CN114634488A - 琥珀酰亚胺酯及其制备、处理和检测方法 - Google Patents

琥珀酰亚胺酯及其制备、处理和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种琥珀酰亚胺酯及其制备、处理和检测方法。所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法包括以下步骤：在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，得到琥珀酰亚胺酯。本发明的制备方法可以抑制杂质的产生，提升了产品的纯度和产率，降低后处理纯化的难度；产品的后处理过程中能够保持稳定，从而提高了反应收率；本发明的检测方法中，采用了衍生的方法，将检测样品转化成一种较为稳定的酰胺类或酯类化合物，确保了检测的稳定性和精确性。

Description

琥珀酰亚胺酯及其制备、处理和检测方法
技术领域
本发明涉及琥珀酰亚胺酯及其制备、处理和检测方法。
背景技术
琥珀酰亚胺活性酯常用于荧光免疫、荧光探针、细胞染色等。包括特异性的DNA染色，用于染色体分析、细胞周期、细胞凋亡等相关研究。另有很多核酸染料在多色染色系统中是非常有用的复染剂，可作为背景对照，标记细胞核使细胞内结构的空间关系一目了然。
在免疫分析中荧光标记的单克隆抗体技术为流式细胞仪在研究细胞膜和细胞内各种功能性抗原、肿瘤基因蛋白等领域扩展了无限的应用空间。荧光探针可以通过蛋白质交联剂共价结合在单克隆抗体上。
在核酸检测中荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量，并可以对细胞周期和细胞的增殖状况进行分析。有多种荧光染料可以对细胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。
目前市面上的荧光染料价格比较高，其相关的活性酯因产率低、纯化困难且不稳定，导致染料活性酯生产成本更加高昂，这也推高了基因测序技术及荧光染料生物标记的成本，同时限制了它的推广应用。所以优化工艺，降低生物染料活性酯的生产成本是其技术发展的必然方向。另外常规的检测的手段，对活性较高的琥珀酰亚胺活性酯难以检查或者检测结果偏差较大。
降低成本的重要方向之一就是降低琥珀酰亚胺活性酯的合成成本。
传统技术方案：
合成方法：在常温(25℃)左右，DMF溶剂中，采用TSTU(或DSC)作为缩合剂，在三乙胺的作用下，合成活化酯。
后处理：将反应液体，加入到10倍容积量的乙酸乙酯中，析出固体，过滤，真空干燥得到产品。
检测方法：常规检测方法，将反应液或固体产品，用乙腈稀释后，直接送HPLC或LCMS检测。
Cy5-linker-NHS的合成路线如下：
Figure BDA0002836808220000021
现有琥珀酰亚胺活性酯的方案缺点显著，主要表现在以下几个方面：
1.反应液纯度较低约60％～80％，杂质含量较高，后处理难度大，收率低，成本高；
2.原料转化不完全；
3.后处理过程中，产品不稳定，产品降解，导致收率进一步降低；
4.产品检测过程中，检测结果含量偏低，或者检测不到产品；
5.产品的不稳定，由现有方法得到的产品中含有较多的杂质，并含有三乙胺等碱性物质，导致产品极易降解。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是琥珀酰亚胺酯的制备方法收率和纯度较低、检测方法不准确等问题。为了解决这个技术问题，本发明提供了琥珀酰亚胺酯及其制备、处理和检测方法。本发明的制备方法可以抑制杂质的产生，提升了产品的纯度和产率，降低后处理纯化的难度；产品的后处理过程中能够保持稳定，从而提高了反应收率；本发明的检测方法中，采用了衍生的方法，将检测样品，转化成一种较为稳定的酰胺类或酯类化合物，确保了检测的稳定性和精确性。
本发明提供了一种琥珀酰亚胺酯的制备方法，其包括以下步骤：在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，得到琥珀酰亚胺酯；其中，所述的化合物A的结构式为：
Figure BDA0002836808220000031
Figure BDA0002836808220000041
其中，R11和R12独立地为-O-、-S-或-N-；
R21、R22、R23和R24独立地为-SO3H、-OH、-NH2、-F、-Cl或-Br；
R31、R32、R33、R34、R35、R36、R37和R38独立地为-H、-F、-Cl或-Br。
并且，所述的缩合反应在以下条件中的至少一个下进行：
条件1：所述的缩合反应在氮气或惰性气体保护下进行；
条件2：所述的缩合反应的反应温度为0～-50℃(不包括0℃)；
条件3：所述的TSTU分至少2次加入反应体系。
在一些实施方案中，所述的化合物A为
Figure BDA0002836808220000042
Figure BDA0002836808220000051
Figure BDA0002836808220000061
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法，其包括以下步骤：在氮气或惰性气体保护下，在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，得到琥珀酰亚胺酯。
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法，其包括以下步骤：在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，反应温度为0～-50℃(不包括0℃)，得到琥珀酰亚胺酯。
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法，其包括以下步骤：在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，得到琥珀酰亚胺酯，其中，所述的TSTU分至少2次加入反应体系。
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法，其包括以下步骤：在氮气或惰性气体保护下，在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，反应温度为0～-50℃(不包括0℃)，得到琥珀酰亚胺酯。
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法，其包括以下步骤：在氮气或惰性气体保护下，在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，得到琥珀酰亚胺酯，其中，所述的TSTU分至少2次加入反应体系。
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法，其包括以下步骤：在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，反应温度为0～-50℃(不包括0℃)，得到琥珀酰亚胺酯，其中，所述的TSTU分至少2次加入反应体系。
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法，其包括以下步骤：在氮气或惰性气体保护下，在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，反应温度为0～-50℃(不包括0℃)，得到琥珀酰亚胺酯，其中，所述的TSTU分至少2次加入反应体系。
在一些实施方案中，所述的三乙胺的用量可为本领域该类反应的常规用量。例如，所述的化合物A与三乙胺的摩尔比为1:5-20；又例如，所述的化合物A与三乙胺的摩尔比为为1:5-15，又例如，所述的化合物A与三乙胺的摩尔比为1:10。
在一些实施方案中，所述的溶剂可为本领域该类反应的常规溶剂。例如，所述的溶剂可为酰胺类溶剂，如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等。
在一些实施方案中，所述的溶剂的用量可为本领域该类反应的常规用量。例如，所述的化合物A和溶剂的用量比为0.05-0.20mol：1L；又例如，所述的化合物A和溶剂的用量比为0.10-0.16mol：1L；又例如，所述的化合物A和溶剂的用量比为0.16mol：1L、0.15mol：1L、0.14mol：1L、0.13mol：1L或0.12mol：1L。
在一些实施方案中，所述的TSTU的用量可为本领域该类反应的常规用量。例如，所述的化合物A与TSTU的摩尔比为1:1-5；又例如，所述的化合物A与TSTU的摩尔比为1:2-4；又例如，所述的化合物A与TSTU的摩尔比为1:3。
在一些实施方案中，所述的缩合反应的反应温度为0～-30℃(不包括0℃)进行；例如，所述的反应在0～-20℃(不包括0℃)进行；又例如，所述的缩合反应在-10℃进行。
在一些实施方案中，所述的反应时间可为本领域该类反应的常规时间。例如，所述的反应时间为0.1-10h；又例如，所述的反应时间为0.1-5h；又例如，所述的反应时间为1h。
在一些实施方案中，所述的TSTU分至少2次加入反应体系，例如，分2-10次加入反应体系，又例如，分2-5次加入反应体系，又例如，分2次、分3次、4次或5次加入反应体系。
在一些实施方案中，每次加入TSTU之间间隔一段时间(例如1-10分钟，又例如5分钟)。
在一些实施方案中，所述的缩合反应的具体步骤包括：将TSTU加入到温度为-70～-10℃以下(例如-70～-50℃以下，或-20～-10℃以下)的含有化合物A和三乙胺的溶液中进行反应。
在一些实施方案中，所述的TSTU在氮气或惰性气体保护下加入反应体系。
在一些实施方案中，所述的缩合反应的具体步骤包括：在氮气或惰性气体保护下，将TSTU分5次加入到温度为-20～-10℃以下的含有化合物A和TEA的溶液中进行反应；其中，TSTU、化合物A和TEA的摩尔比为3:1:10，所述的化合物A为化合物AF532。
在一些实施方案中，所述的缩合反应的具体步骤包括：在氮气或惰性气体保护下，将TSTU分3次加入到温度为-70～-50℃以下的含有化合物A和TEA的溶液中进行反应；其中，TSTU、化合物A和TEA的摩尔比为3:1:10，所述的化合物A为化合物AF532-linker。
在一些实施方案中，所述的缩合反应的具体步骤包括：在氮气或惰性气体保护下，将TSTU分5次加入到温度为-20～-10℃以下的含有化合物A和TEA的溶液中进行反应；其中，TSTU、化合物A和TEA的摩尔比为3:1:10，所述的化合物A为化合物ROX C4。
在一些实施方案中，所述的缩合反应的具体步骤包括：在氮气或惰性气体保护下，将TSTU分5次加入到温度为-70～-50℃以下的含有化合物A和TEA的溶液中进行反应；其中，TSTU、化合物A和TEA的摩尔比为3:1:10，所述的化合物A为化合物ROX C4-linker。
在一些实施方案中，所述的缩合反应的具体步骤包括：在氮气或惰性气体保护下，将TSTU分5次加入到温度为-20～-10℃以下的含有化合物A和TEA的溶液中进行反应；其中，TSTU、化合物A和TEA的摩尔比为3:1:10，所述的化合物A为化合物Cy5。
在一些实施方案中，所述的缩合反应的具体步骤包括：在氮气保护下，将TSTU分5次加入到温度为-70～-50℃以下的含有化合物A和TEA的溶液中进行反应；其中，TSTU、化合物A和TEA的摩尔比为3:1:10，所述的化合物A为化合物Cy5-linker。
在一些实施方案中，所述的含有化合物A和三乙胺的溶液通过将化合物A和TEA溶于所述溶剂(例如DMF)中得到。
在一些实施方案中，所述的缩合反应的原料仅为三乙胺、溶剂、化合物A和TSTU。
在一些实施方案中，所述的制备方法还包括后处理。
在一些实施方案中，所述的后处理包括：将反应液的pH值调节为5-7.5，例如，将反应液的pH值调节为6-7。
在一些实施方案中，所述的后处理包括：将反应液与含有pH值调节剂(可为酸，如乙酸等)的二氯甲烷溶液混合，使得pH值为5-7.5。
在一些实施方案中，所述的后处理还包括：将反应液与含有pH值调节剂(可为酸，如乙酸等)的二氯甲烷溶液的混合物与石油醚混合。
在一些实施方案中，所述的后处理包括：将反应液加入(例如滴加)到含有pH值调节剂(可为酸，如乙酸等)的二氯甲烷中，使得pH值为5-7.5，再加入石油醚，有固体析出，过滤。
在一些实施方案中，所述的溶剂(例如DMF)和二氯甲烷的体积比为1:10-20，例如为1:15。
在一些实施方案中，所述的二氯甲烷和石油醚的体积比为1-5:1，例如为2-4:1，又例如为3:1。
在一些实施方案中，所述的pH值调节剂和二氯甲烷的体积比为1：100-200，例如1:150。
在一些实施方案中，所述的后处理包括：将反应液滴加至含有乙酸的二氯己烷溶液中，所得溶液pH值为6-7，再加入石油醚，静置，过滤，滤饼在30℃、1mbar下抽真空；其中，乙酸、二氯甲烷和石油醚的体积比为1：150：50。
本发明还提供了一种含有琥珀酰亚胺酯的溶液的处理方法，其包括：将含有琥珀酰亚胺酯的溶液的pH值调节为5-7.5；其中，所述的琥珀酰亚胺酯为：
Figure BDA0002836808220000101
Figure BDA0002836808220000111
其中，R11和R12独立地为-O-、-S-或-N-；
R21、R22、R23和R24独立地为-SO3H、-OH、-NH2、-F、-Cl或-Br；
R31、R32、R33、R34、R35、R36、R37和R38独立地为-H、-F、-Cl或-Br。
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯为
Figure BDA0002836808220000121
Figure BDA0002836808220000131
在一些实施方案中，所述的pH值调节为6-7。
在一些实施方案中，所述的处理方法的具体步骤包括：将含有琥珀酰亚胺酯溶液与含有pH值调节剂的溶液混合，所得混合物B的pH值为5-7.5。
在一些实施方案中，所述的含有琥珀酰亚胺酯溶液的溶剂为酰胺类溶剂，例如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺等。
在一些实施方案中，所述的含有琥珀酰亚胺酯溶液中琥珀酰亚胺酯的浓度为0.1-0.2mol/L。
在一些实施方案中，所述的含有pH值调节剂的溶液的溶剂为氯代烷类溶剂，例如二氯甲烷或二氯乙烷等。
在一些实施方案中，所述的pH值调节剂为酸，例如乙酸等。
在一些实施方案中，所述的含有pH值调节剂的溶液中，所述pH值调节剂与含有pH值调节剂的溶液的溶剂的体积比为1:100-200，例如1:150。
在一些实施方案中，所述的含有琥珀酰亚胺酯溶液的溶剂与含有pH值调节剂的溶液的溶剂的体积比为1:10-20，例如1:15。
在一些实施方案中，所述的处理方法的具体步骤还包括：将所得混合物B与溶剂C(例如醚类溶剂，例如石油醚等)混合。
在一些实施方案中，所述的含有pH值调节剂的溶液的溶剂与溶剂C的体积比为2-4:1，例如3:1。
在一些实施方案中，所述的处理方法的具体步骤还包括：将所述混合物B与溶剂C的混合物静置、过滤，抽真空。
在一些实施方案中，所述的抽真空是在20-40℃、0.5-1.5mbar下进行。
在一些实施方案中，所述的静置时间为1-3小时。
在一些实施方案中，所述的含有琥珀酰亚胺酯的DMF溶液为制备琥珀酰亚胺酯的反应液。所述的制备琥珀酰亚胺酯的反应液可由上述制备方法制得。
在一些实施方案中，所述的处理方法的具体步骤包括：将含有琥珀酰亚胺酯溶液滴加至含有乙酸的二氯甲烷溶液中，所得溶液的pH值为6-7；其中，所述琥珀酰亚胺酯溶液的溶剂为DMF，DMF、乙酸和二氯甲烷的体积比可为10：1：150。
在一些实施方案中，所述的处理方法的具体步骤还包括：在所得溶液中再加入石油醚，其中，二氯甲烷和石油醚的体积比可为3:1。
在一些实施方案中，所述的处理方法的具体步骤包括：将含有琥珀酰亚胺酯溶液滴加至含有乙酸的二氯甲烷溶液中，所得溶液的pH值为6-7，再加入石油醚，静置(例如2小时)，过滤，滤饼抽真空(例如在30℃、1mbar下)；其中，所述含有琥珀酰亚胺酯溶液的溶剂可为DMF，DMF、乙酸、二氯甲烷和石油醚的体积比可为10：1：150：50，所述含有琥珀酰亚胺酯溶液中琥珀酰亚胺酯的浓度例如为0.15mol/L、0.13mol/L、0.12mol/L、0.11mol/L和0.14mol/L。
本发明还提供了一种琥珀酰亚胺酯的检测方法，其包括以下步骤：对含有琥珀酰亚胺酯、试剂D和溶剂E的混合物进行检测；其中所述的试剂D为伯胺或伯醇，所述的伯胺为甲胺、乙胺或单Boc乙二胺，所述的伯醇为甲醇或乙醇；
所述的琥珀酰亚胺酯为：
Figure BDA0002836808220000151
Figure BDA0002836808220000161
其中，R11和R12独立地为-O-、-S-或-N-；
R21、R22、R23和R24独立地为-SO3H、-OH、-NH2、-F、-Cl或-Br；
R31、R32、R33、R34、R35、R36、R37和R38独立地为-H、-F、-Cl或-Br。
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯为：
Figure BDA0002836808220000171
Figure BDA0002836808220000181
在一些实施方案中，所述的溶剂E为腈类溶剂，例如为乙腈。
在一些实施方案中，所述的试剂D和溶剂E的体积比为1:10-99，例如1:20-99，又例如1：99或1:20。
在一些实施方案中，所述的检测方法为液相色谱法或液相色谱质谱联用法。
在一些实施方案中，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法的色谱条件包括：色谱柱为C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸水溶液，流动相A和流动相B的体积比为5-95：95-5。
在一些实施方案中，所述的琥珀酰亚胺酯与试剂D和溶剂E的混合物的比例为1mg：1-3mL，例如1mg：2mL。
在一些实施方案中，所述的C18色谱柱为Agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱。
在一些实施方案中，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法的色谱条件还包括：柱温为25-35℃，例如30℃。
在一些实施方案中，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法的色谱条件还包括：流速为0.2-0.5mL/min，例如为0.3-0.4mL/min，例如0.4mL/min。
在一些实施方案中，所述的三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.001％-0.02％，例如为0.005％-0.015％，例如0.01％。
在一些实施方式中，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，在0-14min，流动相A的体积百分比从5％逐渐增加到95％，流动相B的体积百分比从95％逐渐下降到5％。
在一些实施方式中，当所述的琥珀酰亚胺酯为AF532-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
洗脱时间/min A(vol％) B(vol％)
0 5 95
1 5 95
1.5 20 80
6 50 50
8.5 95 5
。
在一些实施方式中，当所述的琥珀酰亚胺酯为AF532-linker-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
Figure BDA0002836808220000191
Figure BDA0002836808220000201
在一些实施方式中，当所述的琥珀酰亚胺酯为ROX C4-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
洗脱时间/min A(vol％) B(vol％)
1 5 95
2 30 70
7.8 40 60
在一些实施方式中，当所述的琥珀酰亚胺酯为ROX C4-linker-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
洗脱时间/min A(vol％) B(vol％)
0 5 95
1 5 95
2 25 75
8 80 20
8.5 95 5
10.5 95 5
11 5 95
14 5 95
。
在一些实施方式中，当所述的琥珀酰亚胺酯为Cy5-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
Figure BDA0002836808220000202
Figure BDA0002836808220000211
在一些实施方式中，当所述的琥珀酰亚胺酯为Cy5-linker-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
洗脱时间/min A(vol％) B(vol％)
0 5 95
2 5 95
3 30 70
9 30 70
10 95 5
11.5 95 5
。
本发明提供了一种含有苯环的化合物，其结构为：
Figure BDA0002836808220000212
Figure BDA0002836808220000221
Figure BDA0002836808220000231
其中，所述的R4和R5独立地为CH3O-、CH3CH2O-、CH3NH-、CH3CH2NH-、或Boc-NH-CH2CH2-NH-。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1)本发明针对传统方法反应粗品的纯度不高，后处理难度大的缺点，采用降低反应温度，控制反应速率，抑制杂质的产生，从而提高反应粗品的纯度，进一步提升反应收率，降低生产成本。
2)本发明通过反应温度及水分的控制，抑制了杂质的产生，从而达到提升了反应液的纯度，降低了后处理纯化的难度。
3)本发明研究了琥珀酰亚胺活性酯在不同pH下的稳定性，确定了琥珀酰亚胺活性酯的后处理方案；在后处理中加入适量的弱酸，调节pH至5～7.5，有效解决了产品在后处理过程中的不稳定性，从而提升了反应收率，降低了生产成本；同时保证了琥珀酰亚胺活性酯的稳定性。
4)本发明通过衍生的方法(如添加单Boc乙二胺、甲醇等伯胺或醇)，将琥珀酰亚胺活性酯先转化成稳定的酰胺类或酯类化合物，再进行检测，解决了琥珀酰亚胺活性酯在LCMS及HPLC检测过程中不稳定，导致无法准确检测的问题，确保了检测的稳定性，精确性。
5)本发明可以得到稳定的高纯度活性酯，可以有效的推广到各种脂肪酸和芳香酸的活性酯合成。
6)本发明中合成的琥珀酰亚胺活性酯(花青染料活性酯及其衍生物、罗丹明染料活性酯及其衍生物)是各种荧光标记的关键试剂，广泛应用于基因测序技术与荧光免疫、荧光探针、细胞染色、蛋白质等荧光标记中。
7)本发明采用在低温、严格隔离水的条件下合成琥珀酰亚胺活性酯，得到的反应液纯度高约为92％～97％，后处理纯化简单，能快速得到纯度大于95％的合格产品，且收率90％以上。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明采用的各缩写含义为：TEA代表三乙胺，DMF是指二甲基甲酰胺，TSTU是指2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯，TFA是指三氟乙酸，PE是指石油醚，BOC是指叔丁氧羰基。
以下实施例中所用的乙酸的浓度为均为纯度99％的乙酸，未添加任何稀释溶剂。
实施例1
Figure BDA0002836808220000241
AF532-NHS的合成：
在50mL三口瓶中加入化合物AF532(1000mg，1.60mmol，1eq)，TEA(1618mg，16.02mmol，10eq)，使用DMF(10mL)溶解后，氮气置换三次，用冰盐浴将反应体系降温至-20～-10℃以下，分五次以上加入TSTU(1442mg，4.79mmol，3eq)，每次加入约300mg，每次间隔5分钟。在氮气保护下，在-10℃以下保温进行缩合反应1h。
后处理：
将反应液滴加至150mL的干燥二氯甲烷中(150mL二氯甲烷中加入1mL乙酸)，所得溶液pH值为6-7，有少量固体析出，再加入50mL干燥的PE，静置2h，有大量粉状固体析出，过滤，滤饼在30℃、1mbar下抽真空至恒重，得约深红色固体1.1g(1100mg，收率93％)。
检测方法：
空白溶液(稀释剂)：乙腈
样品溶液：称取约1mg样品，加入2mL所述稀释剂溶解，得到0.5mg/mL的待测溶液，并用0.22μm孔径的滤膜过滤，即得。
进行HPLC检测，色谱条件如表1所示：
表1：
Figure BDA0002836808220000251
Figure BDA0002836808220000261
检测结果如下表所示，其中，目标化合物的保留时间为7.99min。
表2：
保留时间(min) 峰面积(％)
4.24 0.23
5.45 1.81
6.66 1.78
7.01 0.11
7.26 0.15
7.99 94.69
8.26 0.96
8.54 0.10
9.61 0.15
质谱数据如下：(正离子模式)
AF532-NHS：724.2。
实施例2
AF532-linker的合成方法：
Figure BDA0002836808220000271
带氮气球的三通连接250mL二口瓶，往二口瓶中加入AF532-NHS(9.60g，13.275mmol)和无水DMF(96mL)完全溶解成橙色溶液，再加入DIPEA(5.15g，39.825mmol)。预先另取一个50mL单口瓶称取Linker(9.75g，26.550mmol)，加入无水DMF(48mL)，溶解为无色透明液体。然后一次性加入到上述反应体系，氮气置换三次，室温搅拌反应1h。将反应液倒入1L乙酸乙酯中，析出固体，过滤即可得到14g红褐色固体。
质谱数据如下：(正离子模式)
AF532-linker：796.3。
Figure BDA0002836808220000272
AF532-linker-NHS的合成：
在50mL三口瓶中加入化合物AF532-linker(1400mg，1.43mmol，1eq)，TEA(1451.7mg，14.3mmol，10eq)，使用DMF(10mL)溶解后，氮气置换三次，用冰盐浴将反应体系降温至-70～-50℃以下，分三次以上加入TSTU(1582mg，4.31mmol，3eq)，每次加入约100mg，每次间隔5分钟。在氮气保护下，在-10℃以下保温进行缩合反应1h。
后处理：
将反应液滴加至150mL的干燥二氯甲烷中(150mL二氯甲烷中加入1mL乙酸)，所得溶液pH值为6-7，有少量固体析出，再加入50mL干燥的PE，静置2h，有大量粉状固体析出，过滤，滤饼在30℃、1mbar下抽真空至恒重，得约深红色固体1.5g(1500mg，收率92％)。
检测方法：
空白溶液(稀释剂)：乙腈：单BOC乙二胺＝20：1(v/v)
样品溶液：称取约1mg样品，加入2mL稀释剂溶解，超声震荡5分钟，得到0.5mg/mL的待测溶液，并用0.22μm孔径的滤膜过滤，即得。
进行HPLC检测，色谱条件如表3所示：
表3：
Figure BDA0002836808220000281
Figure BDA0002836808220000291
检测结果如下表所示，其中，目标化合物的保留时间为9.79。
表4：
保留时间(min) 峰面积(％)
4.67 0.01
5.55 0.28
6.79 0.07
7.09 0.05
7.26 0.10
8.19 0.83
8.91 0.96
9.57 1.78
9.79 94.64
10.38 1.28
质谱数据如下：(正离子模式)
AF532-linker-NHS(单Boc乙二胺衍生后)：1118.4。
实施例3
Figure BDA0002836808220000301
ROX C4-NHS的合成：
在50mL三口瓶中加入化合物ROX C4(1000mg，1.33mmol，1eq)，TEA(1343mg，13.3mmol，10eq)，使用DMF(10mL)溶解后，氮气置换三次，用冰盐浴将反应体系降温至-20～-10℃以下，分五次以上加入TSTU(1464mg，3.99mmol，3eq)，每次加入约300mg，每次间隔5分钟。在氮气保护下，在-10℃以下保温进行缩合反应1h。
后处理：
将反应液滴加至150mL的干燥二氯甲烷中(150mL二氯甲烷中加入1mL乙酸)，所得溶液pH值为6-7，有少量固体析出，再加入50mL干燥的PE，静置2h，有大量粉状固体析出，过滤，滤饼在30℃、1mbar下抽真空至恒重，得约深红色固体1g(1100mg，收率95％)。
检测方法：
空白溶液(稀释剂)：乙腈
样品溶液：称取约1mg样品，加入2mL稀释剂溶解，超声震荡5分钟，得到0.5mg/mL的待测溶液，并用0.22μm孔径的滤膜过滤，即得。
进行HPLC检测，色谱条件如表5所示：
表5：
Figure BDA0002836808220000302
Figure BDA0002836808220000311
检测结果如下表所示，其中，目标化合物的保留时间为7.27min。
表6：
保留时间(min) 峰面积(％)
6.03 0.18
6.24 1.04
6.66 2.11
6.95 0.82
7.27 95.86
质谱数据如下：(正离子模式)
Rox C4-NHS：851.3。
实施例4
Figure BDA0002836808220000321
Rox C4-linker的合成方法：
在250mL二口瓶中直接加入原料ROX C4-NHS(7.58g,8.926mmol,1.0eq)然后直接到入DMF(80mL)，溶解后，再直接加入TEA(3.155g，31.240mmol，3.5eq)。另取一个50mL棕色瓶，称取Linker(8.68g，22.314mmol，2.5eq)，溶解为无色透明液体。然后一次性加入到上述反应体系，氮气置换三次，室温搅拌反应1h。将反应液倒入1L乙酸乙酯中，析出固体，过滤即可得到10g红褐色固体。
质谱数据如下：(正离子模式)
Rox C4-linker：1102.4。
Figure BDA0002836808220000322
ROX C4-linker-NHS的合成：
在50mL三口瓶中加入化合物ROX C4-linker(1300mg，1.18mmol，1eq)，TEA(1193mg，11.8mmol，10eq)，使用DMF(10mL)溶解后，氮气置换三次，用冰盐浴将反应体系降温至-70～-50℃以下，分五次以上加入TSTU(1066mg，3.54mmol，3eq)，每次加入约200mg，每次间隔5分钟。在氮气保护下，在-10℃以下保温进行缩合反应1h。
后处理：
将反应液滴加至150mL的干燥二氯甲烷中(150mL二氯甲烷中加入1mL乙酸)，所得溶液pH值为6-7，有少量固体析出，再加入50mL干燥的PE，静置2h，有大量粉状固体析出，过滤，滤饼在30℃、1mbar下抽真空至恒重，得约深红色固体1.4g(1400mg，收率93％)。
检测方法：
空白溶液(稀释剂)：乙腈：单BOC乙二胺＝20：1(v/v)
样品溶液：称取约1mg样品，加入2mL稀释剂溶解，得到0.5mg/mL的待测溶液，并用0.22μm孔径的滤膜过滤，即得。
进行HPLC检测，色谱条件如表7所示：
表7：
Figure BDA0002836808220000331
检测结果如下表所示，其中，目标化合物的保留时间为11.74min。
表8：
保留时间(min) 峰面积(％)
11.45 2.77
11.55 0.93
11.60 1.62
11.74 94.68
质谱数据如下：(正离子模式)
Rox C4-linker-NHS(单Boc乙二胺衍生后)：1244.5。
实施例5
Figure BDA0002836808220000341
Cy5-NHS的合成：
化合物2的合成：在50mL三口瓶中加入化合物Cy5(1000mg，1.52mmol，1eq)，TEA(1539mg，115.2mmol，10eq)，使用DMF(10mL)溶解后，氮气置换三次，用冰盐浴将反应体系降温至-20～-10℃以下，分五次以上加入TSTU(1376mg，4.57mmol，3eq)，每次加入约300mg，每次间隔5分钟。在氮气保护下，在-10℃以下保温进行缩合反应1h。
后处理：
将反应液滴加至150mL的干燥二氯甲烷中(150mL二氯甲烷中加入1mL乙酸)，所得溶液pH值为6-7，有少量固体析出，再加入50mL干燥的PE，静置2h，有大量粉状固体析出，过滤，滤饼在30℃、1mbar下抽真空至恒重，得约深红色固体1g(1100mg，收率93％)。
检测方法：
空白溶液(稀释剂)：乙腈
样品溶液：称取约1mg样品，加入2mL稀释剂溶解，得到0.5mg/mL的待测溶液，并用0.22μm孔径的滤膜过滤，即得。
进行HPLC检测，色谱条件如表9所示：
表9：
Figure BDA0002836808220000351
Figure BDA0002836808220000361
检测结果如下表所示，其中，目标化合物的保留时间为7.20min。
表10：
保留时间(min) 峰面积(％)
6.41 0.18
6.81 1.96
7.03 0.89
7.20 94.32
8.10 0.23
10.33 2.43
质谱数据如下：(正离子模式)
Cy5-NHS：754.3。
实施例6
Figure BDA0002836808220000362
Cy5-linker-NHS的合成：
在50mL三口瓶中加入化合物Cy5-linker(1400mg，1.39mmol，1eq)，TEA(1406mg，13.9mmol，10eq)，使用DMF(10mL)溶解后，氮气置换三次，用冰盐浴将反应体系降温至-70～-50℃以下，分五次以上加入TSTU(1256mg，4.17mmol，3eq)，每次加入约220mg，每次间隔5分钟。在氮气保护下，在-10℃以下保温进行缩合反应1h。
后处理：
将反应液滴加至150mL的干燥二氯甲烷中(150mL二氯甲烷中加入1mL乙酸)，所得溶液pH值为6-7，有少量固体析出，再加入50mL干燥的PE，静置2h，有大量粉状固体析出，过滤，滤饼在30℃、1mbar下抽真空至恒重，得约深红色固体1.45g(1450mg，收率96％)。
检测方法：
空白溶液(稀释剂)：乙腈：单BOC乙二胺＝20：1(v/v)
样品溶液：称取约1mg样品，加入2mL稀释剂溶解，超声震荡5分钟，得到0.5mg/mL的待测溶液，并用0.22μm孔径的滤膜过滤，即得。
进行HPLC检测，色谱条件如表11所示：
表11：
Figure BDA0002836808220000371
Figure BDA0002836808220000381
检测结果如下表所示，其中，目标化合物的保留时间为10.35min。
表12：
保留时间(min) 峰面积(％)
6.51 0.10
7.33 0.14
7.67 0.47
7.99 0.04
8.83 0.37
9.09 1.20
9.37 0.07
10.35 97.61
质谱数据如下：(正离子模式)
Cy5-linker-NHS(单Boc乙二胺衍生后)：1148.5。
效果例1
用三乙胺、乙酸调节实施例2中合成的AF532-linker-NHS反应液的pH值，放置一段时间，采用HPLC测定放置前和放置后的纯度，如表13所示。其中，HPLC的测定条件与实施例2相同。
表13：AF532-linker-NHS在不同pH下的稳定性
pH值 放置时间 放置前纯度 放置后纯度
8 12h 94.64％ 78％
6.8 12h 94.64％ 94.2％
5.2 12h 94.64％ 92.6％
由上表中数据可见，所合成的AF532-linker-NHS在不同的pH下稳定性不同，在pH为6.8和8时，稳定性较高。
效果例2
采用不同条件合成下表中所列的琥珀酰亚胺活性酯，生产1g琥珀酰亚胺活性酯数据对比如表14所示。HPLC条件分别和实施例1-6中的检测条件相同。
表14：生产1g琥珀酰亚胺活性酯数据对比
Figure BDA0002836808220000391
备注：
对比条件：室温(25℃)，不氮气保护，后处理不加乙酸调节pH值，其它条件分别与实施例1-6相同；
总共所需时长是指合成、后处理和检测的总时长。
效果例3
采用与实施例1-6相同的合成和后处理步骤分别制备下表中的琥珀酰亚胺活性酯，采用不同的检测条件检测纯度如表15所示。
表15：同一样品在不同检测条件下的纯度
Figure BDA0002836808220000401
上表中AF532-NHS、Rox C4-NHS、Cy5-NHS中衍生前的数据分别采用实施例1、3、5中的检测方法测得；衍生后数据的测定方法分别类似于实施例1、3、5，区别在于稀释剂中添加单Boc乙二胺，且稀释剂中乙腈和单BOC乙二胺的体积比为20：1。
上表中AF532-linker-NHS、Rox C4-linker-NHS和Cy5-linker-NHS中的衍生后的数据分别采用实施例2、4、6中的检测方法测得；衍生前数据的测定方法分别类似于实施例2、4、6，区别在于稀释剂中不加单Boc乙二胺。
表16：论证表15中检测纯度的方案
Figure BDA0002836808220000402
Figure BDA0002836808220000411
效果例4
按照实施例2中操作步骤合成AF532-linker-NHS，但其中的反应温度、氮气保护条件以及TsTU加入次数分别如下表所示，其它反应条件与实施例2相同，并参照实施例2进行后处理和检测，所得的收率见下表。
表17：AF532-linker-NHS的变量数据
Figure BDA0002836808220000412
Figure BDA0002836808220000421
备注：1、TsTU加入每次加入量1次、3次、5次，均为对应总量的100％、33％、20％，每次加入间隔约5～10分钟。

Claims (10)

1.一种琥珀酰亚胺酯的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，得到琥珀酰亚胺酯；其中，所述的化合物A的结构式为：
Figure FDA0002836808210000011
Figure FDA0002836808210000021
其中，R11和R12独立地为-O-、-S-或-N-；
R21、R22、R23和R24独立地为-SO3H、-OH、-NH2、-F、-Cl、或-Br；
R31、R32、R33、R34、R35、R36、R37和R38独立地为-H、-F、-Cl、或-Br；
并且，所述的缩合反应在以下条件中的至少一个下进行：
条件1：所述的缩合反应在氮气或惰性气体保护下进行；
条件2：所述的缩合反应的反应温度为0～-50℃,不包括0℃；
条件3：所述的TSTU分至少2次加入反应体系。
2.如权利要求1所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法，其特征在于，所述的化合物A为
Figure FDA0002836808210000022
Figure FDA0002836808210000031
和/或，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法包括以下步骤：在氮气或惰性气体保护下，在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，得到琥珀酰亚胺酯；
和/或，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法包括以下步骤：在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，反应温度为0～-50℃，得到琥珀酰亚胺酯；
和/或，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法包括以下步骤：在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，得到琥珀酰亚胺酯，其中，所述的TSTU分至少2次加入反应体系；
和/或，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法包括以下步骤：所述的化合物A与三乙胺的摩尔比为1:5-20；又例如，所述的化合物A与三乙胺的摩尔比为为1:5-15，又例如，所述的化合物A与三乙胺的摩尔比为1:10；
和/或，所述的溶剂为酰胺类溶剂，如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺；
和/或，所述的化合物A和溶剂的用量比为0.05-0.20mol：1L；又例如，所述的化合物A和溶剂的用量比为0.10-0.16mol：1L；又例如，所述的化合物A和溶剂的用量比为0.16mol：1L、0.15mol：1L、0.14mol：1L、0.13mol：1L或0.12mol：1L；
和/或，所述的化合物A与TSTU的摩尔比为1:1-5；又例如，所述的化合物A与TSTU的摩尔比为1:2-4；又例如，所述的化合物A与TSTU的摩尔比为1:3；
和/或，所述的缩合反应的反应温度为0～-30℃进行，不包括0；例如，所述的反应在0～-20℃进行；又例如，所述的缩合反应在-10℃进行；
和/或，所述的反应时间为0.1-10h；又例如，所述的反应时间为0.1-5h；又例如，所述的反应时间为1h；
和/或，所述的TSTU分至少2次加入反应体系，例如，分2-10次加入反应体系，又例如，分2-5次加入反应体系，又例如，分2次、分3次、4次或5次加入反应体系；
和/或，所述的缩合反应的具体步骤包括：将TSTU加入到温度为-70～-10℃以下的含有化合物A和三乙胺的溶液中进行反应；优选地，所述的TSTU在氮气或惰性气体保护下加入反应体系；优选地，所述的含有化合物A和三乙胺的溶液通过将化合物A和TEA溶于所述溶剂中得到；
和/或，所述的制备方法还包括后处理；优选地，所述的后处理包括：将反应液的pH值调节为5-7.5，例如，将反应液的pH值调节为6-7；更优选地，所述的后处理包括：将反应液与含有pH值调节剂的二氯甲烷溶液混合，使得pH值为5-7.5；更优选地，所述的后处理还包括：将反应液与含有pH值调节剂的二氯甲烷溶液的混合物与石油醚混合。
3.如权利要求2所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法，其特征在于，所述的琥珀酰亚胺酯的制备方法包括以下步骤：在氮气或惰性气体保护下，在三乙胺存在的条件下，在溶剂中使化合物A与TSTU进行缩合反应，反应温度为0～-50℃，得到琥珀酰亚胺酯，其中，所述的TSTU分至少2次加入反应体系；
和/或，所述的后处理包括：将反应液加入到含有pH值调节剂的二氯甲烷中，使得pH值为5-7.5，再加入石油醚，有固体析出，过滤；
和/或，所述的溶剂和二氯甲烷的体积比为1:10-20，例如为1:15；
和/或，所述的二氯甲烷和石油醚的体积比为1-5:1，例如为2-4:1，又例如为3:1；
和/或，所述的pH值调节剂和二氯甲烷的体积比为1：100-200，例如1:150。
4.一种含有琥珀酰亚胺酯的溶液的处理方法，其包括：将含有琥珀酰亚胺酯的溶液的pH值调节为5-7.5；其中，所述的琥珀酰亚胺酯为：
Figure FDA0002836808210000061
Figure FDA0002836808210000071
其中，R11和R12独立地为-O-、-S-或-N-；
R21、R22、R23和R24独立地为-SO3H、-OH、-NH2、-F、-Cl、或-Br；
R31、R32、R33、R34、R35、R36、R37和R38独立地为-H、-F、-Cl、或-Br。
5.如权利要求4所述的含有琥珀酰亚胺酯的溶液的处理方法，其特征在于，所述的琥珀酰亚胺酯为
Figure FDA0002836808210000072
Figure FDA0002836808210000081
Figure FDA0002836808210000091
和/或，所述的pH值调节为6-7；
和/或，所述的处理方法的具体步骤包括：将含有琥珀酰亚胺酯溶液与含有pH值调节剂的溶液混合，所得混合物B的pH值为5-7.5；优选地，所述的含有pH值调节剂的溶液的溶剂为氯代烷类溶剂，例如二氯甲烷或二氯乙烷；优选地，所述的pH值调节剂为酸，例如乙酸；优选地，所述的含有pH值调节剂的溶液中，所述pH值调节剂与含有pH值调节剂的溶液的溶剂的体积比为1:100-200，例如1:150；优选地，所述的含有琥珀酰亚胺酯溶液的溶剂与含有pH值调节剂的溶液的溶剂的体积比为1:10-20，例如1:15；优选地，所述的处理方法的具体步骤包括：将含有琥珀酰亚胺酯溶液滴加至含有乙酸的二氯甲烷溶液中，所得溶液的pH值为6-7；其中，所述琥珀酰亚胺酯溶液的溶剂为DMF，DMF、乙酸和二氯甲烷的体积比为10：1：150；
和/或，所述的含有琥珀酰亚胺酯溶液的溶剂为酰胺类溶剂，例如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺；
和/或，所述的含有琥珀酰亚胺酯溶液中琥珀酰亚胺酯的浓度为0.1-0.2mol/L。
6.如权利要求5所述的含有琥珀酰亚胺酯的溶液的处理方法，其特征在于，所述的处理方法的具体步骤还包括：将所得混合物B与溶剂C混合；优选地，所述的含有pH值调节剂的溶液的溶剂与溶剂C的体积比为2-4:1，例如3:1；优选地，所述的溶剂C为石油醚；优选地，所述的处理方法的具体步骤还包括：将所述混合物B与溶剂C的混合物静置、过滤，抽真空；优选地，所述的抽真空是在20-40℃、0.5-1.5mbar下进行；优选地，所述的静置时间为1-3小时；
和/或，所述的含有琥珀酰亚胺酯的DMF溶液为制备琥珀酰亚胺酯的反应液。
7.一种琥珀酰亚胺酯的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：对含有琥珀酰亚胺酯、试剂D和溶剂E的混合物进行检测；其中所述的试剂D为伯胺或伯醇，所述的伯胺为甲胺、乙胺或单Boc乙二胺，所述的伯醇为甲醇或乙醇；
所述的琥珀酰亚胺酯为：
Figure FDA0002836808210000101
Figure FDA0002836808210000111
其中R1独立地为-O-、-S-、-N-；
R2独立地为-SO3H、-OH、-NH2、-F、-Cl、-Br；
R3独立地为-H、-F、-Cl、-Br。
8.如权利要求7所述的琥珀酰亚胺酯的检测方法，其特征在于，所述的琥珀酰亚胺酯为：
Figure FDA0002836808210000112
Figure FDA0002836808210000113
Figure FDA0002836808210000121
和/或，所述的溶剂E为腈类溶剂，例如为乙腈；
和/或，所述的试剂D和溶剂E的体积比为1:10-99，例如1:20-99，又例如1：99或1:20；
和/或，所述的检测方法为液相色谱法或液相色谱质谱联用法；优选地，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法的色谱条件包括：色谱柱为C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为三氟乙酸水溶液，流动相A和流动相B的体积比为5-95：95-5；
和/或，所述的琥珀酰亚胺酯与试剂D和溶剂E的混合物的比例为1mg：1-3mL，例如1mg：2mL。
9.如权利要求8所述的琥珀酰亚胺酯的检测方法，其特征在于，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法的色谱条件还包括：柱温为25-35℃，例如30℃；
和/或，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法的色谱条件还包括：流速为0.2-0.5mL/min，例如为0.3-0.4mL/min，例如0.4mL/min；
和/或，所述的三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.001％-0.02％，例如为0.005％-0.015％，例如0.01％；
和/或，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，在0-14min，流动相A的体积百分比从5％逐渐增加到95％，流动相B的体积百分比从95％逐渐下降到5％；
优选地，，当所述的琥珀酰亚胺酯为AF532-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
Figure FDA0002836808210000131
Figure FDA0002836808210000141
优选地，当所述的琥珀酰亚胺酯为AF532-linker-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
洗脱时间/min A(vol％) B(vol％) 0 5 95 1.5 25 75 6 25 75 8.5 95 5 10 95 5
；
优选地，当所述的琥珀酰亚胺酯为ROX C4-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
洗脱时间/min A(vol％) B(vol％) 1 5 95 2 30 70 7.8 40 60
；
优选地，当所述的琥珀酰亚胺酯为ROX C4-linker-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
Figure FDA0002836808210000142
Figure FDA0002836808210000151
优选地，当所述的琥珀酰亚胺酯为Cy5-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
Figure FDA0002836808210000152
优选地，当所述的琥珀酰亚胺酯为Cy5-linker-NHS时，所述的液相色谱法或液相色谱质谱联用法采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比如下表所示：
Figure FDA0002836808210000153
Figure FDA0002836808210000161
10.一种含有苯环的化合物，其结构为：
Figure FDA0002836808210000162
Figure FDA0002836808210000171
其中，所述的R4和R5独立地为CH3O-、CH3CH2O-、CH3NH-、CH3CH2NH-、或Boc-NH-CH2CH2-NH-。
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