CN113637709A

CN113637709A - Kif5b基因作为靶点在抑制口蹄疫病毒复制中的应用

Info

Publication number: CN113637709A
Application number: CN202110933585.2A
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 张伟; 杨帆; 杨洋; 齐晓兰; 朱紫祥; 曹伟军; 任蕊芳; 郑敏; 张克山
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-08-14
Filing date: 2021-08-14
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2041-08-14
Also published as: CN113637709B

Abstract

首先，本发明发现通过抑制或沉默宿主KIF5B基因，能够抑制口蹄疫病毒的复制，可作为靶点用于制备或筛选抑制口蹄疫病毒复制的药物；其次，以KIF5B为靶点，本发明设计了siRNA，所述siRNA能够抑制口蹄疫病毒复制，可用于制备抑制口蹄疫病毒复制的药物；同时，本发明提供了特异性靶向KIF5B的sgRNA，所述sgRNA能够靶向KIF5B基因，并结合CRISPR‑Cas9技术，实现了宿主细胞中KIF5B基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系对口蹄疫病毒具有抗性表型，能够显著抑制口蹄疫病毒在细胞内的复制，也为进一步研究KIF5B基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。

Description

KIF5B基因作为靶点在抑制口蹄疫病毒复制中的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种KIF5B基因作为靶点在抑制口蹄疫病毒复制中的应用。

背景技术

小核糖核酸(RNA)病毒科是由RNA病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属，包括塞内卡病毒和口蹄疫病毒。口蹄疫属于口疮病毒属，是一种由口蹄疫病毒引起的重要的感染偶蹄动物的疾病，口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus，FMDV)是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，由结构蛋白VP1-VP4组成。如何制定有效的诊断和防控策略以及措施来防止口蹄疫病毒的不断流行和扩散是当前亟待解决的问题。开发出有效的疫苗或者药物是当前该病防控最有效的举措。

RNA干扰技术的出现对选择毒性提出了可能，为抗病毒研究提供了新思路。RNA干扰是RNA序列特异性转录后基因沉默现象。与以往抗病毒治疗的手段相比，RNA干扰介导的抗病毒效应具有高度的特异性，对非同源基因表达几乎没有影响，因此可将不良反应降到最小；RNA干扰能高效抑制病毒复制，少量的siRNA就可达到降低病毒表达产物的作用；RNA干扰可以针对病毒基因组保守区域发挥作用，从而在一定程度上限制了病毒产生逃避突变株的能力。因此，设计合成靶向小RNA病毒科病毒基因组的siRNAs将可能成为抑制小RNA病毒科病毒感染的有效途径。

驱动蛋白是1985年从鱿鱼的轴质(axonplasm)中分离的一种发动机蛋白。驱动蛋白家族(kinesin superfamilys，KIFs)是一类分子马达，在胞内运输、有丝分裂、细胞形成、细胞功能等方面起着至关重要的作用，不仅负责运输各种膜细胞器、蛋白复合体、mRNA等以保证细胞的基本活性，同时其自身也可对部分细胞内分子信号通路起调节作用。哺乳动物基因组包含三个KIF5基因(KIF5A、KIF5B和KIF5C)，KIF5B表达无所不在，而KIF5A和KIF5C仅在神经元组织中表达。

本发明发现，通过抑制或沉默宿主KIF5B基因，能够抑制口蹄疫病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制小RNA病毒科病毒复制的药物。基于此，本发明以KIF5B基因为靶点，设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰口蹄疫病毒的复制，可用于制备抑制小RNA病毒科病毒复制的药物。而且为了进一步研究KIF5B基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制，本发明设计了一种特异性靶向KIF5B基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向KIF5B基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了KIF5B基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系对口蹄疫病毒具有抗性表型，能够显著抑制小RNA病毒科病毒在细胞内的复制，而且KIF5B基因的敲除并不影响宿主细胞的正常生长，为研究KIF5B基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供了研究工具和材料，也可用于抗小RNA病毒科病毒的动物育种。

发明内容

针对上述技术问题，本发明首先发现通过抑制或沉默宿主KIF5B基因，能够抑制口蹄疫病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制小RNA病毒科病毒复制的药物；其次，以KIF5B基因为靶点，本发明设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰口蹄疫病毒复制，可用于制备抑制小RNA病毒科病毒复制的药物；并且，本发明提供了一种特异性靶向KIF5B基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向KIF5B基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了KIF5B基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系对口蹄疫病毒具有抗性表型，能够显著抑制小RNA病毒科病毒在细胞内的复制，为进一步研究KIF5B基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种KIF5B基因作为靶点在筛选用于预防或治疗小RNA病毒科病毒感染药物的应用，所述药物以KIF5B基因为靶点，抑制或沉默KIF5B基因的表达。

优选地，所述小RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。

第二方面，本发明提供了一种抑制KIF5B基因表达的试剂或药物在制备预防或治疗小RNA病毒科病毒感染药物中的应用。

优选地，所述试剂或药物为以KIF5B基因为靶点设计的小干扰RNA。

优选地，所述小干扰RNA包括下述siRNA中的任一组：

KIF5B-siRNA-1642-F：5’-GCGGUGGAUAAGGAUAUUATT-3’，

KIF5B-siRNA-1642-R：5’-UAAUAUCCUUAUCCACCGCTT-3’；

KIF5B-siRNA-3159-F:5’-GCAGGAAGUAGAUCGUAUATT-3’，

KIF5B-siRNA-3159-R:5’-UAUACGAUCUACUUCCUGCTT-3’；

KIF5B-siRNA-775-F:5’-CCAGAAGGCAUGGGAAUUATT-3’，

KIF5B-siRNA-775-R:5’-UAAUUCCCAUGCCUUCUGGTT-3’。

优选地，所述小干扰RNA为：

KIF5B-siRNA-1642-F：5’-GCGGUGGAUAAGGAUAUUATT-3’，

KIF5B-siRNA-1642-R：5’-UAAUAUCCUUAUCCACCGCTT-3’。

优选地，所述试剂或药物包括靶向敲除KIF5B基因的sgRNA，和/或Cas9蛋白的mRNA序列。

优选地，所述药物通过药物递送载体将携带靶向KIF5B基因的sgRNA，和/或Cas9蛋白的mRNA序列递送至动物体内抑制KIF5B基因表达。

优选地，所述药物递送载体为脂质体纳米颗粒。

优选地，所述sgRNA包括KIF5B-sgRNA1、KIF5B-sgRNA2中的任一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

KIF5B sgRNA1：TGGCGATGTACTTATCGCCG；

KIF5B sgRNA2：AACACCCGGTCAAATGCGTA。

优选地，所述小RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。

第三方面，本发明提供了一种特异性靶向敲除KIF5B基因的sgRNA，所述sgRNA包括KIF5B-sgRNA1、KIF5B-sgRNA2中的任一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

KIF5B sgRNA1：TGGCGATGTACTTATCGCCG；

KIF5B sgRNA2：AACACCCGGTCAAATGCGTA。

第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的sgRNA在制备KIF5B基因敲除细胞系中的应用。

第五方面，本发明提供了一种KIF5B基因敲除细胞系的构建方法，所述方法为：制备特异性靶向KIF5B基因的sgRNA，退火并连接至PX459质粒，获得CRISPR质粒；将CRISPR质粒转染宿主细胞，筛选挑取单个细胞，接种培养，获得KIF5B基因敲除细胞系。

KIF5B sgRNA1：TGGCGATGTACTTATCGCCG；

KIF5B sgRNA2：AACACCCGGTCAAATGCGTA。

优选地，所述宿主细胞为PK-15细胞。

第六方面，本发明提供了一种根据上述第五方面所述方法构建的KIF5B基因敲除细胞系。

第七方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的KIF5B基因敲除细胞系在非诊断治疗目的的检测中的应用。

第八方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的KIF5B基因敲除的细胞系在动物抗小RNA病毒科病毒育种中的应用。

优选地，所述小RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。

本发明的有益效果是：①本发明发现通过抑制或沉默宿主KIF5B基因，能够抑制口蹄疫病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制小RNA病毒科病毒复制的药物；②本发明以KIF5B基因为靶点，本发明设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰口蹄疫病毒的复制，可用于制备抑制小RNA病毒科病毒的复制的药物；③本发明提供了一种靶向KIF5B基因的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向KIF5B基因，结合CRISPR-Cas9技术可实现宿主细胞中KIF5B基因的完全敲除；将靶向KIF5B基因的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA序列通过药物载体递送至动物体内，可实现KIF5B基因的抑制，进而抑制小RNA病毒科病毒的复制；④在宿主细胞中敲除KIF5B基因，并不影响宿主细胞的正常生长，安全性良好；⑤本发明提供了一种通过CRISPR-Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建KIF5B基因编码蛋白功能丧失细胞系的方法，通过使KIF5B基因编码蛋白功能丧失，获得了具有口蹄疫病毒抗性表型的细胞系，能够显著抑制口蹄疫病毒的复制，为进一步研究KIF5B基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料，也可用于抗口蹄疫的动物育种。

附图说明

图1KIF5B siRNA对KIF5B基因和蛋白表达的影响；

图2KIF5B siRNA对口蹄疫病毒复制的影响；

图3靶向KIF5B基因组区域的sgRNA色谱示意图；

图4PK-KIF5B-KO-1细胞系基因缺失突变型分析图；

图5PK-KIF5B-KO-2细胞系基因缺失突变型分析图；

图6Western Blotting检测敲除细胞系中KIF5B基因的蛋白水平结果；

图7绝对定量检测FMDV在PK-15-KIF5B-WT和PK-15-KIF5B-KO细胞中病毒拷贝数；

图8相对定量检测FMDV在PK-15-KIF5B-WT和PK-15-KIF5B-KO细胞中的复制结果；

图9Western Blotting检测FMDV在PK-15-KIF5B-WT和PK-15-KIF5B-KO细胞中的复制结果；

图10PK-15-KIF5B-KO细胞中口蹄疫病毒的病毒滴度检测结果；

图11PK-15细胞中KIF5B基因敲除后细胞生长速率的变化结果；

图12间接免疫荧光实验检测FMDV在PK-15-KIF5B-WT和PK-15-KIF5B-KO细胞中的复制结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。

定义

术语“基因打靶”是指利用DNA定点同源重组进行细胞或生物个体遗传信息定向改变的定向转基因技术，主要包括基因敲除、基因灭活、基因敲入、点突变、缺失突变以及染色体组大片段删除等。其中“基因敲除”是指通过同源重组使特定靶基因失活。本发明通过基因敲除技术，使宿主细胞中KIF5B基因敲除，获得的KIF5B基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系既能抑制口蹄疫病毒感染后的病毒复制；本发明也可以通过对宿主细胞中的KIF5B基因突变，或缺失基因片段，导致KIF5B基因编码蛋白发生移码突变，成功构建出KIF5B基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系。

术语“sgRNA”为向导RNA，是指在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体(kinetoplastid)中，属于一种小型非编码RNA。

本发明通过人工合成了靶向KIF5B基因的sgRNA，进一步在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端制备了靶向KIF5B基因的sgRNA寡聚核苷酸，并退火为双链片段；

本发明在直接靶向剪接KIF5B基因的基础上，利用CRISPR/Cas9联合特异性敲除KIF5B基因的方法，以猪肾上皮细胞PK-15为例，进行了KIF5B基因敲除(所述KIF5B基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，为口蹄疫的预防或治疗提供了一种策略。本发明虽然仅对猪肾上皮细胞PK-15中KIF5B基因进行敲除，获得了一种具有口蹄疫病毒抗性的基因敲除细胞，但是本发明所述的方法可以推论并扩展到对其他动物宿主细胞(例如IBRS细胞系)中KIF5B基因敲除，构建具有口蹄疫病毒抗性的基因敲除细胞。

CRISPR/Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了Cas9的靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过体内外筛选针对KIF5B基因的sgRNA序列，实现KIF5B基因的准确、高效地敲除，获得一种具有抑制口蹄疫病毒复制的KIF5B基因敲除单克隆细胞系，从而为口蹄疫病毒感染的预防或治疗提供新的策略。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过靶向KIF5B基因的sgRNA引导Cas9蛋白结合到KIF5B基因特定序列位置对DNA双链进行切割，造成基因双链断裂，在细胞自身修复机制作用下，产生随机突变，核苷酸的缺失或插入等突变会造成基因的读码框发生改变，最终达到基因编码蛋白功能丧失的目的，获得基因编码蛋白功能丧失细胞系。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。

以下实施例中所涉及的质粒来源：购买于淼灵质粒平台。

细胞培养：猪肾上皮细胞PK-15，来源于猪肾，中文名为猪肾上皮细胞。

病毒来源：口蹄疫病毒毒株FMDV/O/ZK/93保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。

实施例1KIF5B基因沉默后口蹄疫病毒复制结果

1.小干扰RNA(siRNA)的设计

设计KIF5B基因的RNA干扰靶点序列KIF5B siRNA和NC siRNA，具体序列如下：

KIF5B-siRNA-1642-F：5’-GCGGUGGAUAAGGAUAUUATT-3’(SEQ ID NO.3)；

KIF5B-siRNA-1642-R：5’-UAAUAUCCUUAUCCACCGCTT-3’(SEQ ID NO.4)；

KIF5B-siRNA-3159-F：5’-GCAGGAAGUAGAUCGUAUATT-3’(SEQ ID NO.5)；

KIF5B-siRNA-3159-R：5’-UAUACGAUCUACUUCCUGCTT-3’(SEQ ID NO.6)；

KIF5B-siRNA-775-F：5’-CCAGAAGGCAUGGGAAUUATT-3’(SEQ ID NO.7)；

KIF5B-siRNA-775-R：5’-UAAUUCCCAUGCCUUCUGGTT-3’(SEQ ID NO.8)；

NC siRNA-F：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO.9)；

NC siRNA-R：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.10)。

2.KIF5B基因沉默细胞系构建：

(1)KIF5B基因沉默siRNA Oligo制备：将设计好的干扰RNA序列送至上海吉玛公司进行合成，得到相对应的siRNA Oligo，用DEPC H₂O重悬1OD的siRNA使其终浓度为20Μm。溶解前先离心，10000rpm，2min,再慢慢打开管盖，溶解时加足DEPC水后充分振荡使其溶解。对照组siRNA(NC)用同样的方法溶解备用。

(2)KIF5B基因沉默细胞系的构建：PK-15细胞计数后铺在六孔板中，待细胞融合度至70％～80％融合度时，将溶解好的siRNA 6μL分别与Lipofectamine2000，6μL加至100μL的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将脂质体-siRNA混合物静置20min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％CO₂培养箱中培养6h后换液，24h检测mRNA表达，48h检测蛋白表达。

3.KIF5B基因和蛋白表达水平检测

PK-15细胞分别转染KIF5B-siRNA-1642、KIF5B-siRNA-3159、KIF5B-siRNA-775和NC siRNA，转染24h后，检测KIF5B mRNA表达，转染48h后，检测KIF5B蛋白表达。检测结果如图1所示，从基因和蛋白水平检测结果显示，通过小干扰RNA干扰基因沉默技术，能够显著抑制KIF5B的表达，其中，KIF5B-siRNA-1642的沉默效率最高。

4.FMDV病毒感染后的病毒复制结果

PK-15细胞分别转染NC siRNA和KIF5B-siRNA-1642，转染24h后，接种口蹄疫病毒毒株FMDV/O/ZK/93(MOI＝1)，感染0，12，24h后，用PBS清洗一遍，分别收取细胞提取RNA，利用荧光定量PCR的方法检测FMDV的表达水平。结果如图2所示，相比较于NC siRNA转染的PK-15细胞，转染KIF5B-siRNA-1642后的PK-15细胞感染口蹄疫病毒毒株FMDV/O/ZK/93后，能够显著抑制FMDV的复制。

上述结果表明，以KIF5B为靶点涉及的小干扰RNA能够显著抑制KIF5B基因的表达，进而抑制FMDV病毒的复制。因此，KIF5B作为靶点能够用于筛选或设计用于抑制FMDV病毒复制的药物，进而用于预防或治疗口蹄疫。

实施例2KIF5B基因敲除PK-15细胞系

利用CRISPR软件在KIF5B的第1个外显子区域的567位置和第2个外显子区域的9913位置分别设计两条sgRNA序列(如图3所示)：

KIF5B sgRNA1：TGGCGATGTACTTATCGCCG(SEQ ID NO.11)；

KIF5B sgRNA2：AACACCCGGTCAAATGCGTA(SEQ ID NO.12)。

设计好的gRNA，合成、退火并连接至PX459(Addgene#62988)质粒；测序正确的CRISPR质粒提取备用；

根据Lipofectamine 2000(Invitrogen)的标准转染程序，CRISPR质粒转染PK-15细胞系，转染24h后加入终浓度3μg/mL的嘌呤霉素筛选3天后，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克隆(KIF5B-KO-1和KIF5B-KO-2)，转移至48孔板，于37℃，5％CO₂培养箱中，添加DMEM培养基中(10％胎牛血清和1％抗生素(penicilin-streptomycin))扩大培养。收集不同细胞克隆分别在DNA水平和蛋白水平进行鉴定；

DNA水平鉴定引物包括：

sgRNA1-F：ATGGCTGCCATGATGGATCGGAAG(SEQ ID NO.13)，

sgRNA1-R：ACTCCCTACTTCCCAGGACTCCAG(SEQ ID NO.14)；

sgRNA2-F：TACTGTTGCAGTACACTGAAAGGC(SEQ ID NO.15)，

sgRNA2-R：TACTGTTGGGACAACTTAGCAGAT(SEQ ID NO.16)；

扩增产物进行Sanger测序；结果如图4-5所示，KIF5B-KO-1在Cas9外显子1的预定切割位置处(距离PAM基序(CGG)第1和16个碱基之间切割)有16个碱基的缺失，KIF5B-KO-2在外显子2的预定切割位置处(距离PAM基序(AGG)第3和4个碱基之间切割)有2个碱基的缺失。

蛋白水平鉴定时用KIF5B的抗体(CST#18148)，利用Western blot检测KIF5B的蛋白水平表达。

结果如图6所示，KIF5B-KO-1和KIF5B-KO-2细胞系中均检测不到KIF5B的蛋白表达。

上述结果表明，KIF5B基因敲除PK-15细胞系构建成功，命名为PK-15-KIF5B-KO。

实施例3KIF5B基因敲除PK-15细胞系对FMDV复制的影响

取实施例2成功构建的KIF5B敲除的PK-15细胞系(PK-15-KIF5B-KO)及对照细胞系(转染PX459空质粒的PK-15细胞系)在35mm的细胞培养皿中培养到大约80％的汇合度时，吸掉培养基，加入2mL PBS洗两次细胞后，吸干净PBS，分别加入稀释至MOI＝1的口蹄疫病毒FMDV/O/ZK/93，并以加入1mL DMEM为对照，在培养箱中孵育1h；吸掉病毒液，加入2mLPBS洗两次细胞后吸干净PBS，加入2mLDMEM培养基。分别在感染不同时间收集上清及细胞样品，利用RT-qPCR、Western blot、病毒滴度测定等方法综合评价口蹄疫病毒的复制情况。

1.绝对定量验证FMDV在PK-15-KIF5B-KO细胞系上的复制情况

分别于FMDV接毒后6，12，24，48h收取细胞，用Trizol裂解法提取细胞的总RNA，然后利用扩增FMDV 3D蛋白保守区域的绝对定量引物FMDV-3-F/R以及FMDV 3D蛋白的探针对提取的全基因组RNA进行绝对定量检测，测定FMDV的拷贝数，引物序列详见表1。

表1绝对定量引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		FMDV-3D Forward	CACTGGTGACAGGCTAAGG(SEQ ID NO.17)
FMDV-3D Reverse	CCCTTCTCAGATTCCGAGT(SEQ ID NO.18)
		FMDV-3D探针	FAM-TCCTTTGCACGCCGTGGGAC-TAMRA

结果如图7所示，在FMDV/O/ZK/93接毒后收取的样品中，PK-15-KIF5B-KO细胞中FMDV的绝对拷贝数远低于PK-15-KIF5B-WT细胞中FMDV的绝对拷贝数。结果表明，KIF5B基因功能缺失单克隆细胞系PK-15-KIF5B-KO能够显著抑制FMDV的复制，具有FMDV抗性表型。

2.相对定量验证FMDV在PK-15-KIF5B-KO细胞系上的复制情况

分别于FMDV接毒后0，6，12，24h收取细胞，用Trizol裂解法提取细胞总RNA，测定浓度后利用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA#RR047A)反转录试剂盒进行反转录，qPCR用SYBR Green qPCR SuperMix(TAKARA)试剂完成。GAPDH作为内参基因，对FMDV的相对表达水平进行定量；所用引物为：

p-GAPDH-F：ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA(SEQ ID NO.19)，

p-GAPDH-R：GATCGAGTTGGGGCTGTGACT(SEQ ID NO.20)；

FMDV-F：TGGGACCATACAGGAGAAGT(SEQ ID NO.21)，

FMDV-R：GTAGCTTGGAATCTCGAAGAGG(SEQ ID NO.22)。

结果如图8所示，在FMDV/O/ZK/93接毒后收取的样品中，PK-15-KIF5B-KO细胞中FMDV的相对拷贝数也低于PK-15-KIF5B-WT细胞中FMDV的相对拷贝数。结果表明，KIF5B基因功能缺失单克隆细胞系PK-15-KIF5B-KO能够显著抑制FMDV的复制，具有FMDV抗性表型。

3.Western blot检测口蹄疫病毒结构蛋白VP1表达水平

收集的细胞样品中加入200μL细胞裂解液(Pierce)，待细胞充分裂解之后离心除去细胞碎片收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)定量总蛋白。剩余部分加入四分之一体积的4×上样缓冲液混匀，煮沸5min，室温静置冷却。利用定量结果确定上样体积，上样量一般为20-40μg。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转NC膜，冰浴中100V恒压转膜1.5h。5％脱脂奶粉封闭1h。β-actin抗体(Santa Cruz)1:1000倍稀释，VP1单抗(由兰州兽医研究所流行病学团队保存)1:1000倍稀释，一抗4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗1:5000倍稀释，二抗室温孵育1h。蛋白检测用Thermo公司的显色试剂盒(Pierce^TM ECLWestern Blotting Substrate)，图片经Image Lab 4.1(BIO-RAD)扫描成像。

结果如图9所示，在FMDV/O/ZK/93接毒后收取的样品中，PK-15-KIF5B-KO细胞中口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达远低于野生型细胞，说明KIF5B基因功能缺失单克隆细胞系PK-15-KIF5B-KO能够显著抑制FMDV的复制，具有FMDV抗性表型。

4.病毒滴度TCID₅₀测定

将FMDV分别感染PK-15-KIF5B-KO和PK-15-KIF5B-WT细胞，不同时间点收取细胞样品。反复冻融三次后，用无血清的DMEM将获得细胞样品进行10^-2～10^-8倍梯度稀释，用各稀释度毒液分别接种96孔细胞培养板中长满单层的BHK细胞，每个稀释度接种8个孔，每个孔100μL。置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养并观察4天，每隔12h观察并记录细胞病变(CPE)情况，根据Reed-Muench法计算扩增病毒的TCID₅₀。

结果如图10所示，在FMDV/O/ZK/93接毒后收取的样品中，PK-15-KIF5B-KO细胞中口蹄疫病毒的病毒滴度远低于野生型细胞，说明KIF5B基因功能缺失单克隆细胞系PK-15-KIF5B-KO能够显著抑制FMDV的复制，具有FMDV抗性表型。

5.细胞生长速率的测定

细胞消化后计数，以每孔10000个细胞，接种至96孔板，置细胞培养箱正常培养。为了测定特定时间的细胞活力，培养基中添加终浓度为0.5mg/mL的MTT，培养箱继续孵育培养4h，弃掉培养基，每孔加入150μL DMSO充分裂解后，在VarioskanTM LUX多功能酶标仪(Thermo)上测定595nm处的吸光值。根据测定的吸光值制作细胞的生长曲线。

结果如图11所示，PK-15-KIF5B-KO和PK-15-KIF5B-WT细胞的生长速率相同，表明KIF5B基因的敲除并不影响宿主细胞的正常生长。

6.间接免疫荧光实验

将PK-15-KIF5B-KO和PK-15-KIF5B-WT细胞分别铺于共聚焦小皿中，待细胞长至70％～80％时，用MOI＝1的FMDV感染；接毒后12h收取细胞，用PBS清洗3次；4％多聚甲醛室温固定30min；PBS清洗3次，5min/次；0.3％Triton X-100室温通透30min；PBS清洗3次，5min/次；5％BSA 4℃封闭4h；弃掉封闭液，加入5％BSA稀释的一抗，4℃过夜；PBST清洗3次，10min/次；加入用PBS稀释的荧光素标记二抗，室温孵育2h；PBST清洗3次，10min/次；加入DAPI染核15min；使用激光共聚焦显微镜观察荧光，并保存图片。

结果如图12所示，间接免疫荧光实验检测显示，野生型细胞PK-15-KIF5B-WT感染FMDV后，随病毒感染时间推移，病毒复制增加；而KIF5B敲除细胞PK-15-KIF5B-KO中感染FMDV后仍然检测不到FMDV病毒的复制。其中蓝色为细胞核染色结果，绿色为FMDV结构蛋白染色。

以上结果表明，通过基因编辑技术获得KIF5B基因敲除宿主细胞能够显著抑制FMDV的复制，具有FMDV抗性。因此，构建的KIF5B基因缺失细胞可用于动物抗FMDV的育种。

综上所述，本发明首先发现通过抑制或沉默宿主KIF5B基因，能够抑制口蹄疫病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制口蹄疫病毒复制的药物；其次，通过CRISPR-Cas9技术成功构建了KIF5B基因缺失的细胞系。但本发明并不局限于CRISPR-Cas9技术，在本发明的基础上，通过其他技术手段使KIF5B基因缺失也能够获得KIF5B基因缺失的细胞系；且其他能够抑制宿主KIF5B基因表达的试剂或药物也可用于制备治疗口蹄疫病毒感染的药物；本发明并不局限于口蹄疫病毒，与口蹄疫病毒同属于小RNA病毒科的其他病毒均适用。而且其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> KIF5B基因作为靶点在抑制口蹄疫病毒复制中的应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 963

<212> PRT

<213> 猪(swine)

<400> 1

Met Ala Asp Pro Ala Glu Cys Asn Ile Lys Val Met Cys Arg Phe Arg

1 5 10 15

Pro Leu Asn Glu Ser Glu Val Asn Arg Gly Asp Lys Tyr Ile Ala Lys

20 25 30

Phe Gln Gly Glu Asp Thr Val Met Ile Ala Ser Lys Pro Tyr Ala Phe

35 40 45

Asp Arg Val Phe Gln Ser Ser Thr Ser Gln Glu Gln Val Tyr Asn Asp

50 55 60

Cys Ala Lys Lys Ile Val Lys Asp Val Leu Glu Gly Tyr Asn Gly Thr

65 70 75 80

Ile Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Ser Ser Gly Lys Thr His Thr Met Glu

85 90 95

Gly Lys Leu His Asp Pro Glu Gly Met Gly Ile Ile Pro Arg Ile Val

100 105 110

Gln Asp Ile Phe Asn Tyr Ile Tyr Ser Met Asp Glu Asn Leu Glu Phe

115 120 125

His Ile Lys Val Ser Tyr Phe Glu Ile Tyr Leu Asp Lys Ile Arg Asp

130 135 140

Leu Leu Asp Val Ser Lys Thr Asn Leu Ser Val His Glu Asp Lys Asn

145 150 155 160

Arg Val Pro Tyr Val Lys Gly Cys Thr Glu Arg Phe Val Cys Ser Pro

165 170 175

Asp Glu Val Met Asp Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Asn Arg His Val

180 185 190

Ala Val Thr Asn Met Asn Glu His Ser Ser Arg Ser His Ser Ile Phe

195 200 205

Leu Ile Asn Val Lys Gln Glu Asn Thr Gln Thr Glu Gln Lys Leu Ser

210 215 220

Gly Lys Leu Tyr Leu Val Asp Leu Ala Gly Ser Glu Lys Val Ser Lys

225 230 235 240

Thr Gly Ala Glu Gly Ala Val Leu Asp Glu Ala Lys Asn Ile Asn Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Ala Leu Gly Asn Val Ile Ser Ala Leu Ala Glu Gly Ser

260 265 270

Thr Tyr Val Pro Tyr Arg Asp Ser Lys Met Thr Arg Ile Leu Gln Asp

275 280 285

Ser Leu Gly Gly Asn Cys Arg Thr Thr Ile Val Ile Cys Cys Ser Pro

290 295 300

Ser Ser Tyr Asn Glu Ser Glu Thr Lys Ser Thr Leu Leu Phe Gly Gln

305 310 315 320

Arg Ala Lys Thr Ile Lys Asn Thr Val Cys Val Asn Val Glu Leu Thr

325 330 335

Ala Glu Gln Trp Lys Lys Lys Tyr Glu Arg Glu Lys Glu Lys Asn Lys

340 345 350

Thr Leu Arg Asn Thr Ile Gln Trp Leu Glu Asn Glu Leu Asn Arg Trp

355 360 365

Arg Asn Gly Glu Thr Val Pro Ile Asp Glu Gln Phe Asp Lys Glu Lys

370 375 380

Ala Asn Leu Glu Ala Phe Ala Val Asp Lys Asp Ile Thr Ile Ser Asn

385 390 395 400

Asp Lys Pro Ala Ala Thr Ile Gly Val Thr Gly Asn Phe Thr Asp Ala

405 410 415

Glu Arg Arg Lys Cys Glu Glu Glu Ile Ala Lys Leu Tyr Lys Gln Leu

420 425 430

Asp Asp Lys Asp Glu Glu Ile Asn Gln Gln Ser Gln Leu Val Glu Lys

435 440 445

Leu Lys Thr Gln Met Leu Asp Gln Glu Glu Leu Leu Ala Ser Thr Arg

450 455 460

Arg Asp Gln Asp Asn Met Gln Ala Glu Leu Asn Arg Leu Gln Ala Glu

465 470 475 480

Asn Asp Ala Ser Lys Glu Glu Val Lys Glu Val Leu Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Glu Leu Ala Val Asn Tyr Asp Gln Lys Ser Gln Glu Val Glu Asp Lys

500 505 510

Thr Lys Glu Tyr Glu Leu Leu Ser Asp Glu Leu Asn Gln Lys Ser Ala

515 520 525

Thr Leu Ala Ser Ile Asp Ala Glu Leu Gln Lys Leu Lys Glu Met Thr

530 535 540

Asn His Gln Lys Lys Arg Ala Ala Glu Met Met Ala Ser Leu Leu Lys

545 550 555 560

Asp Leu Ala Glu Ile Gly Ile Ala Val Gly Asn Asn Asp Val Lys Gln

565 570 575

Pro Glu Gly Thr Gly Met Ile Asp Glu Glu Phe Thr Val Ala Arg Leu

580 585 590

Tyr Ile Ser Lys Met Lys Ser Glu Val Lys Thr Met Val Lys Arg Cys

595 600 605

Lys Gln Leu Glu Ser Thr Gln Thr Glu Ser Asn Lys Lys Met Glu Glu

610 615 620

Asn Glu Lys Glu Leu Ala Ala Cys Gln Leu Arg Ile Ser Gln His Glu

625 630 635 640

Ala Lys Ile Lys Ser Leu Thr Glu Tyr Leu Gln Asn Val Glu Gln Lys

645 650 655

Lys Arg Gln Leu Glu Glu Ser Val Asp Ser Leu Asn Glu Glu Leu Val

660 665 670

Gln Leu Arg Ala Gln Glu Lys Val His Glu Met Glu Lys Glu His Leu

675 680 685

Asn Lys Val Gln Thr Ala Asn Glu Val Lys Gln Ala Val Glu Gln Gln

690 695 700

Ile Gln Ser His Arg Glu Thr His Gln Lys Gln Ile Ser Ser Leu Arg

705 710 715 720

Asp Glu Val Glu Ala Lys Glu Lys Leu Ile Thr Asp Leu Gln Asp Gln

725 730 735

Asn Gln Lys Met Met Leu Glu Gln Glu Arg Leu Arg Val Glu His Glu

740 745 750

Lys Leu Lys Ala Thr Asp Gln Glu Lys Ser Arg Lys Leu His Glu Leu

755 760 765

Thr Val Met Gln Asp Arg Arg Glu Gln Ala Arg Gln Asp Leu Lys Gly

770 775 780

Leu Glu Glu Thr Val Ala Lys Glu Leu Gln Thr Leu His Asn Leu Arg

785 790 795 800

Lys Leu Phe Val Gln Asp Leu Ala Thr Arg Val Lys Lys Ser Ala Glu

805 810 815

Ile Asp Ser Asp Asp Thr Gly Gly Ser Ala Ala Gln Lys Gln Lys Ile

820 825 830

Ser Phe Leu Glu Asn Asn Leu Glu Gln Leu Thr Lys Val His Lys Gln

835 840 845

Leu Val Arg Asp Asn Ala Asp Leu Arg Cys Glu Leu Pro Lys Leu Glu

850 855 860

Lys Arg Leu Arg Ala Thr Ala Glu Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Ala

865 870 875 880

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Asn Ala Ser Arg Asp Arg Lys Arg Tyr Gln

885 890 895

Gln Glu Val Asp Arg Ile Lys Glu Ala Val Arg Ser Lys Asn Met Ala

900 905 910

Arg Arg Gly His Ser Ala Gln Ile Ala Lys Pro Ile Arg Pro Gly Gln

915 920 925

His Pro Ala Ala Ser Pro Thr His Pro Ser Ala Ile Arg Gly Gly Gly

930 935 940

Ala Phe Val Gln Asn Ser Gln Pro Val Ala Val Arg Gly Gly Gly Gly

945 950 955 960

Lys Gln Val

<210> 2

<211> 2892

<212> DNA

<213> 猪(swine)

<400> 2

atggcggacc cggccgaatg caacatcaaa gtgatgtgtc gcttcagacc tctgaacgag 60

tccgaggtga accgcggcga taagtacatc gccaagtttc agggagaaga cacggtcatg 120

atcgcgtcca agccttacgc atttgaccgg gtgttccagt caagcacatc tcaagagcaa 180

gtgtacaatg actgtgcaaa gaagattgtt aaagatgtac ttgaaggata caatggaaca 240

atatttgcat acggacagac atcttccggg aagacacaca caatggaggg taaacttcat 300

gatccagaag gcatgggaat tattccaaga atagtgcaag atatttttaa ttatatttat 360

tccatggatg aaaacttgga atttcatatt aaggtttcat attttgaaat ttatttggat 420

aagataaggg acctattaga tgtttcaaag accaatcttt cagttcatga agataaaaat 480

cgagttccct atgtgaaggg gtgcacagag cgttttgtat gtagtccaga tgaagttatg 540

gataccatcg atgaaggaaa atccaacaga cacgtagcag ttacaaatat gaatgaacat 600

agctctagga gtcacagtat atttcttatt aatgtgaaac aagagaacac acaaacagaa 660

caaaagctga gtggaaaact ttatctggtc gatttagctg gtagtgaaaa ggttagtaaa 720

actggagctg aaggtgctgt gctggatgaa gctaagaata tcaacaagtc cctttctgct 780

ctcggcaatg tcatttctgc tctggctgag ggtagtacct atgttccata tcgagatagt 840

aaaatgacaa gaatccttca agattcgtta ggtgggaact gtagaaccac tattgtaatt 900

tgctgctctc catcatcata caatgaatct gaaacgaaat ctacactcct gtttggtcag 960

agggccaaaa caattaagaa cacagtttgt gtcaatgtag agttaactgc agaacagtgg 1020

aaaaagaagt atgaaagaga aaaagaaaaa aacaagacct tgcggaacac cattcagtgg 1080

cttgaaaatg aactcaaccg atggcgtaat ggagagacag tgcctattga tgaacagttt 1140

gacaaagaga aagccaactt ggaagcattt gcggtggata aggatattac tattagcaat 1200

gataagccag cagccactat tggagttact ggaaatttta ctgatgctga aagaagaaag 1260

tgtgaagaag aaattgctaa attgtacaaa cagcttgatg acaaggatga agaaattaat 1320

caacagagtc aattggtaga gaaactgaag acccaaatgt tggatcagga ggagcttctg 1380

gcatctacca gaagggatca agataatatg caggctgagc tgaatcgcct tcaggcagaa 1440

aacgatgcct ctaaagaaga agtaaaagaa gttttacaag ccttagaaga acttgctgtc 1500

aactatgatc agaagtctca ggaagttgaa gacaaaacta aggaatatga gttacttagt 1560

gatgaactga atcagaaatc ggcaacttta gcaagtatag atgctgagct tcagaaactt 1620

aaggaaatga ccaaccacca gaaaaaacga gcagctgaga tgatggcatc tttactaaaa 1680

gacctagcag aaataggaat tgctgtagga aataatgacg tcaagcaacc tgagggaact 1740

ggcatgatag atgaagagtt cactgttgca cggctctaca ttagcaaaat gaaatcagaa 1800

gttaaaacaa tggtgaaacg ttgcaaacag ttagaaagca cacaaactga gagcaataaa 1860

aaaatggaag aaaatgaaaa ggagttagca gcatgccagc ttcggatctc tcaacatgaa 1920

gccaaaatca aatcattgac tgaatacctt caaaatgtgg agcaaaagaa aagacaactg 1980

gaggagtctg ttgattctct caatgaggag ctagtccagc ttcgagcaca agagaaagta 2040

catgaaatgg aaaaggagca cttaaataag gttcagactg caaatgaagt taagcaagct 2100

gttgaacagc agatccaaag ccacagagag actcatcaga aacaaattag tagtttgaga 2160

gatgaagtcg aggcaaaaga aaaacttatt actgatcttc aagaccaaaa ccagaaaatg 2220

atgctagaac aggaacgtct gagagtagaa catgagaagt tgaaagctac agatcaggaa 2280

aagagcagga aattacatga acttacggtt atgcaagata gacgagaaca agcaagacaa 2340

gacttgaagg gtttggaaga gacagtggca aaggaacttc agactttaca caacctacgg 2400

aagctctttg ttcaagacct ggccaccagg gttaaaaaga gtgccgaaat cgattctgat 2460

gacactggag gtagtgctgc tcaaaagcaa aaaatctcct ttcttgaaaa taatcttgag 2520

caactcacta aagtgcacaa acagttggta cgtgataatg cagatcttcg ctgtgagctt 2580

cctaagttgg aaaagcgact cagagctaca gctgagaggg tgaaagcttt ggagtctgca 2640

ctgaaagaag ccaaagaaaa tgcatctcgt gatcgcaaac gctatcagca ggaagtagat 2700

cgtataaagg aagcagtcag atcaaagaat atggccagaa gaggacattc tgcacaaatt 2760

gctaaaccta ttcgtcctgg gcaacatccc gcagcttctc cgactcatcc aagtgcaatt 2820

cgtggaggag gtgcatttgt tcagaacagc cagccagtgg cagtacgagg cgggggaggc 2880

aagcaggtgt aa 2892

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgguggaua aggauauuat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uaauauccuu auccaccgct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaggaagua gaucguauat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uauacgaucu acuuccugct t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccagaaggca ugggaauuat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

uaauucccau gccuucuggt t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggcgatgta cttatcgccg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aacacccggt caaatgcgta 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggctgcca tgatggatcg gaag 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actccctact tcccaggact ccag 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tactgttgca gtacactgaa aggc 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tactgttggg acaacttagc agat 24

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cactggtgac aggctaagg 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cccttctcag attccgagt 19

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acatggcctc caaggagtaa ga 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gatcgagttg gggctgtgac t 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgggaccata caggagaagt 20

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtagcttgga atctcgaaga gg 22

Claims

1.KIF5B基因作为靶点在筛选用于预防或治疗小RNA病毒科病毒感染药物中的应用，所述药物以KIF5B基因为靶点，抑制或沉默KIF5B基因的表达。

2.抑制KIF5B基因表达的试剂或药物在制备预防或治疗小RNA病毒科病毒感染药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂或药物为以KIF5B基因为靶点设计的小干扰RNA。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小干扰RNA包括下述siRNA中的任一组：

KIF5B-siRNA-1642-F：5’-GCGGUGGAUAAGGAUAUUATT-3’，

KIF5B-siRNA-1642-R：5’-UAAUAUCCUUAUCCACCGCTT-3’；

KIF5B-siRNA-3159-F:5’-GCAGGAAGUAGAUCGUAUATT-3’，

KIF5B-siRNA-3159-R:5’-UAUACGAUCUACUUCCUGCTT-3’；

KIF5B-siRNA-775-F:5’-CCAGAAGGCAUGGGAAUUATT-3’，

KIF5B-siRNA-775-R:5’-UAAUUCCCAUGCCUUCUGGTT-3’。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂或药物包括靶向敲除KIF5B基因的sgRNA，和/或Cas9蛋白的mRNA序列。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物通过药物递送载体将携带靶向KIF5B基因的sgRNA，和/或Cas9蛋白的mRNA序列递送至动物体内抑制KIF5B基因表达。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述sgRNA包括KIF5B-sgRNA1、KIF5B-sgRNA2中的任一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

KIF5B sgRNA1：TGGCGATGTACTTATCGCCG；

KIF5B sgRNA2：AACACCCGGTCAAATGCGTA。

8.如权利要求1-7任一所述的应用，其特征在于，所述小RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。

9.一种KIF5B基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法为：将靶向KIF5B基因的sgRNA退火并连接至PX459质粒，获得CRISPR质粒；将CRISPR质粒转染宿主细胞，筛选挑取单个细胞，接种培养，获得KIF5B基因敲除细胞系。

10.根据权利要求9所述方法构建获得的KIF5B基因敲除细胞系。