实施例
中间体的合成
中间体1 2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-羧酸
步骤1)2-(2-(2-(叔丁氧基羰基)-2-苯基肼基)-2-氧乙氧基)乙酸
向1-苯基肼-1-甲酸叔丁酯(3.7g,18mmol)的DMF(50mL)溶液中加入1,4-二氧六环-2,6-二酮(3.13g,27mmol)和碳酸钠(3.82g,36mmol)。将所得混合物保持在氮气下,并在室温搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,用2N HCl调节pH至4~5,加入H2O(50mL),用EtOAc(150mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩,得到2-(2-(2-(叔丁氧基羰基)-2-苯基肼基)-2-氧乙氧基)乙酸为白色固体(4.2g,64.4%)。MS(ESI)m/z 346.9[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.79(s,1H),10.63(s,1H),7.39–7.29(m,4H),7.15(ddd,J=8.4,5.5,1.8Hz,1H),4.15(d,J=2.2Hz,4H),1.42(s,9H)。
步骤2)2-(2-(2-羟基乙氧基)乙酰基)-1-苯基肼基-1-甲酸叔丁酯
在0℃、氮气氛下,向2-(2-(2-(叔丁氧基羰基)-2-苯基肼基)-2-氧乙氧基)乙酸(4.2g,12.9mmol)的THF(60mL)溶液中加入BH3的THF(19.4ml,19.35mmol)溶液。反应在室温下搅拌4h。将混合物用NH4Cl水溶液淬灭,用H2O(30mL)稀释,然后用EtOAc(130mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩,所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到2-(2-(2-羟基乙氧基)乙酰基)-1-苯基肼基-1-甲酸叔丁酯为白色固体(3.16g,70.54%)。MS(ESI)m/z 332.9[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),7.37–7.30(m,4H),7.19-7.11(m,1H),4.06(s,2H),3.59-3.49(m,4H),1.42(s,9H)。
步骤3)(3-氧吗啉基)(苯基)氨基甲酸叔丁酯
在0℃下,向2-(2-(2-羟基乙氧基)乙酰基)-1-苯基肼基-1-甲酸叔丁酯(3.16g,10.1mmol)的THF(60mL)混合物中加入三苯基膦(4.0g,15.2mmol)和DIAD(3.06g,15.2mmol)。反应在25℃下搅拌16h。LCMS显示得到产物。混合物中加入H2O(30mL),用EtOAc(130mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩,所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(PE/EA=3/1),得到(3-氧吗啉基)(苯基)氨基甲酸叔丁酯为白色固体(2.9g,78.2%)。MS(ESI)m/z 193[M-100+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.37(d,J=4.5Hz,4H),7.21(dt,J=8.3,4.2Hz,1H),4.78(dq,J=12.4,6.1Hz,1H),4.26(q,J=16.5Hz,2H),3.97–3.88(m,2H),3.72–3.64(m,1H),3.51(dt,J=11.2,4.0Hz,1H),1.44(d,J=5.9Hz,9H)。
步骤4)4-(苯氨基)吗啉-3-酮
向(3-氧吗啉基)(苯基)氨基甲酸叔丁酯(2.9g,9.9mmol)的二氧六环(20mL)混合物中加入HCl的二氧六环(20ml)溶液。混合物在室温下搅拌3h。LCMS显示得到产物,将混合物浓缩,用Na2CO3水溶液调节pH至7~8,加入H2O(50mL)稀释,用EtOAc(150mL×2)萃取。。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩,得到4-(苯氨基)吗啉-3-酮为黄色油状物(1.9g,89.9%)。MS(ESI)m/z 193.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.18(dd,J=8.4,7.4Hz,2H),6.76(t,J=7.3Hz,1H),6.70–6.65(m,2H),4.19(s,2H),4.03–3.95(m,2H),3.58–3.51(m,2H)。
步骤5)3-氧-3-((3-氧吗啉基)(苯基)氨基)丙酸乙酯
向4-(苯氨基)吗啉-3-酮(1.9g,9.9mmol)的DCM(30mL)混合物中加入3-氯-3-氧丙酸乙酯(2.98g,19.8mmol)和碳酸钠(3.15g,29.7mmol)。混合物在0℃下搅拌5h。LCMS显示得到产物,将反应混合物过滤并用盐水(30ml)洗,滤液经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩,所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(PE/EA=2/1),得到3-氧-3-((3-氧吗啉基)(苯基)氨基)丙酸乙酯为黄色油状物(1.35g,42.4%)。MS(ESI)m/z306.9[M+H]+。
步骤6)2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酸乙酯
将3-氧-3-((3-氧吗啉基)(苯基)氨基)丙酸乙酯(1.35g,4.4mmol)的DBU(5mL)混合物在50℃下搅拌1h。LCMS显示得到产物,将混合物用水(10ml)稀释,用2N HCl调节pH至7,加入H2O(20mL)稀释,然后用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(20mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩,所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(PE/EA=1/4),得到2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酸乙酯为黄色油状物(770mg,56.8%)。MS(ESI)m/z 288.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.55(dd,J=10.4,4.8Hz,2H),7.48–7.37(m,3H),4.98(s,2H),4.14(q,J=7.1Hz,2H),4.04(dd,J=9.8,4.5Hz,2H),3.60(t,J=5.0Hz,2H),1.22(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤7)2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-羧酸
向2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酸乙酯(770mg,2.67mmol)的EtOH/H2O(20ml/5ml)混合物中加入NaOH(534mg,13.35mmol),混合物在室温下搅拌16h,LCMS显示得到产物。将混合物浓缩以除去有机物,用2N HCl将pH调节至4~5,用H2O(50mL)稀释,然后用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(20mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩,得到2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-羧酸为黄色固体(660mg,90.21%)。MS(ESI)m/z 260.9[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)δ11.93(s,1H),7.57(dd,J=10.2,4.7Hz,2H),7.52–7.42(m,3H),4.98(s,2H),4.10–4.01(m,2H),3.64(t,J=5.0Hz,2H)。
中间体2 2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸
步骤1)5-氯-N'-苯基戊酰肼
在0℃下,向苯肼(1600mg,14.8mmol)和10%Na2CO3水溶液(25mL)的DCM(25mL)溶液中加入5-氯戊酰氯(2065mg,13.3mmol),将混合物在20℃下搅拌16小时。混合物用DCM(50mL)稀释,分离的有机层先后用1N HCl水溶液(30mL)和盐水(50mL)洗,然后经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩,得到粗制的5-氯-N'-苯基戊酰肼为淡黄色油状物(2800mg,75.1%收率)。MS(ESI):226.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.39(m,1H),7.34-7.28(m,1H),7.25-7.21(m,1H),6.97-6.75(m,2H),3.58-3.45(m,2H),2.32-2.18(m,2H),1.89-1.82(m,2H),1.81-1.78(m,1H),1.75-1.71(m,1H)。
步骤2)3-(2-(5-氯戊酰基)-1-苯基肼基)-3-氧丙酸乙酯
向5-氯-N'-苯基戊酰肼(2.8g,0.012mol)和Na2CO3(1.57g,0.015mol)的DCM(50mL)溶液中加入3-氯-3-氧丙酸乙酯(1.86g,0.012mol),混合物在20℃下搅拌16h。混合物用DCM(50mL)稀释,并用盐水(50mL×2)洗。有机层经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化,得到粗制的3-(2-(5-氯戊酰基)-1-苯基肼基)-3-氧丙酸乙酯为黄色油状物(3.8g,81.2%收率)。MS(ESI):341.2[M+H]+。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.47-7.36(m,5H),4.30-4.08(m,2H),3.54-3.35(m,4H),2.30-2.25(m,2H),1.85-1.73(m,4H),1.35–1.21(m,3H)。
步骤3)3-氧-3-((2-氧哌啶-1-基)(苯基)氨基)丙酸乙酯
向3-(2-(5-氯戊酰基)-1-苯基肼基)-3-氧丙酸乙酯的DMF(30mL)溶液中加入NaH(782mg,0.032mmol),混合物在20℃下搅拌16小时。反应混合物用NaH2PO4水溶液(20mL)淬灭,然后用EtOAc(30mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(50mL×2)洗,经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(EtOAc/PE=1/1),得到粗制的3-氧-3-((2-氧哌啶-1-基)(苯基)氨基)丙酸乙酯为黄色油状物(1.8g,51.7%收率)。MS(ESI):305.2[M+H]+。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.62-7.30(m,5H),4.29-4.09(m,2H),3.79-3.75(m,1H),3.63-3.43(m,2H),3.28(s,2H),2.67-2.55(m,1H),2.46-2.35(m,1H),2.02-1.69(m,5H),1.34-1.23(m,3H)。
步骤4)2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯
将2-((2-氧哌啶-1-基)(苯基)氨基甲酰基)乙酸乙酯(1.7g,5.59mmol)的DBU(20mL)混合物在50℃下搅拌2h。混合物用水(20mL)稀释,并用EtAOc(50mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(50mL×2)洗。有机层经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(EtOAc/PE=1/1),得到粗制的2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯为棕色固体(1.5g,89%收率)。MS(ESI):287.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48-7.44(m,1H),7.38-7.33(m,1H),7.32-7.29(m,2H),4.31(q,J=7.2Hz,1H),3.51(t,J=6.0Hz,1H),3.20(t,J=6.4Hz,1H),2.08-1.99(m,1H),1.91-1.87(m,1H),1.36(t,J=7.2Hz,3H)。
步骤5)2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑[1,5-a]吡啶-3-羧酸
将2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯(1.5g,5.24mmol)和NaOH(1.048g,26.2mmol)的EtOH(20mL)和H2O(10mL)混合物在25℃下搅拌16h。将混合物真空浓缩,所得残余物溶于水(20mL)。将混合物用1N HCl酸化至pH 4-5,然后用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(40mL×2)洗,经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩,得到2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑[1,5-a]吡啶-3-羧酸为棕色固体(1.3g,91%收率)。MS(ESI):259.2[M+H]+。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ11.84(s,1H),7.57-7.48(m,3H),7.38-7.34(m,2H),3.59(t,J=5.7Hz,2H),3.26(t,J=6.3Hz,2H),2.11-2.05(m,2H),1.96-1.90(m,2H)。
中间体3 2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸
步骤1)4-氯-N'-苯基丁酰肼
在0℃下,向苯肼(1600mg,14.8mmol)和10%Na2CO3水溶液(25mL)的DCM(25mL)溶液中加入4-氯丁酰氯(2087mg,14.8mmol),混合物在20℃下搅拌16小时。混合物用DCM(50mL)稀释,分离的有机层用1N HCl水溶液(30mL)洗,然后用盐水(50mL)洗,经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩,得到粗制的4-氯-N'-苯基丁酰肼为淡黄色油状物(2.9g,78.3%收率)。MS(ESI):213.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.28(m,2H),7.25-7.22(m,1H),6.96-6.90(m,1H),6.86-6.83(m,2H),5.78(s,1H),3.66-3.61(m,2H),2.48(t,J=7.2Hz,2H),2.20-2.13(m,2H)。
步骤2)3-(2-(4-氯丁酰基)-1-苯基肼基)-3-氧丙酸乙酯
向4-氯-N'-苯基丁酰肼(2.6g,0.012mol)和Na2CO3(1.55g,1.13mol)的DCM(50mL)溶液中加入3-氯-3-氧丙酸乙酯(1.84g,0.012mol),混合物在20℃下搅拌16h。反应混合物用DCM(50mL)稀释,并用盐水(50mL×2)洗。有机层经Na2SO4干燥,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化,得到粗制的3-(2-(4-氯丁酰基)-1-苯基肼基)-3-氧丙酸乙酯为黄色油状物(3.0g,63.9%收率)。MS(ESI):327.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.54-7.30(m,5H),4.28-4.08(m,2H),3.65-3.55(m,2H),3.43-3.34(m,1H),2.43(t,J=7.2Hz,2H),2.16-2.07(m,2H),1.34-1.20(m,3H)。
步骤3)3-氧-3-((2-氧吡咯烷-1-基)(苯基)氨基)丙酸乙酯
在0℃下,向3-(2-(4-氯丁酰基)-1-苯基肼基)-3-氧丙酸乙酯(3.0g,0.0092mol)的DMF(20mL)溶液中加入NaH(0.66g,0.027mol),然后混合物在20℃下搅拌16小时。反应混合物用NaH2PO4水溶液(30mL)淬灭,并用EtOAc(40mL x3)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(EA/PE=1/1),得到3-氧-3-((2-氧吡咯烷-1-基)(苯基)氨基)丙酸乙酯为棕色油状物(1.7g,54%收率)。MS(ESI):291.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51-7.26(m,5H),4.28-4.10(m,2H),3.87-3.44(m,2H),3.29(s,2H),2.58-2.30(m,2H),2.22-1.94(m,2H),1.32-1.23(m 3H)。
步骤4)2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酸乙酯
将3-氧-3-((2-氧吡咯烷-1-基)(苯基)氨基)丙酸乙酯(1.8g,0.0062mmol)的DBU(10mL)混合物在50℃下加热6h。混合物用水(30mL)稀释,并用EtOAc(50mL×3)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(EA/EA=1/1),得到2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酸乙酯为黄色固体(0.6g,33.8%收率)。MS(ESI):273.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45(t,J=7.6Hz,2H),7.38-7.36(m,2H),7.31-7.26(m,1H),4.32(q,J=7.2Hz,2H),3.67(t,J=6.8Hz,2H),3.19(t,J=7.2Hz,2H),2.52-2.39(m,2H),1.36(t,J=7.2Hz,3H)。
步骤5)2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸
将2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酸乙酯(600mg,2.2mmol)和氢氧化钠(264mg,6.6mmol)的EtOH(10mL)、THF(10mL)和H2O(10mL)混合物在20℃下搅拌16h。然后将其真空浓缩,残余物用水(20mL)稀释。混合物用1N HCl酸化至pH 4至5,然后用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(40mL×2)洗,经Na2SO4干燥,蒸发浓缩,得到粗制的2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸为棕色固体(500mg,88.4%收率)。MS(ESI):245.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.42(s,1H),7.53(t,J=7.6Hz,2H),7.43-7.38(m,3H),3.80(t,J=7.2Hz,2H),3.27(t,J=7.2Hz,2H),2.60-2.51(m,2H)。
实施例1N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
步骤1)1-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮
在25℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(5.6g,20.0mmol)的DMF(50mL)混合物中加入1-溴丙烷-2-酮(5.48g,40.0mmol)和Cs2CO3(13.03g,10.0mmol)。反应在25℃下搅拌16h,LCMS显示得到产物。混合物用H2O(100mL)稀释,再用EtOAc(100mL×2)萃取。有机层用盐水(100mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(PE/EtOAc=1/1),得到1-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮为白色固体(3.8g,57%)。MS(ESI)m/z 335.9[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)δ8.62(s,1H),7.85(s,1H),5.28(s,2H),2.24(s,3H)。
步骤2)(4-(4-氯-7-(2-氧丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯
向1-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮(948mg,2.83mmol)的二氧六环/H2O(20mL/4mL)溶液中加入N-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基]氨基甲酸叔丁酯(1085mg,3.40mmol)、碳酸钠(449mg,4.25mmol)和Pd(PPh3)4(327mg,0.283mmol)。将所得混合物保持在氮气下,并在80℃下搅拌6小时。合物用H2O(50mL)稀释,再用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到(4-(4-氯-7-(2-氧丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯为白色固体(872mg,77%)。MS(ESI)m/z 401.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)δ9.47(s,1H),8.63(s,1H),7.56–7.54(m,3H),7.40(d,J=8.6Hz,2H),5.33(s,2H),2.26(s,3H),1.50(s,9H)。
步骤3)(4-(4-氨基-7-(2-氧丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯
向N-(4-(4-氯-7-(2-氧丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.08g,2.51mmol)的二氧六环混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应在130℃下在密封管中搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,得到(4-(4-氨基-7-(2-氧丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯为黄色固体(950mg,92%)。MS(ESI)m/z 382.1[M+H]+。
步骤4)1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮
向N-(4-(4-氨基-7-(2-氧丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(950mg,粗品)的二氧六环(10mL)溶液中加入HCl(2.5mL,4M的二氧六环溶液),混合物在25℃下搅拌6h。将混合物浓缩以除去有机物,用H2O(20mL)稀释,然后用1M NaOH处理至pH约为9,用H2O(50mL)稀释,再用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮为白色固体(188mg,30%)。MS(ESI)m/z 282.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.08(s,1H),7.11(d,J=8.3Hz,2H),7.02(s,1H),6.67(d,J=8.3Hz,2H),6.06(s,2H),5.22(s,2H),5.08(s,2H),2.18(s,3H)。
步骤5)1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇
在0℃下,向1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮(203mg,0.72mmol)的MeOH(10mL)混合物中加入NaBH4(28mg,0.72mmol)。反应在0℃下搅拌2h。将混合物浓缩以除去有机物,混合物用H2O(30mL)稀释,用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩,得到1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇为白色固体(190mg,97%)。MS(ESI)m/z 284.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(s,1H),7.10(d,J=8.8Hz,3H),6.66(d,J=8.4Hz,2H),6.30-5.85(m,2H),5.44(s,2H),4.97(s,1H),4.10-3.93(m,3H),1.04(d,J=6.0Hz,3H)。
步骤6)N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇(57mg,0.20mmol)的DCM/THF(10mL/10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,6H,7H-吡唑并[3,2-c]吗啉-3-羧酸(52mg,0.2mmol)、EDCI(58mg,0.3mmol)、HOAT(41mg,0.3mmol)和DIEA(78mg,0.6mmol),然后混合物在50℃下搅拌16h。反应混合物用H2O(30mL)稀释,再用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(0.1%FA)10%-40%)纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(62.1mg,59%)。MS(ESI)m/z 526.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H),8.13(s,1H),7.70(d,J=8.6Hz,2H),7.62–7.58(m,2H),7.56-7.50(m,3H),7.41(d,J=8.5Hz,2H),7.28(s,1H),6.08(s,2H),5.13(s,2H),4.98(s,1H),4.12–4.02(m,5H),3.69(t,J=4.9Hz,2H),1.05(d,J=6.0Hz,3H)。
实施例2(S)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
步骤1)1-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮
向1-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮(336mg,1.0mmol)的二氧六环/H2O(10mL/2mL)溶液中加入N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(285mg,1.2mmol)、碳酸钠(159mg,1.5mmol)和Pd(PPh3)4(116mg,0.1mmol)。所得混合物保持在氮气下,并在80℃下搅拌6h。将混合物浓缩以除去有机物,用H2O(50mL)稀释,再用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到1-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮为白色固体(300mg,94%)。MS(ESI)m/z 319.0[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)δ8.60(s,1H),7.55(s,1H),7.06(t,J=8.6Hz,1H),6.46–6.41(m,2H),5.53(s,2H),5.32(s,2H),2.26(s,3H)。
步骤2)1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮
向N-(4-(4-氯-4-(2-氧丙基))吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)氨基甲酸叔丁酯(300mg,0.72mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应在密闭管中于130℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,用H2O(30mL)稀释,再用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮为白色固体(105mg,37%)。MS(ESI)m/z300.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.07(s,1H),7.07–7.02(m,2H),6.51-6.43(m,2H),5.96(s,2H),5.55(s,2H),5.10(s,2H),2.18(s,3H)。
步骤3)(S)-1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇
在0℃下,向1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-酮(485mg,1.62mmol)的MeOH(20mL)混合物中加入NaBH4(62mg,1.62mmol)。反应在0℃下搅拌2h。将混合物浓缩以除去有机物,用H2O(30mL)稀释,然后用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经SFC(CHIRALPAK AD-H250mm,20mm,5μm,30%ETOH(0.2%NH4OH))纯化,得到(S)-1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇(180mg)。MS(ESI)m/z 302.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.09(s,1H),7.12(s,1H),7.02(t,J=8.6Hz,1H),6.49–6.42(m,2H),6.13-5.71(m,2H),5.52(s,2H),4.96(d,J=4.7Hz,1H),4.09–3.99(m,3H),1.03(d,J=6.4Hz,3H)。
步骤4)(S)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡咯并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向(S)-1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇(60mg,0.20mmol)的DCM(20mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,6H,7H-吡唑并[3,2-c]吗啉-3-羧酸(52mg,0.2mmol)、EDCI(58mg,0.3mmol)、HOAT(41mg,0.3mmol)和DIEA(78mg,0.6mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物用H2O(30mL)稀释,再用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(0.1%FA),10%-40%)纯化,得到(S)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡咯并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(75.3mg,69%)。MS(ESI)m/z 544.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),8.13(s,2H),7.85–7.81(m,1H),7.63–7.58(m,2H),7.56-7.51(m,3H),7.35–7.28(m,3H),6.03(s,2H),5.12(s,2H),4.97(s,1H),4.11–4.00(m,4H),3.70(t,J=5.0Hz,2H),1.05(d,J=6.0Hz,3H)。
实施例3(R)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡咯并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
步骤1)(R)-1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇
根据实施例2步骤(3)中所述方法,分离得到(R)-1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇(170mg)。
步骤2)(R)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡咯并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向(R)-1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇(60mg,0.20mmol)的DCM(20mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,6H,7H-吡唑并[3,2-c]吗啉-3-羧酸(52mg,0.2mmol)、EDCI(58mg,0.3mmol)、HOAT(41mg,0.3mmol)和DIEA(78mg,0.6mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物用H2O(30mL)稀释,用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(0.1%FA),10%-40%)纯化,得到(R)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡咯并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(60.2mg,55%)。MS(ESI)m/z 544.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),8.13(s,1H),7.85–7.81(m,1H),7.64-7.58m,2H),7.55–7.51(m,3H),7.37–7.28(m,3H),6.03(s,2H),5.12(s,2H),4.97(s,1H),4.13–4.00(m,5H),3.70(t,J=4.8Hz,2H),1.05(d,J=6.0Hz,3H)。
实施例4N-(4-(4-氨基-7-(2-羟乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
步骤1)2-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇
将4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2g,0.01mol)、2-溴乙醇(1.5g,0.012mol)和Cs2CO3(4.89g,0.015mol)的DMF(30mL)混合物在20℃下搅拌16h。将反应混合物用EtOAc(80mL)稀释,并用盐水(40mL×2)洗。有机层经Na2SO4干燥,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(EA/PE=1/1),得到2-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇为黄色固体(1.5g,44%收率)。MS(ESI):m/z 324.0[M+1]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.50(s,1H),4.43(t,J=4.8Hz,2H),4.02(t,J=4.8Hz,2H)。
步骤2)2-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇
将2-(5-碘-4-甲基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(1.5g,4.63mmol)、3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(1.209g,5.1mmol)、碳酸钠(982mg,9.23mmol)和四(三苯基膦)钯(268mg,0.23mmol)的二氧六环(80mL)和H2O(20mL)混合物在90℃下加热反应16h。然后将混合物真空浓缩,残余物用EtOAc(50mL)稀释,并用盐水(30mL×3)洗。有机层经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到2-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇为黄色固体(1g,66.8%收率)。MS(ESI):307.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(s,1H),7.67(s,1H),7.05(t,J=8.6Hz,1H),6.46-6.38(m,2H),5.51(s,2H),4.98(s,1H),4.35(t,J=5.6Hz,2H),3.79(t,J=5.2Hz,2H)。
步骤3)2-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇
将2-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(500mg,1.63mmol)的二氧六环(5mL)和25%NH4OH(5mL)混合物在120℃下加热反应16h。然后将其冷却至室温,并将混合物真空浓缩。所得残余物用MeOH(5mL)和H2O(2mL)处理,过滤。滤饼用水(2mL)洗,经真空干燥,得到粗制的2-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇为白色固体(260mg,52.7%收率)。MS(ESI):288.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.10(s,1H),7.15(s,1H),7.02(t,J=9.3Hz,1H),6.52-6.40(m,2H),5.91(s,1H),5.54(s,2H),4.96(t,J=5.1Hz,1H),4.19(t,J=5.7Hz,2H),3.73(q,J=5.4Hz,2H)。
步骤4)N-(4-(4-氨基-7-(2-羟乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
将2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-羧酸的混合物(50mg,0.19mmol)、2-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(55mg,0.19mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(55mg,0.29mmol)、HOAt(31.5mg,0.23mmol)和DIEA(74.5mg,0.58mmol)的DCM(20mL)和THF(20mL)混合物于40℃下加热反应16h。然后将混合物用EtOAc(30mL)稀释,并用盐水(20mL×2)洗。有机层经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩。所得残余物经制备型HPLC(ACN-H2O(0.1%FA),梯度15%-40%)纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(2-羟乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(52.8mg,50.9%收率)。MS(ESI):530.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),8.13(s,1H),7.87-7.79(m,1H),7.63-7.58(m,2H),7.54-7.52(m,3H),7.39-7.29(m,3H),6.03(s,2H),5.12(s,2H),4.97(t,J=5.2Hz,1H),4.22(t,J=5.6Hz,2H),4.11-4.08(m,2H),3.78-3.68(m,4H)。
实施例5N-(4-(4-氨基-7-(2-羟乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺
步骤1)2-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇
将4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2.0g,0.01mol)、2-溴乙醇(1.5g,0.012mol)和Cs2CO3(4.89g,0.015mol)的DMF(30mL)混合物在20℃下搅拌16h。混合物用EtOAc(80mL)稀释,并用盐水(40mL×2)洗。有机层经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(EA/PE=1/1),得到2-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇为黄色固体(1.5g,44%收率)。MS(ESI):324.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.50(s,1H),4.43(t,J=4.8Hz,2H),4.02(t,J=4.8Hz,2H)。
步骤2)2-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇
将2-(5-碘-4-甲基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(1.5g,4.63mmol)、3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(1.209g,5.1mmol)、碳酸钠(982mg,9.23mmol)和四(三苯基膦)钯(268mg,0.23mmol)的二氧六环(80mL)和H2O(20mL)混合物在90℃下加热反应16h。然后将混合物真空浓缩,残余物用EtOAc(50mL)稀释,并用盐水(30mL×3)洗。有机层经Na2SO4干燥,蒸发浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到2-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇为黄色固体(1g,66.8%收率)。MS(ESI):307.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(s,1H),7.67(s,1H),7.05(t,J=8.6Hz,1H),6.46-6.38(m,2H),5.51(s,2H),4.98(s,1H),4.35(t,J=5.6Hz,2H),3.79(t,J=5.2Hz,2H)。
步骤3)2-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇
将2-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(500mg,1.63mmol)的二氧六环(5mL)和25%NH4OH(5mL)混合物在120℃下加热反应16h。然后将混合物冷却至室温,真空浓缩。所得残余物用MeOH(5mL)和H2O(2mL)处理,过滤。滤饼用水(2mL)洗,经真空干燥,得到粗制的2-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙烷-1-醇为白色固体(260mg,52.7%收率)。MS(ESI):288.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.10(s,1H),7.15(s,1H),7.02(t,J=9.3Hz,1H),6.52-6.40(m,2H),5.91(s,1H),5.54(s,2H),4.96(t,J=5.1Hz,1H),4.19(t,J=5.7Hz,2H),3.73(q,J=5.4Hz,2H)。
步骤4)N-(4-(4-氨基-7-(2-羟乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺
将2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸(100mg,0.41mmol)、2-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(129mg,0.45mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(101.6mg,0.53mmol)、HOAt(67.4mg,0.49mmol)和DIEA(159mg,1.23mmol)的DCM(20mL)和THF(20mL)混合物在40℃下加热反应16h。然后将混合物用EtOAc(30mL)稀释,并用盐水(20mL×2)洗。有机层经Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩。所得残余物经制备型HPLC纯化(ACN-H2O(0.1%FA),梯度15%-40%),得到产物N-(4-(4-氨基-7-(2-羟乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺为白色固体(61.6mg,29%收率)。MS(ESI):513.8[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.38(s,1H),8.13(s,1H),7.87(d,J=12.4Hz,1H),7.60-7.49(m,4H),7.44-7.40(m,1H),7.35-7.32(m,3H),6.04(brs,2H),4.97(t,J=5.2Hz,1H),4.22(t,J=5.6Hz,2H),3.82(t,J=6.8Hz,2H),3.74(q,J=5.2Hz,2H),3.18(t,J=7.2Hz,2H),2.46-2.42(m,2H)。
实施例6N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
步骤1)4-氯-5-碘-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
在0℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2.8g,10.0mmol)的THF(40mL)混合物中加入氧杂环戊烷-3-醇(1.76g,20.0mmol)、三苯基膦(5.3g,20.0mmol)和DIAD(4.04g,20.0mmol)。反应在25℃下搅拌16h。LCMS显示得到产物。反应混合物用H2O(30mL)稀释,EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到4-氯-5-碘-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶为白色固体(1.977g,56%)。MS(ESI)m/z349.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(s,1H),7.95(s,1H),5.51-5.44(m,1H),4.15–4.10(m,1H),3.97-3.88(m,2H),3.86-3.77(m,1H),2.49-2.45(m,1H),2.25-2.16(m,1H)。
步骤2)4-(4-氯-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯胺
向4-氯-5-碘-7-(氧杂环戊烷-3-基)吡咯并[2,3-d]嘧啶(700mg,2.0mmol)的二氧六环/H2O(10mL/2mL)溶液中加入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(526mg,2.4mmol)、碳酸钠(318mg,3.0mmol)、和Pd(PPh3)4(232mg,0.2mmol)。所得混合物保持在氮气下,并在25℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,用H2O(50mL)稀释,然后用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到4-(4-氯-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯胺为白色固体(350mg,55%)。MS(ESI)m/z 315.1[M+H]+。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.62(s,1H),7.61(s,1H),7.18(d,J=8.4Hz,2H),6.61(d,J=8.4Hz,2H),5.56–5.48(m,1H),5.17(s,2H),4.16-4.08(m,1H),4.01–3.91(m,2H),3.87-3.80(m,1H),2.49-2.41(m,1H),2.27-2.21(m,1H)。
步骤3)5-(4-氨基苯基)-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺
向4-(4-氯-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯胺(350mg,1.11mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应在密闭管中于130℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,加入H2O(30mL)稀释,然后用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到5-(4-氨基苯基)-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺为白色固体(260mg,79%)。MS(ESI)m/z 296.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(s,1H),7.13–7.11(m,3H),6.66(d,J=8.4Hz,2H),6.25-5.72(m,2H),5.40–5.35(m,1H),5.21(s,2H),4.11–4.06(m,1H),3.97–3.93(m,1H),3.88–3.80(m,2H),2.46–2.41(m,1H),2.19–2.12(m,1H)。
步骤4)N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向5-(4-氨基苯基)-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(56mg,0.19mmol)的DCM(20mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,6H,7H-吡唑并[3,2-c]吗啉-3-羧酸(50mg,0.19mmol)、EDCI(58mg,0.3mmol)、HOAT(41mg,0.3mmol)和DIEA(78mg,0.6mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物中加入H2O(30mL)稀释,然后用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(15-30)(0.1%FA))纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(82.4mg,79.78%)。MS(ESI)m/z 537.7[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.42(s,1H),8.15(s,1H),7.70(d,J=8.6Hz,2H),7.61(dd,J=10.5,4.5Hz,2H),7.53(dt,J=7.0,2.9Hz,3H),7.44(d,J=8.5Hz,2H),7.31(s,1H),6.13(s,2H),5.45-5.37(m,1H),5.13(s,2H),4.09(dd,J=9.3,5.4Hz,3H),4.01-3.94(m,1H),3.92-3.79(m,2H),3.69(t,J=4.9Hz,2H),2.48-2.41(m,1H),2.25-2.13(m,1H)。
实施例7N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
步骤1)4-氯-5-碘-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
根据实施例6步骤(1)所述方法制备得到4-氯-5-碘-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶为白色固体(1.977g,56%)。MS(ESI)m/z 349.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(s,1H),7.95(s,1H),5.51-5.44(m,1H),4.15–4.10(m,1H),3.97-3.88(m,2H),3.86-3.77(m,1H),2.49-2.45(m,1H),2.25-2.16(m,1H)。
步骤2)4-(4-氯-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯胺
向4-氯-5-碘-7-(氧杂环戊烷-3-基)吡咯并[2,3-d]嘧啶(700mg,2.0mmol)的二氧六环/H2O(10mL/2mL)溶液中加入N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(569mg,2.4mmol)、碳酸钠(318mg,3.0mmol)、和Pd(PPh3)4(232mg,0.2mmol)。所得混合物保持在氮气下,并在80℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,加入H2O(50mL)稀释,然后用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到4-(4-氯-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯胺为白色固体(550mg,82%)。MS(ESI)m/z 333.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.64(s,1H),7.66(s,1H),7.11–7.05(m,1H),6.46–6.39(m,2H),5.69–5.34(m,3H),4.15–4.09(m,1H),4.02–3.94(m,2H),3.89-3.81(m,1H),2.59-2.52(m,1H),2.28–2.20(m,1H)。
步骤3)5-(4-氨基-2-氟苯基)-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺
向4-(4-氯-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯胺(550mg,1.65mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应在密闭管中于130℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,加入H2O(30mL)稀释,然后用EA(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到5-(4-氨基-2-氟苯基)-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺为白色固体(400mg,77%)。MS(ESI)m/z 314.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.12(s,1H),7.15(s,1H),7.04(t,J=8.8Hz,1H),6.49–6.43(m,2H),6.16-5.76(m,2H),5.54(s,2H),5.40–5.35(m,1H),4.12-4.04(m,1H),3.98–3.94(m,1H),3.88–3.80(m,2H),2.47–2.41(m,1H),2.18–2.13(m,1H)。
步骤4)N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向5-(4-氨基-2-氟苯基)-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(60mg,0.19mmol)的DCM(20mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,6H,7H-吡唑并[3,2-c]吗啉-3-羧酸(50mg,0.19mmol)、EDCI(58mg,0.3mmol)、HOAT(41mg,0.3mmol)和DIEA(78mg,0.6mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物中加入H2O(30mL)稀释,用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(15-50)(0.05%NH3))纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(46.3mg,43.34%)。MS(ESI)m/z555.7[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.54(s,1H),8.15(s,1H),7.83(dd,J=12.4,1.8Hz,1H),7.64–7.58(m,2H),7.53(dd,J=7.1,4.8Hz,3H),7.41-7.29(m,3H),6.08(s,2H),5.45-5.37(m,1H),5.12(s,2H),4.13-4.04(m,3H),3.97(dd,J=9.4,6.0Hz,1H),3.91-3.79(m,2H),3.70(t,J=4.9Hz,2H),2.47-2.41(m,1H),2.23-2.12(m,1H)。
实施例8N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇(43mg,0.15mmol)的DCM(10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(39mg,0.15mmol)、EDCI(43mg,0.23mmol)、HOAT(31mg,0.23mmol)和DIEA(59mg,0.45mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物用H2O(30mL)稀释,然后用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(0.1%FA)25%-30%)纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(37.6mg,48%)。MS(ESI)m/z 524.2[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.68(s,1H),8.13(s,1H),7.69(d,J=8.6Hz,2H),7.61-7.56(m,2H),7.54-7.50(m,1H),7.49–7.45(m,2H),7.40(d,J=8.4Hz,2H),7.27(s,1H),6.18-5.98(m,2H),5.05-4.92(m,1H),4.10–4.01(m,3H),3.57(t,J=5.8Hz,2H),3.22(t,J=6.2Hz,2H),2.02–1.96(m,2H),1.85–1.80(m,2H),1.05(d,J=6.0Hz,3H)。
实施例9(S)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向1-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇(45mg,0.15mmol)的DCM(10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(39mg,0.15mmol)、EDCI(43mg,0.23mmol)、HOAT(31mg,0.23mmol)和DIEA(59mg,0.45mmol),然后混合物在42℃下搅拌16h。反应混合物用DCM(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(0.1%FA)25%-30%)纯化,得到(S)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(35.5mg,44%)。MS(ESI)m/z 542.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.81(s,1H),8.12(s,1H),7.84(dd,J=12.6,1.9Hz,1H),7.62-7.56(m,2H),7.54-7.49(m,1H),7.49–7.45(m,2H),7.36–7.27(m,3H),6.12-5.90(m,2H),5.95-4.90(m,1H),4.12–4.00(m,3H),3.58(t,J=5.8Hz,2H),3.21(t,J=6.2Hz,2H),2.02–1.95(m,2H),1.85–1.79(m,2H),1.05(d,J=6.0Hz,3H)。
实施例10N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
步骤1)4-氯-5-碘-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
在0℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2.79g,10.0mmol)的THF(20mL)混合物中加入氧杂环丁烷-3-醇(1.48g,10.0mmol)、三苯基膦(5.25g,10.0mmol)和DEAD(4.04g,20.0mmol)。反应在85℃下搅拌16h。LCMS显示得到产物。混合物加入H2O(30mL)稀释,再用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到4-氯-5-碘-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶为白色固体(3.0g,89%)。MS(ESI)m/z 335.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(s,1H),8.41(s,1H),5.96–5.88(m,1H),4.99(dt,J=14.7,7.0Hz,4H)。
步骤2)4-(4-氯-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯胺
向4-氯-5-碘-7-(氧杂环丁烷-3-基)吡咯并[2,3-d]嘧啶(670mg,2.0mmol)的二氧六环/H2O(20mL/4mL)溶液中加入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(439mg,2.0mmol)、碳酸钠(318mg,3.0mmol)、和Pd(PPh3)4(232mg,0.2mmol)。将所得混合物保持在氮气下,并在80℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,用H2O(50mL)稀释,然后用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到4-(4-氯-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯胺为白色固体(350mg,58%)。MS(ESI)m/z 301.1[M+H]+。
步骤3)5-(4-氨基苯基)-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺
向4-(4-氯-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯胺(470mg,1.56mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应在密闭管中于130℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,用H2O(30mL)稀释,然后用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到5-(4-氨基苯基)-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺为白色固体(70mg,15%)。MS(ESI)m/z 282.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(s,1H),7.52(s,1H),7.15(d,J=8.4Hz,2H),6.67(d,J=8.4Hz,2H),6.26-5.91(m,2H),5.87–5.82(m,1H),5.22(s,2H),5.03-4.93(m,4H)。
步骤4)N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向5-(4-氨基苯基)-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(40mg,0.14mmol)的DCM(10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,6H,7H-吡唑并[3,2-c]吗啉-3-羧酸(37mg,0.14mmol)、EDCI(41mg,0.24mmol)、HOAT(29mg,0.21mmol)和DIEA(55mg,0.42mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物用H2O(30mL)稀释,用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18150x21.2mm,5um,ACN-H2O(0.1%FA)20%-30%)纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(25.7mg,37%)。MS(ESI)m/z 524.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.43(s,1H),8.14(s,1H),7.74–7.70(m,3H),7.63–7.59(m,2H),7.56-7.50(m,3H),7.47(d,J=8.8Hz,2H),6.30-6.04(m,2H),5.92-5.83(m,1H),5.13(s,2H),5.04–4.96(m,4H),4.10(t,J=4.8Hz,2H),3.70(t,J=4.8Hz,2H)。
实施例11N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
步骤1)4-氯-5-碘-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
根据实施例10步骤(1)所述方法制备得到4-氯-5-碘-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶为白色固体(3.0g,89%)。MS(ESI)m/z 335.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(s,1H),8.41(s,1H),5.96–5.88(m,1H),4.99(dt,J=14.7,7.0Hz,4H)。
步骤2)4-(4-氯-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯胺
向4-氯-5-碘-7-(氧杂环丁烷-3-基)吡咯并[2,3-d]嘧啶(670mg,2.0mmol)的二氧六环/H2O(20mL/4mL)溶液中加入N-(3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(475mg,2.0mmol)、碳酸钠(318mg,3.0mmol)、和Pd(PPh3)4(232mg,0.2mmol)。将所得混合物保持在氮气下,并在80℃下搅拌6h。将混合物浓缩以除去有机物,加入H2O(50mL)稀释,用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到4-(4-氯-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯胺为白色固体(400mg,62%)。MS(ESI)m/z 319.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,1H),8.08(s,1H),7.10(t,J=8.6Hz,1H),6.47–6.40(m,2H),6.02–5.94(m,1H),5.54(s,2H),5.04(dt,J=14.8,7.1Hz,4H)。
步骤3)5-(4-氨基-2-氟苯基)-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺
向4-(4-氯-7-(氧杂环丁烷-3-基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯胺(500mg,1.57mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应在密闭管中于130℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,加入H2O(30mL)稀释,然后用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到5-(4-氨基-2-氟苯基)-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺为白色固体(70mg,15%)。MS(ESI)m/z 300.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(s,1H),7.53(s,1H),7.07(t,J=8.6Hz,1H),6.50–6.43(m,2H),6.115-5.90(m,2H),5.87–5.82(m,1H),5.56(s,2H),5.02–4.94(m,4H)。
步骤4)N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向5-(4-氨基-2-氟苯基)-7-(氧杂环丁烷-3-基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(35mg,0.12mmol)的DCM(10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,6H,7H-吡唑并[3,2-c]吗啉-3-羧酸(32mg,0.12mmol)、EDCI(35mg,0.18mmol)、HOAT(25mg,0.18mmol)和DIEA(46mg,0.36mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物加入H2O(30mL),用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18150x21.2mm,5um,ACN-H2O(0.1%FA)15%-40%)纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(23.4mg,37%)。MS(ESI)m/z 542.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.55(s,1H),8.14(s,1H),7.85(d,J=12.0Hz,1H),7.70(s,1H),7.63–7.58(m,2H),7.53(d,J=8.0Hz,3H),7.43-7.32(m,2H),6.24-6.00(m,2H),5.90–5.84(m,1H),5.13(s,2H),5.54-4.94(m,4H),4.10(t,J=4.8Hz,2H),3.71(t,J=4.6Hz,2H)。
实施例12N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向5-(4-氨基苯基)-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(40mg,0.14mmol)的DCM(10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(37mg,0.14mmol)、EDCI(41mg,0.24mmol)、HOAT(29mg,0.21mmol)和DIEA(55mg,0.42mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物加入H2O(30mL),用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(0.1%FA)25%-30%)纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(10.8mg,15%)。MS(ESI)m/z 522.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.70(s,1H),8.14(s,1H),7.73–7.70(m,3H),7.62-7.56(m,2H),7.52(d,J=7.2Hz,1H),7.49–7.45(m,4H),6.127-6.08(m,2H),5.92-5.83(m,1H),5.04-4.95(m,4H),3.57(t,J=6.0Hz,2H),3.22(t,J=6.4Hz,2H),2.01–1.96(m,2H),1.85–1.80(m,2H)。
实施例13N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向5-(4-氨基-2-氟苯基)-7-(氧杂环丁烷-3-基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(35mg,0.12mmol)的DCM(10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(31mg,0.12mmol)、EDCI(35mg,0.18mmol)、HOAT(25mg,0.18mmol)和DIEA(46mg,0.36mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物加入H2O(30mL),用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(0.1%FA)25%-30%)纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(氧杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(22.7mg,36%)。MS(ESI)m/z 540.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.83(s,1H),8.14(s,1H),7.89-7.84(m,1H),7.69(s,1H),7.59(t,J=7.5Hz,2H),7.54–7.44(m,3H),7.38(t,J=8.6Hz,1H),7.33–7.28(m,1H),6.22-6.12(m,2H),5.89–5.84(m,1H),5.04-4.94(m,4H),3.58(t,J=6.0Hz,2H),3.21(t,J=6.4Hz,2H),2.02–1.97(m,2H),1.85–1.78(m,2H)。
实施例14N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
将2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(43.9mg,0.17mmol)、5-(4-氨基苯基)-7-(氧杂环戊烷-3-基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(50mg,0.17mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(49mg,0.255mmol)、HOAT(27.8mg,0.204mmol)和DIEA(66mg,0.51mmol)的DCM(20mL)混合物在40℃下加热反应16h。反应混合物用DCM(20mL)稀释,然后用盐水(30mL×2)洗。有机层经无水Na2SO4干燥,蒸发浓缩。所得残余物用MeOH(3mL)重结晶,过滤,滤饼用MeOH(1mL)洗,真空干燥,得到N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(43.7mg,48%收率)。MS(ESI):536.3[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.69(s,1H),8.16(s,1H),7.70(d,J=8.4Hz,2H),7.61-7.57(m,2H),7.52(d,J=7.2Hz,1H),7.48-7.41(m,4H),7.32(s,1H),6.19(s,2H),5.42-5.40(m,1H),4.10(q,J=7.6Hz,1H),3.99-6.95(m,1H),3.90-3.81(m,2H),3.57(t,J=5.6Hz,2H),3.22(t,J=6.0Hz,2H),2.50-2.41(m,1H),2.22-2.15(m,1H),2.05-1.95(m,2H),1.86-1.78(m,2H)。
实施例15N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
将2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(41.3mg,0.16mmol)、5-(4-氨基-2-氟苯基)-7-(氧杂环戊烷-3-基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(50mg,0.16mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(46mg,0.24mmol)、HOAT(26.3mg,0.19mmol)和DIEA(62mg,0.48mmol)的DCM(20mL)混合物在40℃下加热反应16h。反应混合物用DCM(20mL)稀释,然后用盐水(30mL×2)洗。有机层经无水Na2SO4干燥,过滤,蒸发浓缩。所得残余物用MeOH(3mL)重结晶,过滤,滤饼用MeOH(1mL)洗,真空干燥,得到N-(4-(4-氨基-7-(四氢呋喃-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(41.3mg,46%收率)。MS(ESI):554.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.82(s,1H),8.14(s,1H),7.85(d,J=12.4Hz,1H),7.62-7.57(m,2H),7.52(d,J=7.2Hz,1H),7.50-7.46(m,2H),7.36(t,J=8.4Hz,1H),7.33-7.26(m,2H),6.09(s,2H),5.43-5.37(m,1H),4.09(q,J=8.0Hz,1H),3.99-3.95(m,1H),3.90-3.79(m,2H),3.58(t,J=5.6Hz,2H),3.21(t,J=6Hz,2H),2.50-2.42(m,1H),2.21-2.13(m,1H),2.02-1.97(m,2H),1.86-1.82(m,2H)。
实施例16N-(4-(4-氨基-7-(3-羟基环戊基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
步骤1)3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇
在0℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(900mg,3.22mmol)的THF(40mL)混合物中加入环戊烷-1,3-二醇(493mg,4.83mmol)、三苯基膦(1.7g,6.44mmol)和DIAD(1.3g,6.44mmol)。反应在25℃下搅拌16h。LCMS显示得到产物。混合物中加入H2O(30mL),再用EA(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇为白色固体(800mg,粗品)。MS(ESI)m/z 363.7[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.63(s,1H),8.14(s,1H),5.34-5.26(m,1H),4.85-4.68(m,1H),4.27(s,1H),2.45-2.31(m,1H),2.24–2.13(m,1H),2.05-1.91(m,1H),1.83–1.75(m,3H)。
步骤2)3-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇
向3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇(800mg,2.2mmol)的二氧六环/H2O(10mL/2mL)溶液中加入3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(340mg,1.43mmol)、碳酸钠(466mg,4.4mmol)和Pd(PPh3)4(254mg,0.22mmol)。将所得混合物保持在氮气下,并在80℃下搅拌2小时。将混合物浓缩以除去有机物,然后用EA(50mL×2)和H2O(50mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇为白色固体(320mg,41.94%)。MS(ESI)m/z346.7[M+H]+。
步骤3)3-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇
向3-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇(320mg,0.92mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应在密闭管中于130℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,加入H2O(30mL)稀释,用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=10/1),得到3-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇为白色固体(200mg,66.2%)。MS(ESI)m/z 327.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.09(s,1H),7.36–7.21(m,2H),7.03(t,J=8.7Hz,1H),6.68(s,1H),6.51–6.41(m,2H),5.89(s,2H),4.71(d,J=3.5Hz,1H),4.35(d,J=2.6Hz,1H),4.10(q,J=5.3Hz,1H),2.26–1.96(m,5H),1.88-1.77(m,1H)。
步骤4)N-(4-(4-氨基-7-(3-羟基环戊基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向3-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇(62.2mg,0.19mmol)的DCM(20mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(50mg,0.19mmol)、EDCI(52mg,0.28mmol)、HOAT(37mg,0.28mmol)和DIEA(74mg,0.57mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。混合物中加入H2O(30mL),用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(15-40)(0.1%FA))纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(3-羟基环戊基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(43.2mg,40.1%)。MS(ESI)m/z 567.8[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.81(s,1H),8.12(s,1H),7.84(dd,J=12.5,2.0Hz,1H),7.59(t,J=7.4Hz,2H),7.53–7.46(m,3H),7.39(s,1H),7.35–7.27(m,2H),6.00(s,2H),5.34–5.28(m,1H),4.71(s,1H),4.36(s,1H),3.58(t,J=5.9Hz,2H),3.20(t,J=6.3Hz,2H),2.54-2.21(m,1H),2.17–2.08(m,2H),2.03–1.96(m,3H),1.89-1.78(m,3H),1.64-1.58(m,1H)。
实施例17N-(4-(4-氨基-7-(3-羟基环戊基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向3-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1-醇(63mg,0.19mmol)的DCM(20mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-羧酸(50mg,0.19mmol)、EDCI(52mg,0.28mmol)、HOAT(37mg,0.28mmol)和DIEA(74mg,0.57mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物中加入H2O(30mL),用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(20-30)(0.1%FA))纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(3-羟基环戊基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(43.8mg,40.2%)。MS(ESI)m/z569.7[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),8.12(s,1H),7.83(dd,J=12.4,1.9Hz,1H),7.63–7.58(m,2H),7.53(dd,J=7.1,5.0Hz,3H),7.41–7.31(m,3H),6.01(s,2H),5.35–5.28(m,1H),5.12(s,2H),4.72(s,1H),4.36(s,1H),4.10(t,J=5.0Hz,2H),3.70(t,J=4.9Hz,2H),2.24-2.01(m,4H),1.88–1.80(m,1H),1.63–1.56(m,1H)。
实施例18N-(4-(4-氨基-7-((1R,4R)-4-羟基环己基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
步骤1)4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇
在0℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2.0g,7.2mmol)的THF(40mL)混合物中加入环己烷-1,4-二醇(1.67g,14.4mmol)、三苯基膦(3.7g,14.4mmol)和DIAD(2.9g,14.4mmol)。反应在25℃下搅拌16h。LCMS显示得到产物。混合物加入H2O(30mL),再用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇为白色固体(2g,74.07%)。MS(ESI)m/z 377.7[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.63(s,1H),8.10(s,1H),4.72-4.61(m,1H),4.53(d,J=3.7Hz,1H),3.90(d,J=2.4Hz,1H),2.29-2.15(m,2H),1.81(d,J=12.2Hz,2H),1.65(dd,J=23.2,11.5Hz,4H)。
步骤2)(1R,4R)-4-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇
向4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇(250mg,0.66mmol)的二氧六环/H2O(10mL/2mL)溶液中加入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(144.6mg,0.66mmol)、碳酸钠(210mg,1.98mmol)和Pd(PPh3)4(38mg,0.032mmol)。将所得混合物保持在氮气下,并在80℃下搅拌2小时。将混合物浓缩以除去有机物,然后用EtOAc(50mL×2)和H2O(50mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到(1R,4R)-4-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇为白色固体(100mg,44.05%)。MS(ESI)m/z342.8[M+H]+。
步骤3)(1R,4R)-4-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇
向(1R,4R)-4-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇(95mg,0.27mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应在密闭管中于130℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,然后用EtOAc(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=10/1),得到(1R,4R)-4-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇为白色固体(31mg,34.6%)。MS(ESI)m/z 323.9[M+H]+。步骤4)N-(4-(4-氨基-7-((1R,4R)-4-羟基环己基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向(1R,4R)-4-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇(30mg,0.09mmol)的DCM(20mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(23.2mg,0.09mmol)、EDCI(26mg,0.14mmol)、HOAT(18.5mg,0.14mmol)和DIEA(35mg,0.27mmol),然后混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物用DCM(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(15-40)(0.1%FA))纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-((1R,4R)-4-羟基环己基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(19.2mg,35.6%)。MS(ESI)m/z 563.8[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.68(s,1H),8.12(s,1H),7.69(d,J=8.6Hz,2H),7.59(t,J=7.5Hz,2H),7.52(d,J=7.4Hz,1H),7.46(dt,J=16.7,6.4Hz,4H),7.36(s,1H),6.07(s,2H),4.59(t,J=12.1Hz,1H),4.50(s,1H),3.90(s,1H),3.57(t,J=5.9Hz,2H),3.22(t,J=6.3Hz,2H),2.19(dd,J=24.1,11.8Hz,2H),2.03-1.94(m,2H),1.87-1.76(m,4H),1.72-1.56(m,4H)。
实施例19N-(4-(4-氨基-7-((1R,4R)-4-羟基环己基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
步骤1)(1R,4R)-4-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇
在0℃下,向4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇(250mg,0.66mmol)的二氧六环/H2O(10mL/2mL)溶液中加入3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(156.5mg,0.66mmol)、碳酸钠(140mg,1.32mmol)和Pd(PPh3)4(38mg,0.032mmol)。将所得混合物保持在氮气下,并在80℃下搅拌2小时。将混合物浓缩以除去有机物,然后用EtOAc(50mL×2)和H2O(50mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到(1R,4R)-4-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇为白色固体(130mg,54.4%)。MS(ESI)m/z 360.8[M+H]+。
步骤2)(1R,4R)-4-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇
向(1R,4R)-4-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇(130mg,0.36mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应在密闭管中于130℃下搅拌16h。将混合物浓缩以除去有机物,然后用EtOAc(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH=10/1),得到(1R,4R)-4-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇为白色固体(51mg,35.28%)。MS(ESI)m/z 341.9[M+H]+。
步骤3)N-(4-(4-氨基-7-((1R,4R)-4-羟基环己基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向(1R,4R)-4-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇(51mg,0.15mmol)的DCM(20mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-羧酸(39mg,0.15mmol)、EDCI(43mg,0.23mmol)、HOAT(31mg,0.23mmol)和DIEA(58mg,0.45mmol),然后将混合物在45℃下搅拌16h。反应混合物用DCM(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩。所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN-H2O(18-35)(0.1%FA))纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-((1R,4R)-4-羟基环己基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(29.5mg,32.67%)。MS(ESI)m/z 583.7[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),8.12(s,1H),7.83(dd,J=12.5,1.9Hz,1H),7.64–7.58(m,2H),7.57-7.49(m,3H),7.40–7.28(m,3H),6.02(s,2H),5.12(s,2H),4.64-4.45(m,2H),4.10(t,J=4.9Hz,2H),3.90(s,1H),3.70(t,J=4.9Hz,2H),2.17(dd,J=24.6,12.2Hz,2H),1.81(d,J=11.8Hz,2H),1.65(dd,J=25.2,12.0Hz,4H)。
实施例20(S)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺
步骤1)6-羟基-3-氧己酸乙酯
将在-78℃下由二异丙胺(16.42mL,116.158mmol)和正丁基锂(46.46mL,116.158mmol,2.5M的正己烷溶液)生成的二异丙基酰胺锂溶液在0℃搅拌20分钟,然后冷却至-78℃。向混合物中逐滴加入乙酸乙酯(11.35mL,116.198mmol,1.0当量),并将反应混合物在-78℃下保持1h。然后加入4-丁内酯(10g,116.158mmol),将溶液在-78℃下再搅拌3h,然后用乙醇淬灭并温热至20℃。将产物在乙醚和水之间分层。用1M HCl中和水层后,将所得混合物用乙酸乙酯(3×500mL)萃取,合并有机层,经无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法(0-35%乙酸乙酯/石油醚)纯化,得到6-羟基-3-氧己酸乙酯为黄色油状物(12.0g,59.31%收率)。
步骤2)5-(3-羟基丙基)-2-苯基-1H-吡唑-3-酮
向6-羟基-3-氧己酸乙酯(3.0g,17.222mmol)的1,4-二氧六环(50mL)溶液中加入乙酸钠(4.69g,34.444mmol)、AcOH(1.48mL,24.650mmol)、和苯肼(2.05g,18.944mmol)。将所得混合物在110℃下搅拌3小时。混合物冷却至室温后,将固体滤出。滤液真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法(0-8%MeOH/DCM)纯化,得到5-(3-羟基丙基)-2-苯基-1H-吡唑-3-酮为黄色油状物(3.3g,87.79%收率)。MS(ESI)m/z 219.10[M+H]+。
步骤3)1-苯基-4H,5H,6H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-酮
在0℃、N2(g)气氛下,向5-(3-羟基丙基)-2-苯基-1H-吡唑-3-酮(3.0g,13.745mmol)的THF(300mL)溶液中加入PPh3(3.97g,15.120mmol)。在0℃下滴加DIAD(3.06g,15.120mmol)。混合物在25℃下搅拌3h。混合物在真空下浓缩,所得残余物经硅胶柱色谱法(0-3%MeOH/DCM)纯化,得到1-苯基-4H,5H,6H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-酮为黄色固体(1.6g,58.13%收率)。MS(ESI)m/z 201.10[M+H]+。
步骤4)2-氧-1-苯基-4H,5H,6H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲醛
向1-苯基-4H,5H,6H-吡咯并[1,2-b]吡唑-2-酮(1.60g,7.990mmol)的乙腈(15mL)溶液中加入N-(氯亚甲基)-N-甲基甲基氯化铵(1.53g,11.986mmol)。将所得混合物在25℃下搅拌过夜。然后加入NaOH(水溶液)。将所得混合物在25℃下搅拌2h。反应用水(100mL)淬灭。所得混合物用DCM(3×100mL)萃取。合并有机层,经无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(0-100%乙酸乙酯/石油醚),得到2-氧-1-苯基-4H,5H,6H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲醛为黄色固体(1.2g,65.80%收率)。MS(ESI)m/z 229.10[M+H]+。
步骤5)2-氧-1-苯基-4H,5H,6H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸
在0℃下,向2-氧-1-苯基-4H,5H,6H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲醛(1.5g,6.572mmol)的t-BuOH(24mL)混合物中加入2-甲基-2-丁烯(4.51g,64.403mmol),然后加入亚氯酸钠(1.72g,19.058mmol)的H2O(8mL)溶液。然后向混合物中加入KH2PO4(4.38g,32.201mmol)的H2O(8mL)溶液,并将混合物温热至室温。将混合物搅拌18小时,冷却至室温后,将混合物过滤,所得固体用MeCN重结晶,得到2-氧-1-苯基-4H,5H,6H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸为黄色固体(1.0g,62.30%收率)。MS(ESI)m/z 245.10[M+H]+。
步骤6)(S)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺
向2-氧-1-苯基-4H,5H,6H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸(500mg,2.047mmol)的DCM(20mL)溶液中加入HOAT(334.36mg,2.456mmol)、DIEA(793.71mg,6.141mmol)、1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇(580.01mg,2.047mmol)、和EDCI(510.16mg,2.661mmol)。将所得混合物在40℃下搅拌3h,冷却至室温后,将反应用水(100mL)淬灭。所得混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并有机层,经无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩。所得残余物经手性HPLC在以下条件下纯化(柱:CHIRALART Cellulose-SB,3*25cm,5μm;流动相A:己烷:DCM=1:1(0.5%2M NH3-MeOH)--HPLC,流动相B:MeOH—HPLC;流速:50mL/min;梯度:20分钟内从85B至85B;220/254nm;RT:19;进样量:1mL;运行次数:15),得到(S)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺为白色固体(106.1mg,10.15%收率)。LCMS(ES,m/z)510.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.25(s,1H),8.13(s,1H),7.72(d,J=4.2Hz,2H),7.52–7.58(m,4H),7.40–7.43(m,3H),7.27(s,1H),6.06(br,2H),4.95(d,J=2.4Hz,1H),4.00-4.13(m,3H),3.80(t,J=6.8Hz,2H),3.17(t,J=7.2Hz,2H),2.41-2.50(m,2H),1.03(d,J=2.8Hz,3H)。
实施例21(R)-N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺
由实施例20所述方法分离得到实施例21为白色固体(106.0mg,10.15%收率)。LCMS(ES,m/z)510.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.25(s,1H),8.13(s,1H),7.72(d,J=4.2Hz,2H),7.52–7.58(m,4H),7.40–7.43(m,3H),7.27(s,1H),6.06(br,2H),4.95(d,J=2.4Hz,1H),4.00-4.13(m,3H),3.80(t,J=6.8Hz,2H),3.17(t,J=7.2Hz,2H),2.41-2.50(m,2H),1.03(d,J=2.8Hz,3H)。
实施例22N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺
将EDCI(380.0mg,1.94mmol)和HOAT(33.0mg,0.238mmol)加至2-氧-1-苯基-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸(308.0mg,1.261mmol)和1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)丙烷-2-醇(300.0mg,1.059mmol)的DCM(15mL)混合物中,将混合物回流过夜。TLC显示起始原料耗尽,将H2O(20mL)加入混合物中,然后用DCM(100mL x2)萃取。合并有机相,真空浓缩,得到黄色固体。所得固体经快速柱色谱法(DCM:MeOH=1:0-20:1)纯化,得到标题化合物为黄色固体(79.6mg,13.7%收率)。HRMS(ESI+)510.2246[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ10.28(s,1H),8.31(s,1H),7.79(d,J=8.4Hz,2H),7.55(t,J=7.8Hz,2H),7.42(dd,J=18.0,9.3Hz,5H),7.02(s,1H),5.81(s,2H),4.35–4.29(m,1H),4.29–4.21(m,1H),4.20–4.13(m,1H),3.75(t,J=6.9Hz,2H),3.35(t,J=7.4Hz,2H),3.22(s,1H),2.61–2.50(m,2H),1.28(d,J=6.1Hz,3H)。
实施例23N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
将EDCI(116mg,0.593mmol)和HOAT(11mg,0.0792mmol)加至2-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(105mg,0.3899mmol)和2-氧-1-苯基-5,6-二氢-4H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-羧酸(112mg,0.4304mmol)的DCM(6mL)混合物中,将混合物回流过夜。TLC显示起始原料耗尽,将H2O(20mL)加入混合物中,然后用DCM(50mL x2)萃取。合并有机相,真空浓缩,得到黄色固体。所得固体经快速柱色谱法(DCM:MeOH=100:1-10:1)纯化,得到标题化合物为黄色固体(33.1mg,94.6质量%,0.0612mmol,15.7%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:512.3([M+H]+)。HRMS(ESI+)512.2037[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.28(s,1H),8.16(s,1H),7.61(d,J=8.3Hz,2H),7.46(t,J=7.5Hz,2H),7.38(t,J=7.4Hz,1H),7.30(dd,J=7.6,5.4Hz,4H),7.27(s,1H),6.93(d,J=3.2Hz,1H),5.16(s,2H),4.85(s,1H),4.26–4.19(m,2H),4.09–4.02(m,2H),3.87(M,2H),3.60–3.53(m,2H)。
实施例24N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基-2-甲基丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
步骤1)1-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-甲基丙烷-2-醇
在0℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(3.0g,11mmol)的DMF(10mL)溶液中加入60%油分散氢化钠(560mg,14.0012mmol),然后将混合物搅拌30分钟。将2,2-二甲基环氧乙烷(5.0mL,56mmol)滴加至混合物中,再搅拌过夜。将反应混合物用水(10ml)淬灭,用EtOAc(100mL×3)萃取,合并有机相,用H2O(30mL)洗,浓缩,所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(PE:EtOAC=5:1-0:1),得到白色固体(2.6g,69%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:352.0[M+H]+。
步骤2)(4-(4-氯-7-(2-羟基-2-甲基丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯
向1-(4-氯-5-碘-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-甲基-丙烷-2-醇(2.57g,7.31mmol)的二氧六环(50mL)和H2O(10ml)溶液中加入N-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(2.8g,8.8mmol)、Pd(PPh3)4(852.0mg,0.734mmol)、和碳酸铯(6.0g,18mmol)。将反应混合物回流过夜。反应混合物用水(200mL)淬灭,并用EtOAc(250mL×3)萃取,合并的有机层用盐水(100mL×2)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,真空浓缩,残余物经硅胶柱色谱法纯化(PE:EtOAc=1:1-0:1),得到标题化合物,为黄色固体(2.8g,92%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:417.15[M+H]+。
步骤3)1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-甲基丙烷-2-醇
在压力容器中,向1-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-甲基-丙烷-2-醇(2.8g,8.8mmol)的二氧六环(10mL)溶液中加入NH3(80mL,25%的水溶液),将反应混合物在130℃下搅拌24小时。将反应混合物真空浓缩,残余物经硅胶柱色谱法纯化(PE:EtOAc=1:1),得到标题化合物为白色固体(1.56g,59%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:297.5[M+H]+。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.09(s,1H),7.11(d,J=8.3Hz,2H),7.10(s,1H),6.66(d,J=8.3Hz,2H),6.00(s,2H),5.19(s,2H),4.81(s,1H),4.08(s,2H),1.07(s,6H)。步骤4)N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基-2-甲基丙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向2-氧-1-苯基-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(305mg,1.181mmol)的DCM(20ml)溶液中加入1-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-甲基-丙烷-2-醇(350mg,1.177mmol)、EDCI(92.8mg,0.476mmol)和HOAT(33mg,0.238mmol)。将反应混合物回流过夜。反应混合物用水(50ml)淬灭,并用DCM(100mL×2)萃取,合并的有机层用H2O(50mL×2)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,真空浓缩,残余物经硅胶柱色谱法纯化(DCM:MeOH=100:1-10:1),得到标题化合物为黄色固体(231.0mg,34.6%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:538.25[M+H]+。HRMS(ESI)538.2569[M+H]+。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ10.66(s,1H),8.25(s,1H),7.74(d,J=8.3Hz,2H),7.53(t,J=7.7Hz,2H),7.45(t,J=7.4Hz,1H),7.40(d,J=8.3Hz,2H),7.36(d,J=7.8Hz,2H),6.94(s,1H),5.25(s,2H),4.72(s,1H),4.19(s,2H),3.56(t,J=5.9Hz,2H),3.40(t,J=6.4Hz,2H),2.07(dt,J=11.5,5.7Hz,2H),1.94–1.89(m,2H),1.24(s,6H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.58,160.46,158.39,155.73,155.12,146.71,145.34,137.37,133.12,129.71,128.16,122.81,121.68,118.43,116.80,50.00,49.59,45.97,41.15,36.53,21.56。
实施例25N-(4-(4-氨基-7-(2-(羟基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6,7,8-六氢-1H-吡唑并[1,5-a]氮杂环庚烷-3-甲酰胺
步骤1)8-羟基-3-氧代辛酸乙酯
在-78℃条件下,向含有LDA(33.0ml,65.70mmol,2mol/L)的四氢呋喃(300ml)溶液中加入乙酸乙酯(3.86g,43.80mmol)。将反应液保持低温搅拌1小时后加入氧杂环庚烷-2-酮(5.00g,43.80mmol),继续搅拌3小时,用水(50ml)淬灭后,用乙酸乙酯(200mL x3)萃取。合并有机相,并用盐水(100mL x2)洗,无水硫酸钠干燥,过滤并减压浓缩。所得残余物经硅胶柱层析纯化(EtOAc/PE(v/v)=1/5),得到标题化合物为黄色液体(4.00g,45.1%收率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):4.34(t,J=5.1Hz,1H),4.09(q,J=7.1Hz,2H),3.56(s,2H),3.40-3.35(m,2H),2.51(t,J=7.2Hz,2H),1.52-1.36(m,4H),1.25-1.20(m,2H),1.19(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤2)8-碘-3-氧代辛酸乙酯
向含有8-羟基-3-氧代辛酸乙酯(4.00g,19.80mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入1H-咪唑(4.03g,59.30mmol)、和三苯基膦(10.40g,39.60mmol)。将反应液降温至0℃,加入碘(10.00g,39.60mmol),之后在室温下继续搅拌4小时,用饱和亚硫酸钠溶液(100ml)淬灭,用二氯甲烷(200mL x3)萃取。合并有机相,用盐水(100mL x2)洗,经无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。所得残余物经硅胶柱层析纯化(EtOAC/PE(v/v)=1/20),得到标题化合物为黄色液体(5.40g,87.5%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:313.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):4.09(q,J=7.1Hz,2H),3.57(s,2H),3.26(t,J=6.9Hz,2H),2.53(dd,J=12.7,5.4Hz,2H),1.74(dd,J=14.5,7.1Hz,2H),1.53-1.44(m,2H),1.36-1.28(m,2H),1.19(t,J=7.1Hz,3H)。
步骤3)1-苯基-5,6,7,8-四氢-1H-吡唑并[1,5-a]氮杂环庚烷-2(4H)-酮
向含有8-碘-3-氧代辛酸乙酯(5.20g,16.65mmol)的1,4-二氧六环(100ml)溶液中加入苯肼(1.98g,18.32mmol)、冰醋酸(3.00g,49.97mmol)和醋酸钠(4.10g,49.97mmol)。将反应液加热至回流,搅拌24小时,减压浓缩,所得残余物经硅胶柱层析纯化(MeOH/DCM(v/v)=1/30),得到标题化合物为黄色液体(1.20g,31.6%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:229.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.48(t,J=7.8Hz,2H),7.32-7.27(m,3H),5.24(s,1H),2.74(s,2H),1.91(s,2H),1.68(s,4H),1.58(s,2H)。
步骤4)2-氧代-1-苯基-2,4,5,6,7,8-六氢-1H-吡唑并[1,5-a]氮杂环庚烷-3-甲醛
向含有1-苯基-5,6,7,8-四氢-1H-吡唑并[1,5-a]氮杂环庚烷-2(4H)-酮(1.00g,4.38mmol)的氯仿(50mL)溶液中加入(氯亚甲基)-二甲基氯化铵(3.36g,26.30mmol)。将反应液加热至回流搅拌6小时,用水(20ml)淬灭,用饱和碳酸氢钠溶液调节至pH=7,之后用二氯甲烷(200mL x3)萃取。合并有机相,用盐水(100mL x2)洗,经无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。所得残余物经硅胶柱层析纯化(MeOH/DCM(v/v)=1/30),得到标题化合物为黄色液体(1.12g,100.0%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:257.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.65(s,1H),7.56(t,J=7.7Hz,2H),7.46(t,J=7.4Hz,1H),7.33(d,J=7.5Hz,2H),3.81-3.75(m,2H),3.32-3.25(m,2H),1.77-1.63(m,6H)。
步骤5)2-氧代-1-苯基-2,4,5,6,7,8-六氢-1H-吡唑并[1,5-a]氮杂环庚烷-3-甲酸
向含有2-氧代-1-苯基-2,4,5,6,7,8-六氢-1H-吡唑并[1,5-a]氮杂环庚烷-3-甲醛(1.50g,5.85mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入二甲基亚砜(3.42g,43.90mmol)、磷酸(0.43g,3.51mmol,80%的水溶液)和水(3mL)。将反应液室温搅拌30分钟之后加入次氯酸钠(1.32g,11.70mmol,80%)和水(10ml),继续室温搅拌3小时,用二氯甲烷(10mL x3)洗,并用饱和碳酸氢钠溶液调节至pH=7。水相用浓盐酸(12M)调节至pH=1,析出固体,过滤,收集滤饼,得到标题化合物为白色固体(0.40g,25.0%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:273.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.30(s,1H),7.60(t,J=7.5Hz,2H),7.52(t,J=7.4Hz,1H),7.41(d,J=7.4Hz,2H),3.84-3.76(m,2H),3.30(d,J=4.3Hz,2H),1.81-1.68(m,4H),1.64(d,J=4.3Hz,2H)。
步骤6)N-(4-(4-氨基-7-(2-(羟基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧代-1-苯基-2,4,5,6,7,8-六氢-1H-吡唑并[1,5-c]氮杂环庚烷-3-甲酰胺
向含有2-氧代-1-苯基-2,4,5,6,7,8-六氢-1H-吡唑并[1,5-a]氮杂环庚烷-3-甲酸(0.16g,0.59mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中加入2-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(0.16g,0.59mmol)、EDCI(0.23g,1.18mmol)和HOAT(0.16g,1.18mmol)。将反应液加热至回流搅拌过夜,用水(50ml)淬灭后,用二氯甲烷(200mL x3)萃取。合并有机相,用饱和碳酸氢钠溶液(50mL)和盐水(100mL x2)洗,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。所得残余物经硅胶柱层析纯化(MeOH/DCM(v/v)=1/30),得到标题化合物为黄色固体(0.080g,26.0%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:524.2[M+H]+;HRMS(ESI+)524.2390[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.86(s,1H),8.14(s,1H),7.70(d,J=8.5Hz,2H),7.60(t,J=7.6Hz,2H),7.50(t,J=7.4Hz,1H),7.41(dd,J=7.8,3.3Hz,5H),7.30(s,1H),6.07(s,2H),4.22(t,J=5.6Hz,2H),3.81(d,J=8.3Hz,2H),3.79-3.73(m,2H),3.49(s,2H),1.76(s,4H),1.64(s,2H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ(ppm):164.03,161.53,160.89,157.69,151.87,150.73,137.86,133.77,130.02,129.95,129.33,128.95,126.90,124.30,120.04,114.96,100.43,97.31,60.42,49.11,49.06,46.96,29.74,26.34,25.07,24.97。
实施例26N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基乙基)-7H-吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基)苯基-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
步骤1)2-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇
向含有4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(5.00g,17.89mmol)的DMF(50mL)溶液中加入2-溴乙醇(4.47g,35.78mmol)和氢氧化钾(3.00g,53.67mmol)。将反应液加热至70℃搅拌10小时,用水(200ml)淬灭,过滤,收集滤饼,得到标题化合物为黄色固体(3.0g,52.0%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:324.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.63(s,1H),7.97(s,1H),4.93(t,J=5.4Hz,1H),4.31(t,J=5.4Hz,2H),3.75(q,J=5.4Hz,2H)。
步骤2)(4-(4-氯-7-(2-羟基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯
向含有2-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(2.80g,8.65mmol)的1,4-二氧六环(50mL)和水(10ml)的混合液中加入(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯(2.76g,8.65mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(1.00g,0.86mmol)和碳酸钠(2.75g,25.96mmol)。将反应液加热至回流搅拌6小时,用水(100ml)淬灭后,用乙酸乙酯(200mL x3)萃取。合并有机相,用盐水(100mL x2)洗,经无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。所得残余物经硅胶柱层析纯化(MeOH/DCM(v/v)=1/30),得到标题化合物为黄色固体(0.80g,24.0%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:389.2[M+H]+。
步骤3)2-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇
在高压釜中,向含有(4-(4-氯-7-(2-羟基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)氨基甲酸叔丁基酯(0.80g,2.06mmol)的1,4-二氧六环(5ml)溶液中加入氨水(25ml,25%的水溶液)。将反应液加热至130℃搅拌24h,减压浓缩。所得残余物经硅胶柱层析纯化(MeOH/DCM(v/v)=1/20),得到标题化合物为白色固体(0.25g,45.0%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:270.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.10(s,1H),7.14-7.09(m,3H),6.66(d,J=8.3Hz,2H),5.99(s,2H),5.18(s,3H),4.19(t,J=5.8Hz,2H),3.73(t,J=5.8Hz,2H)。
步骤4)N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基乙基)-7H-吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基)苯基-2-氧代-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向含有2-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(0.12g,0.45mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中加入2-氧代-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸(0.12g,0.45mmol)、EDCI(0.17g,0.89mmol)和HOAT(0.12g,0.89mmol)。将反应液加热至回流搅拌过夜,用水(50ml)淬灭后,用二氯甲烷(200mL x3)萃取。合并有机相,用饱和碳酸氢钠溶液(50mL)和盐水(100mL x2)洗,经无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。所得残余物经硅胶柱层析纯化(MeOH/DCM(v/v)=1/30),得到标题化合物为白色固体(100.0mg,45.1%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:510.2[M+H]+。HRMS(ESI+)510.2248[M+H]+;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.67(s,1H),8.13(s,1H),7.70(d,J=7.4Hz,2H),7.58(d,J=6.7Hz,2H),7.51(d,J=6.6Hz,1H),7.43(dd,J=24.5,7.2Hz,4H),7.30(s,1H),6.07(s,2H),4.98(s,1H),4.22(s,2H),3.75(s,2H),3.56(s,2H),3.22(s,2H),1.98(s,2H),1.82(s,2H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.21,161.57,157.69,154.05,151.87,150.71,137.99,133.15,129.89,129.85,129.35,129.30,127.72,124.28,119.86,114.99,100.45,96.72,60.43,46.96,46.90,23.90,22.30,19.08。
实施例27N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-甲酰胺
向含有2-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(90mg,0.33mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中加入1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-甲酸(77mg,0.33mmol)、EDCI(130mg,0.67mmol)和HOAT(91mg,0.67mmol)。将反应液加热至回流搅拌过夜,用水(50ml)淬灭后,用二氯甲烷(200mL x3)萃取。合并有机相,用饱和碳酸氢钠溶液(50mL)和盐水(100mL x2)洗,经无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩。所得残余物经硅胶柱层析纯化(MeOH/DCM(v/v)=1/30),得到标题化合物为白色固体(50.0mg,31.0%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:484.2[M+H]+。HRMS(ESI+)484.2091[M+H]+;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.82(s,1H),8.14(s,1H),7.70(d,J=8.2Hz,2H),7.60(t,J=7.3Hz,2H),7.53(d,J=7.2Hz,1H),7.43(dd,J=13.8,8.0Hz,4H),7.30(s,1H),6.07(s,2H),4.97(s,1H),4.22(s,2H),3.75(d,J=5.0Hz,2H),2.72(s,3H),2.51(s,3H)。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.54,161.67,157.69,154.26,151.87,150.70,137.95,133.52,129.95,129.91,129.35,127.63,124.30,119.96,114.99,100.45,97.66,60.43,46.96,33.75,11.90。
实施例28N-(4-(4-氨基-7-(2-羟基乙基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺
将EDCI(900.0mg,4.60mmol)和HOAT(86mg,0.619mmol)加至2-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)乙醇(760mg,2.822mmol)和2-氧-1-苯基-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸(831mg,3.403mmol)的DCM(15mL)混合物中,将混合物回流过夜。TLC显示起始原料耗尽,将H2O(20mL)加入混合物中,然后用DCM(50mL x2)萃取。合并有机相,真空浓缩,得到黄色固体。所得固体经快速柱色谱法(DCM:MeOH=100:1-10:1)纯化,得到标题化合物为黄色固体(366.4mg,0.6702mmol,23.75%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:496.3([M+H]+)。
实施例29(1S,4S)-4-(4-氨基-5-(2-氟-4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯
步骤1)(1S,4S)-4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯
室温下,向(1S,4S)-4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己烷-1-醇(300mg,0.79mmol)、异丁酰氯(127mg,1.20mmol)和TEA(240.73mg,2.38mmol)的DCM(30mL)溶液中加入DMAP(9.71mg,0.079mmol),混合物在40℃下搅拌反应24h。反应混合物用水(20mL)淬灭,然后用DCM(20mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(10mL×2)洗,经Na2SO4干燥,减压浓缩。所得残余物经硅胶色谱法纯化(EA/PE=1/1),得到(1S,4S)-4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯为白色固体(260mg,62.13%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:447.6[M+H]+。
步骤2)(1S,4S)-4-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯
向密封管中的(1S,4S)-4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯(260mg,0.58mmol)的二氧六环(6mL)溶液中加入NH3溶液(25%,6mL),所得混合物于120℃下搅拌反应16h。冷却后,将混合物减压浓缩,所得残余物经硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到(1S,4S)-4-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯为黄色固体(160mg,57.90%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:428.7[M+H]+。
步骤3)(1S,4S)-4-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯
向(1S,4S)-4-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯(160mg,0.37mmol)、3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(115.1mg,0.49mmol)和碳酸钠(118.8mg,1.12mmol)的二氧六环(16mL)和H2O(4mL)混合物中加入1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(43.17mg,0.037mmol),所得混合物于N2氛下在80℃下加热10h。冷却后,将混合物减压浓缩。残余物用水(30mL)稀释,然后用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(20mL×2)洗,经Na2SO4干燥,减压浓缩。所得残余物经硅胶色谱法纯化(EA/PE=1/1),得到(1S,4S)-4-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯为淡黄色固体(120mg,80%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:411.8[M+H]+。
步骤4)(1S,4S)-4-(4-氨基-5-(2-氟-4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯
室温下,向(1S,4S)-4-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯(100mg,0.24mmol)、2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-羧酸(75.89mg,0.29mmol)、DIEA(94.04mg,0.73mmol)和HOAt(49.61mg,0.36mmol)的DCM(20mL)混合物中加入N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(69.87mg,0.36mmol),然后混合物于40℃下加热16h。冷却至室温后,将混合物用DCM(30mL)稀释,然后用盐水(30mL×3)洗。分离的有机层经Na2SO4干燥,减压浓缩。所得残余物经制备型HPLC纯化(Gemini-C18 150x21.2mm,5um.ACN--H2O(0.1%FA)),得到(1S,4S)-4-(4-氨基-5-(2-氟-4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环己基异丁酸酯为白色固体(31.4mg,19.55%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:653.6[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ10.54(s,1H),8.13(s,1H),7.86-7.80(m,1H),7.64-7.58(m,2H),7.54(dd,J=6.9,4.7Hz,3H),7.45(s,1H),7.39-7.29(m,2H),6.05(s,2H),5.12(s,2H),4.80-4.60(m,2H),4.10(t,J=5.0Hz,2H),3.70(t,J=4.8Hz,2H),2.11-1.90(m,6H),1.59(dd,J=23.3,11.3Hz,2H),1.09(d,J=7.0Hz,6H)。
实施例30 3-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
步骤1)3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(140mg,0.5mmol)的THF(20mL)溶液中加入3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(131mg,0.75mmol)、三苯基膦(263mg,1.0mmol)、和DIAD(203mg,1.0mmol)。反应在25℃下搅拌16h,LCMS显示得到产物。将混合物减压浓缩以除去有机物,然后用EA(50mL×2)和H2O(50mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,所得残余物经柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(280mg,粗品)。MS(ESI,pos.ion)m/z:434.9[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ8.65(s,1H),8.34(s,1H),5.55(t,J=7.0Hz,1H),4.32(d,J=7.2Hz,4H),1.42(s,9H)。
步骤2)3-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(280mg,0.65mmol)的二氧六环/H2O(20mL/4mL)溶液中加入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(141mg,0.65mmol)、碳酸钠(103mg,0.97mmol)、和Pd(PPh3)4(75mg,0.065mmol)。所得混合物保持在氮气下,并于80℃下搅拌反应6h。冷却后,将混合物减压浓缩以除去有机物,加入H2O(50mL),用EtOAc(50mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,然后所得残余物经柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(100mg,40%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:400.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ8.62(s,1H),7.97(s,1H),7.21(d,J=8.4Hz,2H),6.62(d,J=8.4Hz,2H),5.65–5.60(m,1H),5.18(s,2H),4.36(d,J=6.4Hz,4H),1.42(s,9H)。
步骤3)3-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向3-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(100mg,0.25mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。将反应于密闭管中在130℃下搅拌16h。冷却后,将混合物减压浓缩以除去有机物,加入H2O(30mL),然后用EtOAc(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,然后所得残余物经柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(40mg,40%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:381.2[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ8.10(s,1H),7.42(s,1H),7.15(d,J=8.4Hz,2H),6.66(d,J=8.4Hz,2H),6.24-5.96(m,2H),5.50–5.45(m,1H),5.21(s,2H),4.36-4.25(m,4H),1.42(s,9H)。
步骤4)3-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向3-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(40mg,0.1mmol)的DCM(10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-4H,6H,7H-吡唑并[3,2-c]吗啉-3-羧酸(26mg,0.1mmol)、EDCI(29mg,0.15mmol)、HOAT(21mg,0.15mmol)、和DIEA(39mg,0.30mmol),然后将混合物于50℃下搅拌反应16h。冷却后,混合物加入H2O(30mL),再用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,然后所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN--H2O(0.1%FA))纯化,得到3-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(40mg,63%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:623.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ10.43(s,1H),8.14(s,1H),7.71(d,J=8.4Hz,2H),7.63–7.59(m,3H),7.55–7.51(m,3H),7.46(d,J=8.8Hz,2H),6.23-6.11(m,2H),5.52–5.49(m,1H),5.13(s,2H),4.32(d,J=8.0Hz,4H),4.12–4.09(t,J=5.0Hz,2H),3.70(t,J=4.8Hz,2H),1.42(s,9H)。
实施例31N-(4-(4-氨基-7-(氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
在0℃下,向3-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(26.6mg,0.04mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入HCl(0.5mL,0.52mmol,4M的二氧六环溶液)。反应在25℃下搅拌2h。将混合物减压浓缩以除去有机物,所得残余物经制备型HPLC纯化(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN--H2O(0.1%FA)10%-40%)得到N-(4-(4-氨基-7-(氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(6.4mg,33%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:523.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ10.43(s,1H),8.33(s,1H),8.14(s,1H),7.72(d,J=6.8Hz,2H),7.67(s,1H),7.60(d,J=6.4Hz,2H),7.54(s,3H),7.45(d,J=7.6Hz,2H),6.23-6.07(m,2H),5.54(s,1H),5.13(s,2H),4.13–4.03(m,4H),3.95–3.88(m,2H),3.72–3.69(m,2H)。
实施例32N-(4-(4-氨基-7-(1-异丁酰基氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
向N-(4-(4-氨基-7-(氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺(40mg,0.08mmol)的DCM(10mL)混合物中加入三乙胺(25mg,0.24mmol)和2-甲基丙酰氯(9mg,0.08mmol),然后混合物于常温下搅拌反应2h。反应混合物中加入H2O(30mL),用DCM(30mL×2)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18150x21.2mm,5um,ACN--H2O(0.1%FA)20%-30%)纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(1-异丁酰基氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(8.2mg,18%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:593.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ10.43(s,1H),8.15(s,1H),7.71(d,J=8.4Hz,2H),7.67(s,1H),7.63–7.58(m,2H),7.56–7.51(m,3H),7.46(d,J=8.4Hz,2H),6.25-6.09(m,2H),5.60–5.55(m,1H),5.13(s,2H),4.69-4.63(m,1H),4.61-4.56(m,1H),4.37-4.31(m,1H),4.27–4.23(m,1H),4.10(t,J=5.0Hz,2H),3.70(t,J=5.0Hz,2H),2.54(s,1H),1.06–0.99(m,6H)。
实施例33N-(4-(4-氨基-7-(哌啶-4-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺盐酸盐
步骤1)4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在0℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(500mg,1.79mmol)、4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.08g,5.3mmol)和三苯基膦(938mg,3.5mmol)的THF(20mL)混合物中加入DIAD(723mg,3.5mmol),混合物在室温下搅拌反应16h。反应混合物用水(20mL)淬灭,然后用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(40mL×2)洗,经Na2SO4干燥,减压浓缩。所得残余物经硅胶色谱法纯化(EtOAc/PE=1/1),得到4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯为白色固体(550mg,63%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:463.1[M+H]+。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),7.44(s,1H),4.90(t,J=12.0Hz,1H),4.34(d,J=12.3Hz,2H),2.93(t,J=12.6Hz,2H),2.07-2.02(m,2H),1.98-1.84(m,2H),1.49(s,9H)。
步骤2)4-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向4-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(200mg,0.43mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(94mg,0.43mmol)和碳酸钠(91mg,0.86mmol)的二氧六环(16mL)和H2O(4mL)混合物中加入1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(35.5mg,0.043mmol),所得混合物于N2氛下、在60℃下加热反应16h。冷却后,将混合物减压浓缩。残余物用水(30mL)稀释,然后用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(20mL×2)洗,经Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩。所得残余物经硅胶色谱法纯化(EtOAc/PE=1/1),得到4-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯为浅黄色固体(160mg,82.6%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:428.1[M+H]+。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),7.33(d,J=8.4Hz,2H),7.23(s,1H),6.85(d,J=8.1Hz,2H),4.99-4.91(m,1H),4.39-4.2(m,2H),3.0-2.92(m,2H),2.12-2.05(m,2H),1.97-1.92(m,2H),1.49(s,9H)。
步骤3)4-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向密封管中的4-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(160mg,0.37mmol)的二氧六环(2mL)溶液中加入NH3溶液(25%,2mL),混合物于130℃下搅拌反应16h。冷却后,将混合物减压浓缩,所得残余物经硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到4-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯为黄色固体(100mg,59%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:409.0[M+H]+。
步骤4)4-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
室温下,向4-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(90mg,0.22mmol)、2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-羧酸(57mg,0.22mmol)、DIEA(85mg,0.66mmol)和HOAt(30mg,0.22mmol)的DCM(20mL)混合物中加入N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(63mg,0.33mmol),所得混合物于50℃下加热反应16h。冷却至室温后,将混合物用DCM(30mL)稀释,然后用盐水(30mL×3)洗。分离的有机层经Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩。残余物经硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH=30/1),得到4-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯为淡黄色固体(50mg,33%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:651.3[M+H]+。
步骤5)N-(4-(4-氨基-7-(哌啶-4-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺盐酸盐
向4-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(50mg,0.08mmol)的二氧六环(1mL)溶液中加入4N HCl的二氧六环(1mL)溶液,混合物于25℃下搅拌反应16h。然后将混合物减压浓缩,得到N-(4-(4-氨基-7-(哌啶-4-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺盐酸盐为淡黄色固体(45mg,97%收率)。MS(ESI):551.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.48(s,1H),9.00(s,1H),8.77(s,1H),8.46(s,1H),7.75(d,J=8.4Hz,2H),7.63-7.51(m,5H),7.46(d,J=8.4Hz,2H),5.13(s,2H),5.00-4.94(m,1H),4.11(s,2H),3.70(s,2H),3.47-3.43(m,2H),3.21-3.13(m,2H),2.33-2.26(m,2H),2.17-2.13(m,2H)。
实施例34N-(4-(4-氨基-7-(1-异丁酰基哌啶-4-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺
在0℃下,向N-(4-(4-氨基-7-(哌啶-4-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺盐酸盐(35mg,0.06mmol)和DIEA(16mg,0.13mmol)的DCM(10mL)溶液中加入2-甲基丙酰氯(6.8mg,0.06mmol)。混合物在室温搅拌2h。将混合物用DCM(20mL)稀释,然后用盐水(20mL×2)洗。分离的有机层经Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩。所得残余物经制备型HPLC纯化(ACN-H2O 0.1%FA,梯度80%至40%),得到N-(4-(4-氨基-7-(1-异丁酰基哌啶-4-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,6,7-四氢-1H-吡唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-3-甲酰胺为白色固体(19.9mg,48.3%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:621.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.46(s,1H),8.36(s,1H),7.77(s,1H),7.73(d,J=8.4Hz,2H),7.64-7.58(m,2H),7.54-7.51(m,3H),7.44(d,J=8.4Hz,2H),5.12(s,2H),4.96-4.87(m,1H),4.64-4.61(m,1H),4.10(s,2H),3.70(s,2H),3.28-3.23(m,2H),2.95-2.89(m,
1H),2.75-2.72(m,1H),2.02-1.90(m,4H),1.06-1.01(m,6H)。
实施例35N-(4-(4-氨基-7-(3-羟基环丁基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-(哌啶-2-基)-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
步骤1)5-氯-N'-(吡啶-2-基)戊酰肼
在0℃下,向2-肼基吡啶(400mg,3.67mmol)和Na2CO3(621mg,5.8g mmol)的DCM(8mL)和H2O(8mL)的混合物中加入5-氯戊酰氯(511.4mg,3.29mmol),混合物在20℃下搅拌反应16h。将混合物用DCM(50mL)稀释,分离的有机层用盐水(20mL×3)洗,然后经Na2SO4干燥,减压浓缩,得到5-氯-N'-(吡啶-2-基)戊酰肼为淡黄色固体(800mg,86.3%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:227.9[M+H]+。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.14(d,J=5.1Hz,1H),7.96(s,1H),7.56(t,J=7.2Hz,1H),6.85-6.79(m,1H),6.71(d,J=8.4Hz,1H),3.60-3.54(m,2H),2.40-2.34(m,2H),1.88-1.78(m,4H)。
步骤2)3-(2-(5-氯戊酰基)-1-(吡啶-2-基)肼基)-3-氧丙酸乙酯
在0℃下,向5-氯-N'-(吡啶-2-基)戊酰肼(800mg,3.51mmol)和碳酸钠(558mg,5.3mmol)的DCM(20mL)混合物中加入3-氯-3-氧丙酸乙酯(528mg,3.51mmol),混合物在20℃下搅拌反应16h。将反应混合物用DCM(40mL)稀释,然后用盐水(20mL×2)洗。分离的有机层经Na2SO4干燥,减压浓缩。所得残余物经硅胶色谱法纯化(EA/PE=1/1),得到3-(2-(5-氯戊酰基)-1-(吡啶-2-基)肼基)-3-氧丙酸乙酯为无色油状物(850mg,67.3%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:342.1[M+H]+。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.32(d,J=4.2Hz,1H),8.22-8.10(m,2H),7.75(t,J=7.2Hz,1H),7.19–7.10(m,1H),4.22(q,J=7.2Hz,2H),3.79-3.70(m,1H),3.58-3.48(m,3H),2.45-2.39(m,2H),1.91-1.84(m,4H),1.33–1.25(m,4H)。
步骤3)3-氧-3-((2-氧哌啶-1-基)(吡啶-2-基)氨基)丙酸乙酯
在0℃下,向3-(2-(5-氯戊酰基)-1-(吡啶-2-基)肼基)-3-氧丙酸乙酯(800mg,2.34mmol)的DMF(15mL)溶液中加入NaH(168mg,7mmol),混合物在室温下搅拌反应2h。将反应混合物用NaH2P4水溶液(10mL)淬灭,然后用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(20mL×3)洗,经Na2SO4干燥,减压浓缩。所得残余物经硅胶色谱法纯化(EA/PE=1/1),得到3-氧-3-((2-氧哌啶-1-基)(吡啶-2-基)氨基)丙酸乙酯为白色固体(600mg,79.8%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:306.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.38(d,J=4.8Hz,1H),7.89-7.70(m,2H),7.26-7.22(m,1H),4.12(q,J=7.2Hz,2H),3.55(t,J=5.2Hz,2H),2.49-2.45(m,2H),1.92-1.87(m,2H),1.87-1.72(m,2H),1.20(t,J=7.2Hz,3H)。
步骤4)2-氧-1-(吡啶-2-基)-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯
向乙醇钠(200mg,3.94mmol)的EtOH(10mL)溶液中加入3-氧-3-((2-氧哌啶-1-基)(吡啶-2-基)氨基)丙酸乙酯(300mg,0.98mmol),混合物于70℃下加热16h。冷却至室温后,混合物减压浓缩。残余物用水(20mL)稀释,然后用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥,减压浓缩。所得残余物经硅胶色谱法纯化(EA/PE=1/1),得到2-氧-1-(吡啶-2-基)-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯为棕色固体(200mg,56%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:288.2[M+H]+。
步骤5)2-氧-1-(吡啶-2-基)-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸
向2-氧-1-(吡啶-2-基)-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯(200mg,0.7mmol)的THF(5mL)和EtOH(5mL)溶液中加入NaOH(84mg,2mmol)的H2O(5mL)溶液,混合物于25℃下搅拌反应16h。将混合物减压浓缩,残余物用水(10mL)稀释。混合物通过1NHCl酸化至pH 4-5,然后将混合物用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥,减压浓缩。所得残余物经制备型HPLC纯化(ACN-H2O 0.1%FA,梯度20%至40%),得到2-氧-1-(吡啶-2-基)-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸为棕色固体(50mg,26%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:260.0[M+H]+。1H NMR(301MHz,DMSO)δ11.84(s,1H),8.57(d,J=4.2Hz,1H),8.05(t,J=7.8Hz,1H),7.67(d,J=8.1Hz,1H),7.49-7.41(m,1H),3.89(t,J=5.7Hz,2H),3.10(t,J=6.3Hz,2H),1.99-1.95(m,2H),1.84-1.78(m,2H)。
步骤6)N-(4-(4-氨基-7-(3-羟基环丁基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-(吡啶-2-基)-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向2-氧-1-(吡啶-2-基)-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(25mg,0.1mmol)、3-[4-氨基-5-(4-氨基苯基)吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基]环丁烷-1-醇(29mg,0.1mmol)、HOAt(13.6mg,0.1mmol)和DIEA(38.8mg,0.3mmol)的DCM(20mL)溶液中加入N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(28.8mg,0.15mmol),混合物于40℃下搅拌反应16h。冷却至室温后,将混合物用DCM(30mL)稀释,然后用盐水(20mL×2)洗。分离的有机层经Na2SO4干燥,减压浓缩。所得残余物经制备型HPLC纯化(ACN-H2O(0.1%FA),梯度25%至50%),得到N-(4-(4-氨基-7-(3-羟基环丁基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-(吡啶-2-基)-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(16mg,28.6%收率)。MS(ESI,pos.ion)m/z:537.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.53(s,1H),8.60(d,J=4.0Hz,1H),8.12(s,1H),8.08(t,J=7.6Hz,1H),7.76(d,J=8Hz,1H),7.71(d,J=8.4Hz,2H),7.54(s,1H),7.46(dd,J=15.3,7.7Hz,3H),6.09(s,2H),5.44-5.37(m,1H),5.23(s,1H),4.47(s,1H),3.92(t,J=5.4Hz,2H),3.30-3.26(m,2H),2.73-2.68(m,2H),2.41-2.32(m,2H),2.05-1.96(m,2H),1.88-1.82(m,2H)。
实施例36 3-(4-氨基-5-(2-氟-4-(2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
步骤1)3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(140mg,0.5mmol)的THF(20mL)混合物中加入3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(131mg,0.75mmol)、三苯基膦(263mg,1.0mmol)、和DIAD(203mg,1.0mmol)。反应在25℃下搅拌16h,LCMS显示得到产物。将混合物减压浓缩以除去有机物,然后用EA(50mL×2)和H2O(50mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,所得残余物经柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(280mg,粗品)为白色固体。LCMS:tR=1.368min,色谱柱(HALO C18 4.6*50mm,2.7μm),MS(ESI,pos.ion)m/z:434.9[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ8.65(s,1H),8.34(s,1H),5.55(t,J=7.0Hz,1H),4.32(d,J=7.2Hz,4H),1.42(s,9H)。
步骤2)3-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(350mg,0.80mmol)的二氧六环/H2O(20mL/4mL)溶液中加入3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯胺(190mg,0.80mmol)、碳酸钠(128mg,1.2mmol)、和Pd(PPh3)4(93mg,0.08mmol)。所得混合物保持在氮气下,并于60℃下搅拌6h。冷却后,将混合物减压浓缩以除去有机物,然后用DCM(50mL×2)和H2O(50mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,所得残余物经柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(380mg,95%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:418.1[M+H]+。
步骤3)3-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向3-(5-(4-氨基-2-氟苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(380mg,0.90mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应于密闭管中在130℃下搅拌16h。冷却后,将混合物减压浓缩以除去有机物,然后用DCM(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,所得残余物经柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(120mg,30%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:399.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ8.10(s,1H),7.42(s,1H),7.06(t,J=8.8Hz,1H),6.49–6.43(m,2H),6.15-5.85(m,2H),5.55(s,2H),5.49-5.42(m,1H),4.35–4.24(m,4H),1.42(s,9H)。
步骤4)3-(4-氨基-5-(2-氟-4-(2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向3-(4-氨基-5-(4-氨基-2-氟苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(50mg,0.13mmol)的DCM(10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-羧酸(32mg,0.13mmol)、EDCI(38mg,0.195mmol)、HOAT(27mg,0.195mmol)、和DIEA(51mg,0.39mmol),所得混合物于50℃下搅拌反应16h。冷却后,混合物用DCM(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN--H2O(0.1%FA))纯化,得到3-(4-氨基-5-(2-氟-4-(2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(40mg,49%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:625.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ10.39(s,1H),8.13(s,1H),7.89–7.85(m,1H),7.61(s,1H),7.58-7.50(m,4H),7.43–7.36(m,3H),6.20-6.05(m,2H),5.51–5.48(m,1H),4.32(d,J=8.4Hz,4H),3.83(t,J=6.8Hz,2H),3.18(t,J=7.2Hz,2H),2.46-2.41(m,2H),1.42(s,9H)。
实施例37N-(4-(4-氨基-7-(氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺
在0℃下,向3-(4-氨基-5-(2-氟-4-(2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(32.4mg,0.05mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入HCl(0.5mL,0.52mmol,4M的二氧六环溶液)。反应于25℃下搅拌2h。将混合物减压浓缩以除去有机物,所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN--H2O(0.1%FA)10%-40%),得到N-(4-(4-氨基-7-(氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺为白色固体(14.3mg,53%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:525.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),8.33(s,1H),8.14(s,1H),7.88(d,J=13.2Hz,1H),7.66(s,1H),7.60-7.51(m,4H),7.45–7.36(m,3H),6.19-6.05(m,2H),5.57–5.50(m,1H),4.09–4.00(m,2H),3.96–3.87(m,2H),3.82(t,J=6.8Hz,2H),3.17(t,J=7.2Hz,2H),2.46-2.41(m,2H)。
实施例38N-(4-(4-氨基-7-(1-异丁酰基氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺
向N-(4-(4-氨基-7-(氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺(80mg,0.15mmol)的DCM(10mL)混合物中加入三乙胺(46mg,0.45mmol)和2-甲基丙酰氯(16mg,0.15mmol),所得混合物于RT下搅拌反应2h。反应混合物用DCM(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,残余物经制备型HPLC(Gemini-C18150x21.2mm,5um,ACN--H2O(0.1%FA)20%-30%)纯化,得到N-(4-(4-氨基-7-(1-异丁酰基氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-3-氟苯基)-2-氧-1-苯基-2,4,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-甲酰胺为白色固体(22.1mg,25%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:595.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),8.14(s,1H),7.90–7.85(m,1H),7.65(s,1H),7.60-7.50(m,4H),7.45–7.35(m,3H),6.28-6.01(m,2H),5.61-5.52(m,1H),4.69–4.58(m,2H),4.34(t,J=9.2Hz,1H),4.27-4.21(m,1H),3.82(t,J=6.8Hz,2H),3.18(t,J=7.2Hz,2H),2.56–2.51(m,1H),2.46-2.39(m,2H),1.06-0.99(m,6H)。
实施例39 3-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
步骤1)3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下,向4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(140mg,0.5mmol)的THF(20mL)混合物中加入3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(131mg,0.75mmol)、三苯基膦(263mg,1.0mmol)、和DIAD(203mg,1.0mmol)。反应于25℃下搅拌16h,LCMS显示得到产物。将混合物减压浓缩以除去有机物,然后用EA(50mL×2)和H2O(50mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,残余物经柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(280mg,粗品)。MS(ESI,pos.ion)m/z:434.9[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ8.65(s,1H),8.34(s,1H),5.55(t,J=7.0Hz,1H),4.32(d,J=7.2Hz,4H),1.42(s,9H)。
步骤2)3-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向3-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(280mg,0.65mmol)的二氧六环/H2O(20mL/4mL)溶液中加入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺(141mg,0.65mmol)、碳酸钠(103mg,0.97mmol)、和Pd(PPh3)4(75mg,0.065mmol)。所得混合物保持在氮气下,并于60℃下搅拌6h。冷却后,将混合物减压浓缩以除去有机物,然后用EA(50mL×2)和H2O(50mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,所得残余物经柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(100mg,40%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:400.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ8.62(s,1H),7.97(s,1H),7.21(d,J=8.4Hz,2H),6.62(d,J=8.4Hz,2H),5.65–5.60(m,1H),5.18(s,2H),4.36(d,J=6.4Hz,4H),1.42(s,9H)。
步骤3)3-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向3-(5-(4-氨基苯基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(100mg,0.25mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入氢氧化铵(10mL)。反应于密闭管中在130℃下搅拌16h。冷却后,将混合物减压浓缩以除去有机物,然后用EA(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,所得残余物经柱色谱法纯化(DCM/MeOH=20/1),得到3-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(40mg,40%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:381.2[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ8.10(s,1H),7.42(s,1H),7.15(d,J=8.4Hz,2H),6.66(d,J=8.4Hz,2H),6.24-5.96(m,2H),5.50–5.45(m,1H),5.21(s,2H),4.36-4.25(m,4H),1.42(s,9H)。步骤4)3-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向3-(4-氨基-5-(4-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(120mg,0.31mmol)的DCM(10mL)混合物中加入2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-羧酸(32mg,0.13mmol)、EDCI(90mg,0.47mmol)、HOAT(64mg,0.47mmol)、和DIEA(121mg,0.93mmol),所得混合物于50℃下搅拌反应16h。冷却后,混合物用DCM(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN--H2O(0.1%FA))纯化,得到3-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯为白色固体(110mg,60%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:621.6[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ10.69(s,1H),8.14(s,1H),7.72–7.69(m,2H),7.62–7.57(m,3H),7.53–7.51(m,1H),7.48–7.44(m,4H),6.23-6.13(m,2H),5.53–5.49(m,1H),4.36-4.28(m,4H),3.57(t,J=5.6Hz,2H),3.22(t,J=6.4Hz,2H),1.99(dd,J=6.7,3.7Hz,2H),1.84–1.80(m,2H),1.42(s,9H)。
实施例40N-(4-(4-氨基-7-(氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
在0℃下,向3-(4-氨基-5-(4-(2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(30mg,0.05mmol)的二氧六环(10mL)混合物中加入HCl(0.5mL,0.52mmol,4M的二氧六环溶液)。反应于25℃下搅拌2h。将混合物减压浓缩以除去有机物,所得残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN--H2O(0.1%FA)10%-40%),得到N-(4-(4-氨基-7-(氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(10.8mg,42%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:520.8[M+H]+。1HNMR:(400MHz,DMSO)δ10.70(s,1H),8.26(s,1H),8.16(s,1H),7.72(d,J=8.4Hz,2H),7.66(s,1H),7.62-7.56(m,2H),7.54–7.41(m,5H),6.30-6.06(m,2H),5.62-5.54(m,1H),4.29(t,J=8.4Hz,,2H),4.13(t,J=9.2Hz,2H),3.58(t,J=5.8Hz,2H),3.21(t,J=6.2Hz,2H),2.02-1.95(m,2H),1.86–1.79(m,2H)。
实施例41N-(4-(7-(1-乙酰基氮杂环丁烷-3-基)-4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺
向N-(4-(4-氨基-7-(氮杂环丁烷-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺(60mg,0.12mmol)的DCM(10mL)混合物中加入三乙胺(37mg,0.36mmol)和乙酰氯(10mg,0.12mmol),所得混合物于RT下搅拌反应2h。反应混合物用DCM(30mL×2)和H2O(30mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗,经无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,残余物经制备型HPLC(Gemini-C18 150x21.2mm,5um,ACN--H2O(0.1%FA)20%-30%)纯化,得到N-(4-(7-(1-乙酰基氮杂环丁烷-3-基)-4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)苯基)-2-氧-1-苯基-1,2,4,5,6,7-六氢吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酰胺为白色固体(44.6mg,66%)。MS(ESI,pos.ion)m/z:563.1[M+H]+。1H NMR:(400MHz,DMSO)δ10.70(s,1H),8.15(s,1H),7.72–7.68(m,3H),7.59(t,J=7.4Hz,2H),7.52(d,J=7.2Hz,1H),7.48–7.44(m,4H),6.32-6.10(m,2H),5.61-5.53(m,1H),4.63-4.57(m1H),4.57–4.53(m,1H),4.37-4.31(m,1H),4.25-4.20(m,1H),3.57(t,J=5.8Hz,2H),3.21(t,J=6.4Hz,2H),2.01–1.96(m,2H),1.85–1.81(m,5H)。
生物试验
分析用的LC/MS/MS系统包括Agilent 1200系列真空脱气炉,二元注射泵,孔板自动采样器,柱恒温箱,带电喷雾电离(ESI)源的Agilent G6430三级四级杆质谱仪。定量分析在MRM模式下进行,MRM转换的参数如表A所示:
表A
多反应检测扫描 |
490.2→383.1 |
碎裂电压 |
230V |
毛细管电压 |
55V |
干燥气温度 |
350℃ |
雾化器 |
0.276MPa |
干燥气流速 |
10L/min |
分析使用Agilent XDB-C18,2.1×30mm,3.5μM柱,注入5μL样品。分析条件:流动相为0.1%的甲酸水溶液(A)和0.1%的甲酸甲醇溶液(B)。流速为0.4mL/min。流动相梯度如表B所示:
表B
时间 |
流动相B的梯度 |
0.5min |
5% |
1.0min |
95% |
2.2min |
95% |
2.3min |
5% |
5.0min |
终止 |
此外,用于分析的还有Agilent 6330系列LC/MS/MS光谱仪,配备有G1312A二元注射泵,G1367A自动采样器和G1314C UV检测器;LC/MS/MS光谱仪采用ESI放射源。使用标准液对每一个分析物进行合适的阳离子模型处理和MRM转换进行最佳的分析。在分析期间使用Capcell MP-C18柱,规格为:100×4.6mm I.D.,5μM(Phenomenex,Torrance,California,USA)。流动相是5mM醋酸铵,0.1%甲醇水溶液(A):5mM醋酸铵,0.1%甲醇乙腈溶液(B)(70:30,v/v);流速为0.6mL/min;柱温保持在室温;注入20μL样品。
实施例A激酶活性试验
本发明公开化合物作为蛋白激酶抑制剂的效用可以通过下面的实验来评价。
本发明化合物的AXL(h)激酶活性采用以下方法进行测试:
方法1:
激酶试验通过检测掺入γ-33P-ATP的髓磷脂碱基蛋白(MBP)来完成的。制备20μg/ml的MBP(Sigma#M-1891)三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(TBS;50mM Tris pH=8.0,138mMNaCl,2.7mM KCl),包被高结合性的白384孔板(Greiner),每孔60μL。4℃下,孵育24小时。之后用100μL TBS洗板3次。激酶反应在总体积为34μL的激酶缓冲液(根据需要配制,例如,5mMHepes pH 7.6,15mM NaCl,0.01%牛血清白蛋白(Sigma#I-5506),10mM MgCl2,1mM DTT,0.02%TritonX-100)中进行。将化合物溶解在DMSO中,加入各孔中,DMSO溶液中化合物的最终浓度为1%。每个化合物的测定至少进行两次试验。比如,酶的最终浓度为10nM或20nM。加入没有标记的ATP(10μM)和γ-33P标记的ATP(每孔2×106cpm,3000Ci/mmol)开始反应。反应在室温下震荡进行1个小时。384孔板用7×的PBS清洗,然后加入每孔50μL的闪烁液。用Wallac Trilux计数器检测结果。
AXL(h)在8mM MOPS pH=7.0,0.2mM EDTA,250μM KKSRGDYMTMQIG,10mM醋酸镁和[γ-33P-ATP](比活性和浓度根据需求确定)存在的条件下进行孵育。加入MgATP混合物后开始反应。室温下孵育40分钟之后,向其中加入磷酸溶液至0.5%浓度来终止反应。将10μL的反应液呈斑点状分布于P30过滤器上,用4分钟以0.425%磷酸溶液清洗4次,甲醇清洗1次。干燥后用闪烁计数器测定。
方法2:
在试验中所使用的试剂有AXL(Carna Bioscience,Cat No.:08-107)和FLPeptide30(PerkinElmer,Cat No.:760430)。所涉及的仪器有恒温箱(ThermoScientific),震荡器(QILINBEIER),EZ Reader(PerkinElmer,Cat No.:122919),非接触式级移液系统(Labcyte Inc.,Cat No.:Echo 550),和非接触式纳升级移液系统(TECAN,CatNo.:EVO200)。
试验方法
化合物稀释:1)将化合物溶解于DMSO到适当的浓度;2)利用TECAN EVO200在384微孔板中3倍梯度稀释10个浓度,最高浓度为1mM;利用Echo550从稀释板中转移20nL溶液到实验板中。
酶实验方法
1)准备溶液1,如下表C所示
表C
试剂名称 |
溶液1 |
MgCl2 |
10mM |
Brij-35 |
0.050% |
DTT |
2mM |
BSA |
0.05% |
EGTA |
1mM |
HEPE(pH7.5) |
50mM |
AXL |
1.333nM |
2)实验板中每个孔加入15uL溶液1,并室温孵育30分钟。
3)准备溶液2,如下表D所示:
表D
试剂名称 |
溶液2 |
MgCl2 |
10mM |
Brij-35 |
0.050% |
DTT |
2mM |
BSA |
0.05% |
EGTA |
1mM |
HEPE(pH7.5) |
50mM |
FLPeptide |
6μM |
ATP |
400μM |
4)加入5μL溶液2启动反应,最终每孔的体积是20μL,体系中成分如下表E所示:
表E
试剂名称 |
终浓度 |
MgCl2 |
10mM |
Brij-35 |
0.050% |
DTT |
2mM |
BSA |
0.05% |
EGTA |
1mM |
HEPE(pH7.5) |
50mM |
FLPeptide |
1.5μM |
ATP |
100μM |
AXL |
1nM |
5)25℃下孵育90分钟,然后加入75μL的终止液(含0.5M EDTA)终止反应。
6)使用EZ reader分析每个孔的样品。
数据分析
1)通过测得的转化率(CR),根据下面的函数计算酶的保留活性(RemainingActivity(%)):
2)使用XLFit(方程201)软件拟合计算IC50。
上述试验方法可以得到抑制的IC50和/或抑制常数Ki。IC50定义为在试验条件下,抑制50%酶活性时的化合物浓度。利用1/2log的稀释倍数做出包含10个浓度点的曲线,估算IC50值(例如,通过以下化合物浓度做出一条典型的曲线:3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM、0.003μM、0.001μM、0.0003μM、0μM),或者10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM、0.003μM、0.001μM、0μM)。
对于所属领域的技术人员而言,这仅是众多检测方法中的两种,其他的方法亦可。
实施例B细胞活性试验
本试验是通过检测化合物对Ba/F3 AXL细胞系和Ba/F3亲代细胞系两株细胞生长的抑制作用来完成的。收获处于对数生长期的细胞并采用血小板计数器进行细胞计数,用台盼蓝排斥法检测细胞活力,确保细胞活力在90%以上;调整细胞浓度;分别添加90μL细胞悬液至96孔板中;将96孔板中的细胞置于37℃、5%CO2、95%湿度条件下培养过夜。配制10倍药物溶液,最高浓度为10μM,9个浓度,3.16倍稀释,在接种有细胞的96孔板中每孔加入10μL药物溶液,每个药物浓度设置三个复孔;将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5%CO2、95%湿度条件下继续培养72小时,之后进行CTG分析。融化CTG试剂并平衡细胞板至室温30分钟,每孔加入等体积的CTG溶液,在定轨摇床上振动5分钟使细胞裂解,将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号,读取冷光值。使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据,利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线,并由此计算IC50值,细胞存活率(%)=(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100%。
下表1提供了本发明化合物的AXL(h)激酶实验结果,表明本发明化合物对AXL激酶有非常好的抑制作用。
表1本发明化合物对AXL(h)激酶和Ba/F3 AXL细胞的抑制活性
+:>100nM;++:50-100nM;+++:10-50nM;++++:<10nM
最后,需要注意的是,还有其他方式用来实施本发明。相应地,本发明的实施例是将作为例证进行说明,但并不限于本发明所描述的内容,还可能是在本发明范围内所作的修改或在权利要求中所添加的等同内容。本发明所引用的所有出版物或专利都将作为本发明的参考文献。