CN106971141B - 细胞区域确定方法、细胞拍摄系统及细胞图像处理装置 - Google Patents

细胞区域确定方法、细胞拍摄系统及细胞图像处理装置 Download PDF

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Abstract

一种确定细胞区域的方法，包括：获取用第一观察法拍摄细胞所获得的第一细胞图像、获取用不同于第一观察法的第二观察法拍摄细胞所获得的第二细胞图像、根据第一细胞图像和第二细胞图像确定细胞的区域。

Description

细胞区域确定方法、细胞拍摄系统及细胞图像处理装置
技术领域
本发明涉及一种细胞区域确定方法、细胞拍摄系统及细胞图像处理装置。
背景技术
美国专利第7711174号公报上公开了一种从培养过程中的细胞图像获取细胞轮廓和细胞纹理信息并对所获得的信息进行解析以确定细胞结构特征的方法。
要通过机械处理来确定细胞的特征，最好将通过拍摄细胞所获得的细胞图像中的细胞区域与背景区域等非细胞区域区分开，尽可能准确地求出通过拍摄细胞所获得的细胞图像中的细胞区域。从细胞图像所确定的细胞区域越接近实际的细胞形态，就越容易根据所确定的细胞区域利用机械处理确定细胞特征。
然而，细胞形状是不定的，通过机械处理将细胞图像中的细胞识别为细胞并非易事。特别是当细胞为移植用细胞时，不能对细胞染色，所以不存在用于将细胞图像中的细胞识别为细胞的标记，更难求出细胞图像中的细胞区域。
因此，人们希望有一种新的方式能够从细胞图像中尽可能准确地求出细胞区域。
发明内容
本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。
本发明一种技术方案涉及一种确定细胞区域的方法。方法包括：获取用第一观察法拍摄细胞所获得的第一细胞图像；获取用不同于第一观察法的第二观察法拍摄细胞所获得的第二细胞图像；根据第一细胞图像和第二细胞图像确定细胞区域。
优选地，确定所述细胞的区域的作业包括以下步骤：根据所述第一细胞图像确定所述第一细胞图像中的细胞区域——即第一细胞区域；根据所述第二细胞图像确定所述第二细胞图像中的细胞区域——即第二细胞区域；生成所述第一细胞区域和所述第二细胞区域叠加而成的合成图像。
优选地，所述第一观察法是相差显微镜观察法；所述第一细胞图像是所述细胞的位相差影像。
优选地，所述第二观察法是暗视野观察法；所述第二细胞图像是所述细胞的暗视野影像。
优选地，所述第一观察法是相差显微镜观察法；所述第一细胞图像是所述细胞的位相差影像；确定所述第一细胞区域的作业包括：将所述位相差影像中亮度高于第一阈值的区域以及亮度低于比所述第一阈值小的第二阈值的区域分别确定为所述第一细胞区域。
优选地，所述第二观察法是暗视野观察法；所述第二细胞图像是所述细胞的暗视野影像；确定所述第二细胞区域的作业包括：将所述暗视野影像中亮度高于第三阈值的区域确定为所述第二细胞区域。
优选地，确定所述细胞的区域的作业还包括以下步骤：根据区域的大小识别所述第一细胞区域中包括的第一噪声区域，并进行从所述第一细胞区域除去所述第一噪声区域的第一噪声除去处理，以及根据区域的大小识别所述第二细胞区域中包括的第二噪声区域，并进行从所述第二细胞区域除去所述第二噪声区域的第二噪声除去处理；其中，用于生成所述合成图像的所述第一细胞区域是除去所述第一噪声区域后的所述第一细胞区域，用于生成所述合成图像的所述第二细胞区域是除去所述第二噪声区域后的所述第二细胞区域。
优选地，所述第一细胞图像和所述第二细胞图像是彩色图像；对作为彩色图像的所述第一细胞图像的红色图像、绿色图像和蓝色图像分别进行所述第一噪声除去处理；对作为彩色图像的所述第二细胞图像的红色图像、绿色图像和蓝色图像分别进行所述第二噪声除去处理。
优选地，确定所述细胞的区域的作业包括对所述细胞的区域中出现的孔洞进行孔洞填充处理。
优选地，所述细胞是未染色细胞。
优选地，所述细胞为移植用细胞。
本发明另一技术方案涉及一种细胞拍摄系统。细胞拍摄系统具有拍摄部件和处理部件。拍摄部件用第一观察法拍摄细胞并生成第一细胞图像，用不同于第一观察法的第二观察法拍摄细胞并生成第二细胞图像。处理部件进行图像处理。图像处理包括从拍摄部件获取第一细胞图像的处理、从拍摄部件获取第二细胞图像的处理、以及根据第一细胞图像和第二细胞图像确定细胞区域的处理。
优选地，所述拍摄部件还包括：为获得暗视野影像作为所述第二细胞图像而包括光照所述细胞的照射用光学系统和从所述细胞接受散射光的受光用光学系统的暗视野观察用光学系统，以及放置所述细胞的培养容器的放置部件；其中，所配置的所述照射用光学系统从所述放置部件中放置的所述培养容器的底面一侧照射光，所配置的所述受光用光学系统在所述放置部件中放置的所述培养容器的底面一侧接受所述散射光。
本发明另一技术方案涉及一种处理装置。处理装置具有处理部件，该处理部件实施包括下述处理在内的图像处理：获取用第一观察法拍摄细胞所获得的第一细胞图像的处理、获取用不同于第一观察法的第二观察法拍摄细胞所获得的第二细胞图像的处理、以及根据第一细胞图像和第二细胞图像确定细胞区域的处理。本发明另一技术方案涉及一种让计算机实施上述图像处理的计算机程序。
本发明提供了一种从细胞图像求出细胞区域的新方式。
附图说明
图1A为细胞拍摄系统的框状图；
图1B为切换后的细胞拍摄系统的框状图；
图2A为位相差观察用第一光学系统的示图；
图2B为暗视野观察用第二光学系统的示图；
图3为放置部件和培养容器的示图；
图4为处理装置所实施的处理的流程图；
图5为细胞的位相差影像图；
图6为细胞的暗视野影像图；
图7为噪声除去处理的流程图；
图8为自动识别出的细胞区域与肉眼观察所识别出的细胞区域的示图；
图9为自动识别出的细胞区域数与肉眼观察所识别出的细胞区域数的相关图；
图10为细胞的位相差影像图；
图11为细胞的暗视野影像图；
图12为机械识别出的细胞区域与肉眼观察识别出细胞区域的示图。
具体实施方式
下面参照附图说明本发明的具体实施方式。
（1. 细胞拍摄系统）（1.1 概要）
图1A所示细胞拍摄系统100具有拍摄部件10和处理装置20。细胞拍摄系统根据拍摄细胞所得到的细胞图像自动识别细胞图像中的细胞区域。拍摄部件10拍摄细胞并生成细胞图像。生成的细胞图像传给处理装置20。处理装置20对细胞图像进行处理。
所拍摄的细胞例如是用于再生医疗的移植用细胞。移植用细胞比如是培养间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell（MSC））所得到的。所使用的MSC比如来自人骨髓（来自人骨髓的间充质干细胞）。要评价MSC的状态，例如评价是否适合移植时，分析所培养的MSC的形态会是一种行之有效的方式。要进行细胞的形态分析就需要在细胞图像中确定细胞区域。
所拍摄的细胞最好是未染色的。染色细胞的话会导致细胞无法用于移植或对细胞造成伤害。此外，移植用细胞宜为无菌状态。为使所拍摄的细胞保持无菌状态，所拍摄的细胞宜采用密封在培养容器30内的细胞。此时，细胞图像是隔着培养容器30拍摄细胞得到的。
拍摄部件10能够拍摄复数种细胞图像。细胞图像的种类根据细胞图像拍摄所用的观察法来区分。观察法的不同会对观察对象的视觉结果——即细胞图像中细胞影像的呈现方式有影响。例如，观察法包括显微镜观察所使用的各种观察法。例如，观察法包括相差显微镜观察法、暗视野观察法、明视野观察法、以及微分干涉差显微镜观察法。依据观察法来分类细胞图像时，细胞图像例如被分类为位相差影像、暗视野影像、明视野影像、微分干涉差影像。位相差影像是根据相差显微镜观察法这一利用了观察对象细胞中通过的光的位相差的方法所拍摄出的图像。位相差影像中有观察对象内侧看起来较暗而轮廓附近看起来较亮的暗反差位相差影像、以及观察对象内侧看起来较亮而轮廓附近看起来较暗的明反差位相差影像。暗视野影像是根据观察来自观察对象细胞的散射光的暗视野观察法所拍摄出的图像。明视野影像是根据明视野观察法，即将观察对象细胞中的光吸收率的差所对应的透射光强度作为图像中的反差反映出来的明视野观察法，所拍摄出的图像。微分干涉差影像是根据利用了光的偏振性和干涉性的微分干涉差显微镜观察法所拍摄出的图像。各观察法分别用不同的光学系统进行观察。另外，细胞图像的种类不限于以上所述。
同一细胞以不同观察法观察时，细胞的视觉结果是不一样的。比如，在位相差影像中，有时细胞的轮廓附近较明亮，细胞越大，细胞中心附近就会越暗。在暗视野影像中，在细胞核附近等位置处，光容易出现散射，因此散射光较强较亮。明视野影像与暗视野影像相反，在细胞核附近等位置处，光难以透射，因此透射光较弱较暗。微分干涉差影像则是具有立体感的图像。
如此，在根据不同观察法所拍摄出的复数种细胞图像中，即使拍摄的是同一细胞，图像中的细胞影像的呈现方式也是不一样的。细胞拍摄系统100利用了这一点，其用不同观察法拍摄出的复数的细胞图像来确定细胞区域。
以下使用两种细胞图像作为观察法不同的复数的细胞图像，但也可以使用三种或四种以上的细胞图像。两种细胞图像的组合例如可以采用以下任意一种组合：位相差影像与暗视野影像、位相差影像与明视野影像、位相差影像与微分干涉差影像、暗视野影像与明视野影像、暗视野影像与微分干涉差影像、以及明视野影像与微分干涉差影像。
三种细胞图像的组合例如可以采用以下任意一种组合：位相差影像与暗视野影像与明视野影像、位相差影像与暗视野影像与微分干涉差影像、位相差影像与明视野影像与微分干涉差影像、暗视野影像与明视野影像与微分干涉差影像。四种细胞图像的组合例如可以采用位相差影像与暗视野影像与明视野影像与微分干涉差影像的组合。在上述各种组合中，位相差影像可以使用暗反差位相差影像，也可以使用明反差位相差影像。上述各组合中也可以包括两种位相差影像，即包括暗反差位相差影像和明反差位相差影像两者。
下面说明用位相差影像和暗视野影像作为两种细胞图像的组合的情况。位相差影像采用的是暗反差位相差影像。以下将根据需要称相差显微镜观察法为第一观察法，称暗视野观察法为第二观察法。以第一观察法拍摄细胞所获得的位相差影像被称为第一细胞图像，以第二观察法拍摄细胞所获得的暗视野影像被称为第二细胞图像。
(1.2 拍摄部件)
拍摄部件10能够以第一观察法即相差显微镜观察法拍摄细胞，生成第一细胞图像，以第二观察法即暗视野观察法拍摄同一细胞，生成第二细胞图像。拍摄部件10具有用于放置观察对象的放置部件130和用于拍摄观察对象的拍摄元件140。放置部件130例如是从下方支撑细胞的培养容器30的承载台。拍摄元件140比如由拍摄彩色图像的CCD图像传感器构成。拍摄元件140配置于放置部件130下方。
拍摄部件10有第一光学系统110和第二光学系统120。第一光学系统110是相差显微镜观察用光学系统。第二光学系统120是暗视野观察用光学系统。拍摄放置在放置部件130的观察对象时，选择性地切换复数个光学系统110、120。即，拍摄第一细胞图像时，如图1B所示，进行切换以使第一光学系统110移动到放置部件130的位置，拍摄第二细胞图像时，如图1A所示，进行切换以使第二光学系统120移动到放置部件130的位置。用于拍摄的光学系统110和120的切换作业可以手动进行，也可以在处理部件200的控制下自动进行。
如图2A所示，相差显微镜观察用的第一光学系统110具有照射用光学系统111和受光用光学系统116。拍摄位相差影像时，照射用光学系统111配置在放置部件130上方，并从观察对象300上方照射光。受光用光学系统116配置在放置部件130下方，其接受来自观察对象300的光。照射用光学系统111具有光源112、位相环113和聚光透镜114。受光用光学系统116具有物镜117和位相板118。另外，在图2A中描绘的是放置部件130和观察对象300的简要结构。
来自光源112的光被位相环113收窄，然后通过聚光透镜114到达观察对象300。通过观察对象300后的光分为直射光和衍射光。衍射光在观察对象300中折射率不同的部位产生。相较于直射光，在观察对象300产生的衍射光具有约1/4波长的相位延迟。直射光与衍射光分别通过物镜117和位相板118并到达拍摄元件140。通过观察对象300后的直射光被物镜117聚集，在位相板118，位相错开1/4波长。直射光的位相在位相板118比如提前1/4波长。因此，直射光与衍射光的位相差为1/2波长，在直射光与衍射光互相干涉的部分，直射光因其与衍射光的干涉而强度减弱，变暗。直射光与衍射光相互干涉的位置是在观察对象300内部，因此，在暗反差位相差影像中，观察对象300的内部比背景部分看起来要暗。此外，观察对象300的轮廓出现被称为光晕的亮边。因此，位相差影像是观察对象300的轮廓等较明亮的图像。另外，可以通过在位相板118上设置用于吸收光的中性密度滤光镜（NeutralDensity）(ND)来进一步降低直射光的强度。设置ND镜就能使观察对象300内部更暗，提高反差。在来自光源112的光——比如激光的强度较强时，在位相板118上设置ND镜会特别有用。
如图2B所示，暗视野观察用的第二光学系统120具有照射用光学系统和受光用光学系统。在实施方式中，照射用光学系统和受光用光学系统设为一体，且配置于放置部件130下方。第二光学系统120具有的照射用光学系统为光源122、环形光圈123、环形镜124、环形聚光透镜125。第二光学系统120具有的受光用光学系统是物镜126和127。
拍摄暗视野影像时，照射用光学系统从观察对象下方——即培养容器30的底面一侧照射光。即，来自光源122的光在环形光圈123作用下成为环形光束，并被环形镜124反射到观察对象一侧，通过环形聚光透镜125，到达观察对象。
受光用光学系统在观察对象下方——即培养容器30的底面一侧接受来自观察对象的散射光。即，来自观察对象的散射光通过物镜126、127并到达拍摄元件140。散射光在细胞核附近等处较强。因此，暗视野影像是细胞中心附近较为明亮的图像。
如图3所示，放置部件130上设有上下贯通的贯通孔130a，以使得拍摄元件140能够从下方拍摄。另外，放置部件130只要保证光能够向下透过即可，例如其也可以部分或全部由透明材料制成。
放置部件130上放置的培养容器30宜使用透明材料制成的、能够密封以使内部的无菌状态能得以维持的容器。图3所示培养容器30有上部有开口的容器主体31和用于密封上部开口的盖32。容器主体31内存在着观察对象细胞300和培养基310。培养基310以液体为宜。
要在保持无菌状态的前提下进行细胞拍摄，拍摄时就不能取下培养容器30的盖32。因此，假如透镜125、126配置在培养容器30上方，在盖32的妨碍下，无法使透镜125、126位于盖32之下。因此，有时无法让透镜125、126充分接近细胞300。透镜125、126不能充分接近细胞300的话，在某些条件下可能无法拍摄到鲜明的图像。相对于此，透镜125、126配置在培养容器30底面一侧时，不会出现盖32造成妨碍的问题。而且，当放置部件130设有贯通孔130a时，通过使照射用光学系统的聚光透镜125和受光用光学系统的物镜126进入贯通孔130a内就能使透镜125、126进一步接近细胞300。
(1.3 处理装置)
处理装置20由计算机构成。如图1A所示，处理装置20具有处理部件200。处理部件200有CPU210和存储部件220。存储部件220中存有供CPU210执行的计算机程序。通过执行计算机程序，处理部件200至少实施图4所示处理。处理装置20还可以有显示部件230和输入部件等。
处理部件200所进行的处理包括对细胞图像的图像处理。图像处理包括在细胞图像中确定细胞存在的区域的处理，即确定细胞区域的处理。处理部件200也可以用图像处理所获得的图像进行分析处理。分析处理比如包括细胞特征量的提取、基于特征量的细胞分析。处理部件200还能够对拍摄部件10进行控制。处理部件200能够使显示部件230显示图像处理所获得的图像和分析处理的结果。
处理部件200根据拍摄部件10所生成的细胞图像进行图像处理。作为处理对象的细胞图像例如可以是通过网络传送的、保存在存储部件220的细胞图像，也可以是通过移动存储介质保存到存储部件220的细胞图像。
在实施方式中，处理部件200所进行的处理包括：第一细胞区域确定处理221、第二细胞区域确定处理222、噪声除去处理223、图像合成处理224、孔洞填充处理225、以及特征提取和分析处理226。下面根据图4说明这些处理。
(2. 处理装置进行的处理)
如图4所示，处理部件200在步骤S111从拍摄部件10获取位相差影像，即第一细胞图像。处理部件200在步骤S121从拍摄部件10获取暗视野影像，即第二细胞图像。处理部件200将获取的图像保存到存储部件220。先进行步骤S111或步骤S121都是可以的。
图5是第一细胞图像的例示，图6是第二细胞图像的例示。为方便起见，作为附图显示的图5、6采用的是黑白图像，但实施方式中的第一细胞图像和第二细胞图像为彩色图像。
处理部件200进行针对第一细胞图像的图像处理和针对第二细胞图像的图像处理。针对两图像的图像处理中的哪一处理在前都是可以的。
处理部件200在步骤S112R、112G和S112B进行第一处理，即第一细胞区域确定处理221，并将其作为针对第一细胞图像的图像处理。在第一细胞区域确定处理221中确定第一细胞图像中的细胞区域，即第一细胞区域。例如通过图像的二值化处理来确定第一细胞图像中的细胞区域。
分别对构成彩色第一细胞图像的红色图像（R图像）、绿色图像（G图像）和蓝色图像（B图像）进行第一细胞区域确定处理221。即，在步骤S112R对R图像进行二值化处理，在步骤S112G对G图像进行二值化处理，在步骤S112B对B图像进行二值化处理。步骤S112R、112G和S112B中的哪一者在先进行都是可以的。
在步骤S112R、112G和S112B分别用与像素的亮度相关的两个阈值进行二值化处理。两个阈值是第一阈值和比第一阈值小的第二阈值。第一阈值是利用在位相差影像中细胞轮廓附近会变明亮这一现象来提取其轮廓附近的明亮部分来作为细胞区域的值。第二阈值是利用在位相差影像中细胞中心附近会变暗这一现象来提取其中心附近的较暗的部分的值。如此，使用两个阈值这一做法利用了在第一细胞图像这一位相差影像中细胞影像主要由比背景区域明亮的部分和暗的部分构成这一现象，可参照图5。
在针对第一细胞图像的二值化处理中，RGB各图像中比第一阈值亮度高的区域和比第二阈值亮度低的区域分别成为表示第一细胞区域的值（例如“1”）。而亮度在第一阈值和第二阈值之间的区域成为表示非细胞区域的值（例如“0”）。另外，典型的非细胞区域有拍摄培养基310而得到的区域。
第一阈值和第二阈值可以通过构成第一细胞图像的RGB各图像中亮度的统计处理来确定。例如，统计处理包括求出构成各图像的像素亮度的平均值μ1和标准偏差σ1 的处理。第一阈值比如可采用μ1+2σ1，第二阈值比如可采用μ1-2σ1。就RGB各图像分别独立进行统计处理，所以就RGB各图像，独立确定第一阈值和第二阈值的值。因此，就RGB各图像来说两个阈值是恰当的。
二值化处理所确定的第一细胞区域包括很多第一噪声区域，第一噪声区域并非真正的细胞区域。处理部件200在步骤S113R、113G、113B对经二值化处理后的RGB各图像进行噪声除去处理223。噪声除去处理223中，根据区域的大小识别第一细胞区域中所包含的第一噪声区域，并从第一细胞区域中除去较小的第一噪声区域。除去较小的噪声区域时利用了二值化处理后的图像中的第一细胞区域的面积的统计处理。
如图7所示，为除去噪声，处理部件200在步骤S201求出二值化处理后的图像中的复数个第一细胞区域各自的面积。在步骤S202，处理部件200求出面积的平均值μ2和标准偏差σ2。在步骤S203中，处理部件200将第一细胞区域中面积小于用于识别噪声区域的阈值（噪声识别用阈值）的区域识别出来作为噪声区域。噪声识别用阈值例如定为μ2-2σ2。处理部件200在步骤S204从第一细胞区域除去噪声区域。要除去噪声区域，例如，只要在二值化处理后的图像中使噪声区域的亮度值成为表示非细胞区域的值（如“0”）即可。
从步骤S205的重复条件可知，从步骤S201到步骤S204的处理重复数次（例如10次）。每重复一次就重新计算平均值μ2和标准偏差σ2，重新确定噪声识别用阈值。因此，每重复一次，噪声区域就会减少一些。
在步骤S113R、113G、113B对二值化处理后的RGB各图像分别进行噪声除去处理223，因此识别噪声区域的精确度得以提高。即，在真正的细胞区域中，RGB各色中有明暗的共通性变化，而与此相对地，噪声区域则容易在RGB各色中独立产生。因此，在RGB各图像中识别噪声区域的做法使噪声区域得以细分，更易于根据区域大小识别噪声区域。
在步骤S114，处理部件200对进行了噪声除去处理的二值化RGB各图像进行合成。通过叠加二值化RGB各图像来进行合成。例如可以如下进行叠加：使二值化RGB各图像的任意一者中成为表示第一细胞区域的值（例如“1”）的像素在合成图像中成为表示第一细胞区域的值，使其他像素成为表示非细胞区域的值（例如“0”）。
处理部件200对第二细胞图像这一暗视野影像也进行与第一细胞图像的处理同样的图像处理。在步骤S122R、122G和S122B，处理部件200进行第二处理，即第二细胞区域确定处理222，并将其作为第二细胞图像的图像处理。在第二细胞区域确定处理222，确定第二细胞图像中的细胞区域，即第二细胞区域。例如，通过图像的二值化处理来确定第二细胞图像中的细胞区域。对构成彩色第二细胞图像的红色图像（R图像）、绿色图像（G图像）和蓝色图像（B图像）分别进行第二细胞区域确定处理222。
在步骤S123R、123G、123B，处理部件200对经二值化处理后的RGB各图像进行噪声除去处理223。按照图7所示顺序对RGB各图像进行噪声除去处理223。处理部件200在步骤S124合成进行了噪声除去处理后的二值化RGB各图像。通过叠加二值化的RGB各图像来进行合成。例如可以如下进行叠加：使二值化RGB各图像的任意一者中成为了表示第二细胞区域的值（例如“1”）的像素在合成图像中成为表示第二细胞区域的值，使其他像素成为表示非细胞区域的值（例如“0”）。
除用于二值化的阈值外，第二细胞图像的具体图像处理均与第一细胞图像的图像处理相同。步骤S122R、122G和122B中第二细胞图像的二值化处理是用与像素亮度相关的一个第三阈值来进行的。如图6所示，第三阈值是利用暗视野影像中细胞影像变明亮的现象来提取明亮部分作为细胞区域的阈值。
在第二细胞图像的二值化处理中，RGB各图像中亮度高于第三阈值的区域成为表示第二细胞区域的值（例如“1”）。而亮度低于第三阈值的区域成为表示非细胞区域的值（例如“0”）。
可以通过构成第二细胞图像的RGB各图像中亮度的统计处理来确定第三阈值。例如，统计处理包括求出构成各图像的像素亮度的平均值μ1和标准偏差σ1 的处理。第三阈值比如可以采用μ1+2σ1。对RGB各图像分别独立进行统计处理，所以在RGB各图像中独立确定第三阈值的值。因此，第三阈值在RGB各图像中是恰当的。另外，与第一细胞图像用的第一阈值和第二阈值分开来，另行确定第三阈值，因此第三阈值是适合第二细胞图像用的阈值。
处理部件200在步骤S105进行图像合成处理224并将其作为第三处理。在图像合成处理224中，生成叠加步骤S114获得的图像中的第一细胞区域和步骤S124获得的图像中的第二细胞区域而得到的合成图像。步骤S105中生成的合成图像是表现叠加第一细胞区域和第二细胞区域所得到的合成细胞区域的图像。合成细胞区域由属于第一细胞区域和第二细胞区域的至少其中之一的区域构成。在合成图像中，合成细胞区域所包括的像素的值例如为“1”，合成细胞区域以外的区域所包括的像素的值例如为“0”。
处理部件200在步骤S106进行孔洞填充处理225。在孔洞填充处理225中，有时在一个合成细胞区域内会出现成为表示合成细胞区域以外的区域的值的部分。这种部分在图像处理中称为“孔洞”。孔洞填充处理225就是要除去孔洞。通过孔洞填充处理225，孔洞所对应的像素的值成为表示合成细胞区域的值。例如可以通过形态学处理来进行孔洞填充处理225。利用形态学处理，通过合成细胞区域的膨胀和收缩来填充合成细胞区域中的孔洞。
处理部件200在步骤S107提取所拍摄的细胞的特征量。基于步骤S106处理后的合成图像提取特征量。特征量例如是细胞的大小、周长、平均直径、最大直径和最小直径。处理部件200在步骤S108对所拍摄的细胞进行分析。分析包括基于细胞特征量的形态分析。分析也可以包括对细胞分化的评价。细胞分析还可以包括对合成图像中的细胞数目的计数，即对合成细胞区域数的计数。
图8显示了处理部件200依据图5所示第一细胞图像和图6所示第二细胞图像生成的合成图像8A。在图8中，图5所示第一细胞图像中的关注区域5A和图6所示第二细胞图像中的关注区域6A被放大显示。关注区域5A和关注区域6A是拍摄同一细胞所获得的区域。合成图像8A显示的是叠加关注区域5A中的第一细胞区域和关注区域6A中的第二细胞区域所得到的合成细胞区域。
在图8中，关于关注区域5A，用白线表示对第一细胞图像进行截止至步骤S114的处理所确定的第一细胞区域的轮廓。同样，关于关注区域6A，用白线表示对第二细胞图像进行截止至步骤S124的处理所确定的第二细胞区域的轮廓。此外，关于合成图像8A，用白线表示截止至步骤S105的图像合成作业所确定的合成细胞区域的轮廓。在图8中，将通过肉眼观察后人工确定的细胞轮廓的参考图像8B显示出来以供参考。
在第一细胞图像这一位相差影像中，从关注区域5A也可以看出，沿着细长细胞的纵长方向形成的轮廓形状易作为第一细胞区域出现，而细胞的横宽方向上易出现第一细胞区域断开的情况。因此，处理部件200将一个细胞识别为复数个断开的第一细胞区域的可能性较高。图9中的（a）显示了处理部件200计数依据第一细胞图像所确定的第一细胞区域的数目后得到的数目（自动识别数目）和肉眼观察第一细胞图像并计数细胞数目后得到的数目（肉眼观察识别数目）的关系。如图9中的（a）所示，第一细胞图像这一位相差影像存在自动识别数目比肉眼观察识别数目多的倾向。如此，根据位相差影像确定细胞区域，则有可能会将一个细胞识别为复数个断开的第一细胞区域，预估出的细胞数较实际多。
在第二细胞图像这一暗视野影像中，从关注区域6A也可以看出，细胞中心附近被识别为第二细胞区域，但在第二细胞区域容易失去细胞纵长方向的形状。因此，第二细胞区域容易失去细胞整体形状的信息。但第二细胞图像这一暗视野影像适于细胞数目的自动识别。图9中的（b）显示了处理部件200计数依据第二细胞图像所确定的第二细胞区域的数目所得到的数目（自动识别数目）和肉眼观察第二细胞图像并计数细胞数目后得到的数目（肉眼观察识别数目）的关系。如图9中的（b）所示，第二细胞图像这一暗视野影像的自动识别数目和肉眼观察识别数目相关性高，其适于用来掌握正确的细胞数目。
因此，在易保持细胞整体形状信息的第一细胞区域上叠加区域不易断开的第二细胞区域所得到的合成细胞区域中，如合成图像8A所示，第一细胞区域中区域断开处因第二细胞区域而得以连接。可以看出，合成图像8A中的细胞轮廓比关注区域5A、6A中的细胞轮廓更接近肉眼观察得到的参考图像8B中的轮廓，其更恰当地确定了细胞区域。
图10显示了与图5不同的位相差影像（第一细胞图像），图11显示了与图6不同的暗视野影像（第二细胞图像）。图10和图11是拍摄同一细胞所得到的。图12显示了由图10中关注区域10A和图11中的关注区域11A生成的合成图像12A和参考图像12B。
在图12中，关于关注区域10A，同样用白线表示对第一细胞图像进行截止至步骤S114的处理所确定的第一细胞区域的轮廓。同样，关于关注区域11A，用白线表示对第二细胞图像进行截止至步骤S124的处理所确定的第二细胞区域的轮廓。关于合成图像12A，同样用白线表示截止至步骤S105的图像合成作业所确定的合成细胞区域的轮廓。关于参考图像12B，用黑线表示通过肉眼观察人工确定的细胞轮廓。
可以看出，合成图像12A中的细胞轮廓比关注区域10A、11B中的细胞轮廓更接近肉眼观察所获得的参考图像12B中的轮廓，其更恰当地确定了细胞区域。
如此，基于不同的观察法——即位相差显微镜观察法和暗视野观察法拍摄出复数的细胞图像，并根据复数的细胞图像确定细胞区域时，与根据其中一种细胞图像确定细胞区域的做法相比，进一步用根据另一种细胞图像所确定的细胞区域进行完善，因此此时能够更恰当地确定细胞区域。此技术点不限于用位相差影像和暗视野影像作为复数的细胞图像这一种情形，其也适用于根据基于其他观察法的复数的细胞图像来确定细胞区域的情形。
在上述实施方式中，就复数的细胞图像分别求出细胞区域后，叠加复数个细胞区域，由此确定最终的细胞区域，但也可以依据合成复数的细胞图像所得到的单张合成图像确定细胞区域。此时，合成复数的细胞图像，使复数的细胞图像的细胞影像分别重叠出现。例如，如果将第一细胞图像的透明度参数设定为半透明的值，再将半透明的第一细胞图像重叠于第二细胞图上合成图像，则在合成图像上，第一细胞图像中的细胞影像和第二细胞图像中的细胞影像重叠出现。对这种合成图像进行二值化处理等就能确定细胞的区域。
编号说明
10 拍摄部件
20 处理装置
120 暗视野观察用光学系统
100 细胞拍摄系统
200 处理部件

Claims (9)

1.一种细胞区域确定方法，包括：
获取用相差显微镜观察法拍摄细胞所获得的细胞的位相差影像；
获取用暗视野观察法拍摄所述细胞所获得的细胞的暗视野影像；
根据所述细胞的位相差影像和所述细胞的暗视野影像确定所述细胞的区域；
确定所述细胞的区域的作业包括以下步骤：
根据所述细胞的位相差影像确定所述细胞的位相差影像中的细胞区域——即第一细胞区域，所述第一细胞区域包括细胞的轮廓区域；
根据所述细胞的暗视野影像确定所述细胞的暗视野影像中的细胞区域——即第二细胞区域，所述第二细胞区域包括细胞的中心附近区域；
生成所述第一细胞区域和所述第二细胞区域叠加而成的合成图像；
其中，确定所述第一细胞区域的作业包括：将所述位相差影像中亮度高于第一阈值的区域以及亮度低于比所述第一阈值小的第二阈值的区域分别确定为所述第一细胞区域；
确定所述第二细胞区域的作业包括：将所述暗视野影像中亮度高于第三阈值的区域确定为所述第二细胞区域。
2.根据权利要求1所述的细胞区域确定方法，其特征在于：
确定所述细胞的区域的作业还包括以下步骤：
根据区域的大小识别所述第一细胞区域中包括的第一噪声区域，并进行从所述第一细胞区域除去所述第一噪声区域的第一噪声除去处理，以及
根据区域的大小识别所述第二细胞区域中包括的第二噪声区域，并进行从所述第二细胞区域除去所述第二噪声区域的第二噪声除去处理；
其中，用于生成所述合成图像的所述第一细胞区域是除去所述第一噪声区域后的所述第一细胞区域，
用于生成所述合成图像的所述第二细胞区域是除去所述第二噪声区域后的所述第二细胞区域。
3.根据权利要求2所述的细胞区域确定方法，其特征在于：
所述细胞的位相差影像和所述细胞的暗视野影像是彩色图像；
对作为彩色图像的所述细胞的位相差影像的红色图像、绿色图像和蓝色图像分别进行所述第一噪声除去处理；
对作为彩色图像的所述细胞的暗视野影像的红色图像、绿色图像和蓝色图像分别进行所述第二噪声除去处理。
4.根据权利要求1所述的细胞区域确定方法，其特征在于：
确定所述细胞的区域的作业包括对所述细胞的区域中出现的孔洞进行孔洞填充处理。
5.根据权利要求1所述的细胞区域确定方法，其特征在于：
所述细胞是未染色细胞。
6.根据权利要求1所述的细胞区域确定方法，其特征在于：
所述细胞为移植用细胞。
7.一种细胞拍摄系统，包括：
拍摄部件，其用相差显微镜观察法拍摄细胞并生成细胞的位相差影像，用暗视野观察法拍摄所述细胞并生成细胞的暗视野影像，
处理部件，其进行图像处理；
其中，所述图像处理包括以下处理：
从所述拍摄部件获取所述细胞的位相差影像的处理，
从所述拍摄部件获取所述细胞的暗视野影像的处理，以及
根据所述细胞的位相差影像和所述细胞的暗视野影像确定所述细胞的区域的处理；
确定所述细胞的区域的处理包括以下步骤：
根据所述细胞的位相差影像确定所述细胞的位相差影像中的细胞区域——即第一细胞区域，所述第一细胞区域包括细胞的轮廓区域；
根据所述细胞的暗视野影像确定所述细胞的暗视野影像中的细胞区域——即第二细胞区域，所述第二细胞区域包括细胞的中心附近区域；
生成所述第一细胞区域和所述第二细胞区域叠加而成的合成图像；
其中，确定所述第一细胞区域的作业包括：将所述位相差影像中亮度高于第一阈值的区域以及亮度低于比所述第一阈值小的第二阈值的区域分别确定为所述第一细胞区域；
确定所述第二细胞区域的作业包括：将所述暗视野影像中亮度高于第三阈值的区域确定为所述第二细胞区域。
8.根据权利要求7所述的细胞拍摄系统，其特征在于所述拍摄部件还包括：
为获得暗视野影像而包括光照所述细胞的照射用光学系统和从所述细胞接受散射光的受光用光学系统的暗视野观察用光学系统，以及
放置所述细胞的培养容器的放置部件；
其中，所配置的所述照射用光学系统从所述放置部件中放置的所述培养容器的底面一侧照射光，
所配置的所述受光用光学系统在所述放置部件中放置的所述培养容器的底面一侧接受所述散射光。
9.一种处理装置，包括处理部件，所述处理部件实施包括下述处理在内的图像处理：
获取用相差显微镜观察法拍摄细胞所获得的细胞的位相差影像的处理；
获取用暗视野观察法拍摄所述细胞所获得的细胞的暗视野影像的处理；以及
根据所述细胞的位相差影像和所述细胞的暗视野影像确定所述细胞的区域的处理；
确定所述细胞的区域的处理包括以下步骤：
根据所述细胞的位相差影像确定所述细胞的位相差影像中的细胞区域——即第一细胞区域，所述第一细胞区域包括细胞的轮廓区域；
根据所述细胞的暗视野影像确定所述细胞的暗视野影像中的细胞区域——即第二细胞区域，所述第二细胞区域包括细胞的中心附近区域；
生成所述第一细胞区域和所述第二细胞区域叠加而成的合成图像；
其中，确定所述第一细胞区域的作业包括：将所述位相差影像中亮度高于第一阈值的区域以及亮度低于比所述第一阈值小的第二阈值的区域分别确定为所述第一细胞区域；
确定所述第二细胞区域的作业包括：将所述暗视野影像中亮度高于第三阈值的区域确定为所述第二细胞区域。
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