CN113686943A

CN113686943A - 一种多功能核酸染料及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113686943A
Application number: CN202110888441.XA
Authority: CN
Inventors: 郑慧敏; 钱近春; 谈雪良; 夏继波
Original assignee: Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113686943B

Abstract

本发明公开了一种多功能核酸染料及其制备方法与应用。本发明的核酸染料用于凝胶电泳成像时，凝胶体系为琼脂糖凝胶体系或者聚丙烯酰胺凝胶体系，核酸成像的成像系统为蓝光成像系统或者紫外成像系统，核酸成像的方法为胶染法、泡染法或者点染法。本发明首次公开了可用于紫外成像系统以及蓝光成像系统的染料，且具有好的生物安全性。

Description

一种多功能核酸染料及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种核酸凝胶电泳染料的制备和应用。

背景技术

琼脂糖（核酸）凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳现已普遍应用于分子生物学，为基因重组、分子杂交以及DNA序列研究等提供了强有力的手段。近十年来荧光染料作为核酸探针得到了广泛的应用，这些荧光核酸染料不仅可以应用在电泳核酸凝胶染色，也可以用来定量检测实时聚合酶链式反应（即qPCR）的DNA。

从化学结构上来说，这些核酸荧光染料主要可以分为吖啶、菲啶、菁类、荧光素和罗丹明类等。在琼脂糖（核酸）凝胶电泳过程中，最常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），其染色效果好，操作方便，但是稳定性差；同时，由于EB具有强诱变性、高致癌性，因此对人体具有非常大的毒害性。为了能够有效的降低EB的毒性等缺点以寻求EB的有效替代物，美国Molecular Probes,Inc.研发生产了相关的SYBR Green系列染料，但该SYBR系列染料不仅对其灵敏度有影响同时又有低毒性低致癌性等缺陷。后来美国拜奥蒂乌母股份有限公司（Biotium. Inc.）用一个小分子把两个EB发光基团（phenyl-phenanthridine）连接而成所制备的化合物进行检测，但结果显示该化合物对DNA的迁移率影响比较大，即相同条带位移会出现明显偏差而不能保证DNA迁移的真实水平，从而使实验结果出现较大偏差。

核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖，许多琼脂糖依据氢键及其它力的作用使其相互盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶，因此适合分离、纯化200bp-50kb长度的核酸片段，可区分相差100bp的DNA片段；聚丙烯酰胺凝胶是密集程度非常高的高聚物，具有分子筛效应、浓缩效应、电荷效应，因此对于小片段DNA（5bp-500bp）的分离效果最好。同时适用于两种电泳介质的染料非常的少。

目前常用的核酸电泳染料有EB、SYBR Green、SYBR Gold、GelRed和GelGreen等众多相关产品。由于不同核酸染料的激发波长存在差异，因此用于核酸电泳常见的凝胶成像仪分为两类波段，即紫外凝胶成像系统和蓝光凝胶成像仪（或蓝光切胶仪）。上述电泳染料中EB、SYBR Gold、GelRed均是用在紫外凝胶成像系统。紫外长时间照射对核酸（DNA）以及对实验人员都有一定的危害性，因而未来的核酸染料更趋向安全无毒的蓝光核酸染料。

现有的蓝光核酸染料，如美国Biotium公司生产的GelGreen染料安全无致癌性，但由于聚丙烯酰胺凝胶密是密集程度更高的三维空间的高聚物，在分离不同大小、不同浓度范围的核酸分子时，作为大分子的Gelgreen很难渗透进去，因而不能应用在聚丙烯酰胺凝胶电泳。另外，美国Biotium公司生产的GelGreen染料在应用于前染时不仅具有较强的背景颜色，同时容易产生严重的拖尾现象，对DNA的迁移率影响比较大，不能保证DNA迁移的真实水平，从而使实验结果出现偏差。并且这类蓝光染料在紫外激发的检测平台中普遍效果较差，对目前使用紫外激发系统的客户不友好。

因此一款蓝光紫外双激发，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均适用且能够适用于核酸电泳的胶染、泡染和点染的核酸染料有待开发。本发明解决了上述难题。

发明内容

本发明公开了核酸染料及其制备方法与应用；本发明的化合物同现有的产品相比较，不仅保持了特有的高度灵敏性，而且更加安全无毒，解决了前染中的拖尾现象，可以同时应用于琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的染色，适用于胶染、泡染、点染等实验需求，而且做到了蓝光紫外都可以激发。本发明的化合物在同样条件下获得的凝胶电泳测试结果显示，其作为核酸染料对核酸迁移率没有影响，可以保证电泳测试的准确性与灵敏度。

本发明采用如下技术方案：

一种多功能核酸染料，具有如下化学结构式：

其中，a为0～6，b为0～10；R为氢或者烷基，R`为氢或者烷基；优选的，所述烷基为碳原子数1～5的支链烷基或者碳原子数1～5的直链烷基，比如甲基、乙基、异丙基等。优选的，a为1～4，b为3～8。

作为常识，上述多功能核酸染料具有配位阴离子，比如卤素离子、磺酸根离子（OTs^-）等。本发明的创造性在于公开了新的阳离子结构，其作为染料既适用于琼脂糖凝胶体系，又适用于聚丙烯酰胺凝胶体系，解决了现有染料不能同时适用琼脂糖凝胶体系与聚丙烯酰胺凝胶体系的问题，也解决了现有染料不能同时适用紫外激发与蓝光激发的问题。

本发明公开了上述多功能核酸染料的制备方法，为以下制备方法中的一种：

（1）将4-甲基喹啉与单卤代乙二醇反应得到4-甲基喹啉基醇化合物；将4-甲基喹啉基醇化合物与阳离子2-(甲硫基)苯并噻唑反应，得到多功能核酸染料；

（2）将4-甲基喹啉与双卤代乙二醇反应得到4-甲基喹啉基端卤素化合物；将4-甲基喹啉基端卤素化合物与阳离子2-(甲硫基)苯并噻唑反应，得到卤代阳离子化合物；将卤代阳离子化合物与4-甲基喹啉反应，得到4-甲基喹啉基阳离子化合物；将4-甲基喹啉基阳离子化合物与2-(甲硫基)苯并噻唑阳离子化合物反应，得到多功能核酸染料。

本发明中，各化合物的结构式如下：

本发明中，X为卤素；优选的，单卤代乙二醇、双卤代乙二醇中，卤代为溴代。其中，a为0～6，b为0～10；R为氢或者烷基，R`为氢或者烷基；优选的，所述烷基为碳原子数1～5的支链烷基或者碳原子数1～5的直链烷基，比如甲基、乙基、异丙基等。优选的，a为1～4，b为3～8。

本发明中，4-甲基喹啉与单卤代乙二醇反应得到4-甲基喹啉基端卤素化合物时，反应温度为100～150℃，反应在溶剂中进行；4-甲基喹啉基醇化合物与阳离子2-(甲硫基)苯并噻唑反应得到多功能核酸染料时，反应在溶剂中、有机胺存在下进行；优选的，有机胺为小分子胺。

本发明中，4-甲基喹啉与双卤代乙二醇反应得到4-甲基喹啉基端卤素化合物时，反应温度为100～150℃，反应在溶剂中进行；4-甲基喹啉基端卤素化合物与阳离子2-(甲硫基)苯并噻唑反应得到卤代阳离子化合物时，反应在溶剂中、有机胺存在下进行；卤代阳离子化合物与4-甲基喹啉反应得到4-甲基喹啉基阳离子化合物时，反应温度为100～150℃，反应在溶剂中进行；4-甲基喹啉基阳离子化合物与2-(甲硫基)苯并噻唑阳离子化合物反应得到多功能核酸染料时，反应在溶剂中、有机胺存在下进行；优选的，有机胺为小分子胺。

本发明公开了一种核酸凝胶成像的方法，包括以下步骤，将上述多功能核酸染料与琼脂糖溶液混合后制备琼脂糖凝胶，然后置入电泳槽中进行上样，然后进行电泳，最后成像，完成核酸凝胶成像。

本发明公开了一种核酸凝胶成像的方法，包括以下步骤，上样至聚丙烯酰胺凝胶内，然后进行电泳，再将电泳后的凝胶浸入泡染液，最后成像，完成核酸凝胶成像；所述泡染液含有上述多功能核酸染料。

本发明公开了一种核酸凝胶成像的方法，包括以下步骤，将上述多功能核酸染料、上样缓冲液、核酸样品混合后，在琼脂糖凝胶上点样，然后进行电泳，最后成像，完成核酸凝胶成像。

本发明中，成像在紫外光成像系统下进行或者在蓝光成像系统下进行。紫外凝胶成像系统是目前市面上普及度较高的核酸凝胶成像设备，但紫外长时间照射对核酸以及实验人员都有一定的危害性，因而未来的发展趋势是使用安全的蓝光凝胶成像系统或蓝光切胶仪。本发明的染料是一款用于紫外与蓝光成像的核酸染料，适用于蓝光凝胶成像系统或蓝光切胶仪等设备，消除成像设备对核酸以及实验人员的危害性。

本发明公开的核酸凝胶成像方法中，琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺凝胶为现有技术，具体凝胶成像过程也是现有技术，本发明的创造性在于公开了上述核酸染料，既适用于琼脂糖凝胶体系，又适用于聚丙烯酰胺凝胶体系，同时确定了本发明在胶染、泡染、点染中的可行性以及染料浓度范围，解决了现有染料背景较强且易产生目的条带弥散拖尾分离不开、核酸迁移率受到影响的现象，而且做到了对人体及环境是安全无毒的。本发明公开了利用上述核酸染料进行不同核酸凝胶电泳测试的浓度：胶染法中，多功能核酸染料的加入浓度为0.5 μM-50 μM，优选为5 μM；泡染法中，多功能核酸染料的加入浓度为1 μM-100 μM，优选为15 μM；点染法中，多功能核酸染料的加入浓度为10 μM-1 mM，优选为100 μM。

与紫外相比，蓝光成像由于极大的避免了对实验材料及操作人员的毒害性，因此是核酸染料未来的发展趋势，本发明与市面常见核酸染料相比，不仅适用于蓝光凝胶成像系统或蓝光切胶仪，而且在紫外下也能观测到其染色效果；不仅可以用于琼脂糖，又可用于聚丙烯酰胺核酸凝胶染色；能满足胶染、泡染和点染的不同实验需求，不仅解决了现有染料灵敏度问题，同时又解决了染料高背景的影响；同时本发明更是对人体及环境是安全无毒害性的。

附图说明

图1为实施例一染料的质谱；

图2为实施例二染料的质谱；

图3为实施例三染料的质谱；

图4为本发明染料与现有染料细胞膜穿透实验结果；

图5为对照组染料与本发明染料核酸电泳对比（蓝光）；

图6为对照组染料与本发明染料核酸电泳对比（紫外）；

图7为本发明染料染色聚丙烯酰胺凝胶结果（蓝光）；

图8为本发明染料染色紫外激发的聚丙烯酰胺凝胶结果；

图9为本发明在点染中的应用结果。

具体实施方式

本发明采用本领域市售原料合成多功能染料，具体的合成方法与测试方法为常规技术，原料比例根据有机合成的常规原则选择。本发明得到的多功能染料细胞毒性低，既适用于琼脂糖凝胶体系，又适用于聚丙烯酰胺凝胶体系，同时本发明在胶染、泡染、点染中都具有好的可行性。本发明与市面常见核酸染料相比，不仅适用于蓝光凝胶成像系统或蓝光切胶仪，而且在紫外下也能观测到其染色效果；不仅可以用于琼脂糖，又可用于聚丙烯酰胺核酸凝胶染色；能满足胶染、泡染和点染的不同实验需求，不仅解决了现有染料灵敏度问题，同时又解决了染料高背景的影响；同时本发明更是对人体及环境是安全无毒害性的。

合成例

500 mL 反应瓶中加入25 g 2-(甲硫基)苯并噻唑，30.8 g 对甲苯磺酸甲酯，机械搅拌，加热至60℃，TLC跟踪至反应结束（展开剂为:乙腈:水=5：1）；反应结束后加入乙酸乙酯300 mL，升温至75℃回流3小时；然后降至室温，过滤，滤饼再用乙酸乙酯洗涤一次，过滤，滤饼真空干燥得到产品47 g 中间体I。

实施例一

在250 mL反应瓶中加入4 g 4-甲基喹啉、9 g溴代-三聚乙二醇、40 mL 邻二氯苯，加热至120℃，TLC跟踪至反应结束（展开剂为:乙腈：水=5：2）；反应结束后冷却至室温，加入乙酸乙酯，洗涤两次，倒出上清液，真空干燥得到9.5 g 中间体II。

250 mL 反应瓶中加入9.8 g 中间体I、9.5 g 中间体II，100 mL 二甲基甲酰胺DMF、8.2mL 三乙胺TEA，TLC跟踪至反应结束（展开剂为：乙腈∶水=10∶1）；反应结束后，真空泵抽干 DMF，用乙腈将其溶解，氧化铝过柱纯化，淋洗剂为乙腈∶水=95∶5，收集旋干，冻干得最终产品7.5 g，图1为其质谱，分子量为594.7。

实施例二

在250 mL反应瓶中加入4 g 4-甲基喹啉、9 g溴代-六聚乙二醇、40 mL 邻二氯苯，加热至120℃，TLC跟踪至反应结束（展开剂为: 乙腈∶水=10∶1）；反应结束后冷却至室温，加入乙酸乙酯，洗涤两次，倒出上清液，真空干燥得到9.2 g 中间体II。

250 mL 反应瓶中加入9.1 g 中间体I，9.2 g 中间体II，100 mL 二甲基甲酰胺DMF，7.5mL 三乙胺TEA，TLC跟踪至反应结束（展开剂为：乙腈∶水=10∶1）；反应结束后，真空泵抽干 DMF，用乙腈将其溶解，氧化铝过柱纯化，淋洗剂为乙腈∶水=94∶6，收集旋干，冻干得最终产品7.1 g，图2为其质谱，分子量为635.7。

实施例三

在250 mL反应瓶中加入3 g 4-甲基喹啉，85g溴代-五聚乙二醇-溴代，加热至110℃，TLC跟踪至反应结束（展开剂为:乙腈∶水=5∶2）；反应结束后冷却至室温，加入乙酸乙酯，洗涤两次，倒出上清液，真空干燥得到8 g 中间体II。

250 mL 反应瓶中加入6.2 g 中间体I，8 g 中间体II，100 mL 二甲基甲酰胺DMF，4.8 mL 三乙胺TEA，TLC跟踪至反应结束（展开剂为：乙腈∶水=10∶1）；反应结束后，真空泵抽干 DMF，用乙腈将其溶解，氧化铝过柱纯化，淋洗剂为乙腈∶水=95∶5，收集旋干，冻干得中间体III 6.1 g。

在250 mL反应瓶中加入6.1 g中间体III、1.1 g 4-甲基喹啉、60ml邻二氯苯，加热至120℃，TLC跟踪至反应结束（展开剂为:乙腈：水=5：2）；反应结束后冷却至室温，加入乙酸乙酯，洗涤两次，倒出上清液，真空干燥得到6.8 g 中间体Ⅳ。

250 mL 反应瓶中加入3.2 g 中间体I，6.8 g 中间体Ⅳ，80 mL 二甲基甲酰胺DMF，2.2 mL 三乙胺TEA，TLC跟踪至反应结束（展开剂为：乙腈：水=10：1）；反应结束后，真空泵抽干 DMF，用乙腈将其溶解，氧化铝过柱纯化，淋洗剂为乙腈：水=96：4，收集旋干，冻干得最终产品（固体多功能染料）5.4 g，图3为其质谱，分子量为1171.6。

实施例四

将实施例三的溴代-五聚乙二醇-溴代更换为溴代-八聚乙二醇-溴代，得到多功能染料如下：

常规质谱测试，其分子量为1303.6。

进一步的，更换磺酸根阴离子，可以得到不同阴离子配位的多功能染料，比如卤素离子配位。可以将最终产物根据常规方法进行阴离子置换，可以得到不同阴离子配位的染料，比如将上述产物在饱和氯化钠水溶液或者碘化钠水溶液中常规置换，常规搅拌后浓缩、过滤，得到的固体是阴离子为氯离子或者碘离子的染料。

实施例五

以实施例三的产物（多功能染料）、现有染料（SYBR Safe）为例，进行细胞渗透实验，以体现本发明染料的安全性佳。分别将不同染料与细胞进行孵育，30分钟后，荧光显微镜下观察，结果显示本发明的产品无法穿透细胞膜，所以无法显示荧光染色；作为对比试验，在同等实验条件下，SYBR Safe 能够迅速渗透细胞膜并能染色细胞中的DNA。结果见图4，实验条件：1）同Hela 细胞在37℃下常规孵育半个小时；2）使用FITC 滤波器。

进一步的，本发明实施例一、实施例二以及实施例四的产品经过同样的实验，也无法穿透细胞膜，无法显示荧光染色。

称取本发明的固体多功能染料（实施例三）2.5 g，加入水40 mL并加入磁子搅拌，使染料完全溶解，得到染料溶液，用于以下凝胶电泳实验。

实施例六胶染法

1、称取0.5 g琼脂糖粉末至锥形瓶中；向锥形瓶中加入50 mL的1xTAE；在微波炉中加热，使其反复煮沸三次，使其充分溶解且最终溶液体积为50 mL；

2、用量桶分别量取两份25 mL的琼脂糖溶液，分别倒入两个锥形瓶中，其中一个锥形瓶中加入2.5 μL对照染料GelGreen，另一个锥形瓶中加入2.5 μL本发明染料溶液，晃动锥形瓶，使染料与琼脂糖溶液混匀，分别倒入已准备好的凝胶装置中；凝胶1h左右，使胶凝好；

3、将凝好的琼脂糖胶放入加满电泳液（1xTAE）的电泳槽中，每块胶中从左到右依次上样为UE 100 bp marker 5 μL；UE 2000bp marker 5 μL；UE 5000bp marker 5 μL；UE1kb marker 5 μL；UE 1.5kb marker 5 μL；Takara 1kb marker 5μL；都是常规核酸样品；

4、打开电泳槽开关，设置电压为160V，时间为30min，开始跑电泳；

5、电泳完成后，取出琼脂糖，放在蓝光凝胶成像系统和蓝光切胶仪上，拍照，保存图片至相应的文件夹下，结果如图5；将上述拍照设备换成紫外成像仪，结果如图6。其中，1.UE 100 bp marker 5 μL；2. UE 2000bp marker 5 μL；3.UE 5000bp marker 5 μL；4. UE1kb marker 5 μL；5. UE 1.5kb marker 5 μL；6.Takara 1kb marker 5μL。

本发明可用于琼脂糖凝胶，紫外和蓝光下检测；与对照组相比，本发明背景颜色较浅，条带清晰，不会出现弥散拖尾的现象。

实施例七泡染法

1、凝胶装置制胶板组装好后加水静置20 min左右，检查装置的密封性，密封性较好则倒干净水准备配置5%的非变性PAGE胶2块；在50 mL的试管中，依次加入H₂O 9.4 mL、30% Acrylamid 2.5 mL、5xTBE 3.0 mL最后加入10% AP 0.11 mL以及TEMED 0.010 mL并混匀（H₂O、30% Acrylamid、5xTBE提前配置好，10% AP以及TEMED灌胶前再加入）；加入混合好的非变性胶，使制胶板中完全充满液体，插入梳子（梳子平滑的一面靠近里面厚的制胶板一侧）；室温凝固1h左右，使胶完全凝固；

2、上样分别为UE 100 bp marker1μL和5 μL、UE 2000bp marker1μL和5 μL、DS50bp marker 1μL和5 μL、Takara 100bp marker 1μL和5 μL、Takara 2000bp marker 1μL和5 μL；

3、电泳缓冲液为1xTBE，设置电压为100V，电泳时间为60 min，开始电泳；

4、泡染液配制：取本发明染料溶液30 μL加入100 mL水中制成泡染液；

5、电泳完成后凝胶泡染30 min染色，染色完成后，放在蓝光凝胶成像仪和蓝光切胶仪上，拍照，保存图片至相应的文件夹下。结果如图7，其中，1. UE 100 bp marker 1 μL；2. UE 100 bp marker 5 μL； 3.UE 2000bp marker 1μL；4.UE 2000bp marker 5μL；5.UE5000bp marker 1 μL；6.UE 5000bp marker 5 μL；7. UE 1kb marker 1 μL；8. UE 1kbmarker 5 μL；9. UE 1.5kb marker 1 μL；10. UE 1.5kb marker 5 μL。本发明能够染色聚丙烯酰胺凝胶，在蓝光下可清晰观测条带。

将上述拍照设备换成紫外成像仪，结果如图8，其中1. UE 100 bp marker 1 μL；2. UE 100 bp marker 5 μL；3.UE 2000bp marker 1μL；4.UE 2000bp marker 5μL；5.UE5000bp marker 1 μL；6.UE 5000bp marker 5 μL；7. UE 1kb marker 1 μL；8. UE 1kbmarker 5 μL；9. UE 1.5kb marker 1 μL；10. UE 1.5kb marker 5 μL。本发明在紫外波段，也可呈现较好的实验结果，故本发明可用于紫外激发设备的图像采集。

将本发明的染料更换为现有gelgreen 染料，经过上述同样的聚丙烯酰胺凝胶电泳测试，无论蓝光还是紫外，无法观测条带，成像效果非常差，无法观察。作为对比例，CN2020101779511公开的编号1的染料，经过上述同样的聚丙烯酰胺凝胶电泳测试，无法在紫外成像仪成像。

实施例八点染法

1、1mL UE 6×Loading Buffer中加入上述本发明染料溶液12 μL，配制成6×DyePrestain Loading Buffer；再加入50 mL的1xTAE；在微波炉中加热，使其反复煮沸三次，使其充分溶解且最终溶液体积为50 mL；简单涡旋并离心 6×Dye Prestain LoadingBuffer，将其与DNA样品按1:5 比例混合；

2、配置琼脂糖凝胶，在凝胶配置中，无需添加任何染料；

3、按点胶标准程序加样，进行 DNA 凝胶电泳实验。在蓝光和紫外成像系统下观察电泳条带，结果如图9，其中1. Takara 2000 bp marker 1 μL；2. Takara 2000 bp marker3 μL；3.Takara 2000 bp marker 5 μL；4. Takara 1.5kb marker 1 μL；5. Takara 1.5kbmarker 3 μL；6. Takara 1.5kb marker 5μL。本发明可用于制备成预混到Loading buffer的即用型6×Dye Prestain Loading Buffer，蓝光、紫外激发均可。

上述点染法中，染料浓度放大10倍，同样的步骤，在蓝光和紫外成像系统下观察电泳条带，结果与图9近似，一样清楚，说明本发明的多功能染料应用于成像误差小。

以上实施例六至实施例八以实施例三制备的多功能染料为例，体现了本发明是一款普遍使用的核酸凝胶电泳染料，具体总结如下：

本发明与现有蓝光激发安全染料GelGreen相比，染色背景清晰，条带不拖尾；本发明不仅可以应用于琼脂糖凝胶电泳，也同时适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳；本发明蓝光可以激发，紫外同样可以激发；本发明不仅可以用于常规的胶染法和泡染法，还可以用于点染法。

以实施例一、实施例二、实施例四的染料替换实施例三的染料进行同样的凝胶成像实验，发现一样可以应用于琼脂糖凝胶电泳，也同时适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，蓝光可以激发，紫外同样可以激发，也能用于胶染法、泡染法与点染法，条带不拖尾。相对而言，实施例三的染料成像效果最好，条带亮度最亮。

本发明用于核酸电泳常见的凝胶成像染色，具体为一种可同时适用于琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳染色的新型蓝光、紫外双激发核酸染料，同时适用于胶染、泡染和点染，涉及染料的制备及其应用。本发明公开的一种新型化合物作为多功能核酸染料，其分子结构稳定，制备方法简易可控，作为核酸染料应用时，具有高的灵敏度，对DNA的迁移率没有影响，从而能保证DNA迁移的真实水平，可以体现真实实验结果；用于凝胶测试时避免了现有荧光染料在浓度大的水溶液中会形成二聚体从而导致明显的荧光猝灭问题，而且本发明化合物由于携带电荷多、分子量大从而不会透过细胞膜进入人体产生伤害即无毒。因此本发明的化合物是一种高度灵敏性、安全无毒的核酸染料。

Claims

1.一种多功能核酸染料，其特征在于，具有如下化学结构式：

其中，a为0～6，b为0～10；R为氢或者烷基，R`为氢或者烷基。

2.根据权利要求1所述的多功能核酸染料，其特征在于，所述烷基为碳原子数1～5的支链烷基或者碳原子数1～5的直链烷基；a为1～4，b为3～8。

3.权利要求1所述多功能核酸染料在核酸成像中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸成像的凝胶体系为琼脂糖凝胶体系或者聚丙烯酰胺凝胶体系；所述核酸成像的成像系统为蓝光成像系统或者紫外成像系统；所述核酸成像的方法为胶染法、泡染法或者点染法。

5.权利要求1所述多功能核酸染料的制备方法，其特征在于，为以下制备方法中的一种：

6.根据权利要求5所述多功能核酸染料的制备方法，其特征在于，各化合物的结构式如下：

。

7.根据权利要求5所述多功能核酸染料的制备方法，其特征在于，4-甲基喹啉与单卤代乙二醇反应得到4-甲基喹啉基端卤素化合物时，反应温度为100～150℃，反应在溶剂中进行；4-甲基喹啉基醇化合物与阳离子2-(甲硫基)苯并噻唑反应得到多功能核酸染料时，反应在溶剂中、有机胺存在下进行；4-甲基喹啉与双卤代乙二醇反应得到4-甲基喹啉基端卤素化合物时，反应温度为100～150℃，反应在溶剂中进行；4-甲基喹啉基端卤素化合物与阳离子2-(甲硫基)苯并噻唑反应得到卤代阳离子化合物时，反应在溶剂中、有机胺存在下进行；卤代阳离子化合物与4-甲基喹啉反应得到4-甲基喹啉基阳离子化合物时，反应温度为100～150℃，反应在溶剂中进行；4-甲基喹啉基阳离子化合物与2-(甲硫基)苯并噻唑阳离子化合物反应得到多功能核酸染料时，反应在溶剂中、有机胺存在下进行。

8.一种核酸凝胶成像的方法，其特征在于，为以下方法中的一种或者几种：

（1）将权利要求1所述多功能核酸染料与琼脂糖溶液混合后制备琼脂糖凝胶，然后置入电泳槽中进行上样，然后进行电泳，最后成像，完成核酸凝胶成像；

（2）上样至聚丙烯酰胺凝胶内，然后进行电泳，再将电泳后的凝胶浸入泡染液，最后成像，完成核酸凝胶成像；所述泡染液含有权利要求1所述多功能核酸染料；

（3）将权利要求1所述多功能核酸染料、上样缓冲液、核酸样品混合后，在琼脂糖凝胶上点样，然后进行电泳，最后成像，完成核酸凝胶成像。

9.根据权利要求8所述核酸凝胶成像的方法，其特征在于，方法（1）中，多功能核酸染料的浓度为0.5 μM～50 μM；方法（2）中，多功能核酸染料的浓度为1 μM～100 μM；方法（3）中，多功能核酸染料的浓度为10 μM～1 mM。

10.根据权利要求8所述核酸凝胶成像的方法，其特征在于，成像的成像系统为蓝光成像系统或者紫外成像系统。