CN113632800A - 生物碱在防治茶树叶部病害中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物碱在防治茶树叶部病害中的新用途，属于茶园植保技术领域。本发明通过室内药剂敏感性测定，确定当小檗碱与苦参碱按照浓度比例4.00mg/ml：3.00mg/ml进行复配时，茶云纹叶枯病的抑菌率为91.2％。当小檗碱与苦参碱按照浓度比例1.00mg/ml：2.00mg/ml进行复配时，茶轮斑病的抑菌率为89.0％。本发明首次提出植物提取物苦参碱和小檗碱应用于茶树主要叶部病害的防控，市场前景广阔，为把两种生物碱开发成一种新型、高效的植物源药剂提供了理论基础。

Description

生物碱在防治茶树叶部病害中的应用

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及生物碱在防治茶树叶部病害中的新用途，具体涉及苦参碱和小檗碱在茶云纹叶枯病和轮斑病病害防治中的新用途。

技术背景

茶云纹叶枯病和轮斑病是茶树上的主要叶部病害，在全国各茶区均有不同程度的发生，长期影响着茶叶的质量和品质，制约着茶产业的发展。茶云纹叶枯病和轮斑病是分别由炭疽属(Colletotrichum)真菌和拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis-like)引起的常见病害，发病严重时会造成茶树叶片大面积枯死脱落，影响茶树的正常生长发育，当病害大面积发生时，会造成茶树整株死亡。目前，茶树病害及其防治措施缺乏系统性研究，防控技术也较单一，主要采用化学农药进行简单喷施进行防治，且农药使用量过多，往往造成农残超标。

生物碱是植物、真菌、细菌中自然产生的一类含氮的有机化合物，具有多种生物学活性，是许多药用植物的有效成分。随着自然产物分离技术的进步，新技术和方法的不断创新，不断有新的生物碱被发现。研究证实，生物碱在抗肿瘤和免疫活性、杀虫、抗菌等方面均表现出良好的生物学活性。

苦参碱是一种从苦参、山豆根、苦豆子中提取的一种喹诺里西陡类生物碱，具有多种生物学活性成分，具有抗病毒、镇痛、抗纤维化、杀虫等活性。目前，国内外关于苦参碱在农林业中的研究主要集中在其杀虫效果上，仅有少量研究发现苦参碱可以抑制大肠杆菌、羊毛状小孢子菌、白色念珠菌等微生物的生长。而关于苦参碱抗真菌活性目前尚无系统研究，只有初步筛选试验发现苦参的丙酮提取物对小麦赤霉病、苹果炭疽病、番前灰霉病均具有较好的抑菌作用，最高可达到90％以上，证实了苦参中含有抗真菌活性物质。至今为止，在茶树上苦参碱一直是作为抗虫药剂，一直未见有苦参碱在防治茶树真菌病害中的应用。

小檗碱(Berberine)，别名黄连素，是中药黄连中的主要有效成分，是一种苯并异哇琳类季按型生物碱。研究表明，小檗碱对金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、枯草杆菌、大肠杆菌等都具有不同程度的抑制作用，低浓度抑菌而高浓度杀菌，且对革兰氏阳性菌抑制作用较强，而对革兰氏阴性菌抑菌能力较弱。近年来，小檗碱在农业方面也表现出较大的应用价值，对水稻细菌性条斑病菌、大麦散黑穗病菌、辣椒疫病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病和番茄叶霉病等病害具有不同程度的防治效果。但目前，尚无小檗碱在茶树真菌病害防治中的应用报道。

发明内容

发明人对植物生物碱苦参碱和小檗碱对由Colletotrichumcamelliae引起的茶云纹叶枯病和由Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis引起的茶轮斑病的抑菌活性及防效进行了深入研究，结果发现苦参碱和小檗碱对两种茶树叶部病害均具有较好的抑菌作用，且通过将两种生物碱按一定比例复配后能更有效抑制茶云纹叶枯病和茶轮斑病。本发明是通过如下手段实现的：

生物碱在防治茶树叶部病害中的应用。

进一步的，所述生物碱包括小檗碱与苦参碱。

进一步的，所述茶树叶部病害为茶云纹叶枯病和茶轮斑病。

进一步的，所述茶树叶部病害为茶云纹叶枯病时，小檗碱与苦参碱按照浓度比例4.00mg/ml：3.00mg/ml进行复配。

进一步的，所述茶树叶部病害为茶轮斑病时，小檗碱与苦参碱按照浓度比例1.00mg/ml：2.00mg/ml进行复配。

进一步的，茶云纹叶枯病的抑菌率为91.2％。

进一步的，茶轮斑病的抑菌率为89.0％。

与现有技术比较，本发明的有益效果如下：

目前茶树真菌病害防治主要以化学药物防治为主，而且由于长期单一使用同类药剂容易导致病原菌抗药性，同时化学农药残留威胁人类的食品安全，也制约了茶叶的出口。本发明使用的生物碱是从植物中分离提取出的一种天然物质，来源广泛，绿色环保，保证茶叶品质的同时，还不会造成农药残留。将小檗碱(1.00mg/ml)与苦参碱(2.00mg/ml)复配时，对茶轮斑病的抑菌效果能达到较优，抑制率达89.0％；而小檗碱(4.00mg/ml)+苦参碱(3.00mg/ml)时，对茶云纹叶枯病的抑菌效果较优，能达到91.2％，对茶树主要病害云纹叶枯病和轮斑病的病害防治提供了新的防治途径。

具体实施方式

实施例1

生物碱在防治茶树叶部病害中的应用

本申请所使用的苦参碱(纯度：98％)和小檗碱(纯度：97％)均购自芜湖贝达化工有限公司。

(1)PDA培养基及POB培养基的制作

将200g马铃薯去皮洗净后，切成小块，加1000ml蒸馏水煮10min，用8层纱布过滤之后，再将滤液倒回洗净的锅中小火加热，同时加入20g葡萄糖和20g琼脂(POB不加琼脂)，搅拌至溶解，将滤液定容至1L，分装，高压灭菌后使用。

(2)小檗碱对茶树病原菌的抑制活性测定

母液配制：用称量纸精准称取小檗碱6g，少量DMSO溶解后，加入ddH₂O至10mL，配成浓度为600.0mg/mL的母液，搅拌至完全溶解后，转移至超净工作台内，将母液用除菌过滤器将过滤至干燥且经高温灭菌过的药瓶中，贴好标签，保存备用。

抑菌活性分析：取灭菌备用的PDA培养基，用微波炉加热PDA至完全融化，冷却至50℃左右，在超净台上加入一定量的小檗碱母液至已冷却好的PDA中，根据预实验结果针对茶云纹叶枯病和轮斑病分别配制成含不同浓度梯度农药的培养基，以加入等量DMSO的培养基为对照。将培养5d的菌用打孔器打成菌块(d＝7mm)后，接种至不同浓度农药培养基上，放置于25±2℃培养箱中培养，在培养6d后记录菌落大小，每次实验共设置三个平行，实验重复三次，用SPSS计算EC50值等。

计算公式：

(3)苦参碱对茶树病原菌的抑制活性测定

母液配制：称取2.5g苦参碱溶解于少量无水乙醇中至完全溶解，然后加入ddH₂O至1ml，搅拌均匀后，在超净工作台上将母液用除菌过滤器过滤除菌后转至干燥、高温灭菌过农药瓶中，贴好标签，保存备用。

抑菌活性分析：在超净台上加入一定量的小檗碱母液至已冷却好的PDA中，根据预实验结果针对茶云纹叶枯病和轮斑病分别配制成不同浓度梯度农药的培养基，以加入等量无水乙醇的培养基为对照。将培养5d的菌用打孔器打成菌块(d＝7mm)后，接种至不同浓度农药培养基上，放置于25±2℃培养箱中培养5-7天，以十字交叉法测量菌落直径，每次实验共设置三个平行，实验重复三次，用SPSS计算EC50值等。

计算公式：

(4)两种生物碱复配对茶树病害的抑菌效果

将两种生物碱按一定比例复配后，加入PDA培养基中，然后将培养5d的茶云纹叶枯病和轮斑病菌用打孔器打成菌块(d＝7mm)后，分别接种至含有复配药剂的培养基上，放置于25±2℃培养箱中培养5-7天，以十字交叉法测量菌落直径，每次实验共设置三个平行，实验重复三次，计算抑菌活性。

(5)实验结果

结果发现，小檗碱和苦参碱均对茶树云纹叶枯病和茶轮斑病表现了较好的抑菌效果。其中，小檗碱对茶轮斑病的抑菌效果明显高于茶云纹叶枯病，其抑菌的EC₅₀值仅为0.338mg/ml，而小檗碱对茶云纹叶枯病的EC₅₀值为2.887mg/ml。

同样，苦参碱对茶轮斑病的抑菌效果也明显高于茶云纹叶枯病，其抑菌的EC₅₀值仅为2.938mg/ml，而小檗碱对茶云纹叶枯病的EC₅₀值为4.397mg/ml。

对比两种生物碱的抑菌活性，小檗碱对茶云纹叶枯病和茶轮斑病的的抑菌浓度均明显小于苦参碱，小檗碱分别在12mg/ml和3mg/ml时就能对两种茶树病害达到100％的抑制率。

具体抑菌效果详见表1与表2.

表1小檗碱和苦参碱对茶云纹叶枯病(C.camelliae)的抑菌活性

表2小檗碱和苦参碱对对茶轮斑病(Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis)的抑菌活性

(6)复配抑菌效果

将两种生物碱按一定比例复配后制成不同浓度比例的培养基，实验结果发现两种药剂复配能更有效抑制茶云纹叶枯病和茶轮斑病，且在小檗碱(1.00mg/ml)+苦参碱(2.00mg/ml)时对茶轮斑病的抑菌效果能达到较优，抑制率达89.0％；而小檗碱(4.00mg/ml)+苦参碱(3.00mg/ml)时，对茶云纹叶枯病的抑菌效果较优，能达到91.2％。具体结果详见表3.

表3小檗碱-苦参碱混合物对茶云纹叶枯病和茶轮斑病的抑菌效果

综上所述，本发明通过室内毒力测定，证明了小檗碱-苦参碱混合物对茶云纹叶枯病和茶轮斑病具有良好的抑制活性。其次，两种生物碱均属于天然功能性物质，来源广泛，绿色环保，保证茶叶品质的同时，不会造成农药残留，在茶树真菌病害防治中具有很大的潜力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.生物碱在防治茶树叶部病害中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其中：所述生物碱包括小檗碱与苦参碱。

3.根据权利要求1所述应用，其中：所述茶树叶部病害为茶云纹叶枯病和茶轮斑病。

4.根据权利要求3所述的应用，其中：所述茶树叶部病害为茶云纹叶枯病时，小檗碱与苦参碱按照浓度比例4.00mg/ml：3.00mg/ml进行复配。

5.根据权利要求3所述的应用，其中：所述茶树叶部病害为茶轮斑病时，小檗碱与苦参碱按照浓度比例1.00mg/ml：2.00mg/ml进行复配。

6.根据权利要求4所述的应用，其中：茶云纹叶枯病的抑菌率为91.2％。

7.根据权利要求5所述的应用，其中：茶轮斑病的抑菌率为89.0％。