autre méthode pour identifier des particules, également fondée sur la technologie de l'holographie.
Toutefois, l'estimation de la concentration, ou plus généralement l'observation, d'objets dispersés (par exemple des globules rouges) dans un milieu liquide (par exemple du sang) à l'aide des systèmes d'imagerie holographique connus n'est fiable que si le volume d'échantillon contenant les objets dispersés au-dessus du capteur est maîtrisé. Ainsi, la présence de bulles d'air dans le volume d'échantillon apparaissant lors du remplissage de la chambre d'observation peut conduire à rendre des résultats erronés, comme cela est expliqué plus loin en relation avec les figures 2 à 6. De façon analogue, un désamorçage complet ou partiel de ladite chambre d'observation conduit à des erreurs de mesure.
De même, lorsque le milieu analysé est le produit de réactifs, par exemple un réactif dont on veut établir la constitution (tel que le sang d'un patient) et un réactif de dilution, un défaut d'homogénéité du milieu introduit dans la chambre d'observation conduit à une caractérisation erronée du réactif dont on veut établir la constitution. Il est donc important de pouvoir écarter toute image acquise à partir d'un produit trop hétérogène afin que les résultats relatifs à cette image ne soient pas comptabilisés.
Une autre source d'erreur peut-être la présence de poussières ou autres impuretés qui peuvent être comptabilisées parmi les objets recherchés.
Il est connu de caractériser des environnements bi-phasiques (gaz/liquide ; liquide/liquide ; solide/liquide), par exemple pour détecter et caractériser des bulles d'air dans un milieu liquide grâce à leur contour, avec des algorithmes d'analyse d'images qui effectuent soit une segmentation à partir des niveaux de gris, comme dans US5566249, soit une recherche des interfaces en examinant les gradients de niveaux de gris.
Ces techniques sont toutes basées sur la détection du contraste optique entre les deux phases afin d'obtenir une caractérisation de la morphologie des bulles, voire aussi de leur vitesse et de leur trajectoire. Cela conduit à des analyses qui peuvent être complexes et nécessitent des ressources importantes en termes de temps et de moyens de calcul.
Il est donc souhaitable de mettre en place une méthode simple permettant de détecter tout défaut susceptible de fausser les mesures, qu'il s'agisse de bulles d'air, de poussières ou autres impuretés, d'un remplissage de la chambre d'observation avec un mélange non homogène, d'un désamorçage partiel ou complet de ladite chambre, etc. L'invention s'étend au dispositif pour la mise en œuvre de cette méthode.
Un objectif de l'invention est de fournir un dispositif et une méthode simples et rapides, nécessitant un traitement numérique limité. Un autre objectif de l'invention est de fournir ce dispositif et cette méthode dans le cadre d'un système d'imagerie holographique visant notamment à estimer la concentration d'objets dispersés dans un milieu liquide.
Pour ce faire, l'invention propose un procédé d'analyse d'un milieu par imagerie holographique (plus simplement appelé "procédé d'imagerie holographique" par la suite) pour l'observation d'objets dispersés dans le milieu (le terme "observation" couvrant ici notamment la recherche, l'identification, la caractérisation, le comptage, etc., desdits objets) , lequel procédé est mis en œuvre dans un système d'imagerie holographique comprenant une source lumineuse, un capteur photosensible, une chambre d'observation recevant le milieu, et des moyens informatiques comprenant un module d'analyse holographique, la chambre d'observation étant agencée entre la source lumineuse et le capteur photosensible, le capteur photosensible étant configuré pour fournir une image d'un échantillon de milieu présent dans la chambre d'observation éclairé par la source lumineuse. Le procédé selon l'invention comprend : une étape d'illumination de l'échantillon à l'aide de la source lumineuse, une étape d'acquisition, à l'aide du capteur photosensible, d'une image de l'échantillon, cette image représentant l'intensité d'une onde lumineuse résultante qui frappe le capteur photosensible, une analyse holographique de l'image acquise par le module d'analyse holographique.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend, après chaque étape d'acquisition, une phase de détection de défauts, pour la détection d'un éventuel défaut présent dans la chambre d'observation tel qu'un corps étranger (bulle d'air ou poussière par exemple) ou d'un éventuel défaut d'homogénéité du milieu, laquelle phase de détection de défauts utilise les niveaux de gris de l'image acquise et comprend : une étape de partition de l'image acquise en un nombre prédéterminé N de vignettes, le terme "vignette" désignant ici simplement une portion (partition) de l'image acquise, l'évaluation pour chaque vignette et pour l'image entière, d'un paramètre statistique caractérisant la distribution des niveaux de gris dans la vignette et dans l'image entière, respectivement, le calcul d'un facteur, dit facteur d'alarme, à partir du paramètre statistique de l'image entière et des paramètres statistiques des N vignettes précédemment évalués,
la comparaison du facteur d'alarme obtenu à une valeur prédéterminée, dite seuil d'alarme,
en fonction du résultat de la comparaison précédente, l'image acquise est considérée comme valide et est analysée, ou comme défectueuse et n'est pas analysée.
Ainsi la phase de détection de défauts s'attache à analyser la dispersion ou la forme de la distribution des niveaux de gris dans chaque vignette et dans l'image entière, et non à localiser les endroits où les niveaux de gris varient fortement.
Les inventeurs ont en effet établi que toutes les images d'un même milieu acquises en l'absence de défaut dans la chambre d'observation présentent des distributions de niveaux de gris similaires, qui s'approchent d'une courbe de référence qui peut, par exemple et selon le milieu analysé, être sensiblement gaussienne et/ou symétrique, et qu'une distribution qui s'éloigne de cette courbe de référence est caractéristique de la présence d'un défaut. Comme on le comprendra à la lecture de la description, le procédé et le système selon l'invention exploitent cette propriété mise au jour par les inventeurs, et ce sans qu'il ne soit nécessaire de déterminer la courbe de référence.
Dans un système et un procédé d'imagerie selon l'invention, il est possible d'utiliser un capteur monochromatique, auquel cas l'expression "niveaux de gris" est à prendre au sens propre.
Le capteur peut, en variante, être polychromatique. Dans ce cas, la phase de détection de défauts utilisant les "niveaux de gris" de l'image acquise peut être effectuée pour chaque canal RVB ou pour l'un d'entre eux seulement, l'expression "niveau de gris" désignant alors le niveau de couleur (rouge, vert ou bleu) dans le canal considéré. La réalisation d'une phase de détection dans un seul canal suffit à atteindre les objectifs de l'invention car la présence d'un défaut dans la chambre d'observation impacte les niveaux de couleur dans les trois canaux.
Dans le cas d'une image sans bulle d'air, les niveaux de gris peuvent être distribués, par exemple, selon une courbe sensiblement gaussienne autour d'une valeur moyenne. La présence d’une bulle, du fait des ménisques créés qui reflètent la lumière, entraine une augmentation de niveaux de gris de faible intensité et donc une déformation (par exemple une dissymétrie) de la distribution des niveaux de gris, voire un déplacement de cette distribution et donc de sa moyenne.
L'invention est ainsi basée sur une analyse globale et basique des niveaux de gris de l'image, et non sur une analyse de l'image visant à localiser précisément les contours des bulles ou autre défaut. Contrairement aux analyses proposées par les méthodes de détection antérieures, l'analyse selon l'invention peut être effectuée avec des ressources informatiques basiques et limitées, en un temps très court.
L’image entière étant constituée d'un nombre très important de pixels, par exemple 10 Mpixel, il est cependant délicat de détecter cette augmentation des niveaux de gris faibles (ou toute autre déformation de la distribution des niveaux de gris par rapport à une courbe de référence) directement sur cette image à partir de la distribution des niveaux de gris de l'image entière. En effet sur l’histogramme de l’ensemble de l’image, ces pixels sont négligeables. La subdivision de l’image en vignettes permet de pallier cet inconvénient en augmentant la contribution de ces zones sombres sur la distribution des niveaux de gris.
L'invention s'étend à un système d'imagerie holographique pour l'analyse holographique d'un milieu aux fins d'observation d'objets dispersés dans le milieu, le système comprenant :
une source lumineuse,
une chambre d'observation recevant un échantillon du milieu, laquelle chambre d'observation est agencée entre la source lumineuse et un capteur photosensible, le capteur photosensible et un processeur associé, configurés pour acquérir une image de l'échantillon présent dans la chambre d'observation éclairé par la source lumineuse,
des moyens informatiques comprenant un module d'analyse holographique pour l'analyse holographique des images acquises par le capteur photosensible.
Le système d'imagerie est caractérisé en ce qu'il comprend de plus un module de détection de défauts, qui utilise les niveaux de gris de l'image acquise, et en ce que le module de détection de défauts est configuré pour :
- effectuer une partition de l'image acquise en un nombre prédéterminé
N de vignettes,
évaluer pour chaque vignette et pour l'image entière, un paramètre statistique caractérisant la distribution des niveaux de gris dans la vignette et dans l'image entière, respectivement,
- calculer un facteur, dit facteur d'alarme, à partir du paramètre statistique de l'image entière et des paramètres statistiques des N vignettes précédemment évalués, comparer le facteur d'alarme obtenu à une valeur prédéterminée, dite seuil d'alarme,
- en fonction du résultat de la comparaison précédente, classer l'image acquise comme valide aux fins de son analyse, ou classer l'image acquise comme défectueuse.
Selon une caractéristique possible de l'invention, si l'image acquise est considérée comme défectueuse, une alarme (sonore et/ou visuelle par exemple) est émise.
Avantageusement et selon l'invention, tant pour le procédé que pour le système d'imagerie, le paramètre statistique évalué pour chaque vignette et pour l'image entière est choisi parmi : un paramètre de position de la distribution des niveaux de gris tel que la moyenne arithmétique ou un fractile (quartile, décile, centile, etc.), un paramètre de dispersion de la distribution des niveaux de gris tel que l'écart-type (racine du moment centré d'ordre 2), un paramètre de forme de la distribution des niveaux de gris tel que le coefficient de variation (ou écart- type relatif), le coefficient d'asymétrie (moment centré réduit d'ordre 3, "skewness" en anglais) ou le kurtosis (ou coefficient d'aplatissement, correspondant au moment centré réduit d'ordre 4) de la distribution des niveaux de gris, un ou plusieurs paramètres d'une fonction de fit ajustée à la distribution des niveaux de gris
Selon une caractéristique possible du système et du procédé selon l'invention, le facteur d'alarme est défini par la formule suivante :
Figure imgf000009_0001
où PSVignette désigne le paramètre statistique de chaque vignette, PS image désigne le paramètre statistique de l'image entière et Fa\arme désigne le facteur d'alarme.
Une acquisition est alors considérée comme défectueuse si le facteur d'alarme calculé est supérieur au seuil d'alarme prédéterminé.
L'invention n'est pas limitée au facteur d'alarme ci-dessus, qui correspond à la différence relative du paramètre statistique d'une vignette ayant un défaut et du paramètre statistique de l'image entière. Ce facteur d'alarme est même inadapté à certains paramètres statistiques, par exemple si le paramètre statistique de l'image entière a tendance à tendre vers zéro, comme c'est le cas avec le coefficient d'asymétrie. Dans ce cas, on peut par exemple utiliser un facteur d'alarme correspondant à la différence absolue du paramètre statistique sur une vignette avec défaut et du paramètre statistique sur l'image entière, soit
Figure imgf000009_0002
D'autres formules de facteur d'alarme sont possibles. En particulier, on a cité précédemment des différences relative et absolue mais on pourrait aussi utiliser des ratios ou d'autres types de relation mathématique de comparaison. L'homme du métier est à même de choisir un facteur d'alarme adapté au paramètre statistique utilisé sans faire preuve d'activité inventive.
Le facteur d'alarme peut ainsi être choisi parmi, par exemple :
Figure imgf000010_0001
Falarme.3 YR< x(a.bs(PSvignette P^imagef) F alarme A max(abs(P Svignette/P Simage))
Selon une caractéristique possible du système d'imagerie selon l'invention, le seuil d'alarme Saiarme et le nombre N de vignettes utilisés par le module de détection de défauts sont prédéterminés en fonction de la sensibilité et/ou de la spécificité souhaitée(s) pour le module de détection de défauts, et en fonction d'une taille minimale des défauts à détecter par le module de détection de défauts qui tient compte non seulement de la taille minimale des objets dispersés recherchés par le système d'imagerie mais aussi d'une ou plusieurs contributions de bruit telles une imperfection d'homogénéité d'éclairage, une imperfection d'homogénéité dimensionnelle de la chambre d'observation (par exemple une légère variation de l'épaisseur ou hauteur de la chambre d'observation), une imperfection d'homogénéité du capteur.
On entend par "contribution de bruit " une imperfection suffisamment petite pour ne pas avoir d'impact (ou seulement un impact négligeable) sur le comptage ou l'observation des objets recherchés in fine par le système et le procédé d'imagerie holographique. La qualification d'une imperfection en tant que source de bruit dépend donc de la destination du système d'imagerie, c'est-à-dire notamment de la taille des objets que le système d'imagerie est destiné à rechercher, identifier et/ou comptabiliser in fine.
Le seuil d'alarme et le nombre de vignettes doivent être définis en fonction de la sensibilité souhaitée pour le module de détection de défauts car il est courant, dans certaines applications, d'avoir de petites bulles d'air dans la chambre d'observation qui n'impactent pas les résultats de comptage des objets recherchés par le système d'imagerie. On rappelle que la sensibilité d'un classificateur mesure sa capacité à donner un résultat positif lorsqu'un objet recherché est présent. Elle s'oppose à la spécificité, qui mesure la capacité du classificateur à donner un résultat négatif lorsque l'hypothèse (ici la présence d'un objet recherché) n'est pas vérifiée. Ainsi, la sensibilité du module de détection de défauts ou du système d'imagerie est sa capacité à détecter tous les objets recherchés (globules blancs et rouges par exemple pour le système d'imagerie, défauts tels que bulles d'air ou impuretés pour le module de détection de défauts), tandis que la spécificité est sa capacité à ne détecter que les objets recherchés. En d'autres termes, la sensibilité du module de détection de défauts ou du système d'imagerie est sa capacité à avoir le moins de faux négatifs, tandis que la spécificité est sa capacité à avoir le moins de faux positifs.
Une phase de calibration préliminaire est avantageusement effectuée pour prédéterminer un couple (S alarme, N) de seuil d'alarme et nombre de vignettes à utiliser pour le module de détection de défauts. Cette phase de calibration comprend :
la constitution d'une banque d'images, ces images étant acquises en procédant à une injection dégradée d'un milieu (10) dans la chambre d'observation (14) afin de créer des bulles, les images étant ensuite analysées à l'aide d'une méthode d'analyse d'image connue quelconque de façon à caractériser le ou les défauts éventuellement présents sur chacune d'entre elles, le classement, de chacune des images de la banque d'images en tant qu'imagé valide ou défectueuse selon le résultat de la caractérisation précédente ; ce classement est qualifié de classement de référence. Plus précisément, lorsque l'on obtient une image sur laquelle sont repérées des bulles atteignant un diamètre seuil correspondant au diamètre au-delà duquel la présence d'une bulle a un impact sur les résultats d'analyse du système d'imagerie (ce diamètre seuil dépend de la destination du système d'imagerie en ce qu'il dépend du diamètre des objets recherchés pour lesquels le système d'imagerie est destiné à être utilisé in fine), cette image est classée dans les images défectueuses, pour lesquelles une alarme doit être émise. Si aucun défaut n'est repéré, ou si les seuls défauts repérés sont insignifiants (c'est-à-dire qu'ils ont une dimension inférieure au diamètre seuil susmentionné), l'image est classée en tant qu'imagé valide ;
pour chacune des images de la banque d'images, le calcul du paramètre statistique de la distribution des niveaux de gris dans les N vignettes et dans l'image entière et le calcul du facteur d'alarme Faiarme correspondant, et ce pour différents couples ( Saiarme , N),
pour chaque couple ( Saiarme , N), le classement par le module de détection de défauts de chacune des images de la banque d'images en tant qu'imagé valide ou défectueuse, ce classement étant par définition effectué selon l'invention c'est-à-dire par comparaison du facteur d'alarme au seuil d'alarme, pour chaque couple ( Saiarme , N), le calcul de la sensibilité et de la spécificité du module de détection de défauts, par comparaison du classement des images tel qu'effectué par le module de détection de défauts au classement de référence,
la sélection du couple ( Saiarme , N), fournissant le module de détection de défauts le plus performant. Pour ce faire, on peut par exemple tracer et comparer des courbes ROC (courbe sensibilité/spécificité) du module de détection de défauts. Chaque courbe ROC correspond de préférence à une valeur fixe du nombre N de vignettes et à des valeurs variables du seuil d'alarme (cela pourrait être l'inverse, c'est-à-dire une valeur fixe du seuil d'alarme et des valeurs variables du nombre N, mais cela demanderait plus de calculs et serait donc moins pratique). Chaque point de la courbe est donc donné par la sensibilité et la spécificité obtenues pour le module de détection de défauts avec cette valeur fixe du nombre de vignettes et une valeur du seuil d'alarme. On sélectionne ensuite la courbe ROC la plus favorable, c'est-à-dire celle dont l'aire sous la courbe est la plus grande, ce qui détermine le nombre N de vignettes. Puis on sélectionne le point sur la courbe qui correspond à la sensibilité et/ou la spécificité recherchée(s), ce qui détermine le facteur d'alarme.
Ainsi par exemple, les inventeurs ont établi, à l'aide d'une série d'analyses préliminaires de calibration comme précédemment décrites, que pour un système d'imagerie doté d'un capteur fournissant des images de 3840x2748 pixels2 utilisé pour l'identification et/ou le comptage d'objets dispersés de taille comprise entre 2 pm (tels des plaquettes) et 15 pm (tels des globules blancs), plus généralement entre 1 pm et 20 pm, voire entre 1 pm et 1000 pm, et doté d'un module de détection de défauts utilisant le facteur d'alarme Faiarme. i défini précédemment (différence relative), les meilleurs résultats sont obtenus pour un nombre N de vignettes égal à 64 et un seuil d'alarme S alarme égal à 7,5%.
Il est à noter que la phase de calibration préliminaire est effectuée lors de la conception du système d'imagerie ; elle ne fait pas, à proprement parlé, partie du procédé d'analyse par imagerie holographique selon l'invention en ce sens qu'elle n'est pas réitérée avant chaque analyse holographique, à l'utilisation du système d'imagerie. Si l'on considère que cette phase de calibration est une étape du procédé d'analyse holographique selon l'invention, il convient de garder à l'esprit qu'une même phase de calibration est commune à toutes les analyses holographiques menées ensuite avec le même système d'imagerie.
L'invention s'étend à un programme d'ordinateur comprenant une série d'instructions pour l'exécution de la phase de détection de défauts d'un procédé selon l'invention lorsqu'il est lu par un processeur d'un système d'imagerie.
L'invention s'étend aussi à un procédé, un système d'imagerie holographique et un programme d'ordinateur caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-avant et ci-après. Autrement dit, toutes les combinaisons possibles à partir des caractéristiques décrites dans la présente demande sont conformes à l'invention dès lors qu'il n'y a pas d'incompatibilité entre les caractéristiques combinées.
D’autres détails et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, qui se réfère aux dessins schématiques annexés et porte sur des modes de réalisation préférentiels, fournis à titre d’exemples non limitatifs. Sur ces dessins :
La figure 1 est une vue schématique d'un système d'imagerie selon l'invention, en coupe selon un plan contenant l'axe Z. Les figures 2 à 4 sont des images acquises d'échantillons présentant un défaut.
Les figures 5A à 5C illustrent un échantillon contenant une bulle de petite taille conduisant à des erreurs de comptage (sous-estimation) des objets dispersés et à une mauvaise évaluation du volume d'échantillon analysé : la figure 5A est une image acquise de l'échantillon, la figure 5B en est une reconstruction holographique, la figure 5C est un masque binaire résultant de la segmentation de la figure 5B.
Les figures 6A à 6C illustrent un échantillon contenant une bulle de grande taille compartimentée conduisant à des erreurs de comptage (surestimation) des objets dispersés et à une mauvaise évaluation du volume d'échantillon analysé : la figure 6B est une image acquise de l'échantillon, la figure 6B en est une reconstruction holographique, la figure 6C est un masque binaire résultant de la segmentation de la figure 6B.
La figure 7A est une image acquise, par un système d'imagerie selon l'invention, d'un échantillon sans bulle ; la figure 7B est une courbe représentant la distribution des niveaux de gris de l'image acquise 7A.
f La figure 8A est une image acquise, par un système d'imagerie selon l'invention, d'un échantillon avec bulle ; la figure 8B est une courbe représentant la distribution des niveaux de gris de l'intégralité de l'image acquise 8A. La figure 9A correspond à l'image acquise 8A subdivisée en vignettes ; la figure 9B est une courbe représentant la distribution des niveaux de gris de la vignette encadrée en pointillés de l'image 9A.
La figure 10 représente les courbes ROC de modules de détection selon l'invention utilisant comme paramètre statistique le coefficient de variation et comme facteur d'alarme le facteur 1 (différence relative Falarme l) défini plus haut, et configurés pour ne pas comptabiliser les bulles de diamètre inférieur à 50 pm et pour effectuer une partition de l'image acquise respectivement en 4, 16, 36, 64 et 100 vignettes. La figure 11 représente les courbes ROC de modules de détection selon l'invention, utilisant comme paramètre statistique le coefficient de variation et comme facteur d'alarme le facteur 1 (différence relative Falarme l) défini plus haut, et configurés pour comptabiliser les bulles de diamètre inférieur à 50 pm et pour effectuer une partition de l'image acquise respectivement en 4, 16, 36, 64 et 100 vignettes.
La figure 12 représente les courbes ROC de modules de détection selon l'invention, configurés pour effectuer une partition de l'image en 64 vignettes et pour utiliser respectivement les facteurs d'alarme 1 à 4 (Faiarme l à F alarme A) définis supra avec un même paramètre statistique, à savoir le coefficient de variation.
La figure 13 représente les courbes ROC de modules de détection selon l'invention, configurés pour effectuer une partition de l'image en 64 vignettes et pour utiliser le facteur d'alarme 1 (Faiarme l) défini supra avec, respectivement, la moyenne, l'écart-type, le coefficient de variation, l'asymétrie et l'aplatissement comme paramètre statistique.
La figure 14 représente les courbes ROC de modules de détection selon l'invention, configurés pour effectuer une partition de l'image en 64 vignettes et pour utiliser le facteur d'alarme 2 (Faiarme 2) défini supra avec, respectivement, la moyenne, l'écart-type, le coefficient de variation, l'asymétrie et l'aplatissement comme paramètre statistique.
La figure 15 représente les courbes ROC de modules de détection selon l'invention, configurés pour effectuer une partition de l'image en 64 vignettes et pour utiliser le facteur d'alarme 3 (Faiarme 3) défini supra avec, respectivement, la moyenne, l'écart-type, le coefficient de variation, l'asymétrie et l'aplatissement comme paramètre statistique.
La figure 16 représente les courbes ROC de modules de détection selon l'invention, configurés pour effectuer une partition de l'image en 64 vignettes et pour utiliser le facteur d'alarme 4 (FaiarmeA) défini supra avec, respectivement, la moyenne, l'écart-type, le coefficient de variation, l'asymétrie et l'aplatissement comme paramètre statistique. Les moyens de détection de défauts selon l'invention sont particulièrement adaptés à un système d'imagerie holographique pour l'évaluation de la concentration en particules de taille comprise entre 1 et 1000pm dans un milieu liquide, tel le système d'imagerie holographique objet de la demande de brevet internationale WO2016/151248, qui est incorporée par référence dans la présente demande.
Un tel système d'imagerie est illustré à la figure 1 ci-annexée. Il comprend des moyens informatiques dont un microprocesseur 20, une mémoire 23, un écran 26 et un module d'analyse holographique comprenant une série d'instructions 25 exécutable par le microprocesseur 20 pour réaliser une analyse holographique des images acquises par un capteur photosensible 16.
Ce système d'imagerie comprend également une source lumineuse 11 apte à produire une onde lumineuse incidente 12 selon un axe de propagation Z, en direction d'une chambre d'observation 14. La chambre d'observation 14 contient un échantillon d'un milieu 10, par exemple un liquide biologique, comportant des particules ou cellules 1 , 2, 3, 4, 5, ..., 9, que l'on souhaite identifier parmi des types de particules prédéterminés. En particulier, lorsque le milieu 10 est du sang ou un produit comportant du sang, une particule peut être un globule rouge, un globule blanc ou une plaquette. Une particule peut également être une microbille, organique ou inorganique, par exemple une microbille métallique, une microbille de polymère ou de verre, ce type de microbille étant couramment mis en œuvre dans la réalisation de protocoles biologiques. Une particule peut également être une gouttelette, par exemple une gouttelette lipidique, baignant dans le milieu 10. Il peut également s'agir d'un microorganisme, par exemple une bactérie ou une levure. Ainsi, le terme "particule" désigne à la fois des cellules endogènes, initialement présentes dans l'échantillon examiné, et des particules exogènes, ajoutées à cet échantillon avant l'analyse.
Le milieu 10 est le plus fréquemment un milieu liquide, et notamment un liquide corporel, mais il peut également d'agir d'une gélose. La méthode de détection de défauts dans la chambre d'observation, objet de l'invention, est avantageusement mise en œuvre dans le cadre d'un procédé d'imagerie holographique permettant d'identifier chaque particule observée.
Dans l'exemple de système d'imagerie illustré, la distance D entre la source lumineuse 11 et la chambre d'observation 14 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm.
La source lumineuse 11 , vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source lumineuse. Ainsi, la lumière parvient à l'échantillon sous la forme d'ondes 12 planes ou pouvant être considérées comme telles. La source lumineuse 11 peut être ponctuelle, ou être associée à un diaphragme ou filtre spatial, non représenté sur la figure 1 , de façon à apparaître comme ponctuelle. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 pm et 1 mm, de préférence entre 50 pm et 500 pm. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à une source lumineuse, et dont une seconde extrémité est placée face à l'échantillon. Dans ce cas, la seconde extrémité peut être assimilée à une source lumineuse ponctuelle 11.
La source lumineuse peut aussi être une diode Laser, par exemple une diode Laser émettant à la longueur d'onde de 405 nm dans le cas d'un système d'imagerie pour la détection et le comptage de cellules biologiques de type globules ou plaquettes dans un milieu sanguin. De préférence, la source lumineuse est de faible largeur spectrale, par exemple inférieure à 100 nm, de préférence inférieure à 20 nm, voire à 5 nm. L'expression "largeur spectrale " désigne la largeur à mi-hauteur du pic d'émission (courbe en fonction de la longueur d’onde) de la source lumineuse.
La chambre d'observation 14 est délimitée par une enceinte, comportant un fond 15 et un couvercle 13. Les parois latérales de l'enceinte ne sont pas représentées. Dans l'exemple considéré, l'enceinte est une chambre micro- fluidique en verre de 100pm d'épaisseur (distance entre le fond 15 et le couvercle 13). Il pourrait s'agir, en variante de chambre de type Countess™ de référence C10228. D'une façon générale, l'épaisseur de la chambre d'observation, selon l'axe de propagation Z, est inférieure à quelques cm, par exemple inférieure à 1 cm, voire inférieure à 1 mm, par exemple comprise entre 50 pm et 500 pm.
La chambre d'observation 14 est ici agencée à une distance de 15 cm de la source lumineuse 1 1 , entre celle-ci et un photodétecteur matriciel ou capteur photosensible 16. Ce dernier s'étend de préférence sensiblement parallèlement au fond 15 de la chambre d'observation. Dans l'exemple illustré, la source lumineuse 11 , la chambre d'observation 14 et le capteur photosensible 16 sont agencés en ligne, alignés selon l'axe Z de propagation de l'onde incidente 12 émise par la source lumineuse 11 (il n'y a donc pas d'organes de renvoi, tels des miroirs, sur le chemin de cette onde incidente 12 ou de l'onde résultante 22 issue de l'échantillon à analyser).
Le capteur photosensible 16 présente un plan de détection P qui, de préférence, est orthogonal à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. Le capteur photosensible 16 peut être un photodétecteur matriciel, de type CCD ou un CMOS, dont le plan de détection P est formé par une matrice de pixels recouverte d'une fenêtre de protection. Les CMOS sont les capteurs préférés car la taille des pixels est plus faible, ce qui permet d'acquérir des images dont la résolution spatiale est plus favorable. Les capteurs dont le pas inter-pixels est inférieur à 3 pm sont préférés, afin d'améliorer la résolution spatiale de l'image. A titre d'exemple, on peut utiliser un capteur IDS™ Ul- 1492LE-M qui est un capteur CMOS monochrome 12 bits 3840x2748 dont le pas inter-pixels est de 1 ,67pm, fabriqué par Aptina™ (référence MT9J003STM).
La distance d entre les particules 1 , 2, ...9 et la matrice de pixels du capteur photosensible 16 dépend de l'épaisseur de la chambre d'observation 14 et de la distance entre le fond de celle-ci et le plan de détection du capteur photosensible 16. D'une manière générale, chambre d'observation et capteur sont dimensionnés et agencés de façon à ce que la distance d entre une particule et les pixels du capteur soit comprise entre 50 pm et 1 cm, de préférence entre 100 pm et 2 mm. On remarque l'absence d'optique de grossissement entre la chambre d'observation 14 et le capteur photosensible 16. Le système illustré est qualifié de système sans lentille (" lensfree " en anglais). Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur 16.
Il est usuel, pour observer un liquide biologique, de le préparer en y ajoutant un ou plusieurs réactifs. Par exemple, un prélèvement de sang peut être dilué avec un réactif de dilution pour dénombrer les globules rouges. Les tests décrits dans la présente demande de brevet ont été effectués sur des échantillons sanguins ainsi dilués.
D'autres protocoles sont couramment utilisés, tel celui décrit dans la demande de brevet WO2016/151248.
Mal réalisée, ce genre de préparation peut conduire à l'obtention d'un milieu inhomogène dont la mesure fournira des résultats peu représentatifs du liquide biologique initial. Ceci constitue une première source d'erreur qu'il est important de pouvoir détecter.
D'autres sources d'erreurs sont illustrées sur les figures 2 à 6. La figure 2 montre une chambre désamorcée, avec d'importantes zones 40 dépourvues de milieu et donc d'objets à comptabiliser. La figure 3 montre un échantillon de milieu comportant une bulle 41 de taille importante. La figure 4 montre un échantillon comportant une bulle 42 de petite taille. Lorsqu'une bulle est présente dans la chambre, cela peut conduire à rendre des résultats erronés. L'examen des figures 5A à 5C et 6A à 6C permet de le comprendre : la présence d'une bulle de petite taille ou de taille moyenne (fig. 5A à 5C) va entraîner un zone 30 sans cellule (voir fig. 5C) conduisant à une mauvaise estimation du volume d'échantillon imagé avec une sous-estimation du nombre d'objets comptés ; dans certains cas, cela peut entraîner, à l'inverse (fig. 6A à 6C), une surestimation du nombre d'objets comptés du fait d'une segmentation de la bulle dont les différents compartiments (points de la zone 31 ) sont alors pris en compte en tant qu'objets. L'invention offre une méthode simple et rapide permettant de rejeter ces images. Outre les éléments décrits précédemment, le système d'imagerie selon l'invention comporte un module de détection de défauts comprenant une série d'instructions 24 mémorisée dans la mémoire 23 et exécutable par le microprocesseur 20 pour réaliser une phase de détection de défauts après acquisition d'une image par le capteur photosensible 16 et avant analyse holographique de cette image (l'analyse comprenant ici la reconstruction holographique de l'image et, par exemple, le comptage des particules 1 , 2, 3,... 9). Les figures 7A, 8A et 9A montrent des images acquises par le capteur photosensible 16, sur lesquelles la phase de détection de défauts peut être appliquée.
La figure 7A correspond à une acquisition valide 100, c'est-à-dire sans bulles, sans désamorçage de la chambre d'observation et avec un niveau de blanc acceptable (caractéristique d'un milieu homogène). La figure 7B représente la courbe de distribution des niveaux de gris de cette image acquise 100. On peut constater que les niveaux de gris mesurés vont de 29 à 255 avec une moyenne à 98,87, selon une répartition sensiblement gaussienne et symétrique dont le coefficient de variation est de 12,70%.
La figure 8A correspond à une acquisition 101 du même milieu que l'acquisition précédente 100 mais avec bulles. La figure 8B représente la courbe de distribution des niveaux de gris de cette image acquise 101 entière. Les niveaux de gris mesurés vont de 21 à 255 avec une moyenne à 97,15, selon une répartition qui, à première vue, paraît sensiblement gaussienne et dont le coefficient de variation est de 13,50%.
Un examen rapide des niveaux de gris sur l'image entière ne permet donc pas de déceler facilement la présence de bulles. La présence des ménisques de la bulle conduit en effet à une faible déformation de la courbe de distribution en niveaux de gris sur l'image entière : coefficient de variation de 13,5 % au lieu de 12,70 %, soit une augmentation d'un facteur 1 ,1 qui n'est pas suffisamment significatif pour pouvoir constituer en lui-même un facteur d'alarme fiable. La figure 9A reprend l'image acquise avec bulles 101 de la figure 8A, segmentée en 64 vignettes 32 de même taille. La figure 9B représente la courbe de distribution des niveaux de gris de la vignette 33 correspondant à une zone avec bulle. Les niveaux de gris mesurés sur cette seule vignette 33 vont de 21 à 255 avec une moyenne à 87,11 , selon une répartition qui qui n'a plus rien d'une gaussienne et dont le coefficient de variation est de 35,09%. Les travaux des inventeurs ont ainsi révélé que le coefficient de variation de la vignette dans laquelle se trouve la bulle est très différent du coefficient de variation de l'image entière valide : 35,09% contre 12,70%, soit une augmentation d'un facteur 2,7.
L'invention propose d'utiliser un facteur d'alarme construit à partir des coefficients de variation de l'image entière et des coefficients de variation des vignettes selon la formule suivante, qui s'avère à la fois représentative de la présence de défauts et pratique d'utilisation :
Figure imgf000021_0001
Ce facteur d'alarme tient compte du coefficient de variation de chaque vignette pour ne retenir finalement, grâce à l'utilisation du maximum, que les données relatives à la vignette contenant un défaut (ou la plus susceptible d'en contenir un). L'utilisation de ce facteur permet ainsi de déceler l'impact de la présence d'un défaut sur la distribution des niveaux de gris de l'image sans savoir quelle sont les ou la vignettes contenant des bulles, c'est-à-dire sans avoir à analyser l'image pour localiser le ou les défauts.
À noter qu'en lieu et place des coefficients de variation, il est possible d'utiliser d'autres paramètres statistiques (moyenne ou kurtosis ou coefficient d'asymétrie par exemple) de la distribution des niveaux de gris de l'image acquise entière et des vignettes. De même, comme expliqué supra, l'utilisation d'autres facteurs d'alarme est possible.
Selon l'invention, le facteur d'alarme ci-dessus est calculé et comparé à un seuil d'alarme prédéterminé. Lorsque le facteur d'alarme est supérieur au seuil d'alarme prédéterminé, l'image est automatiquement rejetée (classée comme défectueuse) et cette image n'est pas analysée afin que les résultats de comptage de particules qu'elle aurait fournis ne soient pas pris en considération. Optionnellement, une alarme est aussi émise. Les performances du système d'imagerie sont donc directement liées à celles de son module de détection de défauts. Il convient par conséquent de paramétrer le module de détection de défauts de façon à ce que celui-ci soit le plus performent possible, en tenant compte de la destination du système d'imagerie, c'est-à-dire du type et de la taille des objets que le système d'imagerie est destiné à rechercher.
Pour déterminer un seuil d'alarme et un nombre de vignettes adéquats, les inventeurs ont mené une série d'analyses préliminaires de calibration à partir d'un prélèvement de sang avec le système d'imagerie illustré, en dégradant l'injection dans la chambre d'observation afin de créer volontairement des bulles. Sur les quarante et une acquisitions réalisées, une analyse visuelle et optique des acquisitions a permis d'identifier vingt et une acquisitions présentant des bulles ou un désamorçage de la chambre d'observation. Parmi les vingt acquisitions jugées acceptables, quatre présentaient une petite bulle dont la taille a été considérée comme faible car inférieure à 30 pixels de diamètre après reconstruction, soit 50 pm. Ces microbulles sont courantes avec les réactifs utilisés qui contiennent des molécules tensioactives, et les bulles inférieures à cette taille peuvent être négligées car elles ont peu ou pas d'influence sur les résultats obtenus. En outre, leur détection par le module de détection de défauts est délicate car elles peuvent être confondues avec du bruit (une légère inhomogénéité de l'éclairage, par exemple, peut en effet impacter la distribution des niveaux de gris dans une mesure comparable à une très petite bulle).
Divers seuils d'alarme compris entre 1 % et 160 % ont été considérés pour chacune des quarante et une acquisitions (subdivisées en 64 vignettes), et la sensibilité et la spécificité du module de détection de défauts ont été calculées pour chaque seuil d'alarme considéré.
Une première série de calculs a été effectuée sans prise en compte des bulles de taille inférieure à 50 pm. Les résultats sont reportés dans le tableau ci- dessous, où VN signifie vrai négatif, VP vrai positif, FN faux négatif, FP faux positif, Se sensibilité et Sp spécificité.
Figure imgf000023_0001
Un seuil d’alarme fixé à 7,5% sur le facteur d'alarme permet donc d’obtenir une sensibilité et une spécificité respectivement de 1 et 0,95 pour le module de détection de défauts utilisant 64 vignettes. Une deuxième série de calculs a été effectuée, similaire à la précédente mais dans laquelle les bulles de taille inférieure à 50 pm étaient prises en compte. Là encore, c'est le seuil d'alarme de 7,5% qui a donné les meilleurs résultats.
Tous ces calculs effectués sur les quarante et une images acquises lors de la phase de calibration ont été répétés (sur les mêmes images) pour diverses valeurs N du nombre de vignettes, afin de voir l'impact du nombre de vignettes sur les performances de module de détection de défauts.
La figure 10 représente les courbes ROC de modules de détection de défauts qui ne tiennent pas compte des bulles de taille inférieure à 50 pm et utilisent un nombre de vignettes respectivement égal à 4, 16, 36, 64 et 100. La figure 11 représente les courbes ROC de modules de détection de défauts configurés de façon à comptabiliser les bulles de taille inférieure à 50 pm, pour un nombre de vignettes respectivement égal à 4, 16, 36, 64 et 100.
Il est rappelé qu'une courbe ROC (ROC étant l'acronyme de l’anglais " Receiver Operating Characteristic" que l'on pourrait traduire par caractéristique de fonctionnement du récepteur) représente sur l'axe des ordonnées la sensibilité d'un classificateur en fonction, sur l'axe des abscisses, de l'anti-spécificité (c'est- à-dire 1 moins la spécificité) du classificateur. Une courbe ROC est aussi parfois appelée "caractéristique de performance" ou "courbe sensibilité/spécificité". La performance du classificateur est donnée par l'aire sous la courbe ROC. Plus cette aire est grande, plus la courbe s’écarte de la ligne du classificateur aléatoire et se rapproche du coude du classificateur idéal (qui passe de (0, 0) à (0, 1 ) puis à (1 , 1 )).
II apparaît qu’il existe donc un optimum en termes de nombre de vignettes car :
si le nombre est trop bas, l’impact de la présence d’une bulle, en particulier quand elle est petite, risque de ne pas être détecté conduisant à des faux négatifs, ce qui diminue la sensibilité.
- si le nombre est trop grand, des faux positifs peuvent apparaître du fait des inhomogénéités d’éclairage ou de légères imperfections sur la chambre (ces imperfections sont source de bruit ; sur une vignette trop petite, elles peuvent conduire à une déformation de la distribution des niveaux de gris de la vignette qui est suffisamment significative pour être attribuée à la présence d'un défaut à détecter alors qu'il n'y en a pas), ce qui diminue la spécificité.
Pour l'application concernée, c'est-à-dire pour un système d'imagerie conçu pour identifier ou comptabiliser des particules de type globule blanc (taille moyenne 15 pm), globule rouge (taille moyenne 7 pm) et plaquette (taille moyenne 2 pm) dans un milieu sanguin, dans le cas de la détection uniquement des bulles >50 pm, les meilleurs résultats sont obtenus avec 64 vignettes pour un seuil d'alarme de 7,5%. Dans le cas de la détection de toutes les bulles, les meilleurs résultats sont aussi obtenus avec cette configuration.
On constate également que, pour l'application concernée, le module de détection de défauts avec détection des bulles inférieures à 50 pm est moins performant (courbe 64 vignettes de la figure 11 ) que le module de détection de défauts sans détection des bulles inférieures à 50 pm (courbe ROC 64 vignettes de la figure 10), probablement en raison d'imperfections du système qui entrent en concurrence avec les défauts que l'on cherche à détecter.
Comme précédemment indiqué, l'utilisation d'autres facteurs d'alarme est possible. La figure 12 permet de comparer l'efficacité de divers facteurs d'alarme calculés à partir d'un même paramètre statistique, en l'occurrence le coefficient de variation de la distribution des niveaux de gris. Cette figure représente les courbes ROC de modules de détection de défauts configurés pour subdiviser l'image en 64 vignettes, utiliser le coefficient de variation comme paramètre statistique avec, respectivement, les facteurs d'alarme 1 à 4 définis plus haut. Les meilleures performances sont obtenues avec la différence relative (Faiarme. i) et le ratio ( Faiarme.4 ) qui donnent ici des courbes superposées. Les valeurs de seuil qui permettent d’avoir une sensibilité de 1 et une spécificité de 0,95 sont dans le premier cas 6% et dans le second cas 107%.
De même, il est possible d'utiliser d'autres paramètres statistiques que le coefficient de variation. La figure 13 représente les courbes ROC des modules de détection de défauts obtenus avec une subdivision de l'image en 64 vignettes, avec le facteur d'alarme 1 défini plus haut et avec, respectivement, divers paramètres statistiques, à savoir la moyenne, l'écart-type, le coefficient de variation, l'asymétrie (" skewness ") et l'aplatissement (kurtosis). On voit sur ce graphe que, dès lors que le facteur d'alarme 1 est utilisé, la moyenne manque de sensibilité pour pouvoir caractériser de façon tout à fait satisfaisante la modification de la distribution, c’est pourquoi des paramètres statistiques de type écart-type, coefficient de variation, asymétrie et aplatissement semblent plus pertinents dans ce cas. Avec le facteur d'alarme 1 , Le coefficient de variation en combinaison avec un seuil d'alarme de 6% donne les meilleurs performances (la sensibilité obtenue est égale à 1 et la spécificité à 0,95).
A noter que l'obtention de performances moindres avec la moyenne n'exclut pas son utilisation selon l'invention. En effet, certaines applications peuvent se contenter des performances conférées par l'utilisation de la moyenne. En fonction du niveau de performances souhaité, il est toutefois préférable d'utiliser soit un autre paramètre statistique, soit un autre facteur d'alarme en combinaison avec la moyenne.
La figure 14 représente les courbes ROC des modules de détection de défauts obtenus avec une subdivision de l'image en 64 vignettes, avec le facteur d'alarme 2 défini plus haut et avec divers paramètres statistiques respectivement, à savoir la moyenne, l'écart-type, le coefficient de variation, l'asymétrie et l'aplatissement. Avec le facteur d'alarme 2, c'est le coefficient de variation qui donne les meilleures performances. La sensibilité obtenue est égale à 0,95 et la spécificité à 0,74 pour un seuil d'alarme fixé à 12%. Le facteur d'alarme 2 semble donc moins efficace que les autres modes de comparaison des paramètres statistiques ici testés.
La figure 15 représente les courbes ROC de modules de détection de défauts configurés pour subdiviser l'image en 64 vignettes, utiliser le facteur d'alarme 3 défini plus haut et utiliser, respectivement, les paramètres statistiques suivants : moyenne, écart-type, coefficient de variation, asymétrie et aplatissement. Cette figure montre que pour le facteur d'alarme 3, c'est l’asymétrie qui donne les meilleures performances : sensibilité obtenue égale à
1 et spécificité égale à 0,95 pour un seuil d'alarme de 60%.
La figure 16 représente les courbes ROC de modules de détection de défauts configurés pour subdiviser l'image en 64 vignettes, utiliser le facteur d'alarme 4 défini plus haut et utiliser respectivement les paramètres statistiques suivants : moyenne, écart-type, coefficient de variation, asymétrie et aplatissement. Cette figure montre que pour le facteur d'alarme 4, c'est encore le coefficient de variation qui donne les meilleures performances : sensibilité obtenue égale à 1 et spécificité égale à 0,95 pour un seuil d'alarme de 107%.
L'invention s'étend à toute variante accessible à l'homme du métier c'est- à-dire entrant dans le cadre délimité par les revendications annexées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'analyse d'un milieu (10) par imagerie holographique pour l'observation d'objets dispersés (1 -9) dans le milieu, le procédé étant mis en œuvre dans un système d'imagerie holographique comprenant une source lumineuse (11 ), un capteur photosensible (16), une chambre d'observation (14) recevant le milieu et des moyens informatiques comprenant un module d'analyse holographique (25), laquelle chambre d'observation est agencée entre la source lumineuse et le capteur photosensible, le capteur photosensible (16) étant configuré pour fournir une image d'un échantillon du milieu (10) présent dans la chambre d'observation éclairé par la source lumineuse (11 ),
le procédé comprenant :
une étape d'illumination de l'échantillon à l'aide de la source lumineuse
(1 1 ).
une étape d'acquisition, à l'aide du capteur photosensible (16), d'une image (100, 101 ) de l'échantillon, cette image représentant l'intensité d'une onde lumineuse résultante (22) qui frappe le capteur photosensible,
une analyse holographique de l'image acquise (100, 101 ) par le module d'analyse holographique (25),
le procédé est caractérisé en ce qu'il comprend de plus, après chaque étape d'acquisition, une phase de détection de défauts qui utilise les niveaux de gris de l'image acquise, et en ce que la phase de détection de défauts comprend :
une étape de partition de l'image acquise (100, 101 ) en un nombre prédéterminé N de vignettes (32, 33),
l'évaluation pour chaque vignette (32, 33) et pour l'image acquise entière (100, 101 ), d'un paramètre statistique caractérisant la distribution des niveaux de gris dans la vignette et dans l'image entière, respectivement, le calcul d'un facteur d'alarme à partir du paramètre statistique de l'image entière et des paramètres statistiques des N vignettes précédemment évalués, la comparaison du facteur d'alarme obtenu à un seuil d'alarme prédéterminé, en fonction du résultat de la comparaison précédente, l'image acquise est considérée comme valide et est analysée, ou comme défectueuse et n'est pas analysée.
2. Procédé d'imagerie holographique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'une alarme est émise si l'image acquise est considérée comme défectueuse.
3. Procédé d'imagerie holographique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le paramètre statistique évalué pour chaque vignette (32, 33) et pour l'image entière (100, 101 ) est choisi parmi : la moyenne arithmétique de la distribution des niveaux de gris, un fractile de la distribution des niveaux de gris, l'écart-type de la distribution des niveaux de gris, le coefficient de variation de la distribution des niveaux de gris, le coefficient d'asymétrie de la distribution des niveaux de gris, le kurtosis de la distribution des niveaux de gris, un ou plusieurs paramètres d'une fonction de fit ajustée à la distribution des niveaux de gris.
4. Procédé d'imagerie holographique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le facteur d'alarme est choisi parmi :
Figure imgf000028_0001
^alarme.3 ^n^^(flbs(PSvigneffe P^image^
PalarmeA V[\3x (xb S{P Svignene / P Simagey) où PS vignette désigne le paramètre statistique chaque vignette, PSimage désigne le paramètre statistique de l'image entière et Fa\arme désigne le facteur d'alarme,
et en ce que l'acquisition (101 ) est considérée comme défectueuse si le facteur d'alarme est supérieur au seuil d'alarme prédéterminé.
5. Programme d'ordinateur comprenant une série d'instructions (24) pour l'exécution de la phase de détection de défauts d'un procédé selon l'une des revendications précédentes lorsqu'il est lu par un processeur (20) d'un système d'imagerie holographique.
6. Système d'imagerie holographique pour l'analyse d'un milieu (10) aux fins d'observation d'objets (1 -9) dispersés dans le milieu, le système comprenant :
une source lumineuse (11 ),
une chambre d'observation (14) recevant un échantillon du milieu (10), laquelle chambre d'observation est agencée entre la source lumineuse et un capteur photosensible (16),
le capteur photosensible (16) et un processeur associé (20), configurés pour acquérir une image (100, 101 ) de l'échantillon de milieu présent dans la chambre d'observation (14) et illuminé par la source lumineuse (11 ),
- un module d'analyse holographique (25) pour l'analyse holographique des images acquises par le capteur photosensible,
caractérisé en ce qu'il comprend de plus un module (24) de détection de défauts qui utilise les niveaux de gris de l'image acquise, et en ce que le module de détection de défauts (24) est configuré pour, pour chaque acquisition : - effectuer une partition de l'image acquise (100, 101 ) en un nombre prédéterminé N de vignettes (32, 33),
évaluer, pour chaque vignette (32, 33) et pour l'image entière (100, 101 ), un paramètre statistique caractérisant la distribution des niveaux de gris dans la vignette et dans l'image entière, respectivement, calculer un facteur d'alarme à partir du paramètre statistique de l'image entière et des paramètres statistiques des N vignettes précédemment évalués, comparer le facteur d'alarme obtenu à un seuil d'alarme prédéterminé, en fonction du résultat de la comparaison précédente, classer l'image acquise comme valide aux fins de son analyse, ou classer l'image acquise comme défectueuse.
7. Système d'imagerie holographique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'émission d'alarmes et en ce que le module de détection de défauts est configuré pour déclencher l'émission d'une alarme si l'image acquise est classée comme défectueuse.
8. Système d'imagerie holographique selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que le paramètre statistique évalué pour chaque vignette et pour l'image entière est choisi parmi : la moyenne arithmétique de la distribution des niveaux de gris, un fractile de la distribution des niveaux de gris, l'écart-type de la distribution des niveaux de gris, le coefficient de variation de la distribution des niveaux de gris, le coefficient d'asymétrie de la distribution des niveaux de gris, le kurtosis de la distribution des niveaux de gris, un ou plusieurs paramètres d'une fonction de fit ajustée à la distribution des niveaux de gris.
9. Système d'imagerie holographique selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le facteur d'alarme est choisi parmi :
Figure imgf000030_0001
Palarme.3 ^n^^(flbs(PSvigneffe P^image^
PalarmeA V[\3x (xb S{P Svignene / P Simagey)
où PS vignette désigne le paramètre statistique de chaque vignette, PS image désigne le paramètre statistique de l'image entière et Faiarme.i désigne le facteur d'alarme, et en ce que l'acquisition (101 ) est considérée comme défectueuse si le facteur d'alarme est supérieur au seuil d'alarme.
10. Système d'imagerie holographique selon l'une des revendications 6 à
9, caractérisé en ce que le seuil d'alarme Saiarme et le nombre N de vignettes utilisés par le module de détection de défauts sont prédéterminés en fonction d'une sensibilité et/ou d'une spécificité souhaitée(s) pour le module de détection de défauts, et en fonction d'une taille minimale des défauts à détecter qui tient compte de la taille minimale des objets recherchés par le système d'imagerie et d'une ou plusieurs contributions de bruit possibles.
11. Système d'imagerie holographique selon l'une des revendications 6 à
10, caractérisé en ce que le couple ( Saiarme , N) de seuil d'alarme et nombre de vignettes utilisé par le module de détection de défauts est prédéterminé dans le cadre d'une phase préliminaire de calibration qui comprend :
la constitution d'une banques d'images, ces images étant acquises en procédant à une injection dégradée d'un milieu (10) dans la chambre d'observation (14) afin de créer des bulles, les images étant ensuite analysées à l'aide d'une méthode d'analyse d'image connue quelconque de façon à caractériser le ou les défauts éventuellement présents sur chacune d'entre elles, un classement de référence de chacune des images de la banque d'images en tant qu'imagé valide ou défectueuse selon le résultat de la caractérisation précédente ; pour chacune des images de la banque d'images, le calcul du paramètre statistique de la distribution des niveaux de gris dans les N vignettes et dans l'image entière et le calcul du facteur d'alarme Faiarme correspondant, et ce pour différents couples ( Saiarme , N),
pour chaque couple ( Saiarme , N), le classement par le module de détection de défauts de chacune des images de la banque d'images en tant qu'imagé valide ou défectueuse, par comparaison du facteur d'alarme calculé au seuil d'alarme, pour chaque couple ( Saiarme , N), le calcul de la sensibilité et de la spécificité du module de détection de défauts, par comparaison du classement des images tel qu'effectué par le module de détection de défaut au classement de référence,
la sélection du couple ( Saiarme , N) fournissant le module de détection de défauts le plus performant.
12. Système d'imagerie holographique selon l'une des revendications 6 à 11 , caractérisé en ce que le capteur photosensible (16) est un capteur CMOS.
13. Système d'imagerie holographique selon l'une des revendications 6 à 12, pour l'observation d'objets dispersés (1 -9) de taille comprise entre 1 pm et
20 pm dans le milieu (10), caractérisé en ce que le capteur photosensible (16) est configuré pour fournir des images de 3840 x 2748 pixels2, et en ce que le nombre N de vignettes est égal à 64, le facteur d'alarme est défini par la formule seuil d'alarme est égal à 7,5%.
Figure imgf000032_0001
14. Système d'imagerie holographique selon l'une des revendications 6 à
13, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de lentille de grossissement entre la chambre d'observation (14) et le capteur photosensible (16).
15. Système d'imagerie holographique selon l'une des revendications 6 à
14, caractérisé en ce que la source lumineuse (11 ), la chambre d'observation (14) et le capteur photosensible (16) sont agencés en ligne.
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