CN113667010A - 冠状病毒的抗体及其衍生物用途 - Google Patents

冠状病毒的抗体及其衍生物用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113667010A
CN113667010A CN202010415322.8A CN202010415322A CN113667010A CN 113667010 A CN113667010 A CN 113667010A CN 202010415322 A CN202010415322 A CN 202010415322A CN 113667010 A CN113667010 A CN 113667010A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
antibody
gly
thr
artificial sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010415322.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113667010B (zh
Inventor
缪小牛
黄曦
许英达
罗羿
袁志军
陈连娣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Biotheus Inc
Original Assignee
Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Biotheus Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University, Biotheus Inc filed Critical Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority to CN202010415322.8A priority Critical patent/CN113667010B/zh
Publication of CN113667010A publication Critical patent/CN113667010A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113667010B publication Critical patent/CN113667010B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明涉及一种抗SARS‑CoV2 Spike 1的抗体和用途。具体地，本发明提供了一种抗SARS‑CoV2 Spike1的全人源单克隆抗体。该抗体来源于康复病人外周血淋巴细胞，可以和SARS‑CoV2 Spike 1特异性结合。并且，本发明提供了该抗体的表达载体和能够表达该抗体的宿主细胞，以及本发明抗体的生产方法。

Description

冠状病毒的抗体及其衍生物用途
技术领域
本发明属于生物技术或医药领域，具体涉及一种冠状病毒的抗体及其衍生物 用途。
背景技术
在急性传染病中，绝大部分都是病毒性传染病，病毒性传染病的发病率高， 死亡率也很高。由于检测和诊断手段有限，导致新病毒引发的新疫情爆发往往 具有突发性、随机性和不可预测性等特点，一旦爆发，如无有效的防治手段， 极易造成大规模流行，严重威胁人民健康生命安全。
2019-nCoV冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，为具有包膜的单链正义 RNA病毒。和其他已知冠状病毒类似，2019-nCoV冠状病毒也经过吸附、穿入、 脱壳、生物合成、子代病毒的组装与释放等几个过程完成子代病毒的增殖。 2019-nCoV冠状病毒感染宿主细胞起始于病毒包膜表面的刺突糖蛋白与宿主细 胞表面的受体结合，随后发生膜融合，病毒进入宿主细胞，在细胞溶酶体等细 胞器作用下，释放出病毒的遗传物质单链正义RNA，在宿主细胞的线粒体、核 糖体等蛋白质合成元件以及必须的原料等作用下，翻译产生多聚蛋白，之后， 2019-nCoV冠状病毒的两大必需半胱氨酸蛋白酶：木瓜样蛋白酶(papain-likeprotease,PLpro)和3C样蛋白酶(3C-like protease,3CLpro)在特定位点切割加 工多聚蛋白前体，产生多个对病毒生命周期非常重要的非结构蛋白。在这些非 结构蛋白的作用下，病毒RNA复制出子代病毒核酸物质，并大量翻译出所需的 结构蛋白，完成子代病毒的组装和释放。2019-nCoV冠状病毒感染细胞的生命 周期的任何环节或关键酶均可以作为抗病毒药物的研究靶点，如水解切割多聚 蛋白前体的半胱氨酸蛋白酶PLpro和3CLpro，负责完成子代病毒遗传物质复制的 RNA聚合酶等。
迄今为止，2019-nCoV病毒的传播途径未完全掌握，已知能通过飞沫和接 触传播，且存在人传人、医务人员感染，一定社区传播风险，且病毒存在变异 的可能。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异的预防和治疗方法。
目前，针对SARS-CoV-2(同2019-nCoV)冠状病毒导致的严重肺炎疾病尚 无特效的疫苗和抗病毒药物。这些感染性疾病严重影响了人类的生命健康，研 发效果好的抗病毒药物迫在眉睫。针对SARS-CoV-2冠状病毒开发出低毒高效 的抗病毒药物，以满足国内外SARS-CoV-2冠状病毒感染患者的临床需求，具 有重大的社会意义。
综上所述，本领域迫切需要开发针对SARS-CoV-2冠状病毒有效诊断和治 疗方法，以用于诊断和治疗新型冠状病毒感染引起的肺炎。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够特异性结合SARS-CoV-2Spike 1蛋白， 并可以和细胞表面表达的SARS-Cov-2结合的抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具 有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:26、32、37、48、55、59或66所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:27、 33、38、49、60或67所示的VH-CDR2，和SEQ ID NO:28、34、39、56或68所 示的VH-CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、 修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留SARS-CoV-2Spike 1蛋白结合亲和 力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10或11所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第 一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区包括CH1区和Fc区，优选地，所述Fc是LALA 突变型Fc。
在另一优选例中，所述的CH1区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
在另一优选例中，所述的LALA突变型Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区具 有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:29、35、40、43、45、50、53、57、61或63所示的VL-CDR1、 SEQ ID NO:30、41、46、51或64所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO:31、36、42、 44、47、52、54、58、62、65或69所示的VL-CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、 修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留SARS-CoV-2Spike 1蛋白结合亲和 力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21或22所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的重链具有如本发明第 一方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源抗体轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有如本发明第一方面所 述的重链可变区，和/或如本发明第二方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有如本发明第二方面所述的重链，和/或如本发明第四方面 所述的轻链；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、 修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留SARS-CoV-2Spike 1蛋白结合亲和 力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如 1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的， 并能够保留SARS-CoV-2Spike 1结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为 至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的 氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人 源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区，且所述轻链 恒定区为人源抗体轻链恒定区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗 体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗 体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、 全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：
(a)特异性结合SARS-CoV-2Spike 1蛋白；
(b)阻断SARS-CoV-2病毒与人血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合。
在另一优选例中，所述抗体在SARS-CoV-2Spike 1蛋白上的结合位点，与 ACE2结合位点相同或部分重合。
在另一优选例中，所述抗体在SARS-CoV-2Spike 1蛋白上的结合位点，与 ACE2结合位点无重合。
在另一优选例中，所述的所述抗体具有如本发明第一方面所述的重链可变区 和如本发明第二方面所述的轻链可变区；
其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
(1)如SEQ ID NO:26所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:27所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:28所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:29所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:30所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:31所示的VL-CDR3；
(2)如SEQ ID NO:32所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:33所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:34所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:35所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:30所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:36所示的VL-CDR3；
(3)如SEQ ID NO:37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:39所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:40所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:42所示的VL-CDR3；
(4)如SEQ ID NO:26所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:27所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:28所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:43所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:30所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:44所示的VL-CDR3；
(5)如SEQ ID NO:32所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:33所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:34所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:45所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:46所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:47所示的VL-CDR3；
(6)如SEQ ID NO:48所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:49所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:39所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:50所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:51所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:52所示的VL-CDR3；
(7)如SEQ ID NO:26所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:27所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:28所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:53所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:51所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:54所示的VL-CDR3；
(8)如SEQ ID NO:55所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:27所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:56所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:57所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:30所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:58所示的VL-CDR3；
(9)如SEQ ID NO:59所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:60所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:34所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:61所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:62所示的VL-CDR3；
(10)如SEQ ID NO:32所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:33所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:34所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:63所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:64所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:65所示的VL-CDR3；或
(11)如SEQ ID NO:66所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:67所示的VH-CDR2、 如SEQ IDNO:68所示的VH-CDR3、如SEQ ID NO:57所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2，和如SEQ ID NO:69所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列 如SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22所示。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10或11所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如SEQ ID NO:12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21或22所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同 性。
在另一优选例中，所述抗体具有选自以下组合的重链可变区序列和轻链可变 区序列：
(1)如SEQ ID NO:1所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:12所示的轻链可变 区；
(2)如SEQ ID NO:2所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:13所示的轻链可变 区；
(3)如SEQ ID NO:3所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:14所示的轻链可变 区；
(4)如SEQ ID NO:4所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:15所示的轻链可变 区；
(5)如SEQ ID NO:5所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:16所示的轻链可变 区；
(6)如SEQ ID NO:6所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:17所示的轻链可变 区；
(7)如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:18所示的轻链可变 区；
(8)如SEQ ID NO:8所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:19所示的轻链可变 区；
(9)如SEQ ID NO:9所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:20所示的轻链可变 区；
(10)如SEQ ID NO:10所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:21所示的轻链可 变区；或
(11)如SEQ ID NO:11所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:22所示的轻链可 变区。
在本发明的第六方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的 多肽：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本 发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链，或如本发明第五 方面所述的抗体。
在本发明的第七方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第六方面所 述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细 胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第八方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含 有如本发明第七方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第六方面所述的多 核苷酸。
在本发明的第九方面，提供了一种抗体偶联物，抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、 如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第 四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体，或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、 药物、毒素、细胞因子、放射性核素、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳 蛋白或VLP，或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行 偶联。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、 I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、 或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、 As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、 Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、 Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133 Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟 结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗 增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基 化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀 (auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、 依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物 (maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类 (benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepinecontaining drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：
耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、 篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉 素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、 长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单 胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八 叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉 素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁 共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物 的酶、放射性核素、细胞因子(如IL-2)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、 金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(如DT-心肌黄酶 (DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(如顺铂)。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的(a)。
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个 重复的(a)。
在本发明的第十方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜 外暴露有如本发明第五方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、 如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第 四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第九方面所述的 抗体偶联物、如本发明第十方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第九方面所述的抗体偶联物、如本发明第十方面所述的免疫 细胞、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质 量百分比。
在本发明的第十二方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下 组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发 明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方 面所述的抗体、如本发明第九方面所述的抗体偶联物、如本发明第十方面所述的免 疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备SARS-CoV2病毒感染的诊断 试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗SARS-CoV2病毒感染的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：检测样品中SARS-CoV-2Spike 1蛋白。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测样品中SARS-CoV-2病毒或 SARS-CoV-2Spike 1蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在 SARS-CoV-2病毒或SARS-CoV-2Spike 1蛋白。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
在本发明的第十四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第五方面的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第五方面所述抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有一检测板，所述检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的 测试条含有如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第九方面所述的抗体偶联物、 如本发明第十方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十五方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述的重组多肽 是如本发明第五方面所述的抗体，所述的方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第八方面所述的宿主细胞；和
(b)从培养物中分离出所述的重组多肽。
在本发明的第十六方面，提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明第五方面所述的抗体、或 如本发明第九方面所述的抗体偶联物、或如本发明第十方面所述的免疫细胞、或 如本发明第十一方面所述的药物组合物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括其他治疗SAR-CoV-2病毒感染的药物。
在另一优选例中，所述其他治疗SAR-CoV-2病毒感染的药物包括：已知的抗 SAR-CoV-2病毒感染的抗体、小分子药物、疫苗、中药等。
在本发明的第十七方面，提供了一种SAR-CoV-2病毒感染的诊断方法，包括 步骤：
(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明第五方面所述的抗体接触；和
(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象为 SAR-CoV-2病毒确诊患者。
在另一优选例中，所述的样品为血液样品或咽拭子样品。
在本发明的第十八方面，提供了一种治疗SAR-CoV-2病毒感染的疾病的方 法，包括步骤：向有需要的对象施用有效量的如本发明第五方面所述的抗体、或如 本发明第九方面所述的抗体偶联物、或如本发明第十方面所述的免疫细胞、如本发 明第十一方面所述的药物组合物，或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明抗体与Spike 1蛋白的亲和力。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，意外地开发了一种高 效地特异性针对2019新型冠状病毒的抗体。实验表明，本发明的抗体能够和 SARS-CoV-2Spike 1蛋白特异性结合，且可以和细胞表面表达的SARS-Cov-2结 合。在此基础上完成了本发明。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道 尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每 条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的 二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一 端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端 有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的 可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同， 它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀 地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区 (CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天 然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形 成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的 CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合 部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的 依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明 显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球 蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM， 其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。 对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免 疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域 来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基 酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其 间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来 确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明中，“VH-CDR1”与“CDR-H1”可互换使用，均指重链可变区的 CDR1；“VH-CDR2”与“CDR-H2”可互换使用，均指重链可变区的CDR2； “VH-CDR3”与“CDR-H3”可互换使用，均指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1” 与“CDR-L1”可互换使用，均指轻链可变区的CDR1；“VL-CDR2”与“CDR-L2” 可互换使用，均指轻链可变区的CDR2；“VL-CDR3”与“CDR-L3”可互换使 用，均指轻链可变区的CDR3。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与 其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类 似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、 人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包 括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗 体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自 鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美 国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人 源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种 的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利 5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体 可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多 重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨 基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3 个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽 最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
Figure BDA0002494765630000131
Figure BDA0002494765630000141
本发明中，所述抗体为特异性结合SARS-CoV-2Spike 1蛋白的抗体。本发 明提供一种针对SARS-CoV-2Spike 1蛋白的高特异性和高亲和力的抗体，其包 括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链 可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:26、32、37、48、55、59或66所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:27、33、38、49、60或67所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:28、34、39、56或68所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:29、35、40、43、45、50、53、57、61或63所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:30、41、46、51或64所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:31、36、42、44、47、52、54、58、62、65或69所示的VL-CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺 失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD47结合亲和力的衍生序 列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序 列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更 佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress， 新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)， von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)， Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman， D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列 之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包 (Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。 公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算 法也可用于测定相同性。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双 特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、 单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody) 中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克 隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、 单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制 备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、 轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可 变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地， 所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；更佳地为IgG1。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合 抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源 化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、 (Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM 抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变 区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向SARS-CoV-2Spike 1蛋白的嵌合抗体、人源化抗体、 CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选 为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选 为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸 数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10或11所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21或22所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述靶向SARS-CoV-2Spike 1蛋白的抗体所包括的重链可 变区、轻链可变区、重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号如表B 所示：
表B重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号
Figure BDA0002494765630000161
Figure BDA0002494765630000171
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺 失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD47结合亲和力的衍生序 列。
在一个更加优选的实施方式中，本发明各抗体具体地包括以下各VL和VH 序列，以及Fc、CL和CH1序列。
表C抗体序列总结
Figure BDA0002494765630000172
Figure BDA0002494765630000181
Figure BDA0002494765630000191
Figure BDA0002494765630000201
编码的多核苷酸
本发明还提供一种多核苷酸，其编码上述的抗体或包含其的重组蛋白或其重 链可变区或轻链可变区。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤： 通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方 法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引 入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚 核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活 性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
载体
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的 核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各 种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、 粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地 为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常 规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携 带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG 抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表 达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法， 热激法或电转法。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩 增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在 一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通 常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中 分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。 通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片 段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种 现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本 发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的 载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)： CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后 用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电 泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人 员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可 用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定 (ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal. Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需 要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的 蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于： 常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、 超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所 述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活 性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射 性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂 的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联 剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价 键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶 联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几 种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像 试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)， 稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功 能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体 上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位 于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降 解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解， 从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头， 其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有 肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。 肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬 氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于 5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接 头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团， 连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括： 例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、 溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代 的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而 对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接 头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方 式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如， 药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药 物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实 施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如， 半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤 中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反 应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于 特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的 1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如 酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和 异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺 酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》， 第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能 够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头 化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件 下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还 进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体 接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Figure BDA0002494765630000241
其中：
Ab是抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1到8的值。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞 的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染的疾病的 药物。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊 断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。
较佳地，所述的样本是来自于检测对象的血液样本或咽拭子样本。
本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。 因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器 官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明 的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选 例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物， 它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以 及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上 可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值 可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)： 瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给 药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌 肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域 常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水 溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比 如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染的疾 病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于结合SARS-CoV-2Spike 1蛋白分子，因而 可用于预防和治疗病毒感染所引发的疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％， 更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受 的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、 甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物 可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过 常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分 的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外， 本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。 所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生 理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料， 较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物 组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比 为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为 能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体 基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员 可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中 该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50 毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然， 具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范 围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染的 疾病的药物中的应用。较佳地，所述SARS-CoV-2病毒感染的疾病为肺炎。
冠状病毒
如本文所用，术语“新型冠状病毒”、“2019-nCov”或“SARS-CoV-2”可互换 使用，该2019新型冠状病毒是已知感染人的第7种冠状病毒，并且造成新冠 肺炎(COVID-19)，是威胁全球人类健康的严重传染性疾病之一。
冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四属。
目前已知的感染人的冠状病毒中，HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠 状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2 均为β属冠状病毒。SARS-CoV-2也被称为2019-nCov。
2003年和2012年分别爆发的高致病性冠状病毒“非典”SARS-CoV和“中东 呼吸综合征”MERS-CoV均属于β属冠状病毒。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与 SARS-CoV有约80％相似性、与MERS-CoV有40％的相似性，也属于β属冠 状病毒。
该类病毒的基因组是一条单股正链RNA，是基因组最大的RNA病毒之一， 编码包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制 的初始阶段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白 (Polyprotein)，随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如RNA聚合酶和解 旋酶)和结构蛋白(如刺突蛋白)及辅助蛋白。
本发明的主要优点包括：
1)本发明为全人源单克隆抗体。
2)本发明可以特异性结合SARS-CoV-2Spike1蛋白。
3)本发明可以特异性结合细胞表面表达的SARS-CoV-2Spike1蛋白。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：人Fab文库构建
1.1 cDNA制备
取康复10天后的SARS-CoV-2感染者外周血，采用淋巴细胞分离液分离得到 淋巴细胞。采用RNA提取试剂Trizol(购自Invitrogen)提取总RNA。使用cDNA合 成试剂盒(购自Invitrogen)反转录获得总cDNA。
1.2 Fab可变区基因扩增
第一轮PCR，从cDNA中扩增出VH和VL序列：
表1.第一轮PCR引物
Figure BDA0002494765630000281
以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR加入用于同源重组的同源臂。第 二轮PCR扩增引物如下：
表2.第二轮PCR引物
Figure BDA0002494765630000282
Figure BDA0002494765630000291
Figure BDA0002494765630000301
利用PCR纯化试剂盒(购自QIAGEN)回收目的片段。
1.3 文库构建
将线性化的酵母展示载体和第2轮的VL PCR产物混合后电转化入酿酒酵母(购 自ATCC)中，构建轻链文库。电转化后培养48小时恢复轻链文库。用同样的方 法将第2轮的VHPCR产物和载体混合后电转化入轻链文库酵母中，构建Fab 展示文库。
实施例2：抗Spike1蛋白的抗体筛选
2.1 SARS-CoV-2Spike 1蛋白的生物素化标记
取适量体积的双蒸水溶解人SARS-CoV-2Spike 1(S1)蛋白(购自Kactus)， 按照生物素标记试剂盒(购自Thermo)产品说明书，将生物素溶解后与蛋白溶液 混合，于4℃孵育2小时。用脱盐柱(购自Thermo)去除多余的生物素，脱盐柱 预处理及样品收集操作均参考产品说明书步骤进行。
2.2 MACS富集能与S1特异性结合的酵母
将实施例1中构建的Fab文库接种于SD-CAA扩增培养基(1L SD-CAA扩增 培养基中含6.7g YNB、5g酪蛋白氨基酸、13.62g Na2HPO4·12H2O、7.44g NaH2PO4和2％葡萄糖)中，30℃，225rpm培养过夜。取适量的酵母细胞，离心去除培养 基，用SD-CAA诱导培养基重悬酵母细胞，诱导过夜。测定诱导后的文库浓度， 取适量酵母细胞，离心去除培养基。用50ml洗涤缓冲液(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA) 重悬酵母细胞，离心去除上清。用10ml洗涤缓冲液重悬酵母细胞。
加入生物素标记的S1蛋白(终浓度100mM)，室温孵育30min，离心收集 酵母细胞，并用50ml洗涤缓冲液洗涤酵母3遍。用5ml洗涤缓冲液重悬酵 母细胞，并加入200μl SA磁珠(购自美天旎)，颠倒孵育10min。用洗涤缓 冲液洗涤酵母和磁珠混合物3遍，将混合物加入LS柱(购自美天旎)中。将LS 柱放在磁力架上，用洗涤缓冲液洗涤去除非特异性结合的酵母细胞。将柱子从 磁力架上取出，加入洗涤缓冲液洗脱酵母。洗脱下来的酵母离心后转入200ml SD-CAA扩增培养基中进行扩增。
2.3 流式细胞分选获得高亲和力酵母细胞
将经过MACS富集的酵母细胞接种于SD-CAA扩增培养基中，30℃，225rpm 摇瓶培养过夜。用SD-CAA诱导培养基(1L SD-CAA诱导培养基中含6.7g YNB， 5g酪蛋白氨基酸，13.62g Na2HPO4·12H2O，7.44g NaH2PO4及2％半乳糖，2％ 棉子糖和0.1％葡萄糖)重悬酵母细胞，诱导过夜。加入anti-c-Myc鼠源抗体(购 自Thermo)和100nM生物素标记的S1抗原，室温孵育10min。加入PBS清洗 酵母3遍，加入羊抗鼠IgG(H+L)Alexa Fluor Plus 488(购自Invitrogen) 和链霉亲和素APC偶联荧光抗体(购自Invitrogen)，4℃孵育15min。加入2mlPBS重悬细胞，使用BD FACSArai III仪器进行分选获得可与S1抗原有较高结 合能力的酵母。
2.4 抗体候选分子抗体基因的调取
通过MACS和FACS富集得到的能与S1抗原有较高结合能力的酵母菌液， 稀释后涂布在SD-CAA平板上，30℃，225rpm培养2天，直至长出明显酵母克 隆。从平板上挑取单克隆入96孔深孔板，每孔中有600μl选择培养基30℃250 RPM培养过夜。利用酵母质粒抽提试剂盒(购自天根)抽提出质粒。
使用Takara的PrimeStart PCR试剂进行扩增，条件为：
表3 PCR扩增组分
PCR组分 含量
模板 1μl
VH上游引物或VL上游引物 0.4μM
VH下游引物或VL下游引物 0.4μM
2×Buffer 10μl
dNTP 2μl
ddH2O 补足20ul
表4 PCR扩增条件
Figure BDA0002494765630000321
PCR产物跑电泳确认，并取10μl送金维智测序，测序引物VH上游引物 或VL上游引物。
实施例3：单克隆抗体的构建及表达纯化
3.1 抗体基因构建入pCDNA3.1表达载体
将VH和VL基因序列分别和人IgG1恒定区或人轻链恒定区相连，利用同 源重组酶(购自Vazyme)和EcoR I/Not I双酶切线性化的pCDNA3.1载体中，流 程按照商品说明书。同源重组产物化转入Top10感受态细胞，涂布氨苄抗性平 板，37℃培养过夜，挑取单克隆测序。
3.2 细胞转染
根据所需转染体积传代HEK293细胞，转染前一天将细胞密度调整至 1.2×106/ml。取适量的MEM(购自Gibco)培养基作为转染缓冲液，加入重轻链 质粒，混匀，过滤除菌。按PEI(购自Polysciences)：质粒＝3:1比例加入PEI， 混匀后室温孵育20min，倒入HEK293细胞中，36.5℃，8％CO2培养，等细胞 活力降低到60％以下离心收集上清利用蛋白A磁珠(购自金斯瑞)分选法纯化目 的蛋白。将磁珠用适当体积的结合缓冲液(PBS+0.1％吐温20，pH 7.4)重悬(1-4 倍磁珠体积)后加入至待纯化样品中，室温孵育1h，期间温柔振荡。样品置于 磁力架上(购自海狸)，弃去上清，磁珠用结合缓冲液清洗3遍。按照磁珠体积 的3-5倍体积加入洗脱缓冲液(0.1M sodium citrate,pH 3.2)室温振荡5-10 min，置回磁力架上，收集洗脱缓冲液，转移至已加入中和缓冲液(1M Tris， pH 8.54)的收集管中混匀。
实施例4：纯化的抗S1抗体与细胞表面表达的S1结合
通过转染克隆到MCS的SARS-CoV-2Spike蛋白全长基因的PLVX-puro载 体产生过表达Spike蛋白的293T细胞(293-Spike细胞)。用胰蛋白酶处理扩大 培养的293-Spike细胞，并调整细胞悬液密度至2×106cells/ml,100μl/ 孔加入96孔流式板，使用2％BSA封闭后离心备用将纯化的抗S1抗体用PBS 稀释，200nM开始3倍稀释共12个点，将上述稀释好的样品100μl/孔加入 上述带有细胞的96孔流式板中，室温孵育60min，PBS清洗两次。100μl/孔加入用PBS稀释100倍的羊F(ab’)2抗人IgG-Fc(PE)(购自Abcam)，4℃ 孵育30min，PBS清洗两次。100μl/孔加入PBS重悬细胞，在CytoFlex(Bechman) 流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。
在如上方法的测定实验中，实验结果如图1所示，本发明所有的纯化样品 和293-Spike细胞均有结合活性，结合活性均与阳性对照ACE2-Fc相似或更优。
实施例5：S1抗体亲和力测定
ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，基于溶液的高通量 抗体-抗原亲和力和表位分级的测量，MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言 之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30min，然后线上检测60s建立基线， 在线加载如上所述获得的生物素化标记的S1蛋白至SA传感器上。再将传感器 放入100nM的上述获得的抗体中作用400s，之后将传感器转移至PBS中解离 400s。使用1:1结合模型进行动力学的分析。
表5 候选分子亲和力
Figure BDA0002494765630000331
Figure BDA0002494765630000341
结论：本发明获得的全人源单克隆抗体89C08、56D05、56F11、07E06、89G2、 34E04、56G02、12B04、34B04和34A01均可以和SARS-CoV2 Spike 1蛋白特异 性结合，且可以和细胞表面表达的SARS-CoV2 Spike 1结合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 普米斯生物技术（珠海）有限公司
中山大学附属第五医院
<120> 冠状病毒的抗体及其衍生物用途
<130> P2020-0836
<160> 125
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Pro
100 105 110
Pro Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Trp Leu Phe Arg Ser Asp Lys Pro
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Asp Leu Pro Lys Thr Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Phe
100 105 110
His Ser Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Met Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 4
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Pro
100 105 110
Pro Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Trp Leu Phe Arg Ser Asp Lys Pro
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 6
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Asp Leu Pro Lys Thr Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Phe
100 105 110
His Ser Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 7
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Pro
100 105 110
Pro Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 8
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Arg Glu Thr Pro Gly Phe Asp Glu Ser Ile Ala Ala
100 105 110
Ala Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 9
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly His
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Trp Leu Phe Arg Ser Asp Lys Pro
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 10
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Trp Leu Phe Arg Ser Asp Lys Pro
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 11
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Gly Phe Gly Glu Leu Phe Arg Lys Thr Gly Tyr
100 105 110
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Gln
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala
<210> 16
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
<210> 17
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Thr Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Tyr Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
<210> 19
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala
115
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Ala Thr Ala Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Lys Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
<210> 23
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 25
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 28
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
Ala Arg Asp Leu Arg Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Pro
1 5 10 15
Pro Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20 25
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
Gly Ala Ser
1
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
Ile Asn His Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 34
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
Ala Arg Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Trp Leu Phe Arg Ser Asp Lys
1 5 10 15
Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 35
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 36
Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Gln Val Thr
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 39
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 39
Thr Thr Asp Leu Pro Lys Thr Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Phe His Ser
1 5 10 15
Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20 25
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 41
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 41
Ala Ala Ser
1
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Trp Thr
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 43
Gln Ser Val Lys Ser Ser Tyr
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Thr
1 5
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
Leu Gly Ser
1
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 47
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr
1 5
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
Gln Ala Ile Ser Thr Ser
1 5
<210> 51
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 51
Asp Ala Ser
1
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 53
Gln Asp Ile Asn Tyr Phe
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 54
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 55
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 56
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 56
Ala Arg Gly Ser Arg Glu Thr Pro Gly Phe Asp Glu Ser Ile Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20 25
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 57
Gln Ser Val Ser Ser Asn
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 58
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Trp Thr
1 5 10
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 59
Gly Gly Ser Phe Ser Gly His Tyr
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 60
Ile Asp His Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 61
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 62
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 63
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 64
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 64
Trp Ala Ser
1
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 65
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 66
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 67
Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala
1 5
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 68
Ala Arg Gly Gly Leu Gly Phe Gly Glu Leu Phe Arg Lys Thr Gly Tyr
1 5 10 15
Tyr Phe Asp Tyr
20
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 69
Gln Gln Tyr Asn Lys Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 70
acaggtgccc actcccaggt gcag 24
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 71
aaggtgtcca gtgtgargtg cag 23
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 72
cccagatggg tcctgtccca ggtgcag 27
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 73
caaggagtct gttccgaggt gcag 24
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 74
ggaaggtgtg cacgccgctg gtc 23
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 75
gggaattctc acaggagacg a 21
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 76
atgaggstcc cygctcagct gctgg 25
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 77
ctcttcctcc tgctactctg gctcccag 28
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 78
atttctctgt tgctctggat ctctg 25
<210> 79
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 79
atgacccagw ctccabycwc cctg 24
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 80
ggtcctgggc ccagtctgtg ctg 23
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 81
ggtcctgggc ccagtctgcc ctg 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 82
gctctgtgac ctcctatgag ctg 23
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 83
ggtctctctc scagcytgtg ctg 23
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 84
gttcttgggc caattttatg ctg 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 85
ggtccaattc ycaggctgtg gtg 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 86
gagtggattc tcagactgtg gtg 23
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 87
gtttctcgta gtctgctttg ctca 24
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 88
gtgctgtcct tgctgtcctg ct 22
<210> 89
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 89
caccagtgtg gccttgttgg cttg 24
<210> 90
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 90
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagacaggt gcagctggtg cag 53
<210> 91
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 91
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagagaggt gcagctggtg cag 53
<210> 92
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 92
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagagaggt gcagctggtg gag 53
<210> 93
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 93
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagagaggt gcagctgttg gag 53
<210> 94
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 94
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagacaggt gcagctgcag gag 53
<210> 95
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 95
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagacaggt gcagctacag cagtg 55
<210> 96
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 96
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagacaggt tcagctggtg cag 53
<210> 97
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 97
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagacaggt ccagctggta cag 53
<210> 98
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 98
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagacaggt gcagctggtg gag 53
<210> 99
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 99
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagagaagt gcagctggtg gag 53
<210> 100
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 100
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagacagct gcagctgcag gag 53
<210> 101
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 101
gagaagctgt tgctgaagct tctttggaca agagacaggt acagctgcag cag 53
<210> 102
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 102
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgacatccag atgacccagt c 51
<210> 103
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 103
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgacatccag ttgacccagt ct 52
<210> 104
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 104
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgatatccgg atgacccagt c 51
<210> 105
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 105
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgatattgtg atgacccaga c 51
<210> 106
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 106
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgatattgtg atgactcagt c 51
<210> 107
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 107
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgatgttgtg atgactcagt c 51
<210> 108
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 108
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgaaattgtg ttgacacagt c 51
<210> 109
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 109
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgaaatagtg atgacgcagt c 51
<210> 110
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 110
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgaaattgtg ttgacgcagt ct 52
<210> 111
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 111
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc cgacatcgtg atgacccagt c 51
<210> 112
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 112
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc ccagtctgtg ctgackcag 49
<210> 113
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 113
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc ccagtctgcc ctgactcag 49
<210> 114
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 114
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc ctcctatgag ctgacwcag 49
<210> 115
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 115
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc ccagcytgtg ctgactca 48
<210> 116
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 116
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc caattttatg ctgactcag 49
<210> 117
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 117
ccttcttttt ctctttagct cggcttattc ccagrctgtg gtgacycag 49
<210> 118
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 118
gccaggggga agaccgatgg gcccttggtg ctagctgagg agacggtgac cag 53
<210> 119
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 119
gccaggggga agaccgatgg gcccttggtg ctagctgaag agacggtgac cattg 55
<210> 120
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 120
gccaggggga agaccgatgg gcccttggtg ctagctgagg agacggtgac cgtg 54
<210> 121
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 121
ggaagatgaa gacagatggt gcagccaccg tacgtttgat ytccaccttg gtc 53
<210> 122
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 122
ggaagatgaa gacagatggt gcagccaccg tacgtttgat ctccagcttg gtc 53
<210> 123
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 123
ggaagatgaa gacagatggt gcagccaccg tacgtttgat atccactttg gtc 53
<210> 124
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 124
ggaagatgaa gacagatggt gcagccaccg tacgtttaat ctccagtcgt gtc 53
<210> 125
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 125
ggaagatgaa gacagatggt gcagccaccg tacgggyggg aacagagtg 49

Claims (10)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:26、32、37、48、55、59或66所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:27、33、38、49、60或67所示的VH-CDR2，和SEQ ID NO:28、34、39、56或68所示的VH-CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留SARS-CoV-2Spike 1蛋白结合亲和力的衍生序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:29、35、40、43、45、50、53、57、61或63所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:30、41、46、51或64所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO:31、36、42、44、47、52、54、58、62、65或69所示的VL-CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留SARS-CoV-2Spike 1蛋白结合亲和力的衍生序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的轻链可变区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有如权利要求1所述的重链可变区，和/或如权利要求2所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有如权利要求2所述的重链，和/或如权利要求4所述的轻链；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留SARS-CoV-2Spike 1蛋白结合亲和力的衍生序列。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：
(a)特异性结合SARS-CoV-2Spike 1蛋白；
(b)阻断SARS-CoV-2病毒与人血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合。
7.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、如权利要求5所述的抗体，或如权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求8所述的载体或基因组中整合有如权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种抗体偶联物，其特征在于，抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、如权利要求5所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白，或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
CN202010415322.8A 2020-05-15 2020-05-15 冠状病毒的抗体及其衍生物用途 Active CN113667010B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010415322.8A CN113667010B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 冠状病毒的抗体及其衍生物用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010415322.8A CN113667010B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 冠状病毒的抗体及其衍生物用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113667010A true CN113667010A (zh) 2021-11-19
CN113667010B CN113667010B (zh) 2023-07-28

Family

ID=78537810

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010415322.8A Active CN113667010B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 冠状病毒的抗体及其衍生物用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113667010B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2109528A1 (en) * 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
WO2008060331A2 (en) * 2006-05-19 2008-05-22 Amgen Inc. Antibodies to sars coronavirus
WO2019039891A1 (ko) * 2017-08-23 2019-02-28 대한민국(관리부서 질병관리본부장) 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 스파이크 단백질에 대한 단일클론항체 및 이의 용도
WO2019151632A1 (ko) * 2018-01-31 2019-08-08 (주)셀트리온 중동호흡기증후군 코로나바이러스에 중화활성을 갖는 결합 분자
CN111053909A (zh) * 2020-02-27 2020-04-24 南通大学 2019-nCoV3CL水解酶抑制剂与IL-6单抗在制备治疗新冠肺炎药物中的应用
CN111089962A (zh) * 2020-03-25 2020-05-01 中山生物工程有限公司 联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2109528A1 (en) * 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
WO2008060331A2 (en) * 2006-05-19 2008-05-22 Amgen Inc. Antibodies to sars coronavirus
WO2019039891A1 (ko) * 2017-08-23 2019-02-28 대한민국(관리부서 질병관리본부장) 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 스파이크 단백질에 대한 단일클론항체 및 이의 용도
WO2019151632A1 (ko) * 2018-01-31 2019-08-08 (주)셀트리온 중동호흡기증후군 코로나바이러스에 중화활성을 갖는 결합 분자
CN111053909A (zh) * 2020-02-27 2020-04-24 南通大学 2019-nCoV3CL水解酶抑制剂与IL-6单抗在制备治疗新冠肺炎药物中的应用
CN111089962A (zh) * 2020-03-25 2020-05-01 中山生物工程有限公司 联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113667010B (zh) 2023-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112646031B (zh) 抗4-1bb纳米抗体及其用途
WO2020119728A1 (zh) 抗人白细胞介素5(il-5)单克隆抗体及其应用
CN113307870B (zh) 抗il5纳米抗体及其应用
EP4257605A1 (en) Anti-tslp nanobody and use thereof
CN112094349A (zh) 靶向于白介素36r的抗体及其制备方法和应用
CN115515984A (zh) 一种抗cd19抗体的抗体及其制备和应用
EP4299589A1 (en) Anti-human cd73 antibody and use thereof
CN113045659B (zh) 抗cd73人源化抗体
CN108452320B (zh) 抗trailr2抗体-毒素-偶联物及其在抗肿瘤治疗中的药物用途
CN111825766B (zh) 抗il-4r单域抗体及其应用
WO2023169583A1 (zh) 基于Pep42构建的双特异性细胞接合器分子的制备及其应用
WO2023076881A1 (en) Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein
CN113667010B (zh) 冠状病毒的抗体及其衍生物用途
WO2022161491A1 (zh) 一种针对SARS-CoV-2病毒的中和性抗体
CN114763383A (zh) 靶向人bcma的单克隆抗体及其应用
KR20220160670A (ko) 항 pd-l1 및 pd-l2 항체 및 이의 유도체 및 용도
CN113150131B (zh) 广谱识别a组肠道病毒2c蛋白的单克隆抗体及其应用
CN114423790A (zh) 靶向caix抗原的纳米抗体及其应用
CN114349864B (zh) 抗前列腺酸性磷酸酶抗体及其用途
WO2021227687A1 (zh) 一种构建冠状病毒抗体的平台
CN113683686A (zh) 抗新冠病毒中和性单克隆抗体的制备和应用
CN110141666B (zh) 抗trailr2抗体-毒素-偶联物及其在抗肿瘤治疗中的药物用途
WO2024001669A1 (zh) 靶向itga2的抗体和包含此抗体的抗体药物缀合物
CN114763382A (zh) 靶向人cd276的单克隆抗体及其应用
CN115594762A (zh) 一种铁蛋白重链抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant