CN113631910A - 细胞表面蛋白质相互作用的调节剂及其相关方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供用于鉴定细胞表面蛋白质相互作用和活性的调节剂的方法，以及细胞表面蛋白质相互作用和活性的调节剂。

Description

细胞表面蛋白质相互作用的调节剂及其相关方法和组合物
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII副本创建于2020年3月27日，命名为50474-182WO3_SEQUENCE_LISTING_3.27.20_ST25，大小为24,492个字节。
技术领域
本文提供用于鉴定细胞表面蛋白质相互作用和活性的调节剂的方法，以及细胞表面蛋白质相互作用和活性的调节剂。
背景技术
最近的注释预测人类基因组中有超过5,000个基因编码质膜表达或分泌的蛋白质，即作用于细胞表面的蛋白质。存在于细胞表面的蛋白质种类包括细胞表面受体(例如，单跨膜(STM)受体)和免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白质。这些蛋白质中许多与癌症和其他疾病有关，因此是开发治疗剂的主要目标；然而，许多质膜蛋白(例如STM和IgSF蛋白)的结合配偶体仍未得到表征。这种差异是由于目前使用的用于研究质膜表达的蛋白质的蛋白质组学技术(例如，酵母双杂交测定和亲和纯化/质谱(AP/MS))的不兼容性。最近已经开发了用于细胞外蛋白质-蛋白质相互作用的高通量筛选；然而，调节大多数这些相互作用的治疗剂尚未得以鉴定。
因此，对用于鉴定细胞表面蛋白质之间相互作用的方法和组合物以及此类相互作用的新型调节剂及其使用方法存在未满足的需求。
发明内容
本发明提供用于鉴定细胞表面蛋白质相互作用和活性的调节剂的方法，以及细胞表面蛋白质相互作用和活性的调节剂。
在一个方面，本公开的特征在于一种鉴定可受益于包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包含确定来自个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为可受益于包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗的个体。
在另一方面，本公开的特征在于一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为可受益于包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗的个体。
在一些方面，个体具有高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平，并且该方法进一步包含向个体施用有效量的PD-L1轴结合拮抗剂。
在另一方面，本公开的特征在于一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括(a)确定来自个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中基因对的第一成员的表达水平高于第一参考表达水平并且基因对的第二成员的表达水平高于第二参考表达水平；和(b)向该个体施用有效量的PD-L1轴结合拮抗剂。
在另一方面，本公开的特征在于一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向个体施用PD-L1轴结合拮抗剂，该个体已经被确定为具有高于第一参考表达水平的表15的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平。
在另一方面，本公开的特征在于一种鉴定可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包含确定来自个体的样品中的表16的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的个体。
在另一方面，本公开的特征在于一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的表16的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的个体。
在一些方面，该个体具有高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平，并且该方法包括向个体施用有效量的不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗、或PD-L1轴结合拮抗剂加上别的治疗。
在一些方面，第一参考表达水平是预先指定的表达水平，并且第二参考表达水平是预先指定的参考表达水平。
在一些方面，来自个体的样品是在施用抗癌疗法之前从该个体获得的。在一些方面，来自个体的样品是在施用抗癌疗法之后从该个体获得的。
在一些方面，来自个体的样品为肿瘤组织样品或肿瘤液体样品。
在一些方面，样品为福尔马林固定和石蜡包埋的(FFPE)样品、存档样品、新鲜样品或冷冻样品。在一些方面，肿瘤组织样品为FFPE样品。
在一些方面，样品中的基因对的第一成员和第二成员的表达水平为蛋白质表达水平；或者样品中的基因对的第一成员和第二成员的表达水平为mRNA表达水平。在一些方面，样品中的基因对的第一成员和第二成员的表达水平分别为该基因对的第一成员和第二成员的mRNA表达水平。
在一些方面，基因对的第一成员和第二成员的mRNA表达水平通过原位杂交(ISH)、RNA-seq、RT-qPCR、qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、FISH或其组合进行确定。在一些方面，第一参考表达水平为介于约0.25至约0.5个计数每百万读段(CPM)之间，并且第二参考表达水平为介于约0.25至约0.5CPM之间。在一些方面，第一参考表达水平为0.25CPM，并且第二参考表达水平为0.25CPM。
在一些方面，第一参考表达水平和第二参考表达水平分别为患有癌症的个体的参考群体中的该基因对的第一成员和第二成员的表达水平。在一些方面，癌症为泌尿道癌症，例如，泌尿道癌，例如，局部晚期尿路上皮癌或转移性尿路上皮癌(mUC)。
在一些方面，益处包含，与不使用PD-L1轴结合拮抗剂的治疗相比，个体的总存活(OS)延长。
在一些方面，该基因对的第一成员为SIGLEC6，并且该基因对的第二成员为NCR1。
在一些方面，该基因对的第一成员为BTN3A1，并且该基因对的第二成员为LRRC4B。
在一些方面，该基因对的第一成员为CD80，并且该基因对的第二成员为CTLA4。
在一些方面，该基因对的第一成员为BTN3A3，并且该基因对的第二成员为LRRC4B。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为TRHDE。
在一些方面，该基因对的第一成员为CTLA4，并且该基因对的第二成员为PCDHGB4。
在一些方面，该基因对的第一成员为CTLA4，并且该基因对的第二成员为FAM200A。
在一些方面，该基因对的第一成员为CA12，并且该基因对的第二成员为SIGLEC6。
在一些方面，该基因对的第一成员为ILDR2，并且该基因对的第二成员为CLEC12B。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为ITLN1。
在一些方面，该基因对的第一成员为CADM1，并且该基因对的第二成员为CRTAM。
在一些方面，该基因对的第一成员为CD79B，并且该基因对的第二成员为CD244。
在一些方面，该基因对的第一成员为DAG1，并且该基因对的第二成员为EFNB1。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为EVC2。
在一些方面，该基因对的第一成员为GPC4，并且该基因对的第二成员为FGFRL1。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB3，并且该基因对的第二成员为EPHB4。
在一些方面，该基因对的第一成员为PTPRD，并且该基因对的第二成员为LRFN4。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为AQPEP。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为DSG4。
在一些方面，该基因对的第一成员为LDLR，并且该基因对的第二成员为LILRB5。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB3，并且该基因对的第二成员为EPHB3。
在一些方面，该基因对的第一成员为PLXNB3，并且该基因对的第二成员为SEMA4G。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为EPHB6。
在一些方面，该基因对的第一成员为FLT4，并且该基因对的第二成员为FLRT2。
在一些方面，该基因对的第一成员为AXL1，并且该基因对的第二成员为IL1RL1。
在一些方面，该基因对的第一成员为CD320，并且该基因对的第二成员为IGSF5。
在一些方面，该基因对的第一成员为CD59，并且该基因对的第二成员为STAB1。
在一些方面，该基因对的第一成员为CNTN3，并且该基因对的第二成员为PTPRG。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为EPHA3。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB3，并且该基因对的第二成员为EPHB2。
在一些方面，该基因对的第一成员为EGF，并且该基因对的第二成员为TNFRSF11B。
在一些方面，该基因对的第一成员为ENPEP，并且该基因对的第二成员为SLITRK1。
在一些方面，该基因对的第一成员为FCGR3B，并且该基因对的第二成员为EDA2R。
在一些方面，该基因对的第一成员为IL20RA，并且该基因对的第二成员为CLEC14A。
在一些方面，该基因对的第一成员为IL6R，并且该基因对的第二成员为BTNL9。
在一些方面，该基因对的第一成员为IZUMO1，并且该基因对的第二成员为LILRA5。
在一些方面，该基因对的第一成员为NGFR，并且该基因对的第二成员为LRRTM3。
在一些方面，该基因对的第一成员为NTM，并且该基因对的第二成员为AMIGO2。
在一些方面，该基因对的第一成员为PCDHB3，并且该基因对的第二成员为IGSF11。
在一些方面，该基因对的第一成员为PTGFRN，并且该基因对的第二成员为TMEM59L。
在一些方面，该基因对的第一成员为TREM1，并且该基因对的第二成员为VSIG8。
在一些方面，PD-L1轴结合拮抗剂选自由PD-L1结合拮抗剂、PD-1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂组成的组。
在一些方面，PD-L1轴结合拮抗剂为PD-L1结合拮抗剂。
在一些方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与其配体结合配偶体中的一个或多个的结合。
在一些方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。
在一些方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。
在一些方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和B7-1两者的结合。
在一些方面，PD-L1结合拮抗剂为抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，抗体选自由以下项组成的组：阿特珠单抗、MDX-1105、MEDI4736(德瓦鲁单抗)和MSB0010718C(阿维单抗)。
在一些方面，抗PD-L1抗体包含以下高变区：(a)GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19)的HVR-H1序列；(b)AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)的HVR-H2序列；(c)RHWPGGFDY(SEQID NO:21)的HVR-H3序列；(d)RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22)的HVR-L1序列；(e)SASFLYS(SEQID NO:23)的HVR-L2序列；和(f)QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)的HVR-L3序列。
在一些方面，抗PD-L1抗体包含：(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在一些方面，抗PD-L1抗体包含(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在一些方面，抗PD-L1抗体包含(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在一些方面，抗PD-L1抗体包含(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在一些方面，抗PD-L1抗体包含(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在一些方面，抗PD-L1抗体包含(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在一些方面，抗PD-L1抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些方面，抗PD-L1抗体为阿特珠单抗(MPDL3280A)。
在一些方面，PD-L1轴结合拮抗剂为PD-1结合拮抗剂。在一些方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合配偶体中的一个或多个的结合。
在一些方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。
在一些方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。
在一些方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和PD-L2两者的结合。
在一些方面，PD-1结合拮抗剂为抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，抗体选自由以下项组成的组：MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810和BGB-108。
在一些方面，PD-1结合拮抗剂为Fc融合蛋白。
在另一方面，本公开的特征在于一种治疗患有癌症的个体的方法，其包括向该个体施用有效量的CD177活性激动剂。
在另一方面，本公开的特征在于一种鉴定可受益于包含CD177活性激动剂的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包含确定来自个体的样品中的平足蛋白(PDPN)表达水平，其中高于参考PDPN表达水平的样品中的PDPN表达水平将该个体鉴定为可受益于包含CD177活性激动剂的治疗的个体。
在另一方面，本公开的特征在于一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包含确定来自个体的样品中的PDPN表达水平，其中高于参考PDPN表达水平的样品中的PDPN表达水平将该个体鉴定为可受益于包含CD177活性激动剂的治疗的个体。
在一些方面，个体具有高于参考PDPN表达水平的样品中的PDPN表达水平，并且该方法进一步包括向该个体施用有效量的CD177活性激动剂。
在另一方面，本公开的特征在于一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包含(a)确定来自个体的样品中的PDPN表达水平，其中样品中的PDPN表达水平高于参考PDPN表达水平；和(b)向该个体施用有效量的CD177活性激动剂。
在另一方面，本公开的特征在于一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的CD177活性激动剂，其中来自该个体的样品中的PDPN表达水平已经被确定为高于参考PDPN表达水平。
在一些方面，CD177活性为对于PDPN的抑制。
在一些方面，来自个体的样品为肿瘤组织样品或肿瘤液体样品。在一些方面，肿瘤组织样品为福尔马林固定和石蜡包埋的(FFPE)样品、存档样品、新鲜样品或冷冻样品。
在一些方面，样品中的PDPN表达水平为PDPN的蛋白质表达水平或PDPN的RNA表达水平。在一些方面，样品中的PDPN表达水平为PDPN的RNA表达水平。在一些方面，PDPN的RNA表达水平通过原位杂交(ISH)、RNA-seq、RT-qPCR、qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、FISH或其组合进行确定。
在一些方面，参考PDPN表达水平为患有癌症的个体的群体中的PDPN表达水平。在一些方面，癌症为结直肠癌(CRC)、头颈部鳞状细胞癌或胶质瘤。
在一些方面，参考PDPN表达水平为该群体中的表达水平的第50百分位。
在一些方面，参考PDPN表达水平为该群体中的表达水平的第66百分位。
在一些方面，参考PDPN表达水平为预先指定的PDPN表达水平。
在一些方面，癌症为CRC、头颈部鳞状细胞癌或胶质瘤。在一些方面，癌症为CRC，例如，II期CRC或IV期CRC。
在一些方面，益处包含，与不使用CD177活性激动剂的治疗相比，个体的无复发存活(RFS)延长。
在一些方面，与在该激动剂不存在下的PDPN与CD177的结合相比，CD177活性激动剂导致所述两种蛋白质的结合增加。
在一些方面，与在CD177活性激动剂不存在下的PDPN的下游活性相比，CD177活性激动剂导致下游活性的改变。
在一些方面，下游活性的改变为肿瘤生长的降低。
在一些方面，下游活性的改变为癌症相关成纤维细胞(CAF)收缩性的降低。
在一些方面，CD177活性激动剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽或模拟物。
在一些方面，CD177活性激动剂为肽。在一些方面，该肽为CD177肽。在一些方面，CD177肽为CD177的细胞外结构域。在一些方面，肽是多聚化的，例如四聚化的，例如使用链霉亲和素四聚化的。
在一些方面，CD177活性激动剂为抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合PDPN。在一些方面，抗体或其抗原结合片段为拮抗剂抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合CD177。在一些方面，抗体或其抗原结合片段为激动剂抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域。
在一些方面，该个体为人。
在另一方面，本公开的特征在于一种多肽集合，其中每种多肽包含细胞外结构域、标签和锚，并且其中该多肽集合包含表7中的至少81％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，该多肽集合包含表7中的至少85％的蛋白质的细胞外结构域。在一些方面，该多肽集合包含表7中的至少90％的蛋白质。在一些方面，该多肽集合包含表7中的至少95％的蛋白质的细胞外结构域。在一些方面，该多肽集合包含表7中的全部蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，锚能够将细胞外结构域系结在细胞质膜的表面上。在一些方面，锚为糖基磷脂酰肌醇(GPI)多肽。
在一些方面，标签可以被直接或间接地可视化。在一些方面，标签包含可以使用抗体或抗体片段检测的部分。在一些方面，标签为糖蛋白D(gD)多肽。在一些方面，标签包含荧光蛋白。
在一些方面，细胞外结构域具有天然构象。在一些方面，细胞外结构域包含天然的翻译后修饰。
在一些方面，细胞为哺乳动物细胞。在一些方面，细胞为COS7细胞。
在一些方面，细胞已经用编码多肽的质粒瞬时转染。
在另一方面，本公开的特征在于编码上述任一方面的多肽集合的载体集合。
在另一方面，本公开的特征在于包含上述方面的载体集合的细胞集合。在一些方面，多个细胞能够表达上述任一方面的至少一种多肽，任选地其中不同的细胞表达不同的多肽。
在一些方面，一种或多种所述多肽中的每一种被固定到一个或多个固体表面上的不同位置。
在另一方面，本公开的特征在于一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，该方法包含提供上述任一方面的多肽集合，任选地其中所述多肽固定在一个或多个固体表面上；使步骤(a)的集合与多聚化的查询蛋白在允许该多聚化的查询蛋白与该多肽的细胞外结构域中的至少一个结合的条件下接触；以及检测多聚化的查询蛋白与至少一个细胞外结构域之间的相互作用，从而鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。在一些方面，一种或多种所述多肽各自固定到所述一个或多个固体表面上的不同位置。在一些方面，该不同位置包含展示多肽的细胞。
在一些方面，细胞为哺乳动物细胞。
在一些方面，接触步骤是半自动化的。
在一些方面，检测相互作用包括检测位于固体表面上某一位置处的高于阈值水平的信号，任选地为荧光信号。在一些方面，检测是自动化的。
在一些方面，相互作用为瞬时相互作用。
在一些方面，相互作用为低亲和力相互作用。在一些方面，低亲和力相互作用为微摩尔亲和力相互作用。
在一些方面，多聚化的查询蛋白为二聚化、三聚化、四聚化或五聚化的查询蛋白。在一些方面，多聚化的查询蛋白为四聚化的查询蛋白。在一些方面，多聚化的查询蛋白包含查询蛋白的分离的细胞外结构域。在一些方面，查询蛋白的分离的细胞外结构域已被生物素化并缀合至荧光链霉亲和素以将查询蛋白四聚化。
在另一方面，本公开的特征在于鉴定表1的蛋白质与表2的蛋白质之间相互作用的调节剂的方法，该方法包括(a)提供候选调节剂；(b)使表1的蛋白质与表2的蛋白质在候选调节剂存在或不存在下在允许表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合的条件下接触，其中在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；(c)测量表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合，其中在候选调节剂存在下的结合相对于在候选调节剂不存在下的结合的增加或减少将该候选调节剂鉴定为表1蛋白质与表2蛋白质之间相互作用的调节剂。
在另一方面，本公开的特征在于鉴定表1的蛋白质的下游活性的调节剂的方法，该方法包括(a)提供候选调节剂；(b)使表1的蛋白质与表2的蛋白质在候选调节剂存在或不存在下在允许表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合的条件下接触，其中在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；(c)测量表1的蛋白质的下游活性，其中在候选调节剂存在下的下游活性相对于在候选调节剂不存在下的下游活性的改变将该候选调节剂鉴定为表1蛋白质的下游活性的调节剂。
在另一方面，本公开的特征在于鉴定表2的蛋白质的下游活性的调节剂的方法，该方法包括(a)提供候选调节剂；(b)使表2的蛋白质与表1的蛋白质在候选调节剂存在或不存在下在允许表2的蛋白质与表1的蛋白质的结合的条件下接触，其中在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；(c)测量表2的蛋白质的下游活性，其中在候选调节剂存在下的下游活性相对于在候选调节剂不存在下的下游活性的改变将该候选调节剂鉴定为表2蛋白质的下游活性的调节剂。
在一些方面，结合的增加或降低为至少70％，如通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的。
在一些方面，调节剂为表1或表2的蛋白质的下游活性的抑制剂。在一些方面，调节剂为表1或表2的蛋白质的下游活性的活化剂。
在一些方面，下游活性的改变为下游活性的量、强度或持续时间的减少。在一些方面，下游活性的改变为下游活性的量、强度或持续时间的增加。
在一些方面，调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物、反义寡核苷酸或小干扰RNA(siRNA)。在一些方面，抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域。在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合表1的蛋白质。在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合表2的蛋白质。
在一些方面，表1的蛋白质为平足蛋白(PDPN)。在一些方面，表2的蛋白质为CD177。
在一些方面，下游活性为癌症相关成纤维细胞(CAF)收缩性。在一些方面，CAF收缩性在调节剂存在下降低。在一些方面，CAF收缩性降低至少20％，如在凝胶收缩测定中测量的。在一些方面，CAF收缩性降低至少20％，如在3D凝胶伸长测定中测量的。
在一些方面，下游活性为肿瘤生长。在一些方面，肿瘤生长在调节剂存在下降低。在一些方面，肿瘤生长降低至少20％，如在肿瘤生长测定中测量的。
在一些方面，调节剂为靶向PDPN的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，调节剂为靶向CD177的抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，表1的蛋白质为PD-L1(CD274)。在一些方面，表2的蛋白质为EPHA3。
在一些方面，表1的蛋白质为PD-L2(PDCD1LG2)。在一些方面，表2的蛋白质为CEACAM4、ICAM5、NECTIN3、PSG9或TNFRSF11A。在一些方面，表2的蛋白质为CEACAM4。
在一些方面，下游活性为免疫检查点抑制。在一些方面，免疫检查点抑制在调节剂存在下降低。在一些方面，免疫检查点抑制降低至少30％，如在基于细胞的测定中测量的。
在一些方面，表1的蛋白质为PTPRD。在一些方面，PTPRD包含G203E和K204E；R232C和R233C；P249L；G285E；E406K；S431L；R561Q；P666S；E755K；V892I；S912F；R995C或R1088C氨基酸取代突变或者ΔG61ΔE106氨基酸缺失突变。在一些方面，表2的蛋白质为BMP5、CEACAM3、IL1RAP、IL1RAPL2、LECT1、LRFN5、SIRPG、SLITRK3、SLITRK4、SLITRK6或TGFA。
在一些方面，下游活性为对于细胞增殖的阻抑。在一些方面，对于细胞增殖的阻抑在调节剂存在下增加。在一些方面，对于细胞增殖的阻抑增加至少30％，如在集落形成测定中测量的。在一些方面，下游活性为对于STAT3磷酸化作用的阻抑。在一些方面，对于STAT3磷酸化作用的阻抑在调节剂存在下增加。在一些方面，对于STAT3磷酸化作用的阻抑增加至少30％，如在针对磷酸化的STAT3的蛋白质印迹中测量的。
在一些方面，表1的蛋白质为PTPRS。在一些方面，表2的蛋白质为C6orf25、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、LRFN1、LRFN5、LRRC4B、NCAM1、SLITRK1、SLITRK2、SLITRK3、SLITRK4或SLITRK6。
在一些方面，表1的蛋白质为PTPRF。在一些方面，表2的蛋白质为CD177、IL1RAP或LRFN5。
在一些方面，下游活性为对于细胞迁移的抑制。在一些方面，对于细胞迁移的抑制在调节剂存在下增加。在一些方面，对于细胞迁移的抑制增加至少20％。
在一些方面，下游活性为对EGFR的磷酸化作用。在一些方面，对EGFR的磷酸化作用在调节剂存在下降低。在一些方面，对EGFR的磷酸化作用降低至少30％，如在针对对EGFR的磷酸化作用的测定中测量的。
在一些方面，表1的蛋白质为CHL1。在一些方面，表2的蛋白质为CNTN1、CNTN5、SIRPA、L1CAM或TMEM132A。
在一些方面，下游活性为对于肿瘤形成的阻抑。在一些方面，对于肿瘤形成的阻抑在调节剂存在下增加。在一些方面，对于肿瘤形成的阻抑增加至少20％。
在一些方面，表1的蛋白质为CNTN1。在一些方面，表2的蛋白质为CDH6、CHL1、FCGRT、PCDHB7或SGCG。
在一些方面，下游活性为细胞增殖或细胞侵袭。在一些方面，细胞增殖或细胞侵袭在调节剂存在下降低。在一些方面，细胞增殖降低至少20％，如在集落形成测定中测量的。在一些方面，细胞侵袭降低至少20％，如在凝胶侵袭测定中测量的。
在一些方面，表1的蛋白质为LILRB1。在一些方面，表2的蛋白质为CLEC6A、CXADR、EDAR、FLT4、IL6R、ILDR1或LILRA5。
在一些方面，下游活性为对于吞噬作用的阻抑。在一些方面，对于吞噬作用的阻抑在调节剂存在下降低。在一些方面，对于吞噬作用的阻抑降低至少20％。
在一些方面，表1的蛋白质为LILRB2。在一些方面，表2的蛋白质为IGSF8或MOG。
在一些方面，表1的蛋白质为LILRB3。在一些方面，表2的蛋白质为LRRC15或LY6G6F。
在一些方面，表1的蛋白质为LILRB4。在一些方面，表2的蛋白质为CNTFR。
在一些方面，表1的蛋白质为LILRB5。在一些方面，表2的蛋白质为APLP2、CD177、CLEC10A、CLECSF13、LDLR、PILRA或UNC5C。在一些方面，表2的蛋白质为LDLR。
在一些方面，下游活性为破骨细胞分化。在一些方面，破骨细胞分化在调节剂存在下降低至少20％。在一些方面，破骨细胞分化是在针对TRAP+多核细胞的测定中测量的。
在一些方面，表1的蛋白质为AXL。在一些方面，表2的蛋白质为IL1RL1或VSIG10L。
在一些方面，下游活性为RAS/RAF/MAPK/ERK1/2途径的活化、JAK/STAT途径的活化、PI3K信号传导途径的活化、细胞迁移、丝状伪足的形成或对AXL的磷酸化作用。在一些方面，细胞迁移降低至少20％，如在凝胶侵袭测定中测量的。
在一些方面，表1的蛋白质为LRRC4B。在一些方面，表2的蛋白质为BTN3A1或BTN3A3
在一些方面，相对于健康组织，肿瘤组织中的表1的蛋白质或表2的蛋白质的表达被上调或下调。
在另一方面，本公开的特征在于表1的蛋白质与表2的蛋白质之间相互作用的分离的调节剂，其中(a)在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；(b)调节剂造成表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合相对于在调节剂不存在下的结合增加或降低。
在另一方面，本公开的特征在于表1的蛋白质或表2的蛋白质的下游活性的分离的调节剂，其中(a)在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；(b)调节剂造成表1的蛋白质或表2的蛋白质的下游活性相对于在调节剂不存在下的下游活性的改变。
在一些方面，结合的增加或降低为至少70％，如通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的。
在一些方面，调节剂为表1或表2的蛋白质的下游活性的抑制剂。在一些方面，调节剂为表1或表2的蛋白质的下游活性的活化剂。
在一些方面，下游活性的改变为下游活性的量、强度或持续时间的减少。在一些方面，下游活性的改变为下游活性的量、强度或持续时间的增加。
在一些方面，调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽或模拟物。在一些方面，抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域。在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合表1的蛋白质。在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合表2的蛋白质。
附图说明
图1A是一对图表，示出了根据UniProt注释在研究中测试成对相互作用的免疫球蛋白超家族(IgSF)成员和其他非IgSF蛋白质集中的主要蛋白质结构域和基序的出现。EGF＝表皮生长因子，TNF＝肿瘤坏死因子。
图1B是描述用于细胞外相互作用组发现(细胞外相互作用筛选)的自动化高通量技术的示意图。(I)描述了STM受体(猎物蛋白)文库，其由1,364种表达为受体细胞外结构域(ECD)-Fc融合蛋白的人类蛋白质组成，用于在转染细胞的条件培养基中表达。(II)描述了一个IgSF优先成员(查询蛋白)文库，待用于测试与STM受体集合的结合。IgSF蛋白表达为与β内酰胺酶融合的五聚体构建体，以增加结合亲合力和对结合配偶体的灵敏检测。(III)描绘了细胞外相互作用的自动化筛选。每个IgSF查询蛋白都经过与所有STM受体结合的筛选，并通过计算流程进行处理，以最小化假阳性、整合基因表达数据使能进一步分析。(IV)描绘了IgSF相互作用组，其包含800多个高可信度的蛋白质-蛋白质相互作用。(V)描述了一种用于验证选定相互作用的方法。验证方法包括用于检测细胞表面的结合配偶体的表面等离子体共振和免疫荧光。
图1C是散点图，显示PD-1(PDCD1)和PD-L2(PDCD1LG2)各自的细胞外相互作用筛选的两个独立重复。文献中已知的结合配偶体用蓝色表示；这些结合配偶体是PD-1的PDCD1LG2和CD274，以及PD-L2的PDCD1。
图2A是通过细胞外相互作用筛选(“IgSF相互作用组”)鉴定的所有预测受体相互作用对的网络表示。节点代表IGSF查询蛋白和STM猎物蛋白，而边代表它们之间的相互作用。节点大小对应于网络邻居的数量(节点度)，以表示网络中心。代表已知相互作用(例如，先前在Bioplex、Biogrid或STRING数据库中预测的相互作用)的边以红色表示。映射到经过充分研究的免疫球蛋白(Ig)家族的概括重述子网络标记如下：(1)轴突导向因子-丛蛋白(Semaphorin-Plexin)子网络；(2)肝配蛋白(ephrin)受体酪氨酸激酶子网络；(3)PD-1/PD-L1免疫调节轴；和(4)PVR/TIGIT子网络。
图2B是脊线图，示出了训练集中非特异性类、阳性类和阴性类之间的特异性得分分布的分离。
图2C是回归图，描绘了IgSF相互作用组网络内的拓扑系数遵循幂律，这是无标度网络的标志。
图2D是维恩图，示出了细胞外相互作用筛选中鉴定的相互作用与Bioplex、Biogrid和STRING数据库中已知相互作用之间的重叠。
图2E是条形图，示出了相对于人类蛋白质组中细胞外蛋白的估计百分比(18％)，根据人类蛋白质图谱细胞定位关联在两种细胞外蛋白之间鉴定的相互作用百分比(Bioplex；1％)的代表性明显不足。
图2F是条形图，示出了按方向性子集细分的报告的独特相互作用对的数量(577)：114对，其中STM文库中的猎物被包括在查询物集中，并且报告的相互作用得到了交互确认(红色)；124对，其中STM文库中的猎物被包括在查询物集中，并且报告的相互作用没有得到交互确认(橙色)；和463对，其中STM文库中的猎物未包括在查询物集中。
图3A是网络表示，示出了基于网络连接性和来自基因型组织表达(GTEx)的健康组织基因表达谱，通过马尔可夫聚类法(MCL)聚类而剖析的IgSF相互作用组。单个聚类中连接节点的边用黑色标注；连接不同聚类中的节点的边用浅灰色着色。所有聚类都用它们最常见的统计上显著丰富的生物过程基因本体论(GO)术语进行注释，对应于下面的编号图例。具有丰富的GO术语的先前注释的网络节点用与其术语相对应的颜色进行差异性着色。具有未知注释或与聚类分配术语不同的注释的节点显示为菱形。
图3B是一组小提琴图，示出了与所有可能的非相互作用网络节点对的补集(右图，蓝色)相比，所有GTEx组织中测量的mRNA表达的平均相关性(Pearson's r)对于所有报告的相互作用蛋白质对都显著更高(p<1.2x10-20)(左图，黄色)。虚线表示相关分布的第95百分位，指出了高于该百分位的在本研究中得到验证的选定的新相互作用。
图3C是散点图，示出了食管GTEx组织子集中报告的结合配偶体NECTIN1和NECTIN4的归一化mRNA表达(log2 nRPKM)的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.05)。
图3D是散点图，示出了结肠GTEx组织子集中报告的结合配偶体CEACAM5和CEACAM7的归一化mRNA表达(log2 nRPKM)的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.05)。
图3E是散点图，示出了血液GTEx组织子集中报告的结合配偶体LILRA5和LILRB1的归一化mRNA表达(log2 nRPKM)的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.05)。
图3F是散点图，示出了脑GTEx组织子集中报告的结合配偶体PTPRZ1和CNTN1的归一化mRNA表达(log2 nRPKM)的比较。
图3G是一组散点图，示出了特定GTEx组织子集(从左到右：结肠、小肠、神经和胃)中报告的结合配偶体L1CAM和CHL1的归一化mRNA表达(log2 nRPKM)的比较，其中表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.05)。
图3H是显示细胞表面相互作用测定的设计的示意图。结合配偶体(BP)在细胞上表达，并使用免疫荧光分析感兴趣的蛋白质(表达为重组纯化的ECD)与未转染(UT)的细胞和表达受体的细胞的细胞表面的结合。使用荧光链霉亲和素对重组蛋白进行生物素化和多聚化，以增加结合亲合力并检测瞬时相互作用。
图3I是一组显微照片，示出了可溶性查询物NCR1以及结合配偶体SIGLEC6、SIGLEC7和SIGLEC8相对于对照UT细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图3J是一组显微照片，示出了可溶性查询物CHL1以及结合配偶体L1CAM相对于对照UT细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图3K是一组显微照片，示出了可溶性查询物CNTN1以及结合配偶体PTPRZ1相对于对照UT细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图3L是一组免疫印迹，示出了共表达SIGLEC7-HA或载体对照的细胞中NCR1-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图3M是一组免疫印迹，示出了共表达SIGLEC8-HA或载体对照的细胞中NCR1-FLAG的co-IP测定的结果。
图3N是一组免疫印迹，示出了共表达CD4-HA或载体对照的细胞中NCR1-FLAG的co-IP测定的结果。
图4A是IgSF相互作用组网络表示，示出了PD-L1(CD274)和PD-L2(PDCD1LG2)免疫调节簇(浅红色阴影)。对应于CD274-EPHA3和CEACAM4-PDCD1LG2相互作用的边用粗线描绘并以红色突出显示。节点根据其主要分配的GO类别进行着色，如图3所示。
图4B是传感图，示出了如通过SPR分析的PD-1、PD-L1和PD-L2(表达为ECD-Fc融合蛋白)与CEACAM4的结合。将重组CEACAM4(表达为ECD-Fc融合蛋白)固定在传感器芯片上，并以250nM的浓度注射指定的蛋白质。不相关的Fc标记蛋白用作对照。显示的传感图是至少3次独立运行的代表。
图4C是传感图，示出了如通过SPR分析的PD-L1、EPHA3和EPHA5(表达为ECD-Fc融合蛋白)与LILRA3的结合。将重组LILRA3(表达为ECD-Fc融合蛋白)固定在传感器芯片上，并以250nM的浓度注射指定的蛋白质。不相关的Fc标记蛋白用作对照。显示的传感图是至少3次独立运行的代表。
图4D是图表，示出了在递增浓度的抗PD-1/PD-L1抗体阿特珠单抗存在下PD-L1与其配偶体PD-1和EPHA3的结合。在注射结束时测量响应单位。条形图显示平均值±标准偏差。实验是2个独立测定的代表。
图4E是传感图，示出了如通过SPR分析的PD-1、PD-L1和PD-L2(表达为ECD-Fc融合蛋白)与EPHA3的结合。将重组EPHA3(表达为ECD-Fc融合蛋白)固定在传感器芯片上，并以250nM的浓度注射指定的蛋白质。不相关的Fc标记蛋白用作对照。显示的传感图是至少3次独立运行的代表。
图4F是一组显微照片，示出了可溶性查询物PD-L1和PD-L2与结合配偶体PD-1、CD80、EPHA3、EPHB1、PD-L2、PD-L1、CEACAM4和CEACAM5的细胞表面相互作用测定的结果。查询蛋白以红色显示，而DAPI染色的细胞核以蓝色显示。比例尺＝50μm。
图4G是一组免疫印迹，示出了共表达EDAR-HA或载体对照的细胞中LILRB1-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图4H是一组免疫印迹，示出了共表达IL6R-HA或载体对照的细胞中LILRB1-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图4I是一组免疫印迹，示出了共表达CNTFR-HA或载体对照的细胞中LILRB4-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图5A是以SLITRK、NTRK、LFRN、IL1RAP和LRRC家族内的PTPR家族(图3A，聚类1)个体结合配偶体为中心的神经系统相关群落中相互作用的简化网络表示。红色的边代表使用细胞表面相互作用测定验证的相互作用，如图5B-5E.虚线边代表具有弱结合的相互作用。
图5B是一组显微照片，示出了相对于对照未转染(UT)细胞，可溶性查询物SLITRK2(上图)和SLITRK3(下图)与结合配偶体PTPRD和PTPRS的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图5C是一组显微照片，示出了可溶性查询物LFRN5以及结合配偶体PTPRD、PTPRS和PTPRF相对于对照UT细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图5D是一组显微照片，示出了可溶性查询物IL1RAP以及结合配偶体PTPRD、PTPRS和PTPRF相对于对照UT细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图5E是一组显微照片，示出了可溶性查询物BTN3A1、BTN3A3和BTN2A2以及结合配偶体LRRC4B相对于对照UT细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图5F是一组传感图，示出了通过SPR分析的ILRAP、ILRAPL1、SLITRK1、SLITRK4、LRFN1和LRFN4与PTPRD的结合。指定的蛋白质(表达为ECD-Fc融合蛋白)固定在传感器芯片上，并以指定的浓度注射PTPRD(表达为与Fc标签融合的细胞外结构域)。
图5G是一组免疫印迹，示出了共表达BTN2A1-HA或载体对照的细胞中FAM-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图5H是一组免疫印迹，示出了共表达BTN3A2-HA或载体对照的细胞中LRRC4B-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图5I是一组免疫印迹，示出了共表达BTN3A3-HA或载体对照的细胞中LRRC4B-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图5J是一组免疫印迹，示出了共表达EDAR-HA或载体对照的细胞中LRRC4B-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图5K是显示PTPRD中的癌症相关氨基酸取代突变的示意图。
图5L是热图，示出了每个结合配偶体的归一化吸光度的行聚类log2比率，颜色编码从白色(结合丧失)到红色(保守结合)。
图5M是显示LILR家族成员与其先前未表征的结合配偶体之间相互作用的网络表示，示出了肾脏肾透明细胞癌(KIRC)中LILR蛋白的协同上调。
图5N是一组显微照片，示出了可溶性查询物EDAR、LDLR、LILRA5和CNTFR以及结合配偶体LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4和LILRB5相对于对照UT细胞的细胞表面相互作用测定的结果。查询蛋白以红色显示，而DAPI染色的细胞核以蓝色显示。
图6A是网络图，示出了表示为网络群落的IgSF相互作用组，增加了每个TCGA适应症的肿瘤和相邻正常组织之间差异表达分析的结果。节点颜色和大小表示发现基因显著失调的TCGA适应症的数量(|log2倍数改变|>1且p<0.05)。
图6B是条形图，按降序显示每个TCGA适应症连接显著反常的节点的边的数量。LUSC＝肺鳞状细胞癌，KIRC＝肾脏肾透明细胞癌，COAD＝结肠腺癌，KICH＝肾嫌色细胞，LUAD＝肺腺癌，UCEC＝子宫内膜癌，KIRP＝肾脏肾乳头状细胞癌，BLCA＝膀胱尿路上皮癌,LIHC＝肝脏肝细胞癌，BRCA＝乳腺浸润癌，THCA＝甲状腺癌，ESCA＝食管癌，STAD＝胃腺癌，HNSC＝头颈部鳞状细胞癌，PRAD＝前列腺腺癌。红色条代表IgSF相互作用组。浅红色条代表TCGA中报告的一组无关基因对的参考集。
图6C是网络图，示出了肾脏肾透明细胞癌(KIRC)中的免疫调节群落(如图3B中定义)中的上调或下调基因。
图6D是网络图，示出了头颈部鳞状细胞癌(HNSC)中的免疫调节群落(如图3B中定义)中的上调或下调基因。
图6E是一组小提琴图，示出了与所有可能的非相互作用网络节点对的补集(右图，蓝色)相比，所有癌症细胞系百科全书(CCLE)细胞系中测量的mRNA表达的平均相关性(Pearson's r)对于所有报告的相互作用蛋白质对都显著更高(p<4x10-2)(左图，黄色)。虚线表示相关分布的第95百分位，指出了高于该百分位的在本研究中得到验证的选定的新相互作用。
图6F是散点图，示出了大肠CCLE组织子集中报告的结合配偶体CEACAM5和CEACAM6的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图6G是散点图，示出了肺CCLE组织子集中报告的结合配偶体CNTN1和NRCAM的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图6H是散点图，示出了大肠CCLE组织子集中报告的结合配偶体BTN3A1和LRRC4B的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图6I是散点图，示出了乳腺CCLE组织子集中报告的结合配偶体FLRT3和UNC5C的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图6J是散点图，示出了造血和淋巴组织CCLE组织子集中报告的结合配偶体CNTN1和PTPRZ1的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图6K是散点图，示出了大肠CCLE组织子集中报告的结合配偶体IGSF3和PTGFRN的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图6L是散点图，示出了乳腺CCLE组织子集中报告的结合配偶体IGSF3和PTGFRN的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图6M是散点图，示出了造血和淋巴组织CCLE组织子集中报告的结合配偶体AXL和VSIG10L的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图6N是一组免疫印迹，示出了共表达AXL-HA或载体对照的细胞中IL1RL1-FLAG和VSIG10L-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图6O是一组传感图，示出了使用生物层干涉分析的AXL和TYRO3与IL1RL1或GAS6的结合。
图6P是一组传感图，示出了使用生物层干涉分析的AXL和MER与IL1RL1或GAS6的结合。
图6Q是一组显微照片，示出了可溶性查询物AXL以及结合配偶体IL1Rl1相对于对照UT细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图7A是图表，示出了根据UniProt注释，受体文库中1,129种独特的单程跨膜蛋白(“猎物构建体”)集的相关蛋白质结构域和基序分布。ITIM/ITAM＝基于免疫受体酪氨酸的抑制基序/基于免疫受体酪氨酸的活化基序，TNFR＝肿瘤坏死因子受体，TLR/ILR＝Toll样受体/白细胞介素受体，Ig样＝免疫球蛋白样，EGF＝表皮生长因子。
图7B是维恩图，示出了Biogrid、Bioplex和STRING数据库(三个综合蛋白质-蛋白质相互作用资源)中存在的独特蛋白质条目与本研究之间的重叠。
图7C是一组384孔板的示意图，示出了针对单程跨膜蛋白(STM)受体文库测试的PD-1(PDCD1)细胞表面相互作用自动测定的两个独立重复。
图7D是一组384孔板的示意图，示出了针对STM受体文库测试的PD-L2(PDCD1LG2)细胞表面相互作用自动测定的两个独立重复。
图7E是箱线图，从上到下显示：每个板的原始酶吸光度背景估计的分布；每块板的最大酶吸光度对照；跨孔的无标度的酶吸光度值；由每板的背景估计校正的酶吸光度值；以及随后的“归一化”至每块板最大估计吸光度的吸光度值。
图8A是445种筛选的IgSF查询蛋白对1,364种猎物蛋白(STM ECD)的归一化吸光度值聚类的热图。
图8B是一组脊线图，描绘了训练集中非特异性、真阳性和真阴性相互作用之间预测特征的判别潜力。从上到下：归一化的吸光度；针对整个STM文库筛选的一个查询物的查询物Z得分；涵盖所有筛选的查询蛋白的STM文库中单个猎物的猎物Z得分；和自定义特异性得分。
图8C是显示针对训练集阴性、训练集非特异性、训练集阳性、预测的非特异性/阴性和预测的阳性相互作用的主成分分析(PCA)的图。将四维特征矩阵映射到第一和第二主成分显示预测的真阳性相互作用(深蓝色)与我们的训练集的真阳性相互作用(浅蓝色)很好地对齐，并且与已知的非特异性相互作用(橙色)和采样的真负相互作用(红色)很好地分开。
图8D是点图，示出了对于CD274、PDCD1和PDCD1LG2的所有相互观察到的相互作用，按预测类别着色(红色：阴性；绿色：阳性/特异性：蓝色：非特异性)的归一化的强度显示出跨多个查询物克隆体的优异交互再现性和特异性。
图8E是点图，示出了对于CD274、PDCD1和PDCD1LG2的所有相互观察到的相互作用，按预测类别着色(红色：阴性；绿色：阳性/特异性：蓝色：非特异性)的归一化的强度显示出跨多个查询物克隆体的优异交互再现性和特异性。
图8F是条形图，示出了Bioplex中细胞外相互作用的总数(“Bioplex相互作用胞外蛋白(人类蛋白质图谱)”；627)、我们筛选的两种蛋白质之间的Bioplex相互作用数(“本研究中的Bioplex相互作用蛋白质”；350)以及本研究中报告的细胞外相互作用的总数(“本研究中的所有相互作用”；577)。
图8G是直方图，示出了IgSF相互作用组网络中的最短路径分布以6为中心。
图9A是跨GTEx组织细节类别的所有IgSF相互作用组基因的行缩放(Z转换)log2rpkm计数的聚类热图。
图9B是小提琴图，示出了与所有可能的非相互作用蛋白质对的分布(筛选文库补充)相比，所有报告的相互作用蛋白质对的组织表达相关性(GTEx中的Pearson's r)分布均值显著更高(p<1.2e-20)。在聚类网络中，与所有聚类间相互作用的分布相比，聚类内相关性也显著更高(p<0.05)。
图9C是结合对CEACAM5和CEACAM7的散点图，这些结合对的mRNA表达跨所有GTEx组织高度相关。
图9D是结合对LILRB1和LILRA5的散点图，这些结合对的mRNA表达跨所有GTEx组织高度相关。
图9E是结合对SIGLEC7和NCR1的散点图，这些结合对的mRNA表达跨所有GTEx组织高度相关。
图9F是一组分面散点图，示出了跨不同大脑区域的L1CAM和CHL1mRNA表达，示出了小脑区域中CHL1的组成性高表达和所有其他区域的强相关表达模式。
图9G是一组显微照片，示出了可溶性查询物CHL1以及细胞表面表达的结合配偶体BTLA和CNTN5相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。与细胞表面结合的查询蛋白在合并图像中以红色显示，而DAPI染色的细胞核以蓝色显示。比例尺＝50μm。
图9H是网络图，示出了使用CNTN1和CHL1簇的独立测定鉴定的新相互作用。
图9I是一组图表，示出了使用SPR分析NRCAM、NFASC、MCAM、CHL1和对照蛋白与CNTN1的结合。将重组NRCAM、NFASC、MCAM、CHL1和对照蛋白固定在传感器芯片上，并以250nM的浓度注射CNTN1(表达为重组ECD-Fc)。
图9J是代表性网络聚类(聚类1)的行缩放表达式值的聚类热图。网络聚类通常包含不同的组织表达亚组，例如脑与全血、脾、肺和小肠亚组。
图9K是一个聚类热图，示出了所有具有>2个成员(列)的网络聚类的简化GO类别(行)的表示。单元格值根据每个类别的OddsRatio着色(上限为OddsRatio>50)。网络聚类反复包含具有多个生物学注释的基因。
图10A是PD-L1/CD274和PDCD1LG2/PD-L2免疫调节簇(绿色)以及Ephrin(紫色)和CEACAM(橄榄色)家族成员的聚类组织表达热图，突出了CEACAM4与PD-L2的共表达以及EPHA3与Ephrin簇之间的共表达分歧。
图10B是一组箱线图，示出了基于GTEx数据的正常组织中PD-L1(CD274)和EPHA3的表达。
图10C是一组箱线图，示出了基于GTEx数据的正常组织中CEACAM4和PD-L2的表达。
图10D是显示代表性SPR实验的传感图，示出了EPHA3与PD-L1结合。PD-L1固定在传感器芯片上，并以0、50、10、20、50和100nM的浓度注射表达为重组His标记的ECD的EPHA3。在平衡状态下计算结合动力学。
图10E是显示代表性SPR实验的传感图，示出了CEACAM4与PD-L2结合。PD-L2固定在传感器芯片上，并以0、10、20、50、100和200nM的浓度注射表达为重组His标记的ECD的CEACAM4。在平衡状态下计算结合动力学。
图10F是一组显微照片，示出了可溶性查询物MDGA1以及细胞表面表达的结合配偶体NLGN3和NLGN4X相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。与细胞表面结合的查询蛋白在合并图像中以红色显示，而DAPI染色的细胞核以蓝色显示。比例尺＝50μm。
图10G是一组显微照片，示出了可溶性查询物TREML2以及细胞表面表达的结合配偶体ANTRX1相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。与细胞表面结合的查询蛋白在合并图像中以红色显示，而DAPI染色的细胞核以蓝色显示。比例尺＝50μm。
图10H是一组免疫印迹，示出了共表达CD300A-HA或载体对照的细胞中IGSF5-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图10I是一组免疫印迹，示出了共表达CD300LF-HA或载体对照的细胞中IGSF5-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图10J是一组显微照片，示出了可溶性查询物FLRT1、FLRT2和FLRT3以及细胞表面表达的结合配偶体UNC5A、UNC5C和UNC5D相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。与细胞表面结合的查询蛋白在合并图像中以红色显示，而DAPI染色的细胞核以蓝色显示。比例尺＝50μm。
图11A是TCGA适应症的网络节点的聚类热图。单元格值代表肿瘤和相邻正常基因表达水平之间的log2平均改变。
图11B是一组显微照片，示出了可溶性查询物CHL1以及细胞表面表达的结合配偶体L1CAM、BTLA和CNTN5相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。与细胞表面结合的查询蛋白在合并图像中以红色显示，而DAPI染色的细胞核以蓝色显示。比例尺＝50μm。
图11C是IgSF相互作用组的子网络图，示出了为CNTN1和CHL1 IgSF蛋白鉴定的推定相互作用。以黄色表示的边表示通过独立技术验证的相互作用。
图12A是一组显微照片，示出了可溶性查询物LFRN5以及结合配偶体PTPRZ1、PTPRG、PTPRT、PTPRS、PTPRO、PTPRM、PTPRF和PTPRD相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。所示实验是两个独立测定的代表。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图12B是一组显微照片，示出了可溶性查询物SLITKR2以及结合配偶体PTPRZ1、PTPRG、PTPRT、PTPRS、PTPRO、PTPRM、PTPRF和PTPRD相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。所示实验是两个独立测定的代表。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图12C是一组显微照片，示出了可溶性查询物IL1RAP以及结合配偶体PTPRZ1、PTPRG、PTPRT、PTPRS、PTPRO、PTPRM、PTPRF和PTPRD相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。所示实验是两个独立测定的代表。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图12D是一组显微照片，示出了可溶性查询物CNTN1以及结合配偶体PTPRZ1、PTPRG、PTPRT、PTPRS、PTPRO、PTPRM、PTPRF和PTPRD相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。所示实验是两个独立测定的代表。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图12E是一组显微照片，示出了可溶性查询物BTN2A2以及结合配偶体LRRC4B相对于对照未转染(UT)细胞的细胞表面相互作用测定的结果。“结合”仅以灰色显示查询蛋白。所示实验是两个独立测定的代表。“融合”以红色显示查询蛋白并且以蓝色显示DAPI染色的细胞核。比例尺＝50μm。
图12F是一组免疫印迹，示出了共表达BTN3A1-HA或载体对照的细胞中LRRC4B-FLAG、LRRC4C-FLAG、TGOLN2-FLAG、VSIG8-FLAG、CDH9-FLAG和ST14-FLAG的共免疫沉淀(co-IP)测定的结果。
图12G是条形图，示出了相对于野生型PTPRD，指定的PTPRD变体与指定的结合配偶体的结合特异性。
图13A是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据公开可用的CRC(II期)微阵列基因表达数据集GSE33113中的平足蛋白(PDPN)表达水平(T1、T2和T3)将患有II期疾病的患者分为三分位数的存活概率。Logrank p值(Logrank p)与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险(CoxPH)p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图13B是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据公开可用的CRC(所有期别)微阵列基因表达数据集GSE39582中的PDPN表达水平分为三分位数的患有任何期别疾病的患者的存活概率。Logrank p值与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图13C是显示癌症基因组图谱(TCGA)中PDPN表达与肿瘤含量(癌细胞的百分比)之间的相关性的图。
图13D是显示PDPN与TCGA中活化的成纤维细胞特征(成纤维细胞得分)之间的相关性的图。
图13E是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据GSE33113和GSE39582数据集中的活化的成纤维细胞识别标志表达水平(活化的成纤维细胞三分位数)分为三分位数的患有II期CRC的患者的存活概率。Logrank p值与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图13F是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据GSE33113和GSE39582数据集中的活化的成纤维细胞识别标志表达水平(活化的成纤维细胞三分位数)分为三分位数的患有任何期别CRC的患者的存活概率。Logrank p值与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图14A是图解和一组显微照片，示出了单体或四聚体PD-L1与PD-1或PD-L2的结合。该图(上图)示出了针对表达PD-1或PD-L2的细胞，在已经与5nM、10nM、50nM、200nM或500nM单体或四聚体PD-L1接触的细胞表面上检测到的归一化的荧光强度.显微照片(下图)是针对表达PD-1或PD-L2的细胞，在已经与500nM单体或四聚体PD-L1接触的细胞表面上的荧光的代表性图像。
图14B是图解和一组显微照片，示出了单体或四聚体脊髓灰质炎病毒受体(PVR)与CD96、CD226或TIGIT的结合。该图(上图)示出了针对表达CD96、CD226或TIGIT的细胞，在已经与5nM、10nM、50nM、200nM或500nM单体或四聚体PVR接触的细胞表面上检测到的荧光链霉亲和素的归一化的荧光强度.显微照片(下图)是针对表达CD96、CD226或TIGIT的细胞，在已经与500nM单体或四聚体PVR接触的细胞表面上的荧光的代表性图像。
图14C是显示胞外域-gD-GPI文库成员设计的示意图。左图：未标记的全长单程跨膜(STM)蛋白。右图：胞外域-gD-GPI蛋白，其包含STM蛋白的胞外域、糖蛋白D(gD)标签和糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接基。
图14D是图表，示出了如使用抗gD抗体测量的对胞外域-gD-GPI文库成员的表面表达(作为每个细胞的荧光强度)的量化。示出了不可检测(无)、低、中和高表达者的表面染色的代表性图像。虚线表示不同表达水平的任意截止值。表达是两个独立测定的代表。
图14E是用于受体发现的基于细胞的自动化平台(细胞表面相互作用筛选)的示意图。(1)描述了一个由大约1200个独特的单跨膜(STM)受体组成的文库，这些受体表达为与gD-GPI标签融合的STM细胞外结构域(ECD)。(2)描述了查询蛋白平足蛋白(PDPN)的四聚化。PDPN表达为与用于定点生物素化的Avidity AVITAGTM(Avi标签)融合的PDPN细胞外结构域(ECD)，经生物素化，并与荧光链霉亲和素(SA)缀合以形成高亲合力四聚体。(3)描绘了受体-配体相互作用的自动化筛选(细胞表面相互作用筛选)。将单个单跨膜(STM)受体转染到哺乳动物细胞中，并在板上的单个孔中培养。高亲合力PDPN四聚体与细胞在4℃培育。当PDPN与STM受体相互作用时，荧光SA标签被保留在细胞表面。(4)描绘了(3)的测定的单个孔的高内涵荧光成像。(5)描绘了荧光信号强度的表示。背景是通过与文库内所有受体的相互作用的平均信号强度来计算的。(6)描绘了代表性表面等离子体共振(SPR)图。SPR作为正交技术用来进一步验证相互作用。
图14F是显示细胞表面相互作用自动化筛选结果的交叉图，其中测试了免疫受体B7-H3(CD276)与胞外域-gD-GPI STM蛋白文库的相互作用。每个圆圈代表B7-H3与STM受体之间的结合相互作用。独特的高分命中以红色圆圈显示。以灰色圆圈显示的命中是凭经验确定的非特异性结合剂。白细胞介素20受体亚基α(IL20-RA)被鉴定为相互作用配偶体。
图14G是显示细胞表面相互作用自动化筛选结果的交叉图，其中测试了免疫受体B7-H3(CD276)与不包含标签的全长STM蛋白文库的相互作用。每个圆圈代表B7-H3与STM受体之间的结合相互作用。独特的高分命中以红色圆圈显示。以灰色圆圈显示的命中是凭经验确定的非特异性结合剂。白细胞介素20受体亚基α(IL20-RA)被鉴定为相互作用配偶体。
图14H是显示细胞表面相互作用自动化筛选结果的交叉图，其中测试了平足蛋白(PDPN)与STM蛋白文库的相互作用。以灰色圆圈显示的命中是凭经验确定的非特异性结合剂。每个相互作用都重复测试。每个圆圈代表PDPN与STM受体之间的结合相互作用。CD177被确定为一种新型的相互作用配偶体。
图14I是传感图，示出了如通过表面等离子体共振(SPR)分析的PDPN与CD177的结合。将重组CD177(表达为ECD)固定在传感器芯片上，并以指定的浓度注射重组PDPN(表达为Fc标记的ECD)和对照蛋白。示出了使用表达为单体胞外域的重组PDPN测量的每个相互作用的解离常数(KD)值。
图14J是传感图，示出了如通过SPR分析的，对照ECD与PDPN之间不存在结合。将对照ECD固定在传感器芯片上，并以指定的浓度注射重组PDPN(表达为Fc标记的ECD)和对照蛋白。示出了使用表达为单体胞外域的重组PDPN测量的每个相互作用的解离常数(KD)值。
图15A是一对图表，示出了嗜中性粒细胞上的CD177表达。左图是代表性直方图，示出了来自三个不同供体和同型对照的健康血液中的中性粒细胞的CD177表达。右图是图表，描绘了供体血液样品中CD177+中性粒细胞的百分比(n＝31)。
图15B是一组图，示出了使用流式细胞术鉴定健康志愿者血液、CRC患者血液、邻近的正常结肠组织(邻近结肠)和癌性结肠组织(CRC结肠)中的嗜中性粒细胞的设门策略。血液图代表来自血液样品的数据，其中红细胞(RBC)被裂解。结肠组织图代表来自结肠组织样品的单细胞悬浮液的数据，其中红细胞被裂解，并且悬浮液用70微米筛网过滤。所有样品都用7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色以排除死细胞，并与指定的抗体一起培育。阴影区域代表被选择用于分析的数据(“门”)。门被选择为包括实时事件(如不存在7-AAD染色所示)、单线态和CD45+。数据是4-7位独立供体的代表。
图15C是显示细胞的百分比的图表，该细胞是来自4-7位独立供体的健康志愿者血液(norm血液)、CRC患者血液(pt血液)、邻近的正常结肠组织(adj结肠)和癌性结肠组织(CRC结肠)样品中的嗜中性粒细胞。***p<0.001，Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。
图15D是显示嗜中性粒细胞的百分比的图表，该嗜中性粒细胞是来自4-7位独立供体的健康志愿者血液、CRC患者血液、邻近的正常结肠组织和癌性结肠组织样品中的CD177+。
图15E是代表性直方图，示出了与同型对照相比，健康血液、患者血液、邻近的正常(adj)结肠组织和癌性(CRC)结肠组织中的嗜中性粒细胞中的CD177表达水平。数据是4-7位独立供体的代表。
图15F是一组曲线图，示出了使用流式细胞术鉴定邻近的正常结肠组织、癌性(CRC)结肠组织和憩室炎(Div)结肠组织中的基质细胞的设门策略。图代表来自组织样品的单细胞悬浮液的数据。样品如所示染色。门被选择为包括实时事件(如不存在7-AAD染色所示)、单线态、CD45-(即不是免疫细胞)和EpCAM-(即不是肿瘤细胞)以进行间质细胞的检查。DN＝双阴性T细胞；BEC＝血液内皮细胞。数据是3-7个独立样品的代表。
图15G是显示CRC结肠细胞中的PDPN+细胞的百分比的图表，该细胞是与癌症相关的成纤维细胞(CAF)细胞(EpCAM-、CD45-、CD31-)；内皮细胞(EC)(EpCAM-、CD45-、CD31+)；肿瘤细胞(TC)(EpCAM+)、髓系细胞(CD45+、CD11B+)、CD4 T细胞(CD45+、CD3+、CD4+)；或CD8 T细胞(CD45+、CD3+、CD8+)。数据是3-7个独立样品的代表。**p<0.01，***p<0.001，Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。
图15H是显示CRC结肠细胞中的PDPN的平均荧光强度(MFI)的图表，该细胞是与癌症相关的成纤维细胞(CAF)细胞(EpCAM-、CD45-、CD31-)；内皮细胞(EC)(EpCAM-、CD45-、CD31+)；肿瘤细胞(TC)(EpCAM+)、髓系细胞(CD45+、CD11B+)、CD4 T细胞(CD45+、CD3+、CD4+)；或CD8T细胞(CD45+、CD3+、CD8+)。数据是3-7个独立样品的代表。**p<0.01，****p<0.0001，Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。
图15I是显示邻近的正常(adj)结肠组织、癌性(CRC)结肠组织和憩室炎(div)结肠组织中PDPN+成纤维细胞的百分比的图表。数据是3-7个独立样品的代表。
图15J是显示邻近的正常(adj)结肠组织、癌性(CRC)结肠组织和憩室炎(div)结肠组织中PDPN成纤维细胞的MFI的图表。数据是3-7个独立样品的代表。
图16A是来自组织微阵列的一对显微照片，示出了针对CD177(蓝色)和PDPN(粉色)染色的邻近的正常结肠组织。PDPN染色在成纤维细胞上基本上不存在，并标记了淋巴管。很少观察到CD177染色。下图示出了放大的图像。
图16B是来自组织微阵列的一对显微照片，示出了针对CD177(蓝色)和PDPN(粉色)染色的癌性CRC结肠组织。PDPN染色在成纤维细胞上基本上不存在，并标记了淋巴管。很少观察到CD177染色。该肿瘤在肿瘤床周围的基质中显示出强烈的PDPN染色，但在上皮细胞本身中没有。下图示出了放大的图像。
图16C是一组显微照片，示出了癌性(CRC)结肠细胞中针对PDPN和CD177的双重免疫荧光染色的代表性图像。第一张图示出了具有PDPN(绿色)和CD177(红色)染色的组织概览。第二、第三和第四张图示出了第一张图的显微照片的插图，如第一张图中的框所示。第二张图显示PDPN和CD77染色。第三张图仅显示CD177染色。第四张图仅显示PDPN染色。比例尺为50μm。
图16D是一组显微照片，示出了CRC细胞中针对髓过氧化物酶(MPO；嗜中性粒细胞的标志物)和CD177的双重免疫荧光染色的代表性图像。第一张图示出了具有MPO(绿色)和CD177(红色)染色的组织概览。第二、第三和第四张图示出了第一张图的显微照片的插图，如第一张图中的框所示。第二张图显示MPO和CD77染色。第三张图仅显示CD177染色。第四张图仅显示MPO染色。比例尺为50μm。
图16E是条形图，示出了对于PDPN或CD177染色呈阴性(-)或阳性(+)的正常邻近结肠(正常)和CRC癌(肿瘤)细胞的百分比。
图17A是柱状图，示出了接种到3D凝胶中并用同型对照、重组人CLEC-2(rCLEC-2)或重组人CD177(r-CD177)处理的野生型癌症相关成纤维细胞(CAF)的形态指数。点代表含有>50个细胞和6个独立实验的单孔。对于每个实验，相对于同型对照绘制数据。**p<0.01，Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。
图17B是一组显微照片，示出了针对肌动蛋白和DAPI染色的3D凝胶中癌症相关成纤维细胞的代表性图像。左图示出了用同型对照处理的细胞。中图示出了用重组人CLEC-2(rCLEC-2)处理的细胞。右图示出了用重组人CD177(rCD177)处理的细胞。比例尺：20μm。
图17C是柱状图，示出了接种到3D凝胶中的野生型癌症相关成纤维细胞(CAF)的形态指数，或单独接种(-)或与从血液中分离的原代嗜中性粒细胞(neut)或T细胞以5:1的比率一起接种。点代表含有>50个细胞的单孔和2-3个独立实验，每个实验代表5个供体。**p<0.01，Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。
图17D是柱状图，显示接种到3D凝胶中并用同型对照、重组人CLEC-2(r-CLEC2)或重组人CD177(r-CD177)处理的来自健康人膀胱、结肠或卵巢(HOF)组织的原代人成纤维细胞的形态指数。点代表含有>50个细胞和3个独立实验的单孔。*p<0.05，Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。
图17E是代表性直方图，示出了来自健康人膀胱、结肠和卵巢(HOF)组织和同型对照的成纤维细胞上的PDPN表达染色。
图17F是柱状图，示出了相对于未受刺激的细胞(un)，用同型对照、重组人CLEC-2(rCLEC-2)或重组人CD177(r-CD177)处理的野生型癌症相关成纤维细胞(CAF)的收缩(以μm为单位)。点代表每个条件下2-3个孔的平均值。图表包含来自4个独立实验的数据。*p<0.05，Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。
图18A是描绘与串联质量标记和用于深度覆盖的分级分离并行的多重全局蛋白质组学和磷酸-蛋白质组学实验的工作流程的示意图。癌症相关成纤维细胞(CAF)用DMSO对照、CLEC-2或CD177一式两份处理2分钟或30分钟，然后裂解。将蛋白质裂解物还原并用LysC和胰蛋白酶消化，然后将肽归一化。肽用串联质量标签(TMT)标记。一部分肽(～0.5mg)用于蛋白质谱分析。这些肽通过高pH反相分级分离(Hi pH RP)进行分级分离。样品在HPLC上运行，肽通过液相色谱-质谱(LC MS/MS)分析进行鉴定。剩余的肽(～6.5mg)用于全局磷酸化分析。肽通过强阳离子交换色谱(SCX)进行分级分离，并通过液相色谱-质谱(LC MS/MS)进行分析。
图18B是热图，示出了在用CLEC-2或CD177处理2分钟(2')或30分钟(30')的CAF中，显著改变(|Log2FC|>1和p<0.05)的所有磷酸化位点的蛋白质磷酸化倍数改变(与未处理的对照相比)。
图18C是火山图，示出了在2分钟后，相对于未处理的细胞，用CD177(圆圈)或CLEC-2(三角形)刺激的CAF中的蛋白质磷酸化的显著改变。
图18D是火山图，示出了在30分钟后，相对于未处理的细胞，用CD177(圆圈)或CLEC-2(三角形)刺激的CAF中的蛋白质磷酸化的显著改变。
图18E是柱状图，示出了由与未处理的CAF相比在CLEC-2或CD177处理组中磷酸位点显著改变的蛋白质代表的富集的(q<0.05)基因本体论(GO)途径。数字表示与每个精选的GO术语相关的磷酸化位点组。
图18F是表格，描述了在具有富集生物过程途径的蛋白质上选择的磷酸化位点在处理条件下(相对于未受刺激的对照)的相对丰度改变。分组的磷酸化位点用分隔的“/”表示。
图18G是维恩图，表明在全局蛋白质组(6,309种蛋白质)和磷酸化蛋白质组(4,122种蛋白质)中鉴定的独特蛋白质之间有约70％的重叠(2,912种蛋白质)。总的来说，鉴定了18,558种具有高质量报告离子强度的独特磷酸肽，它们映射到4,122种具有至少一个磷酸化残基的独特蛋白质。
图18H是维恩图，总结了在30分钟时被CLEC-2(190个磷酸化位点)、CD177(54个磷酸化位点)或两者(32个磷酸化位点)显著改变(p<0.05并且|Log2倍数改变|>1)的磷酸化位点的数目。
图18I是描述在磷酸蛋白质组学测定中检测到的所有磷酸肽的三元图。显著改变的磷酸化位点被描绘为向上三角形(与未刺激相比去磷酸化)或向下三角形(与未刺激相比过度磷酸化)，并根据30分钟时CLEC-2(紫色)或30分钟时CD177(绿色)之间测得的倍数改变进行着色。
图19A是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据公开可用的CRC微阵列基因表达数据集GSE39582中的平足蛋白(PDPN)表达水平(T1、T2和T3)将患有II期疾病的患者分为三分位数的存活概率。Logrank p值(Logrank p)与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险(CoxPH)p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图19B是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据公开可用的CRC微阵列基因表达数据集GSE39582中的平足蛋白(PDPN)表达水平(T1、T2和T3)将患有IV期疾病的患者分为三分位数的存活概率。Logrank p值(Logrank p)与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险(CoxPH)p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图19C是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据公开可用的CRC微阵列基因表达数据集GSE33113中的FAP+成纤维细胞(FAP+fib)识别标志表达水平(T1、T2和T3)将患有II期疾病的患者分为三分位数的存活概率。Logrank p值(Logrank p)与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险(CoxPH)p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图19D是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据公开可用的CRC微阵列基因表达数据集GSE39582中的FAP+成纤维细胞识别标志表达水平(T1、T2和T3)将患有所有期别疾病的患者分为三分位数的存活概率。Logrank p值(Logrank p)与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险(CoxPH)p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图19E是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据公开可用的CRC微阵列基因表达数据集GSE39582中的活性(Act.)成纤维细胞识别标志表达水平(T1、T2和T3)将患有II期疾病的患者分为三分位数的存活概率。Logrank p值(Logrank p)与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险(CoxPH)p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图19F是一组Kaplan-Meier曲线和一个表格，示出了根据公开可用的CRC微阵列基因表达数据集GSE39582中的FAP+成纤维细胞识别标志表达水平(T1、T2和T3)将患有II期疾病的患者分为三分位数的存活概率。Logrank p值(Logrank p)与Kaplan-Meier曲线相关联。Cox比例风险(CoxPH)p值与表10中详述的单变量模型相关联。
图20是显示细胞表面相互作用自动化筛选结果的交叉图，其中一式两份测试了平足蛋白(PDPN)(表达为使用荧光链霉亲和素的四聚体)与全长、未标记STM蛋白文库的相互作用。新鉴定的结合配偶体CD177不存在于该受体文库中。使用高内涵显微镜采集单个孔的图像，使用InCell Developer软件处理图像，并将结合至细胞表面的PDPN的量表示为相对于背景的信号(S/N比)。每个圆圈代表PDPN与STM受体之间的结合相互作用。绿点代表在无关筛选中作为命中观察到的非特异性结合剂。CLEC-2被确定为一种新型的相互作用配偶体。
图21是传感图，示出了如通过SPR分析的PDPN与CLEC-2的结合。将重组CLEC-2固定在传感器芯片上，并以指定的浓度注射纯化的PDPN(表达为Fc标记的ECD)和无关的Fc标记的ECD对照蛋白。示出了使用表达为单体胞外域的重组PDPN测量的每个相互作用的解离常数(KD)值。
图22A是箱线图，示出了癌症基因组图谱(TCGA)数据集中正常结肠组织和CRC肿瘤中的CD177 RNA表达水平(log2 nRPKM)。
图22B是箱线图，示出了癌症基因组图谱(TCGA)数据集中正常结肠组织和CRC肿瘤中的PDPN RNA表达水平(log2 nRPKM)。
图22C是箱线图，示出了GSE39582数据集中CRC肿瘤中的PDPN和CD177 RNA表达水平。
图22D是箱线图，示出了GSE33113数据集中CRC肿瘤中的PDPN和CD177 RNA表达水平。
图23A是一组显微照片，示出了针对PDPN(左图)和CD177(右图)染色的正常邻近的(adj)结肠组织的连续切片。PDPN染色在成纤维细胞上基本上不存在，并标记了淋巴管。很少观察到CD177染色。
图23B是一组显微照片，示出了针对PDPN(左图)和CD177(右图)染色的癌性CRC结肠组织的连续切片。插图显示放大的图像。该肿瘤在肿瘤床周围的基质中显示出强烈的PDPN染色，但在上皮细胞本身中没有。
图23C是一组显微照片，示出了邻近的正常结肠组织中针对PDPN和CD177的双重免疫荧光染色的代表性图像。第一张图示出了具有PDPN和CD177染色的组织概览。第二、第三和第四张图示出了第一张图的显微照片的插图，如第一张图中的框所示。第二张图显示PDPN和CD77染色。第三张图仅显示CD177染色。第四张图仅显示PDPN染色。
图23D是一组显微照片，示出了邻近的正常结肠组织中针对髓过氧化物酶(MPO；嗜中性粒细胞的标志物)和CD177的双重免疫荧光染色的代表性图像。第一张图示出了具有MPO和CD177染色的组织概览。第二、第三和第四张图示出了第一张图的显微照片的插图，如第一张图中的框所示。第二张图显示PDPN和CD77染色。第三张图仅显示CD177染色。第四张图仅显示MPO染色。
图24A是一组密度图，描绘了在用CD177或CLEC-2刺激2分钟或30分钟的CAF中观察到的在蛋白质组学测定和磷酸化-蛋白质组学测定两者中鉴定的蛋白质的磷酸化残基(x轴)相对于总蛋白质丰度改变(y轴)的改变。
图24B是热图，示出了在用CLEC-2或CD177处理2分钟(2')或30分钟(30')的CAF中，显著改变(|Log2FC|>1和p<0.05)的所有磷酸化位点的蛋白质磷酸化倍数改变(与未处理的对照相比)，如图18B中所示，包括观察到显著改变的磷蛋白的身份。
图25是一对图示，示出了肿瘤微环境中CD177与PDPN相互作用的模型。左图显示组织的概览。在肿瘤床岛之间形成密集的CAF带。这些纤维通常与肿瘤床平行并包含许多免疫细胞。具体来说，在这些富含基质的区域中可以找到嗜中性粒细胞和调节性T细胞(Treg)。虽然仍有许多PDPN+CAF不与这些CD177+免疫细胞接触，但一些CAF会与这些细胞相互作用并接收PDPN下游的抑制信号。右图示出了CD177与PDPN之间的分子相互作用模型以及CAF中的下游结果。CD177参与改变了CAF的收缩、运动、细胞外基质(ECM)重塑和代谢。
图26A是直方图，示出了与同型对照样品相比，平足蛋白(PDPN)在野生型(WT)癌症相关成纤维细胞(CAF)和Pdpn-/-CAF上的表达。
图26B是图表，示出了接种到3D凝胶中的WT和Pdpn-/-CAF的形态指数(周长2/4**面积)。每个点代表一个含有>50个细胞的孔的平均值，并且该图是3个独立实验的代表。*p<0.05，Mann-Whitney U检验。
图26C是一对显微照片，示出了对肌动蛋白(红色)和细胞核(DAPI；蓝色)进行染色的3D凝胶中的WT(左)和Pdpn-/-(右)CAF。
图26D是显示Pdpn-/-细胞与WT细胞相比的相对收缩的图。每个点代表来自4个独立实验的3-4个孔的平均值。*p<0.05，Mann-Whitney U检验。
图26E是显示随时间推移WT和Pdpn-/-CAF的汇合百分比的图。每个点代表每个条件下来自4个孔的16个不同视野的平均值，并且该图是4-6个独立实验的代表。****p<0.0001，方差分析。
图27A是一组显微照片，示出了来自与无CAF(仅肿瘤)、Pdpn-/-CAF或野生型(WT)CAF一起生长8天时的3D培养物中表达红色荧光蛋白(RFP)的SW480肿瘤类器官的单孔的代表性图像。没有肿瘤细胞的孔(仅WT CAF和仅Pdpn-/-CAF)作为对照显示。
图27B是图表，示出了来自图27A的孔在培养1天和8天之间的时间点的最大强度投影的球状体的总面积(以μm2为单位)的图。数据是两个独立实验(每个实验中每个条件n＝4个孔)的代表。Dunn多重比较测试是在所有条件下针对仅肿瘤对照进行的。**＝p<0.05，***＝p<0.0001。
图27C是一组显微照片，示出了来自与无CAF(仅肿瘤)、WT CAF或者用对照、四聚体CD177或四聚体CLEC-2处理的WT CAF一起生长17天时的3D培养物中表达RFP的SW480肿瘤类器官的单孔的代表性图像。没有肿瘤细胞的孔(仅WT CAF)作为对照显示。
图27D是图表，示出了来自图27C的孔在培养1天和17天之间的时间点的最大强度投影的球状体的总面积(以μm2为单位)的图。数据是两个独立实验(每个实验中每个条件n＝4个孔)的代表。Dunn多重比较检验显示，肿瘤WT CAF组与除肿瘤+WT CAF+对照组以外的所有其他条件之间存在显著差异，****p<0.0001。
图28A是热图，示出了IgSF相互作用组中的所有基因及其与CD8+Teff细胞识别标志、泛成纤维细胞TFGb识别标志和基于免疫沙漠(UroA：尿路上皮样A)、免疫排除(Inf：浸润的)或免疫发炎的肿瘤(UroB：尿路上皮样B，SCCL：基底/SCC样)的Lund子类型分型方案的基因集的关联。
图28B是火山图，示出了与阳性(蓝色)或阴性(红色)临床结果显著相关的蛋白质相互作用。突出显示了选择相互作用。
图28C是散点图，示出了通过比较从相互作用对的联合表达计算的危害比与个体基因的复合风险比而可视化的具有高协同效应的相互作用。突出显示了对单基因临床结果具有更高预测能力的选择相互作用。红色代表预测缺乏应答的相互作用；蓝色显示与应答相关的相互作用。
图28D是森林图，示出了相对于个体基因，对于每种EFNB1相互作用，与缺乏应答和患者存活的相关性的显著性增加。改进了对EFNB1/EVC2相互作用不良总体存活的预测(HR：1.61；95％CI：1.24；2.09，P＝3.78e-4)，该改进是相对于以下单个基因而言：EFNB1(HR：1.25；95％CI：0.97；1.62；P＝0.087)和EVC2(HR：1.32；95％CI：1.02；1.71，P＝0.035，n＝348位患者)。
图28E是存活图，显示EFNB1的表达水平大于或小于或等于中值表达水平、EVC2的表达水平大于或小于或等于中值表达水平、或EFNB1和EVC2的表达水平大于或小于或等于中值表达水平的个体的存活概率。
图28F是EFNB1/ECV2相互作用和每个基因分别的箱线图。须图代表最小值和最大值，而黑色圆圈是异常值。Y轴：Z得分表达。应答者组：完全应答(CR)和部分应答(PR)；无应答者组：疾病进展(PD)和疾病稳定(SD)。(p值：EFBN1：0.0008901；EVC2：0.009046；EFBN1/EVC2：9.19x10-5，n＝298位患者)。
图29A是热图，示出了按TCGA肿瘤适应症(列)聚类的所有IgSF相互作用组基因(行)的肿瘤与邻近的正常样品之间的差异性表达。单元格值代表肿瘤与邻近的正常样品log2 rsem值之间的平均改变。
图29B是网络图，示出了TCGA肿瘤适应症HNSC(头颈部鳞状细胞癌)中LILR蛋白家族内的上调(红色)和下调(蓝色)基因。
图29C是网络图，示出了TCGA肿瘤适应症KIRC(肾脏肾透明细胞癌)中LILR蛋白家族内的上调(红色)和下调(蓝色)基因。
图29D是聚类热图，示出了CCLE中网络基因的归一化的蛋白质表达值，按组织划分。
图29E是散点图，示出了肺CCLE组织子集中报告的结合配偶体IGSF3和PTGFRN的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图29F是散点图，示出了上呼吸消化道CCLE组织子集中报告的结合配偶体IGSF3和PTGFRN的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图29G是散点图，示出了食管CCLE组织子集中报告的结合配偶体IGSF3和PTGFRN的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图29H是散点图，示出了肺CCLE组织子集中报告的结合配偶体CEACAM5和CEACAM6的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著相关(q<0.2)。
图29I是散点图，示出了肺CCLE组织子集中报告的结合配偶体CEACAM5和CEACAM6的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著负相关(q<0.2)。
图29J是散点图，示出了肺CCLE组织子集中报告的结合配偶体ICOSLG和NTM的相对蛋白质表达的比较。表达模式与叠加的回归模型(红色)显著负相关(q<0.2)。
图30A是火山图，示出了与CD8+Teff细胞显著相关的蛋白质相互作用。突出显示了选择相互作用。
图30B是网络图，示出了按风险比着色的免疫相关相互作用的PD-1/PD-L1群落，具有阿特珠单抗抑制相互作用的视觉指示。
图30C是网络图，示出了按风险比着色的LRRC4B的选择结合配偶体。
图30D是网络图，示出了按风险比着色的ephrin家族内的选择相互作用。
图30E是森林图，示出了相对于个体基因，对于每种CD274(PD-L1)相互作用，与缺乏应答和患者存活的相关性的显著性增加。
图30F是森林图，示出了相对于个体基因，对于每种LRRC4B相互作用，与缺乏应答和患者存活的相关性的显著性增加。
具体实施方式
I.定义
如本文所用的术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包含(且描述)涉及该值或参数本身的方面。
如本文所用，术语“单跨膜受体”、“单程跨膜受体”或“STM受体”是指具有单个跨膜结构域的蛋白质。在一些方面，STM受体在细胞表面上表达。示例性STM受体在表5、表7和表8以及Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018和Clark等人,Genome Res,13:2265-2270,2003中提供。在一些方面，STM蛋白具有UniProt注释“富含亮氨酸”、“富含半胱氨酸”、“ITIM/ITAM”(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序/基于免疫受体酪氨酸的活化基序)、“TNFR”(肿瘤坏死因子受体)、“TLR/ILR”(Toll样受体/白细胞介素受体)、“轴突导向因子(semaphorin)”、“激酶样”、“Ig样”(免疫球蛋白样)、“纤连蛋白”、“ephrin”、“EGF”、“细胞因子R”或“钙粘蛋白”。STM受体可以基于例如信号肽或氨基酸序列中预测的跨膜区的存在来鉴定。在一些方面，STM受体表达为细胞外结构域。
如本文所用，术语“免疫球蛋白超家族蛋白”或“IgSF蛋白”是指包含至少一个免疫球蛋白(Ig)结构域或免疫球蛋白折叠的蛋白，具有注释“免疫球蛋白样超家族”(例如，在UniProt数据库中)，或以其他方式表明与此类蛋白质具有结构或功能相似性。在一些方面，IgSF蛋白在UniProt数据库中具有注释“免疫球蛋白样结构域超家族”。在一些方面，IgSF蛋白基于其参与关键生物活性，例如白细胞活化、细胞-细胞粘附、细胞通讯或信号转导而被包括。在一些方面，IgSF蛋白具有UniProt注释“TFNR”(转录因子样核调节因子)、“TLR/ILR(Toll样受体/白细胞介素受体)、“轴突导向因子”、“激酶样”、“IgSF/Ig样折叠”、“Ig样折叠”、“纤连蛋白”、“ephrin”、“EGF”、“CytokineR”或“钙粘蛋白”。在一些方面，IgSF蛋白在细胞表面上表达。在其他方面，IgSF蛋白是分泌的。示例性IgSF蛋白提供于表4中和Ozkan等人,Cell,154(1):228-239,2013和Yap等人,J Mol Biol,426(4),945-961中。在一些方面，IgSF超家族蛋白是程序性细胞死亡1配体1(PD-L1；CD274)、程序性细胞死亡1配体2(PD-L2；CD274；PDCD1LG2)、受体型酪氨酸-蛋白磷酸酶δ(PTPRD)、受体型酪氨酸-蛋白磷酸酶S(PTPRS)、受体型酪氨酸-蛋白磷酸酶S(PTPRF)、神经细胞粘附分子L1样蛋白(“L1的近同源物”；CHL1)、接触蛋白1(CNTN1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LILRB1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3(LILRB3)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(LILRB4)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员5(LILRB5)、含MAM结构域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1(MDGA1)或酪氨酸-蛋白激酶受体AXL(UFO)。在一些方面，IgSF蛋白表达为细胞外结构域。在一些方面，IgSF蛋白是分泌的蛋白质。
如本文所用，术语“免疫球蛋白结构域”或“Ig结构域”是指IgSF蛋白的结构域，其特征在于约7-9条反平行β-链，包含两层β-折叠夹心，跨越约70-125个氨基酸残基。在一些方面，免疫球蛋白结构域包含连接其B链和F链的保守二硫键。示例性免疫球蛋白结构域描述于Bork等人,JMB,242(4):309-320,1194和Yap等人,J Mol Biol,426(4),945-961中。
如本文所用，术语“细胞外结构域”或“ECD”是指预测定位于细胞外质膜外部的蛋白质结构域。在一些情况下，ECD是受体例如STM受体的ECD。在一些方面，ECD是IgSF蛋白的ECD。在一些方面，ECD是PDPN的ECD。在一些方面，细胞外结构域的边界可以通过预测表明蛋白质穿过质膜的结构域，例如跨膜结构域(例如，跨膜螺旋)来鉴定。在一些方面，细胞外结构域的存在可通过结构域、序列或基序的存在来预测，所述结构域、序列或基序指示蛋白质被运输至质膜，例如信号序列或糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接位点。在一些方面，ECD的边界是根据UniProt注释确定的。在一些方面，ECD是可溶性的。在一些方面，细胞外结构域在全长蛋白质的背景下表达。在其他方面，细胞外结构域表达为分离的细胞外结构域，例如仅包含蛋白质的被预测为处于细胞外的氨基酸残基的氨基酸残基序列。
在一些方面，分离的ECD包含在融合蛋白中。在一些方面，包合在融合蛋白中增加了溶解性、表达的容易性、捕获(例如，在蛋白A包被的板上)的容易性、多聚化或ECD的一些其他所需特性。在一些方面，ECD或ECD融合蛋白是单体。在其他方面，ECD或ECD融合蛋白是多聚体，例如四聚体或五聚体。在一些方面，ECD与人IgG融合。在一些方面，ECD与人Fc标签融合。在一些方面，ECD与Avidity AVITAGTM(Avi标签)融合。在一些方面，ECD与多组氨酸(His)标签融合。在一些方面，ECD与糖蛋白D(gD)标签和糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接基融合，例如gD-GPI标签。在其他方面，ECD与大鼠软骨寡聚基质蛋白(COMP)的五聚化结构域和β-内酰胺酶蛋白融合，例如，如Bushell等人,Genome Res,18:622-630,2008中所述。在一些方面，ECD融合蛋白进一步包括切割序列，例如TEV切割序列，以允许去除一个或多个结构域。在一些情况下，具有可在切割序列处切割的Avi标签和Fc标签的ECD融合蛋白被进一步加工以去除Fc标签、生物素化Avi标签并将生物素化的ECD融合蛋白与荧光链霉亲和素(SA)融合，例如，以形成四聚化的ECD融合蛋白。在一些情况下，分离的ECD或ECD融合蛋白被纯化。
如本文所用，“调节剂”是调节(例如，增加、降低、活化或抑制)给定生物活性(例如，相互作用或由相互作用产生的下游活性)的药剂。调节剂或候选调节剂可以是例如小分子、抗体、抗原结合片段(例如双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域)、肽、模拟物、反义寡核苷酸或小干扰RNA(siRNA)。
“增加”或“活化”意指引起总体增加的能力，例如，总体增加20％或以上，50％或以上，或75％、85％、90％、95％或以上。在某些方面，增加或活化可以指蛋白质-蛋白质相互作用的下游活性。
“减少”或“抑制”意指引起总体降低的能力，例如，总体降低20％或以上，50％或以上，或75％、85％、90％、95％或以上。在某些方面，减少或抑制可以指蛋白质-蛋白质相互作用的下游活性。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，受体与配体)之间的1:1相互作用作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。
如本文所用，“复合”或“复合的”是指通过非肽键的键和/或力(例如，范德华力、疏水力、亲水力)彼此相互作用的两个或更多个分子的缔合。一方面，复合物是异源多聚体。应当理解，如本文所用，术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包含具有缀合至蛋白质复合物中的蛋白质的非蛋白质实体的复合物(例如，包括但不限于化学分子，诸如毒素或检测剂)。
“疾患”是将从治疗获益的任何病症，包括但不限于慢性和急性疾患或疾病，包括那些使哺乳动物易患所述疾患的病理性病症。在一个方面，所述疾患是癌症。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长/增殖不受控制为特征的生理状况。癌症方面包括实体瘤癌症和非实体瘤癌症。实体癌肿瘤包括但不限于结直肠癌、头颈部癌(例如，头颈部鳞状细胞癌)、胶质瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌，或其转移形式。在一些方面，癌症为结直肠癌(CRC)。在一些方面，癌症为头颈部癌。头颈部癌的进一步方面包括头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。在一些方面，癌症为乳腺癌。乳腺癌的进一步方面包括激素受体阳性(HR+)乳腺癌，例如雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌、孕酮受体阳性(PR+)乳腺癌或ER+/PR+乳腺癌。乳腺癌的其他方面包括HER2阳性(HER2+)乳腺癌。乳腺癌的其他方面还包括三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面，乳腺癌为早期乳腺癌。在一些方面，癌症为肺癌。肺癌的进一步方面包括表皮生长因子受体阳性(EGFR+)肺癌。肺癌的其他方面包括表皮生长因子受体阴性(EGFR-)肺癌。肺癌的其他方面还包括非小细胞肺癌，例如鳞状肺癌或非鳞状肺癌。肺癌的其他方面包括小细胞肺癌。在一些方面，癌症为泌尿道癌症。泌尿道癌症包括尿路上皮癌(UC)、泌尿道的非泌尿路上皮癌和具有混合组织学的泌尿道癌。泌尿道非尿路上皮癌包括世界卫生组织分类中列出的所有亚型，例如鳞状细胞癌、疣状癌、腺癌(adenocarcinoma)、腺体癌(glandular carcinoma)、贝里尼集合管癌、神经内分泌癌或小细胞癌。腺癌可以是肠腺癌、粘液腺癌、印戒细胞腺癌或透明细胞腺癌。泌尿道癌症可能位于膀胱、肾盂、输尿管或尿道。在一些方面，根据TNM分类，在治疗开始时，泌尿道癌症(例如，尿路上皮癌、非尿路上皮癌或具有混合组织学的泌尿道癌)是局部晚期的，例如T4b Nany或Tany N2-3期。在一些方面，泌尿道癌症是转移性尿路上皮癌(mUC)、泌尿道非尿路上皮癌的转移形式或具有混合组织学的泌尿道癌的转移形式。在一些方面，根据TNM分类，泌尿道癌症在治疗开始时处于TNM M1期。在一些方面，癌症为膀胱癌。膀胱癌的其他方面包括尿路上皮癌(UBC)、肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)或非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)。在一些方面，癌症为肾癌。肾癌的进一步方面包括肾细胞癌(RCC)。在一些方面，癌症为肝癌。肝癌的进一步方面包括肝细胞癌。在一些方面，癌症为前列腺癌。前列腺癌的进一步方面包括去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。在一些方面，癌症是实体瘤的转移形式。在一些方面，实体瘤的转移形式是黑素瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、头颈部癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌的转移形式。在一些方面，癌症为非实体瘤癌症。非实体瘤癌症包括但不限于B细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的进一步方面包括，例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病(AML)或蕈状真菌病(MF)。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转染细胞”、“转化细胞”和“转化体”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。在一些方面，宿主细胞被外源核酸稳定地转化。在其他方面，宿主细胞被外源核酸瞬时转化。
如本文所用，术语“癌症相关成纤维细胞”(“CAF”)或“肿瘤相关成纤维细胞”是指存在于肿瘤微环境(TME)例如基质中或与之相关的成纤维细胞(例如哺乳动物基质细胞)。在一些方面，CAF是活性成纤维细胞。CAF可以调节TME的结构和/或功能，例如通过细胞外基质(ECM)重塑和/或可溶性因子(例如，生长因子和/或炎症因子)的分泌进行调节。CAF可能有助于肿瘤发生、肿瘤生长、肿瘤侵袭、血管生成或转移。CAF可能损害抗肿瘤免疫。在一些方面，CAF表达平足蛋白(PDPN)。在一些方面，CAF的特征在于肌动球蛋白收缩性，这是一种影响组织硬度的特性。在一些方面，CAF与活化的成纤维细胞识别标志和/或FAP+成纤维细胞识别标志(例如，表达表11和/或表12中提供的基因)相关。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“平足蛋白”或“PDPN”是指来自任何哺乳动物来源的任何天然PDPN，该哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。PDPN也称为gp38、Aggrus和T1α。该术语涵盖全长PDPN和PDPN的分离区域或结构域，例如PDPN细胞外结构域(ECD)。该术语还涵盖PDPN的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人PDPN的氨基酸序列显示于UniProt登录号Q86YL7下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响PDPN功能和/或活性的PDPN的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“分化簇177”或“CD177”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然CD177，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长CD177和CD177的分离区域或结构域，例如CD177 ECD。该术语还涵盖CD177的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人CD177的氨基酸序列显示于UniProt登录号Q8N6Q3下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响CD177功能和/或活性的CD177的保守氨基酸取代。
术语“CD177活性激动剂”或“CD177激动剂”是指增加由CD177与其一种或多种结合配偶体例如PDPN相互作用引起的信号转导的分子。CD177活性激动剂可导致CD177与其一种或多种结合配偶体(例如PDPN)的结合相对于在激动剂不存在下两种蛋白质的结合增加。CD177活性激动剂可以包括抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、肽(例如多聚化肽，例如多聚化CD177多肽)、寡肽和其他增加由CD177与其一种或多种结合配偶体例如PDPN的相互作用引起的信号转导的分子。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“程序性细胞死亡1配体1”或“PD-L1”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然PD-L1，所述哺乳动物来源包含灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。PD-L1也称为CD274。该术语涵盖全长PD-L1和PD-L1的分离区域或结构域，例如PD-L1 ECD。该术语还涵盖PD-L1的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人PD-L1的氨基酸序列显示于UniProt登录号Q9NZQ7下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响PD-L1功能和/或活性的PD-L1的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“ephrin A型受体3”或“EPHA3”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然EPHA3，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长EPHA3和EPHA3的分离区域或结构域，例如EPHA3ECD。该术语还涵盖EPHA3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人EPHA3的氨基酸序列显示于UniProt登录号P29320下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响EPHA3功能和/或活性的EPHA3的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“程序性细胞死亡1配体2”或“PD-L2”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然PD-L2，所述哺乳动物来源包含灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。PD-L2也称为PDCD1LG2。该术语涵盖全长PD-L2和PD-L2的分离区域或结构域，例如PD-L2 ECD。该术语还涵盖PD-L2的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人PD-L2的氨基酸序列显示于UniProt登录号Q9BQ51下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响PD-L2功能和/或活性的PD-L2的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“CEACAM4”是指来自任何哺乳动物来源的任何天然CEACAM4，该哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长CEACAM4和CEACAM4的分离区域或结构域，例如CEACAM4 ECD。该术语还涵盖CEACAM4的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人CEACAM4的氨基酸序列显示于UniProt登录号O75871下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响CEACAM4功能和/或活性的CEACAM4的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“受体型酪氨酸-蛋白磷酸酶δ”或“PTPRD”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然PTPRD，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长PTPRD和PTPRD的分离区域或结构域，例如PTPRD ECD。该术语还涵盖PTPRD的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人PTPRD的氨基酸序列显示于UniProt登录号P23468下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响PTPRD功能和/或活性的PTPRD的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“受体型酪氨酸-蛋白磷酸酶F”或“PTPRF”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然PTPRF，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长PTPRF和PTPRF的分离区域或结构域，例如PTPRF ECD。该术语还涵盖PTPRF的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人PTPRF的氨基酸序列显示于UniProt登录号P10586下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响PTPRF功能和/或活性的PTPRF的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“受体型酪氨酸-蛋白磷酸酶S”或“PTPRS”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然PTPRS，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长PTPRS和PTPRS的分离区域或结构域，例如PTPRS ECD。该术语还涵盖PTPRS的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人PTPRS的氨基酸序列显示于UniProt登录号Q13332下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响PTPRS功能和/或活性的PTPRS的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“CHL1”是指来自任何哺乳动物来源的任何天然CHL1，该哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长CHL1和CHL1的分离区域或结构域，例如CHL1 ECD。该术语还涵盖CHL1的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人CHL1的氨基酸序列显示于UniProt登录号O00533下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响CHL1功能和/或活性的CHL1的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“接触蛋白1”或“CNTN1”是指来自任何哺乳动物来源的任何天然CNTN1，该哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长CNTN1和CNTN1的分离区域或结构域，例如CNTN1 ECD。该术语还涵盖CNTN1的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人CNTN1的氨基酸序列显示于UniProt登录号Q12860下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响CNTN1功能和/或活性的CNTN1的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1”或“LILRB1”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然LILRB1，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长LILRB1和LILRB1的分离区域或结构域，例如LILRB1 ECD。该术语还涵盖LILRB1的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人LILRB1的氨基酸序列显示于UniProt登录号Q8NHL6下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响LILRB1功能和/或活性的LILRB1的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2”或“LILRB2”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然LILRB2，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长LILRB2和LILRB2的分离区域或结构域，例如LILRB2 ECD。该术语还涵盖LILRB2的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人LILRB2的氨基酸序列显示于UniProt登录号Q8N423下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响LILRB2功能和/或活性的LILRB2的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3”或“LILRB3”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然LILRB3，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长LILRB3和LILRB3的分离区域或结构域，例如LILRB3 ECD。该术语还涵盖LILRB3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人LILRB3的氨基酸序列显示于UniProt登录号O75022下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响LILRB3功能和/或活性的LILRB3的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4”或“LILRB4”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然LILRB4，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长LILRB4和LILRB4的分离区域或结构域，例如LILRB4 ECD。该术语还涵盖LILRB4的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人LILRB4的氨基酸序列显示于UniProt登录号Q8NHJ6下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响LILRB4功能和/或活性的LILRB4的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员5”或“LILRB5”广泛地指来自任何哺乳动物来源的任何天然LILRB5，所述哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长LILRB5和LILRB5的分离区域或结构域，例如LILRB5 ECD。该术语还涵盖LILRB5的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性的人LILRB5的氨基酸序列显示于UniProt登录号O75023下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响LILRB5功能和/或活性的LILRB5的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“AXL”是指来自任何哺乳动物来源的任何天然AXL，该哺乳动物来源包括灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖全长AXL和AXL的分离区域或结构域，例如AXL ECD。AXL也称为UFO。该术语还涵盖AXL的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人AXL的氨基酸序列显示于UniProt登录号P30530下。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响AXL功能和/或活性的AXL的保守氨基酸取代。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“蛋白质”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工蛋白，通过细胞中加工产生的任何形式的蛋白。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体，例如氨基酸取代突变或氨基酸缺失突变。该术语还包括蛋白质的分离区域或结构域，例如细胞外结构域(ECD)。
“分离的”蛋白质或肽为已经从其自然环境的组分中分离的蛋白质或肽。在一些方面，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定，将蛋白质或肽纯化至大于95％或99％的纯度。
“分离的”核酸是指已经从其自然环境的组分中分离的核酸分子。经分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
如本文所用，术语“相互作用组”是指发生在一组分子内的一组分子相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用。在一些方面，相互作用组被表示为网络，例如，其中节点代表特定分子并且边连接节点的网络，针对该网络，测定(例如，细胞表面相互作用测定或细胞外相互作用测定)检测两个节点之间的相互作用。
如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指靶向至少一种免疫检查点蛋白以改变免疫应答的调节，例如下调、抑制、上调或激活免疫应答的治疗剂。术语“免疫检查点阻断”可用于指包含免疫检查点抑制剂的疗法。免疫检查点蛋白是本领域已知的，且包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡1(PD-1)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、程序性细胞死亡配体2(PD-L2)、T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、LAG-3、BTLA、IDO、OX40和A2aR。在一些方面，免疫检查点蛋白可在活化的T细胞表面表达。可用作用于本发明方法的免疫检查点抑制剂的治疗剂包括但不限于靶向CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、LAG-3、BTLA、IDO、OX40和A2aR中的一个或多个的治疗剂。在一些方面，免疫检查点抑制剂增强或抑制一种或多种靶向免疫检查点蛋白的功能。在一些方面，免疫检查点抑制剂是PD-L1轴结合拮抗剂，诸如阿特珠单抗。
术语“PD-L1轴结合拮抗剂”是指一种分子，该分子抑制PD-1轴结合配偶体与其一个或多个结合配偶体的相互作用以消除由PD-1信号传导轴上的信号传导引起的T细胞功能障碍，其结果是恢复或增强T细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)。如本文所用，PD-L1轴结合拮抗剂包括PD-L1结合拮抗剂、PD-1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-L1或PD-L2)相互作用产生的信号传导的分子。在一些方面，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其一种或多种结合配偶体的结合的分子。在具体方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体及其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及其它减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用产生的信号传导的分子。在一个方面，PD-1结合拮抗剂可减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-1的信号传导所介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的响应)。在一些方面，PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体。在一个具体方面，PD-1结合拮抗剂为MDX-1106(纳武单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为MK-3475(派姆单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为AMP-224。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为MED1-0680。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为PDR001(斯巴达珠单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为REGN2810(西米普利单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为BGB-108。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-1和B7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一些方面，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体的结合的分子。在具体方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1至PD-1和/或B7-1的结合。在一些方面，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或多个结合配偶体(诸如PD-1和B7-1)相互作用产生的信号转导的分子。在一个方面，PD-L1结合拮抗剂可减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-L1的信号传导所介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的响应)。在一些方面，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在又一具体方面，抗PD-L1抗体是MPDL3280A(阿特珠单抗，以具有WHO药物信息的TECENTRIQTM(药物的国际非专属名称)上市，推荐INN：目录74，第29卷，No.3，2015(参见第387页))。在某一具体方面，抗PD-L1抗体为YW243.55.S70。在另一具体方面，抗PD-L1抗体为MDX-1105。在另一具体方面，抗PD-L1抗体为MSB0015718C。在仍另一具体方面，抗PD-L1抗体为MEDI4736。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-1)的相互作用产生的信号传导的分子。在一些方面，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其一个或多个结合配偶体的结合的分子。在具体方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合。在一些方面，PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一个或多个结合配偶体(诸如PD-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一个方面，PD-L2结合拮抗剂可减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-L2的信号传导所介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的响应)。在一些方面，PD-L2结合拮抗剂为免疫粘附素。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(例如，双Fab)，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗原结合片段”或“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗原结合片段的示例包括但不限于：双Fab；Fv；Fab；Fab，Fab’-SH；F(ab’)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv、ScFab)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单结构域抗体”是指包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单结构域抗体为人单结构域抗体(参见，例如美国专利号6,248,516B1)。单结构域抗体的实例包括但不限于VHH。
Fab片段是通过木瓜蛋白酶消化抗体产生的抗原结合片段并且由完整L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的Fab片段。胃蛋白酶处理抗体产生单个大F(ab')2片段，其大致相当于两个通过二硫键连接的具有二价抗原结合活性并且仍能够交联抗原的Fab片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段而产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，该C末端区域包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可在例如抗体的生产或纯化过程中或通过重组设计编码抗体重链的核酸而去除。因此，完整抗体的组合物可包括去除所有Lys447残基的抗体群体、未去除Lys447残基的抗体群体以及具有含和不含Lys447残基的抗体混合物的抗体群体。
“Fv”由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的紧密、非共价结合的二聚体组成。由这两个结构域的折叠产生六个高变环(H链和L链各产生3个环)，这些环贡献氨基酸残基以实现抗原结合，并且时抗体具有抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或Fv的一半，仅包含三个对抗原具有特异性的CDR)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力经常低于完整结合位点。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接至单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽连接基，使scFv形成所需的抗原结合结构。有关scFv的综述，参见Pluckthun的《单克隆抗体的药理学》(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；Malmborg等人,J.Immunol.Methods 183:7-13,1995。
术语“小分子”是指分子量为约2000道尔顿或更小，例如约1000道尔顿或更小的任何分子。在一些方面，小分子是有机小分子。
如本文所用，术语“模拟物”或“分子模拟物”是指一种多肽，其与给定多肽或所述多肽的一部分在构象和/或结合能力(例如，二级结构、三级结构)方面具有足够的相似性以结合所述多肽的结合配偶体。模拟物可以以与其模拟的多肽相等、较小或较大的亲和力与结合配偶体结合。分子模拟物与其模拟的多肽可能具有或不具有明显的氨基酸序列相似性。模拟物可以是天然存在的，也可以是经过工程改造的。在一些方面，模拟物是表1的蛋白质的模拟物。在其他方面，模拟物是表2的蛋白质的模拟物。在其他方面，模拟物是与表1的蛋白质或表2的蛋白质结合的另一种蛋白质的模拟物。在一些方面，模拟物可以执行所模拟多肽的所有功能。在其他方面，模拟物不执行所模拟多肽的所有功能。
如本文所用，术语两种或更多种蛋白质(例如，表1的蛋白质和表2的蛋白质)的“允许结合的条件”是指以下条件(例如，蛋白质浓度、温度、pH、盐浓度)，在该条件下，两种或多种蛋白质将会在调节剂或候选调节剂不存在下相互作用。允许结合的条件可能因个体蛋白质而异，并且可能因蛋白质-蛋白质相互作用测定(例如，表面等离子体共振测定、生物层干涉测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、细胞外相互作用测定和细胞表面相互作用测定)而异。
术语“存活”是指患者仍然存活，且包括总存活以及无进展存活。
如本文所用，“无复发存活”或“RFS”是指，在癌症的初步治疗结束后，患者存活而没有该癌症的任何体征或症状的时间长度。RFS也可称为“无病存活”或“DFS”。在一些方面，无病存活(RFS)定义为随机分组(例如，分配到辅助治疗组)与疾病(例如癌症)复发、疾病(例如癌症)新发生或因任何原因死亡之间的时间。
如本文所用，“无进展存活”或“PFS”是指在治疗期间和治疗后，被治疗的疾病(例如，癌症)不恶化的时间长度。无进展存活可包括患者经历完全应答或部分应答的时间量，以及患者经历稳定疾病的时间量。
如本文所用，“总存活”或“OS”是指一组个体中在特定时间段后可能存活的个体的百分比。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从所述源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，所述UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以另选地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，药剂(例如，调节剂、PD-L1轴结合拮抗剂或CD177活性激动剂)用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
“受试者”或“个体”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，受试者或个体为人。
如本文所用，“施用”是指向受试者给予一定剂量的化合物(例如，免疫检查点抑制剂)的方法。在一些方面，本文方法中使用的组合物是静脉内施用的。本文描述的方法中使用的组合物可以，例如，肌内地、静脉内地、皮内地、经皮地、动脉内地、腹腔内地、病灶内地、颅内地、关节内地、前列腺内地、胸膜内地、气管内地、鼻内地、玻璃体内地、阴道内地、直肠内地、外用地、肿瘤内地、腹膜地、皮下地、结膜下地、囊内地、粘膜地、心包内地、脐内地、眼内地、口服地、外用地、局部地、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接灌洗靶细胞、通过导管、通过灌洗、以乳剂或以脂质组合物的形式来施用。施用方法可以根据多种因素而变化(例如，待施用的化合物或组合物以及待治疗的病症、疾病或疾患的严重程度)。
如本文所用，术语“样品”是指获自或衍生自目标受试者和/或个体的组合物，其含有例如基于物理、生化、化学和/或生理特征待进行表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体。例如，短语“疾病样品”及其变型是指从目标受试者获得的任何样品，其预期或已知含有待表征的细胞和/或分子实体。样品包括但不限于组织样品、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊水、乳汁、全血、血浆、血清、血液来源的细胞、尿液、脑脊液、唾液、口腔拭子、痰、眼泪、汗液、粘液、肿瘤裂解物和组织培养基、组织提取物诸如均质化的组织、肿瘤组织、细胞提取物以及它们的组合。样品可以是存档样品、新鲜样品或冷冻样品。在一些方面，样品是福尔马林固定且石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织样品。
II.鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的方法
A.蛋白质-蛋白质相互作用测定
两种蛋白质之间的相互作用通常使用酵母双杂交(Y2H)测定和/或生化纯化测定(例如亲和纯化质谱(AP/MS))进行测试；然而，这些方法并不适合测试细胞表面蛋白质之间的相互作用。细胞表面蛋白质通常不溶于细胞质和/或核质(例如，由于疏水性跨膜区域)，因此不适合Y2H测定。此外，细胞表面蛋白质之间的相互作用通常是低亲和力和/或高度瞬态的，例如半衰期小于一秒，因此与涉及冗长纯化方案(例如AP/MS)的分析不兼容(Bushell等人，Genome Res,18:622-630,2008)。本文所述的蛋白质-蛋白质相互作用测定，例如细胞外相互作用测定和细胞表面相互作用测定，与细胞表面蛋白质相容，因此能够鉴定这些蛋白质之间的新型相互作用。
i.细胞外相互作用测定
在本发明的一些方面，蛋白质-蛋白质相互作用测定是细胞外相互作用测定，例如，基于亲合力的细胞外相互作用筛选(AVEXIS)(Bushell等人,Genome Res,18:622-630,2008；Martinez-Martin等人,J Immunol Res,2197615,2017)。在这种类型的测定中，如下所述，一种或多种猎物蛋白(例如，一种或多种STM受体)和一种或多种诱饵蛋白(例如，一种或多种IgSF蛋白)被表达为可溶性细胞外结构域(ECD)融合蛋白，并在条件培养基中测定相互作用(例如，使用比色测定)。
ia.细胞外相互作用测定猎物蛋白
在一些方面，一种或多种猎物蛋白包含一种或多种融合蛋白(例如猎物融合蛋白文库)，其中感兴趣的猎物蛋白(例如，STM蛋白)的细胞外结构域(ECD)被缀合(例如融合)至一个或多个附加部分(例如，IgG或Fc标签，例如人Fc标签)，使得猎物融合蛋白是可溶性的。ECD可以按照第2B(i)节中的描述进行鉴定。
ib.细胞外相互作用测定诱饵蛋白
在一些方面，一种或多种诱饵蛋白(查询蛋白)包含一种或多种融合蛋白(例如诱饵融合蛋白文库)，其中感兴趣的诱饵蛋白的ECD被缀合(例如融合)至一种或多种更多的附加部分，使得诱饵融合蛋白是可溶性的。附加部分还可以例如通过将诱饵蛋白ECD多聚化来增加诱饵融合蛋白对猎物蛋白的亲合力。增加亲合力可能会增加对低亲和力相互作用的检测。在一些方面，一个或多个附加部分引起诱饵蛋白ECD的五聚化。在一些方面，附加部分是大鼠软骨寡聚维持蛋白(COMP)的五聚化结构域。ECD可以按照第2B(i)节中的描述进行鉴定。
诱饵蛋白也可以与允许检测诱饵蛋白的部分(例如beta-内酰胺酶(β-内酰胺酶)蛋白)缀合。β-内酰胺酶水解底物头孢硝噻(nitrocefin)，产生黄色到红色的改变，这可以在比色测定中检测到(例如，在485nm处测量吸光度)。
在一些方面，诱饵融合蛋白包含COMP五聚化结构域和β-内酰胺酶蛋白两者。
ic.表达
诱饵融合蛋白和/或猎物融合蛋白可以在细胞中表达(例如转染，例如瞬时转染)。细胞可以是人类细胞，例如HEK293细胞(例如Expi293F细胞)。在一些方面，诱饵融合蛋白和/或猎物融合蛋白在条件培养基(例如转染细胞的条件培养基，例如转染人细胞的条件培养基)中表达。在人类细胞中的表达可能会增加发生翻译后修饰(例如，二硫键、添加一种或多种聚糖)的可能性，因此增加可以检测到功能相关相互作用的可能性。
细胞可以在生长一段时间(例如7天)后从条件培养基中去除(例如，通过离心)；诱饵融合蛋白和/或猎物融合蛋白存在于已经自其去除细胞的条件培养基(例如，离心步骤的上清液)中。
id.相互作用测定
猎物融合蛋白可以从条件培养基中捕获，例如，基于蛋白A与猎物融合蛋白的Fc标签之间的亲和力，捕获在蛋白A包被的基板上。基板可以是孔，例如384孔板中的孔。
诱饵融合蛋白可以在条件培养基中直接测定。可以在进行相互作用测定之前例如通过稀释将诱饵蛋白的浓度归一化。
为了进行蛋白质-蛋白质相互作用测定，可以将包含诱饵蛋白的溶液添加到一个或多个包含猎物蛋白的基板(例如，添加到384孔板的一个或多个孔)中。然后可以将测定培育并洗涤一次或多次以去除未结合的诱饵蛋白。在其中诱饵融合蛋白包含β-内酰胺酶的方面，诱饵融合蛋白与猎物融合蛋白之间的相互作用可以通过添加底物头孢硝噻并测量头孢硝噻水解来检测，例如，通过测量485nm处的吸光度。相对高的吸光度表明诱饵融合蛋白被保留，即诱饵融合蛋白与猎物融合蛋白相互作用。
在一些方面，该测定是定量的并且吸光度水平可用于测量相互作用的相对强度(例如，如图6G中所示)。
ie.细胞外相互作用的自动化筛选
细胞外相互作用测定可以是高通量测定，例如筛选。筛选可以包括介于1到超过1500种之间的猎物融合蛋白(例如，1、超过1、超过10、超过100、超过250、超过500、超过750、超过1000、超过1250或超过1500种猎物融合蛋白)和介于1到超过1500种之间的诱饵融合蛋白(例如，1、超过1、超过10、超过100、超过250、超过500、超过750、超过1000、超过1250或超过1500种诱饵融合蛋白)。在一些方面，该测定使用集成机器人系统。在一些方面，该测定在一个或多个384孔板中进行。在一些方面，测定通过计算流程(例如监督分类算法)进行评估，以确定是否发生了相互作用。
ii.细胞表面相互作用测定
在本发明的一些方面，蛋白质-蛋白质相互作用测定是细胞表面相互作用测定。在这种类型的测定中，一种或多种猎物蛋白(例如，一种或多种STM受体)在细胞表面表达为细胞外结构域(ECD)融合蛋白，并使用例如其中诱饵蛋白包含荧光标签的荧光测定测试其与一种或多种表达为可溶性细胞外结构域的诱饵蛋白(例如，IgSF蛋白质或PDPN)的相互作用。
在一些方面，本发明包含用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，该方法包括(a)提供多肽集合，其中每个多肽包含细胞外结构域、标签和锚，并且其中多肽集合包含表7的所有或一个子集的蛋白质的细胞外结构域，任选地其中所述多肽固定在(例如，附着或固定到)一个或多个固体表面例如板或一组板的孔上；(b)使步骤(a)的集合与多聚化查询蛋白在允许多聚化查询蛋白与多肽的至少一个细胞外结构域的结合的条件下接触；和(c)检测多聚化查询蛋白与至少一个细胞外结构域之间的相互作用，从而鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。每种多肽可以定位到(例如，固定到)一个或多个固体表面上的不同位置(例如，可明确地质询的位置，例如，可以通过本文所述的方法明确地质询的位置)。例如，每个不同的位置可以包含一个或多个展示多肽的细胞。可用于该方法的示例性多肽集合在IIB节中描述。
在一些方面，本发明包含一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，该方法包括：(a)提供包含多个位置的一个固体表面或一组固体表面，每个位置包含来自多肽集合的独特多肽，其中每个多肽包含细胞外结构域、标签和锚，并且其中多肽集合包含表7的所有或一个子集的蛋白质的细胞外结构域；(b)使步骤(a)的固体表面与多聚化查询蛋白在允许多聚化查询蛋白与多肽细胞外结构域的结合的条件下接触；和(c)检测多聚化查询蛋白与来自多肽集合的至少一种多肽之间的相互作用，从而鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。
在一些方面，该固体表面或该组固体表面一起包含至少965个位置，每个位置包含来自多肽集合的独特多肽，其中每个多肽包含细胞外结构域、标签和锚，并且其中多肽的集合包含表7中的至少81％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，每个位置包含展示独特多肽的细胞，例如哺乳动物细胞。在一些方面，细胞已经用编码独特多肽的载体转染，例如瞬时转染。在一些方面，瞬时转染是半自动化的。
在一些方面，多聚化查询蛋白是如IIA(iib)节中所述的查询蛋白。多聚化查询蛋白可以是例如二聚化、三聚化、四聚化或五聚化的查询蛋白。在一些方面，多聚化的查询蛋白为四聚化的查询蛋白。多聚化查询蛋白可以包含查询蛋白的分离的细胞外结构域。例如，分离的细胞外结构域可以被生物素化并与荧光链霉亲和素缀合以将查询蛋白四聚化。
在一些方面，蛋白质-蛋白质相互作用如IIA(iid)节中所述进行鉴定。
iia.细胞表面相互作用测定猎物蛋白
在一些方面，一种或多种猎物蛋白包含一种或多种融合蛋白(例如猎物融合蛋白文库)，其中感兴趣的猎物蛋白(例如，STM蛋白)的细胞外结构域(ECD)被缀合(例如融合)至一个或多个附加部分(例如，糖基磷脂酰肌醇(GPI)-gD(gDGPI)标签)，使得猎物融合蛋白表达在细胞表面上。ECD可以按照第2B(i)节中的描述进行鉴定。
在其中多肽包含细胞外结构域、标签和锚的一些方面，锚能够将细胞外结构域系结在细胞质膜的表面上。在一些方面，锚为糖基磷脂酰肌醇(GPI)多肽。在一些方面，锚是用于蛋白质脂化的部分，例如用于半胱氨酸棕榈酰化、甘氨酸肉豆蔻酰化、赖氨酸脂肪酰化、胆固醇酯化、半胱氨酸异戊二烯化或丝氨酸脂肪酰化的部分。
在一些方面，标签可以被直接或间接地可视化，或以其他方式检测。例如，标签可以包含可以使用抗体或抗体片段检测的部分，例如可以是糖蛋白D(gD)多肽。在一些方面，标签包含荧光蛋白。
iib.细胞表面相互作用测定诱饵蛋白
一种或多种诱饵蛋白(查询蛋白)可以包含一种或多种融合蛋白(例如诱饵融合蛋白文库)，其中感兴趣的诱饵蛋白的ECD被缀合至一种或多种更多的附加部分，使得诱饵融合蛋白是可溶性的。一个或多个附加部分还可以例如通过将诱饵蛋白ECD多聚化来增加诱饵融合蛋白对猎物蛋白的亲合力。增加亲合力可能会增加对低亲和力相互作用的检测。在一些方面，附加部分引起诱饵蛋白ECD的四聚化。
在一些方面，诱饵融合蛋白包含Avi标签、切割序列(例如，TEV切割序列)和Fc标签，使得在添加酶TEV蛋白酶后Fc标签可以从蛋白质上切割下来。为了制备这种蛋白质以进行细胞表面相互作用测定，切割Fc标签，将Avi标签生物素化，并且将生物素化的诱饵融合蛋白与荧光链霉亲和素(SA)(例如，与别藻蓝蛋白(APC)缀合的链霉亲和素)缀合，以形成可在荧光测定中检测的四聚化的诱饵融合蛋白。
iic.表达
猎物融合蛋白可以在细胞中表达(例如转染，例如，瞬时转染)。细胞可以是人类细胞，例如COS7细胞。转染的细胞可置于孔中，例如384孔板中的孔。
诱饵融合蛋白可以在细胞(例如哺乳动物细胞)中表达(例如转染，例如瞬时转染)。诱饵融合蛋白可以使用标准方案进行纯化，例如，如Ramani等人,Anal Biochem,420:127-138,2012中所述。
iid.相互作用测定
为了进行蛋白质-蛋白质相互作用测定，可以将包含诱饵蛋白(例如，与荧光SA缀合的纯化的诱饵融合蛋白)的溶液添加到一个或多个含有表达猎物蛋白的细胞的孔中(例如，添加到384孔板的一个或多个孔中)。然后可以将测定培育并洗涤一次或多次以去除未结合的诱饵蛋白。然后可以例如用4％多聚甲醛固定细胞，以保持蛋白质-蛋白质相互作用。
在一些方面，检测相互作用包括检测固体表面上高于阈值水平的位置处的信号，例如荧光信号(例如，指示该位置处存在查询蛋白的信号，例如，来自诱饵融合蛋白(例如，多聚化查询蛋白)所包含的部分的信号)。该信号可以被直接或间接地可视化或可以通过其他方式检测。在一些方面，检测是半自动化的或自动化的。相互作用可以是瞬时相互作用和/或低亲和力相互作用，例如微摩尔-亲和力相互作用。
在其中诱饵融合蛋白(例如，多聚化查询蛋白)包含荧光SA的方面，诱饵融合蛋白与猎物融合蛋白之间的相互作用可以通过荧光显微镜检测。相对高的荧光表明存在诱饵融合蛋白，即诱饵融合蛋白与猎物融合蛋白相互作用。
iie.细胞表面相互作用的自动化筛选
细胞外相互作用测定可以是高通量测定，例如筛选。筛选可以包括介于1到超过1500种之间的猎物融合蛋白(例如，1、超过1、超过10、超过100、超过250、超过500、超过750、超过1000、超过1250或超过1500种猎物融合蛋白)和介于1到超过1500种之间的诱饵融合蛋白(例如，1、超过1、超过10、超过100、超过250、超过500、超过750、超过1000、超过1250或超过1500种诱饵融合蛋白)。在一些方面，该测定使用集成机器人系统。在一些方面，该测定在一个或多个384孔板中进行。在一些方面，测定通过计算流程(例如自定义分析模块)进行评估，以确定是否发生了相互作用。
iii.表面等离子体共振(SPR)测定
还可以使用表面等离子体共振(SPR)测定来测定蛋白质-蛋白质相互作用。在一些方面，SPR测定用于确认或验证在细胞外相互作用测定或细胞表面相互作用测定(例如，高通量细胞外相互作用筛选或高通量细胞表面相互作用筛选)中检测到的测定。
在一些方面，猎物蛋白被表达为融合蛋白，该融合蛋白包含缀合至附加部分例如Fc标签的蛋白的ECD。可以纯化猎物融合蛋白。猎物蛋白可以通过胺偶合固定在传感器芯片(例如GLC或CM5传感器芯片)上。
诱饵蛋白可以以可溶性形式提供，例如作为与可溶性标签融合的ECD。可以纯化诱饵融合蛋白。
B.蛋白质、载体和细胞文库
本发明中测定的蛋白质包括细胞表面蛋白质，例如STM受体和IgSF蛋白。蛋白质可以是全长蛋白质(例如，分泌蛋白质)、全长蛋白质的一个或多个结构域或区域(例如，细胞外结构域)或者包含感兴趣的蛋白质的一个或多个结构域和一个或多个附加多肽序列的融合蛋白。在一些方面，蛋白质是融合蛋白，其具有感兴趣的蛋白质的细胞外结构域(例如STM受体或IgSF蛋白)和一个或多个附加多肽序列(例如，允许在测定中使用该蛋白质的附加多肽序列)。蛋白质可以被分组到“文库”中，即具有共享格式、构造或修饰(例如，包含感兴趣蛋白质的ECD和相同或相似的附加多肽序列)的特定类别中的蛋白质(即STM受体或IgSF蛋白)的集合。下面描述了文库的具体示例。
i.细胞外结构域
在一些方面，蛋白质表达为全长蛋白质的一个或多个结构域，例如细胞外结构域(ECD)。ECD是被预测待定位在细胞质膜外的蛋白质结构域。因此，蛋白质的这一结构域可用于与细胞外环境相互作用，例如与可溶性蛋白质、和细胞上或邻近细胞上的其他蛋白质的ECD相互作用。在一些方面，ECD是可溶性的。
蛋白质的一个或多个ECD可以通过生物信息学分析来鉴定，例如通过分析UniProt注释。例如，ECD的边界可以相对于预测的邻近跨膜区域(例如跨膜螺旋)的边界进行鉴定。在一些方面，细胞外结构域的存在可通过结构域、序列或基序的存在来预测，所述结构域、序列或基序指示蛋白质被运输至质膜，例如信号序列或糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接位点。
在一些方面，细胞外结构域在全长蛋白质的背景下表达。在其他方面，细胞外结构域表达为分离的细胞外结构域，例如仅包含蛋白质的被预测为处于细胞外的氨基酸残基的氨基酸残基序列。在一些方面，分离的细胞外结构域在融合蛋白中表达。
ia.ECD融合蛋白
在一些方面，分离的ECD包括在融合蛋白中，例如，表达为包含一个或多个其他多肽序列的多肽链的一部分。分离的ECD可以直接或间接地与一个或多个部分融合，这些部分赋予或增加一种或多种所需特性，例如溶解性、表达的容易性、捕获的容易性或多聚化。在一些方面，ECD融合蛋白可用于测定，例如，细胞外相互作用测定、细胞表面相互作用测定或表面等离子体共振测定。
在一些方面，ECD融合蛋白为单体。在其他方面，ECD融合蛋白为多聚体，例如四聚体或五聚体。在一些方面，ECD与人IgG融合。在一些方面，ECD与人Fc标签融合。在一些方面，ECD与Avi标签融合。在一些方面，ECD与多组氨酸(His)标签融合。在一些方面，ECD与(GPI)-gD(gDGPI)标签融合。在其他方面，ECD与大鼠软骨寡聚基质蛋白(COMP)的五聚化结构域和β-内酰胺酶蛋白融合，例如，如Bushell等人,Genome Res,18:622-630,2008中所述。
在一些方面，ECD融合蛋白进一步包括切割序列，例如TEV切割序列，以允许选择性地去除一个或多个结构域。在一些情况下，具有可在切割序列处切割的Avi标签和Fc标签的ECD融合蛋白被进一步加工以去除Fc标签、生物素化Avi标签并将生物素化的ECD融合蛋白与荧光链霉亲和素(SA)融合，例如，以形成四聚化的ECD融合蛋白。在一些情况下，分离的ECD或ECD融合蛋白被纯化。
在一些方面，融合蛋白包含与本文所述的一种或多种其他多肽序列融合的蛋白质的完整序列(例如，分泌蛋白质(例如分泌的IgSF蛋白)的完整序列)。
ii.STM受体
单跨膜(STM)受体蛋白是一大类膜结合受体，其具有穿过质膜的单个结构域。许多STM受体表达在细胞表面上，因此可能参与细胞外相互作用组。示例性STM受体在表5、表7和表8以及Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018和Clark等人,Genome Res,13:2265-2270,2003中提供。
STM文库中包括的STM受体是通过生物信息学分析来鉴定的，例如，通过使用算法来预测蛋白质特征，例如蛋白质结构域和亚细胞定位。用于预测蛋白质结构域和/或亚细胞定位的示例性算法包括TMHMM和SignalP服务器(丹麦大学)和Phobius(斯德哥尔摩生物信息学中心)。
在一些方面，STM受体具有UniProt注释“富含亮氨酸”、“富含半胱氨酸”、“ITIM/ITAM”(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序/基于免疫受体酪氨酸的活化基序)、“TNFR”(肿瘤坏死因子受体)、“TLR/ILR”(Toll样受体/白细胞介素受体)、“轴突导向因子(semaphorin)”、“激酶样”、“Ig样”(免疫球蛋白样)、“纤连蛋白”、“ephrin”、“EGF”、“细胞因子R”或“钙粘蛋白”。
iia.用于细胞外相互作用测定的STM受体文库
在一些方面，本发明的特征在于一种用于细胞外相互作用测定的STM受体文库。该文库中包括的蛋白质在表5中提供并且是如本文IIA(ia)节中所述构建的“猎物”融合蛋白。
iib.用于细胞表面相互作用测定的STM受体文库
在一些方面，本发明的特征在于一种用于细胞表面相互作用测定的STM受体文库。该文库中包括的蛋白质在表7中提供并且是如本文IIA(iia)节中所述构建的“猎物”融合蛋白。
多肽文库
在一些方面，本公开的特征在于一种多肽集合(例如，多肽文库)，其中每种多肽包含细胞外结构域、标签和锚，并且其中该多肽集合包含表7中的所有或一个子集的蛋白质的细胞外结构域。在一些方面，锚位于多肽的N-末端并且细胞外结构域位于多肽的C-末端。在其他方面，锚位于多肽的C-末端并且细胞外结构域位于多肽的N-末端。在一些方面，该多肽集合包含表7中的至少81％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，多肽集合包含表7中的至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，多肽集合包含表7中的至少81％至100％的蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7中的至少85％、90％、95％或100％(例如，包含所有)的蛋白质，例如，包含表7中的至少81％-85％、83％-87％、85％-89％、87％-91％、89％-93％、91％-95％、93％-97％、95％-99％或100％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，多肽集合包含表7中的至少80％至81％的蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7的至少80.1％、80.2％、80.3％、80.4％、80.5％、80.6％、80.7％、80.75％、80.8％或80.9％的蛋白质。
在一些方面，多肽集合包含表7中的至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少1000、至少1050、至少1100、至少1150种或所有1195种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7中的100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150种或所有1195种多肽的细胞外结构域。
在一些方面，多肽集合包含表7中的至少965到至少970种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7的至少965、966、967、968、969或970种蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，多肽集合包含表17的至少一种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表17的至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230种或所有231种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表17中的1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、101-105、105-110、110-115、115-120、120-125、125-130、130-135、135-140、140-145、145-150、150-155、155-160、160-165、165-170、170-175、175-180、180-185、185-190、190-195、195-200、200-205、205-210、210-215、214-220、220-225、225-230种或所有231种多肽的细胞外结构域。
在一些方面，猎物蛋白(例如，STM蛋白)的细胞外结构域具有天然构象，例如在野生型蛋白质中观察到的构象。在一些方面，猎物蛋白(例如，STM蛋白)的细胞外结构域包含天然的翻译后修饰。
在一些方面，细胞为哺乳动物细胞，例如，COS7细胞。
在一些方面，细胞已经用编码多肽的质粒瞬时转染。
质粒文库
在一些方面，本发明包含载体(例如质粒)集合，每个载体编码包含细胞外结构域、标签和锚的多肽，其中由载体编码的多肽集合包含表7的所有或一个子集的蛋白质的细胞外结构域，例如，编码包含表7中的至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的蛋白质的多肽集合。可由质粒编码的示例性多肽集合在IIB节中描述。
在一些方面，由载体编码的多肽集合包含表7中的至少81％的蛋白质，例如，包含表7中的至少81％至100％的蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7中的至少85％、90％、95％或100％(例如，包含所有)的蛋白质，例如，包含表7的81％-85％、83％-87％、85％-89％、87％-91％、89％-93％、91％-95％、93％-97％、95％-99％或100％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，由载体编码的多肽集合包含表7中的至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少1000、至少1050、至少1100、至少1150种或所有1195种蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，由载体编码的多肽集合包含表7中的至少965种蛋白质。在一些方面，由载体编码的多肽集合包含表7中的至少965到至少970种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7的至少965、966、967、968、969或970种蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，由载体编码的多肽集合包含表17的至少一种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表17的至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230种或所有231种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7中的1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、101-105、105-110、110-115、115-120、120-125、125-130、130-135、135-140、140-145、145-150、150-155、155-160、160-165、165-170、170-175、175-180、180-185、185-190、190-195、195-200、200-205、205-210、210-215、214-220、220-225、225-230种或所有231种多肽的细胞外结构域。
细胞文库
在一些方面，本发明包含细胞集合，其已经用上述载体(例如质粒)转染，即已经用编码包含细胞外结构域、标签和锚的多肽的载体转染，其中由载体编码的多肽集合包含表7的所有或一个子集的蛋白质(例如，表7中的至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的蛋白质)的细胞外结构域。可被细胞包含的示例性多肽集合在IIB节中描述。
在一些方面，细胞所包含的载体集合编码表7中的至少81％的蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7中的至少81％至100％的蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7中的至少85％、90％、95％或100％(例如，包含所有)的蛋白质，例如，包含表7的81％-85％、83％-87％、85％-89％、87％-91％、89％-93％、91％-95％、93％-97％、95％-99％或100％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，细胞所包含的载体集合编码表7中的至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少1000、至少1050、至少1100、至少1150种或所有1195种蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，细胞所包含的载体集合编码表7中的至少965种蛋白质。
在一些方面，细胞所包含的载体集合编码表7中的至少965到至少970种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7的至少965、966、967、968、969或970种蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，细胞所包含的载体集合编码表17的至少一种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表17的至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230种或所有231种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表17中的1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、101-105、105-110、110-115、115-120、120-125、125-130、130-135、135-140、140-145、145-150、150-155、155-160、160-165、165-170、170-175、175-180、180-185、185-190、190-195、195-200、200-205、205-210、210-215、214-220、220-225、225-230种或所有231种多肽的细胞外结构域。
在一些方面，细胞集合中的每个细胞能够表达由已经使用其转化该细胞的载体编码的多肽。在一些方面，细胞集合中的多个细胞中的每一个能够表达由已经使用其转化该细胞的载体编码的多肽。
iic.PDPN
平足蛋白(PDPN)是一种STM受体。PDPN可能在成纤维细胞(例如，癌症相关成纤维细胞)、淋巴管内皮细胞和I型肺泡细胞的表面上高度表达。PDPN在许多肿瘤组织中过度表达，并且其在肿瘤组织中的表达与不良预后有关。已知PDPN通过与C型凝集素受体CLEC-2(CLEC1B)相互作用而在小鼠成纤维细胞中充当肌动球蛋白收缩性的主要调节剂(Astarita等人,Nat Immunol,16:75-84,2015；Acton等人,Nature,514:498-502,2014)。在一些方面，PDPN在人CAF中充当肌动球蛋白收缩性的调节剂。
用于细胞表面相互作用测定的PDPN
在一些方面，本发明的特征在于一种用于细胞表面相互作用测定的PDPN融合蛋白。这种蛋白质是如本文IIA(iib)节所述构建的“诱饵”融合蛋白。
iii.IgSF蛋白
免疫球蛋白超家族(IgSF)是由人类基因组编码的最大的分泌型和细胞表面表达型蛋白质家族，也是人体内最具代表性的细胞外蛋白结构域。已知IgSF蛋白通过形成介导广泛功能(例如，对轴突导向的调节、对突触可塑性的调节、对细胞迁移的控制、对细胞粘附的控制以及自我与非自我识别)的同嗜性复合物和异嗜性复合物而起作用。因此，这些蛋白质构成了药物开发工作的主要焦点。一些IgSF蛋白在细胞表面上表达(例如跨膜蛋白)；其他则是分泌的。示例性IgSF蛋白提供于表4和Ozkan等人,Cell,154(1):228-239,2013中。
免疫球蛋白超家族(IgSF)文库包含具有至少一个免疫球蛋白(Ig)结构域或免疫球蛋白折叠、具有注释“免疫球蛋白样超家族”(例如在SwissProt数据库中)或以其他方式表明与此类蛋白质具有结构或功能相似性的蛋白质。在一些方面，IgSF蛋白质通过SwissProt数据库中蛋白质的注释“免疫球蛋白样结构域超家族”来鉴定。在一些方面，IgSF蛋白质是根据蛋白质参与关键生物活性来鉴定的。
在一些方面，IgSF蛋白具有UniProt注释“TFNR”(转录因子样核调节因子)、“TLR/ILR(Toll样受体/白细胞介素受体)、“轴突导向因子”、“激酶样”、“IgSF/Ig样折叠”、“Ig样折叠”、“纤连蛋白”、“ephrin”、“EGF”、“CytokineR”或“钙粘蛋白”。
在一些方面，IgSF超家族蛋白是程序性死亡配体1(PD-L1；CD274)、程序性细胞死亡1配体2(PD-L2；CD274；PDCD1LG2)、受体型酪氨酸-蛋白磷酸酶δ(PTPRD)、受体型酪氨酸-蛋白磷酸酶S(PTPRS)、受体型酪氨酸-蛋白磷酸酶F(PTPRF)、神经细胞粘附分子L1样蛋白(“L1的近同源物”；CHL1)、接触蛋白1(CNTN1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LILRB1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(LILRB2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3(LILRB3)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(LILRB4)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员5(LILRB5)、含MAM结构域的羰基磷脂酰肌醇锚蛋白1(MDGA1)或酪氨酸-蛋白激酶受体AXL。
iiia.用于细胞外相互作用测定的IgSF文库
在一些方面，本发明的特征在于一种用于细胞外相互作用测定的IgSF受体文库。该文库中包括的蛋白质在表4中提供并且是如本文IIA(ib)节中所述构建的“诱饵”融合蛋白。
iiib.用于细胞表面相互作用测定的IgSF蛋白
在一些方面，本发明的特征在于用于细胞表面相互作用测定的IgSF受体。该文库中包括的蛋白质在表4中提供并且是如本文IIA(iib)节中所述构建的“诱饵”融合蛋白。
iv.诱饵蛋白和猎物蛋白文库
在一些方面，本发明的特征在于一种包含表1中提供的蛋白质的诱饵蛋白文库。蛋白质可以构建为本文IIA(ib)节或IIA(iib)节中描述的“诱饵”融合蛋白。
在一些方面，本发明的特征在于一种包含表2中提供的蛋白质的猎物蛋白文库。蛋白质可以构建为本文IIA(ia)节或IIA(iia)节中描述的“猎物”融合蛋白。
C.蛋白质-蛋白质相互作用网络
在某些方面，诱饵蛋白(表1)与猎物蛋白(表2)之间的相互作用可以使用如IIA节所述的细胞外相互作用测定(包括高通量细胞外相互作用筛选)、细胞表面测定(包括高通量细胞表面相互作用筛选)和表面等离子体共振测定来测试。在一些方面，测定包括介于1到超过1500种之间的猎物蛋白(例如，1、超过1、超过10、超过100、超过250、超过500、超过750、超过1000、超过1250或超过1500种猎物蛋白)和介于1到超过1500种之间的诱饵蛋白(例如，1、超过1、超过10、超过100、超过250、超过500、超过750、超过1000、超过1250或超过1500种诱饵蛋白)。在一些方面，测定鉴定了介于1到900种之间的蛋白质-蛋白质相互作用(例如，1、超过1、超过10、超过100、超过250、超过500、超过750、超过850或900种的蛋白质-蛋白质相互作用)。在一些方面，这些分析鉴定了以前未被识别的功能相关蛋白质群落，揭示了孤儿蛋白的结合配偶体，并揭示了癌症中显著失调的受体-配体相互作用。
i.STM受体——IgSF相互作用组
在一些方面，如本文IIA(ie)节所述，在高通量细胞外相互作用筛选中测试表4中提供的IgSF蛋白与表5中提供的STM蛋白的相互作用。在一些方面，IgSF蛋白被构建为诱饵文库(如在IIB(iiia)节中)，并且STM蛋白被构建为猎物文库(如在IIB(iia)节中)。在一些方面，检测到的相互作用被组装成网络。在一些方面，例如在细胞表面相互作用筛选(在IIa(ii)节中描述)或SPR测定(在IIa(iii)节中描述)中进一步测试选择的相互作用。
ia.与PD-L1和/或PD-L2相互作用的蛋白质
IgSF蛋白PD-L1(CD274)和PD-L2(PDCD1LG2)是免疫检查点蛋白，并且在可能导致肿瘤免疫逃逸的免疫抑制功能中发挥关键作用(Chen和Mellman,Immunity,39:1-10,2013)。据此，靶向PD-L1的疗法一直是研究的主要焦点。对PD-L1的抗体阻断是治疗实体瘤的优选免疫治疗策略；然而，许多患者对于对PD-L1的抗体阻断没有应答或没有表现出持久的应答，这表明需要靶向其他免疫抑制途径的疗法。
在一些方面，本文所述的测定可以鉴定PD-L1与ephrin A型受体3(EPHA3)之间的相互作用。EPHA3是一种受体酪氨酸激酶，其通过与ephrin蛋白的结合被活化并且在信号转导和控制多个细胞过程(例如，细胞生长、迁移和粘附)中发挥作用(Lisabeth等人,ColdSpring Harb Perspect Biol,5,2013)。EPHA3也已经被确定为某些肿瘤中最常见的突变基因之一(Andretta等人,Sci Rep,7:41576,2017)。因此，PD-L1与EPHA3之间的相互作用的下游效应可能包括对免疫检查点功能的调节(例如免疫抑制)和/或对EPHA3激酶功能的调节。
在一些方面，本文所述的测定可以鉴定PD-L2与CEACAM4之间的相互作用。CEACAM家族已经被证明在对免疫系统的调节中起作用：CEACAM1已经被鉴定为抑制性受体TIM-3的配体(Huang等人,Nature,517:386-390,2002)。CEACAM4与PD-L2之间的相互作用可能有助于PD-L2的不依赖于PD-1的功能，例如Liu等人,J Exp Med,197:1721-1730,2003中描述的功能，例如吞噬作用。因此，PD-L2与CEACAM4之间的相互作用的下游效应可能包括对免疫检查点功能的调节，例如免疫抑制(Delgado Tascon等人,J Leukoc Biol,97:521-531,2015；Xiao等人,J Exp Med,211:943-959,2014)。
在一些方面，本文所述的一种或多种测定可以鉴定PD-L2与CEACAM4；PD-L2与ICAM5；PD-L2与NECTIN3；PD-L2与PSG9；和PD-L2与TNFRSF11A之间的相互作用。
ib.与PTPR蛋白相互作用的蛋白质
PTPR蛋白PTPRD、PTPRS和PTPRF为受体型酪氨酸蛋白磷酸酶。酪氨酸磷酸化和去磷酸化调节多种细胞过程，并且酪氨酸磷酸化/去磷酸化的异常与肿瘤形成有关。特别地，PTPRD和PTPRS已经被描述为神经系统过程(例如，突触形成和轴突生长)的关键调节剂，并且还被鉴定为在神经母细胞瘤、胶质瘤、结肠癌和乳腺癌中具有高突变率的肿瘤抑制因子(Veeriah等人,Proc Natl Acad Sci USA,106:9435-9440,2009；Wang等人,Hepatology,62:1201-1214,2015)。
在一些方面，本文所述的测定可鉴定PTPRS、PTPRD和/或PTPRF与SLIT和NTRK样(SLITRK)家族成员(例如SLITRK1、SLITRK2、SLITRK3、SLITRK4和SLITRK6)之间的相互作用，并且还可以鉴定PTPRS、PTPRF和/或PTPRD与含有富含亮氨酸的重复序列和纤连蛋白III型结构域的蛋白质(LRFN)家族成员、白细胞介素1受体辅助蛋白(IL1RAP)以及相关蛋白IL1RAPL1和IL1RAPL2之间的相互作用。SLITRK、LRFN和IL1RAP样蛋白与包含肿瘤在内的神经系统疾患有关。例如，据报导，IL-1信号传导所需的IL1RAP是慢性髓性白血病干细胞的生物标志物(Zhao等人,Int J Clin Exp Med,7:4787-4798,2014)。因此，鉴定的相互作用的下游效应可能包括磷酸酶活性的改变，例如酪氨酸磷酸化/去磷酸化的改变，例如与包含癌症在内的疾病有关的蛋白质的酪氨酸磷酸化/去磷酸化。
在一些方面，一种或多种测定可以鉴定PTPRD与BMP5、CEACAM3、IL1RAP、IL1RAPL2、LECT1、LRFN5、SIRPG、SLITRK3、SLITRK4、SLITRK6和TGFA之间的相互作用。PTPRD与对于细胞增殖和STAT3磷酸化的阻抑有关(Veeriah等人,PNAS,106(23):9435-9440,2009；Peyser等人,PLoS ONE,10.1371/journal.pone.0135750,2015)。
在一些方面，一种或多种测定可以鉴定PTPRS与C6orf25、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、LRFN1、LRFN5、LRRC4B、NCAM1、SLITRK1、SLITRK2、SLITRK3、SLITRK4和SLITRK6之间的相互作用。PTPRS与对于细胞迁移的抑制(Wang等人,Hepatology,62(4):1201-1214,2015)和PI3K信号传导途径的活化(Suarez Pestana等人,Oncogene,18:4069-4079,1999；Morris等人,PNAS,108(47):19024-19029,2011)有关。
在一些方面，一种或多种测定可以鉴定PTPRF与CD177、IL1RAP和LRFN5之间的相互作用。PTPRF与对于细胞迁移和对EGFR的磷酸化的抑制有关(Du等人,J Cell Sci,126:1440-1453,2013)。
与PTPRD突变体相互作用的蛋白质
在一些方面，一种或多种测定可以鉴定具有一种或多种疾病相关(例如癌症相关)突变(例如，氨基酸取代突变或氨基酸缺失突变)的PTPRD形式(PTPRD突变体)与IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、LRFN4、LRFN5、LRRC4B、NTRK3、SLITRK1、SLITRK3或SLITRK6之间的相互作用。PTPRD的疾病相关变异(表9)发生在PTPRD ECD的免疫球蛋白(IG)结构域IG1、IG2和IG3中以及纤连蛋白(FN)结构域FN1-FN8中(图6F)。具体的氨基酸取代或缺失突变包括ΔG61ΔE106(IG1)、G203E K204E(IG2)、R232C R233C(IG2)、P249L(IG3)、G285E(IG3)、E406K(FN1)、S431L(FN2)、R561Q(FN3)、P666S(FN4)、E755K(FN5)、V892I(FN6)、S912F(FN7)、R995C(FN7)和R1088C(FN8)。在一些方面，PTPRD变体表达为如本文IIA(ib)节中所述的诱饵蛋白，并在如本文IIA(i)节中所述的细胞外相互作用测定中测定与猎物蛋白的相互作用。在一些方面，相对于野生型PTPRD蛋白与结合配偶体之间的相互作用强度，PTPRD变体与结合配偶体之间的相互作用强度可能降低。在其他方面，变体和野生型PTPRD蛋白的相互作用强度可能相似。
ic.与CHL1和/或CNTN1相互作用的蛋白质
神经细胞粘附分子L1样蛋白(CHL1)和接触蛋白1(CNTN1)是充当细胞粘附分子(CAM)的IgSF蛋白。CAM的过度表达与癌症患者的不良预后相关(Yan等人,Cancer Res.,76(6),1603-1614,2016)。
CHL1参与神经细胞粘附并在中枢神经系统(CNC)发育中发挥作用。CHL1与以下有关：对于细胞增殖的阻抑(Tang等人,Oncogene,doi:10.1038/s41388-018-0648-7)；对于肿瘤形成的阻抑(Tang等人,Oncogene,doi:10.1038/s41388-018-0648-7)；以及对于细胞侵袭的阻抑(He等人,Biochem Biophys Res Commun,438:433-438,2013)。
在一些方面，本文所述的测定可鉴定CHL1与接触蛋白5(CNTN5)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、参与细胞粘附的两种蛋白质以及B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)之间的相互作用。
CNTN1的上调与前列腺癌细胞侵袭密切相关。CNTN1与以下有关：对于细胞增殖的阻抑；对于细胞侵袭的阻抑(Yan等人,Cancer Res,76(6):1603-1614,2016)以及RhoA和AKT信号传导途径的活化(Yan等人,PLoS ONE,8(5):e65463,2013；Chen等人,Front MolNeurosci,11,Article 422(2018)；Su等人,Cancer Res,66(5):2553-2561,2006)。
在一些方面，一种或多种测定可以鉴定CHL1与SIRPA、CNTN1、CNTN5、L1CAM和TMEM132A之间的相互作用。
在一些方面，一种或多种测定可以鉴定CNTN1与CDH6、CHL1、FCGRT、PCDHB7和SGCG之间的相互作用。鉴定的相互作用的下游效应可能包括对于细胞粘附(例如神经细胞粘附)的调节。
id.与LILRB蛋白相互作用的蛋白质
白细胞免疫球蛋白样受体B蛋白(LILRB)是IgSF蛋白，以细胞溶质免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)或免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的存在为特征(Brown等人,TissueAntigens,64:215-225,2004)。LILR蛋白可能是活化性或抑制性受体，主要在骨髓细胞和淋巴细胞中表达，并与癌症、自身免疫性疾病、感染病和巨噬细胞吞噬作用有关。
在一些方面，本文所述的测定可以鉴定LILRB5与低密度脂蛋白受体(LDLR)之间的相互作用。LDLR介导低密度脂蛋白(LDL)的内吞作用，并与包括家族性高胆固醇血症和冠状动脉疾病在内的疾病有关。
本文所述的测定还可以鉴定LILRB1与CLEC6A、CXADR、EDAR、FLT4、IL6R、ILDR1和LILRA5之间的相互作用。LILRB1是MHC 1类-LILRB1信号传导轴的一个组成部分，已被证明可以保护细胞(例如，肿瘤细胞)免于吞噬作用(Barkal等人,Nature Immunol,19:76-84,2017)。因此，鉴定的相互作用的下游效应可能包括对于吞噬作用的调节(IIIB(vii)节)。涉及LILRB1的相互作用的下调可能导致吞噬作用增加，例如，对肿瘤细胞的吞噬作用增加。LILRB1还与破骨细胞分化相关(Mori等人,J Immunol,181(7):4742-4751,2008)。
本文所述的测定还可以鉴定LILRB2与IGSF8和MOG之间的相互作用。LILRB2与M2巨噬细胞极化相关(Chen等人,J Clin Invest,128(12),5647-5662)。
本文所述的测定还可以鉴定LILRB3与LRRC15和LY6G6F之间的相互作用。LILRB3与破骨细胞分化相关(Mori等人,J Immunol,181(7):4742-4751,2008)。
本文所述的测定还可以鉴定LILRB4与CNTFR之间的相互作用。LILRB4与破骨细胞分化相关(Mori等人,J Immunol,181(7):4742-4751,2008)。
在一些方面，一种或多种测定可以鉴定LILRB5与APLP2、CD177、CLEC10A、LDLR、PILRA和UNC5C之间的相互作用。
ie.与MDGA1相互作用的蛋白质
含MAM结构域的糖基磷脂酰肌醇锚1(MDGA1)位于在神经系统中表达的IgSF蛋白中。在一些方面，本文所述的一种或多种测定可以鉴定MDGA1与NLGN3和NLGN4X之间的相互作用。
if.与AXL相互作用的蛋白质
酪氨酸蛋白激酶受体AXL是一种IgSF蛋白，它是先天免疫应答的抑制剂。AXL的过度表达与多种癌症(例如，结肠癌、食管癌、甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌和星形细胞瘤-胶质母细胞瘤)相关(Verma等人,Mol Cancer Ther,10(10):1763-1773,2011)。
AXL与以下相关：对于细胞侵袭的调节(Verma等人,Mol Cancer Ther,10(10):1763-1773,2011)；对于JAK/STAT途径的调节、对于RAS/RAF/MAPK/ERK1/2途径的调节和对于PI3K信号传导途径的调节(Verma等人,Mol Cancer Ther,10(10):1763-1773,2011)；细胞运动和形态的改变，例如丝状伪足的形成(Verma等人,Mol Cancer Ther,10(10):1763-1773,2011)；以及对于上皮间质转化(EMT)的调节(Gjerdrum等人,PNAS,107(3):1124-1129,2010；Divine等人；Oncotarget,7:77291-77305,2016；Rankin等人,Cancer Res,70(19),7570-7579,2010；Chichon等人,Oncogene,33:4185-4192,2013)。
在一些方面，本文所述的一种或多种测定可以鉴定AXL与IL1RL1和VSIG10L之间的相互作用。
ig.与LRRC4B相互作用的蛋白质
在一些方面，本文所述的一种或多种测定可以鉴定LRRC4B与BTN3A1或BTN3A3之间的相互作用。
ii.STM受体与PDPN之间的相互作用
在一些方面，如本文IIA(iie)节所述，可以在高通量细胞表面相互作用筛选中测试表7中提供的STM蛋白与PDPN的相互作用。PDPN可以被构建为诱饵蛋白(如在IIB(iic)节中)，STM蛋白可以被构建为猎物文库(如在IIB(iib)节中)。在一些方面，可以使用SPR测定进一步测试选定的相互作用(在IIa(iii)节中描述)。
平足蛋白(PDPN)是一种STM受体，其在CAF中充当肌动球蛋白收缩性的调节剂。在一些方面，本文所述的测定可鉴定PDPN与分化簇177(CD177)(一种中性粒细胞受体，最近已被鉴定为肿瘤驻留Treg的标志物)之间的相互作用(Plitas等人,Immunity,45:1122-1134,2016)。在一些方面，一种或多种测定可以鉴定PDPN与CD177、CLEC-2(CLEC1B)和SIGLEC7之间的相互作用。
在一些方面，与PDPN的相互作用(例如，CLEC-2和/或CD177与PDPN的相互作用)的下游效应可能包括成纤维细胞伸长增加(例如，CAF伸长增加)和成纤维细胞收缩性降低(例如，CAF收缩性降低)(IIIB(i)节)。
III.鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂的方法
A.针对对于相互作用的调节的测定
在一些方面，本发明的特征在于鉴定表1的蛋白质与表2的蛋白质之间的相互作用的调节剂，该方法包括：(a)提供候选调节剂(例如，本文IV节中描述的候选调节剂)；(b)使表1的蛋白质与表2的蛋白质在候选调节剂存在或不存在下在允许表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合的条件下接触，其中在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；(c)测量表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合，其中在候选调节剂存在下的结合相对于在候选调节剂不存在下的结合的增加或减少将该候选调节剂鉴定为表1蛋白质与表2蛋白质之间相互作用的调节剂。
在一些方面，将候选调节剂提供给细胞(例如哺乳动物细胞)、提供给细胞培养基、提供给条件培养基和/或提供给表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的纯化形式。在一些方面，以至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、5μM或10μM的浓度提供候选调节剂。在一些方面，以0.1nM到10μM之间的浓度提供候选调节剂。在一些方面，候选调节剂例如以可溶形式提供在溶液中。
在一些方面，如果结合的增加为至少70％，则将候选调节剂鉴定为调节剂。在一些方面，结合的增加为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或超过100％。在一些方面，结合的增加为至少70％。
在一些方面，如果结合的降低为至少70％，则将候选调节剂鉴定为调节剂。在一些方面，结合的降低为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，结合的降低为至少70％。
i.针对对于蛋白质-蛋白质相互作用的调节的测定
在一些方面，在针对蛋白质-蛋白质相互作用的测定中评估表1的蛋白质与表2的蛋白质在候选调节剂存在或不存在下的结合。对于表1的蛋白质与表2的蛋白质之间的相互作用的调节可以被鉴定为，与在调节剂不存在下的蛋白质-蛋白质相互作用相比，在调节剂存在下的蛋白质-蛋白质相互作用的增加，例如，蛋白质-蛋白质相互作用增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、100％或超过100％。作为另一种选择，调节可以被鉴定为，与在调节剂不存在下的蛋白质-蛋白质相互作用相比，在调节剂存在下的蛋白质-蛋白质相互作用的降低，例如，蛋白质-蛋白质相互作用降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或100％。针对蛋白质-蛋白质相互作用的测定可以是例如SPR测定、生物层干涉(BLI)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、如IIAi节所述的细胞外相互作用测定或如IIAii节所述的细胞表面相互作用测定。
ia.针对对于蛋白质-蛋白质相互作用的调节的SPR测定
在一些方面，针对蛋白质-蛋白质相互作用的测定为表面等离子体共振(SPR)测定，如本文IIAiii节所述。在一些方面，对于表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合的调节被测量为SPR信号响应单位(RU)在调节剂存在与不存在下的差异。
ib.针对对于蛋白质-蛋白质相互作用的调节的BLI测定
在一些方面，针对蛋白质-蛋白质相互作用的测定为BLI测定。在一些方面，BLI测定使用分离的ECD进行，例如本文IIB(i)节中描述的分离的ECD。在一些方面，对于表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合的调节被测量为在调节剂存在下在生物传感器尖端测量的波长偏移(Δλ)与在调节剂不存在下相比的差异。
ic.针对对于蛋白质-蛋白质相互作用的调节的ELISA
在一些方面，针对蛋白质-蛋白质相互作用的测定为ELISA。在一些方面，第一蛋白质与板结合(例如，直接与板结合或通过由与板结合的抗体识别的亲和力标签与板结合)，而第二蛋白质以可溶形式提供，例如，作为分离的ECD，如本文IIB(i)节所述。可以通过提供与第二蛋白质或其亲和力标签结合的抗体来检测第一蛋白质与第二蛋白质之间的相互作用，其中可以在针对抗体存在性的测定中检测例如可视化抗体。
id针对对于蛋白质-蛋白质相互作用的调节的其他测定
在一些方面，该测定为细胞外相互作用测定，如本文IIAi节中所述。在一些方面，该测定为细胞表面相互作用测定，如本文IIAii节中所述。在一些方面，该测定为等温滴定量热(ITC)测定、包含免疫沉淀的测定或包含ALPHASCREENTM技术的测定。
B.针对下游活性的改变的测定
在一些方面，本发明的特征在于一种鉴定表1的蛋白质下游活性的调节剂的方法，所述方法包括：(a)提供候选调节剂(例如，本文IV节中描述的候选调节剂)；(b)使表1的蛋白质与表2的蛋白质在允许表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合的条件下在候选调节剂存在或不存在下接触，其中在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；以及(c)测量表1的蛋白质的下游活性(例如，CAF收缩性、免疫检查点抑制、对于细胞增殖的阻抑、对于靶标磷酸化的调节、对于细胞迁移的抑制、对于肿瘤形成的阻抑、对于细胞侵袭的阻抑、巨噬细胞极化、对于吞噬作用的调节、破骨细胞分化、信号传导途径的活化或丝状伪足的形成)，其中在候选调节剂存在下的下游活性相对于在候选调节剂不存在下的下游活性的改变将候选调节剂鉴定为表1的蛋白质的下游活性的调节剂。
在一些方面，本发明的特征在于一种鉴定表2的蛋白质下游活性的调节剂的方法，所述方法包括：(a)提供候选调节剂(例如，本文IV节中描述的候选调节剂)；(b)使表2的蛋白质与表1的蛋白质在允许表2的蛋白质与表1的蛋白质的结合的条件下在候选调节剂存在或不存在下接触，其中在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；以及(c)测量表2的蛋白质的下游活性(例如，CAF收缩性、免疫检查点抑制、对于细胞增殖的阻抑、对于靶标磷酸化的调节、对于细胞迁移的抑制、对于肿瘤形成的阻抑、对于细胞侵袭的阻抑、巨噬细胞极化、对于吞噬作用的调节、破骨细胞分化、信号传导途径的活化或丝状伪足的形成)，其中在候选调节剂存在下的下游活性相对于在候选调节剂不存在下的下游活性的改变将候选调节剂鉴定为表2的蛋白质的下游活性的调节剂。
在一些方面，以至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、5μM或10μM的浓度提供候选调节剂。在一些方面，以0.1nM到10μM之间的浓度提供候选调节剂。在一些方面，以一定浓度范围提供候选调节剂，例如，如图4F所示。在一些方面，候选调节剂例如以可溶形式提供在溶液中。在一些方面，将候选调节剂提供给包含表1的蛋白质和表2的蛋白质的生物体、提供给包含表1的蛋白质和表2的蛋白质的组织、提供给细胞(例如哺乳动物细胞)、提供给细胞培养基、提供给条件培养基和/或提供给表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的纯化形式。
在一些方面，如果表1的蛋白质或表2的蛋白质的下游活性的增加为至少30％，则将候选调节剂鉴定为调节剂。在一些方面，下游活性的增加为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或超过100％。在一些方面，下游活性的增加为至少30％。
在一些方面，如果表1的蛋白质或表2的蛋白质的下游活性的降低为至少30％，则将候选调节剂鉴定为调节剂。在一些方面，下游活性的降低为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，下游活性的降低为至少30％。
在一些方面，在一种或多种测定中评估表1的蛋白质或表2的蛋白质的下游活性，如下所述。
在一些方面，下游活性为与疾病例如癌症的发展或进展有关的活性。
i.CAF收缩性
在一些方面，下游活性为癌症相关成纤维细胞(CAF)肌动球蛋白收缩性(CAF收缩性)。在一些方面，表1的蛋白质为PDPN并且下游活性为CAF收缩性。在一些方面，表1的蛋白质为PDPN，表2的蛋白质为CD177，并且下游活性为CAF收缩性。
在一些方面，针对CAF收缩性的测定为凝胶收缩测定。在这一测定中，将包含表1的蛋白质和表2的蛋白质中的至少一种的成纤维细胞(例如，癌症相关的成纤维细胞)群(例如，100,000个细胞)混合到基质胶-胶原混合物中，并放置放入孔(例如，96孔板中的孔)中。在其中单个细胞不包含表1的蛋白质和表2的蛋白质两者的方面，细胞不包含的蛋白质可以提供在另一个细胞(例如哺乳动物细胞，例如中性粒细胞或T细胞)上或可以提供在或添加到基质胶-胶原培养基或细胞培养基中。细胞可以另外用调节剂处理，例如通过添加到基质胶-胶原培养基或细胞培养基中。凝胶凝固20分钟后，将凝胶从孔的侧面分离并加入细胞培养基。在成像前，将凝胶培育例如72小时。通过比较孔直径和最终凝胶直径来测量细胞群的收缩性。通过比较向其提供调节剂的细胞与未向其提供调节剂的细胞的凝胶收缩来计算增加或降低的收缩性。在一些情况下，用调节剂处理的细胞群相对于未用调节剂处理的细胞群具有降低的凝胶收缩，例如，CAF收缩性在调节剂存在下降低。在一些方面，在调节剂存在下，CAF收缩性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在凝胶收缩测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，CAF收缩性降低至少30％，如在凝胶收缩测定中测量的。在一些方面，CAF收缩性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％，如在凝胶收缩测定中测量的。
在其他方面，使用3D凝胶伸长测定(例如实例8B中所述的测定)测量CAF收缩性。在这一测定中，成纤维细胞(例如，CAF)包含表1的蛋白质和表2的蛋白质中的至少一种。在其中细胞不包含表1的蛋白质和表2的蛋白质两者的方面，细胞不包含的蛋白质可以提供在另一个细胞(例如哺乳动物细胞，例如中性粒细胞或T细胞)上或可以提供在或添加到细胞培养基中。细胞可以另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。与同型对照相比，3D凝胶中细胞的伸长增加表明成纤维细胞的收缩性降低(图17A-17D)。在一些情况下，用调节剂处理的细胞相对于对照细胞被拉长，例如，CAF收缩性在调节剂存在下降低。在一些方面，在调节剂存在下，CAF收缩性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在3D凝胶伸长测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，CAF收缩性降低至少30％，如在3D凝胶伸长测定中测量的。形态指数可以如Astarita等人,Nat Immunol,16:75-84,2015中所述计算。在一些方面，使用等式周长2/4πx面积来计算形态指数，其中“周长”为细胞的周长并且“面积”为细胞的面积。在一些方面，细胞的形态指数在10和30之间，例如为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
ii.免疫检查点抑制
在一些方面，下游活性为免疫检查点抑制。在一些方面，表1的蛋白质为PD-L1并且下游活性为免疫检查点抑制。在一些方面，表1的蛋白质为PD-L1，表2的蛋白质为EPHA3，并且下游活性是免疫检查点抑制。
在其他方面，表1的蛋白质为PD-L2，并且下游活性为免疫检查点抑制。在一些方面，表1的蛋白质为PD-L2，表2的蛋白质为CEACAM4、ICAM5、NECTIN3、PSG9或TNFRSF11A，并且下游活性为免疫检查点抑制。
在一些方面，针对免疫检查点抑制的测定为基于细胞的测定，例如，如Skalniak等人,Oncotarget,8:72167-72181,2017中所述的基于细胞的测定。在一些方面，针对免疫检查点抑制的测定为Mariathasan等人,Nature,554:544-548中所述的测定。在一些方面，被测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，免疫检查点抑制增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，在调节剂存在下，免疫检查点抑制增加至少30％。
iii.对于细胞增殖的阻抑
在一些方面，下游活性为对于细胞增殖的阻抑。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRD，并且下游活性为对于细胞增殖的阻抑。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRD，表2的蛋白质为BMP5、CEACAM3、IL1RAP、IL1RAPL2、LECT1、LRFN5、SIRPG、SLITRK3、SLITRK4、SLITRK6或TGFA，并且下游活性为对于细胞增殖的阻抑。在一些方面，PTPRD蛋白包含G203E和K204E；R232C和R233C；P249L；G285E；E406K；S431L；R561Q；P666S；E755K；V892I；S912F；R995C或R1088C氨基酸取代突变或者ΔG61ΔE106氨基酸缺失突变，并且下游活性为对于细胞增殖的阻抑。
在其他方面，表1的蛋白质为CNTN1，并且下游活性为对于细胞增殖的阻抑。在一些方面，表1的蛋白质为CNTN1，表2的蛋白质为CDH6、CHL1、FCGRT、PCDHB7或SGCG，并且下游活性为对于细胞增殖的阻抑。
在其他方面，表1的蛋白质为CHL1，并且下游活性为对于细胞增殖的阻抑。在一些方面，表1的蛋白质为CHL1，表2的蛋白质为CNTN1、CNTN5、SIRPA、L1CAM或TMEM132A，并且下游活性为对于细胞增殖的阻抑。
在一些方面，针对对于细胞增殖的阻抑的测定为集落形成测定，例如，如Yan等人,Cancer Res,76(6):1603-1614,2016或Ognibene等人,Oncotarget,9(40):25903-25921,2018中所述的集落形成测定。在一些方面，在集落形成测定中测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，细胞增殖降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在集落形成测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，细胞增殖降低至少30％，如在集落形成测定中测量的。
在一些方面，针对对于细胞增殖的阻抑的测定为细胞增殖测定，例如，如Yan等人,Cancer Res,76(6):1603-1614,2016中所述的细胞增殖测定。在一些方面，在细胞增殖测定中测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，细胞增殖降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在细胞增殖测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，细胞增殖降低至少30％，如在细胞增殖测定中测量的。
iv.对于靶标磷酸化作用的调节
在一些方面，下游活性为对靶蛋白的磷酸化或对于对靶蛋白的磷酸化作用的阻抑，例如对EGFR的磷酸化或对于对STAT3磷酸化作用的阻抑。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRD，并且下游活性为对于STAT3磷酸化作用的阻抑。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRD，表2的蛋白质为BMP5、CEACAM3、IL1RAP、IL1RAPL2、LECT1、LRFN5、SIRPG、SLITRK3、SLITRK4、SLITRK6或TGFA，并且下游活性为对于STAT3磷酸化作用的阻抑。在一些方面，PTPRD蛋白包含G203E和K204E；R232C和R233C；P249L；G285E；E406K；S431L；R561Q；P666S；E755K；V892I；S912F；R995C或R1088C氨基酸取代突变或者ΔG61ΔE106氨基酸缺失突变，并且下游活性为对于STAT3磷酸化作用的阻抑。
在一些方面，针对对于STAT3磷酸化作用的阻抑的测定为针对磷酸化的STAT3的蛋白质印迹，例如，如Veeriah等人,PNAS,106(23):9435-9440,2009或Peyser等人,PLoS ONE,10.1371/journal.pone.0135750,2015中所述的蛋白质印迹。在一些方面，在蛋白质印迹中测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，对于STAT3磷酸化作用的阻抑增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对磷酸化的STAT3的蛋白质印迹中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对于STAT3磷酸化作用的阻抑增加至少30％，如在针对磷酸化的STAT3的蛋白质印迹中测量的。
在一些方面，在调节剂存在下，对于STAT3磷酸化作用的阻抑降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对磷酸化的STAT3的蛋白质印迹中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对于STAT3磷酸化作用的阻抑降低至少30％，如在针对磷酸化的STAT3的蛋白质印迹中测量的。
在其他方面，表1的蛋白质为PTPRF，并且下游活性为对EGFR的磷酸化作用。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRF，表2的蛋白质为CD177、IL1RAP或LRFN5，并且下游活性为对EGFR的磷酸化作用。
在一些方面，针对对EGFR的磷酸化作用的测定为针对磷酸化的EGFR的蛋白质印迹，例如Du等人,J Cell Sci,126:1440-1453,2013中描述的蛋白质印迹。在一些方面，在蛋白质印迹中测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，对EGFR的磷酸化作用降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对磷酸化的EGFR的蛋白质印迹中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对EGFR的磷酸化作用降低至少30％，如在针对磷酸化的EGFR的蛋白质印迹中测量的。
在一些方面，在调节剂存在下，对EGFR的磷酸化作用增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对磷酸化的EGFR的蛋白质印迹中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对EGFR的磷酸化作用增加至少30％，如在针对磷酸化的EGFR的蛋白质印迹中测量的。
在其他方面，表1的蛋白质为AXL，并且下游活性为对AXL的磷酸化作用。在一些方面，表1的蛋白质为AXL，表2的蛋白质为IL1RL1或VSIG10L，并且下游活性为对AXL的磷酸化作用。
在一些方面，针对对AXL的磷酸化作用的测定是针对磷酸化的AXL的蛋白质印迹。在一些方面，在蛋白质印迹中测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，对AXL的磷酸化作用增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对磷酸化的AXL的蛋白质印迹中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对AXL的磷酸化作用降低至少30％，如在针对磷酸化的AXL的蛋白质印迹中测量的。
在一些方面，在调节剂存在下，对AXL的磷酸化作用增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对磷酸化的AXL的蛋白质印迹中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对AXL的磷酸化作用增加至少30％，如在针对磷酸化的AXL的蛋白质印迹中测量的。
v.对于细胞迁移的抑制
在一些方面，下游活性为对于细胞迁移的抑制。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRF，并且下游活性为对于细胞迁移的抑制。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRF，表2的蛋白质为CD177、IL1RAP或LRFN5，并且下游活性为对于细胞迁移的抑制。
在一些方面，下游活性为对于细胞迁移的抑制。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRS，并且下游活性为对于细胞迁移的抑制。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRS，表2的蛋白质为C6orf25、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、LRFN1、LRFN5、LRRC4B、NCAM1、SLITRK1、SLITRK2、SLITRK3、SLITRK4或SLITRK6，并且下游活性为对于细胞迁移的抑制。
在一些方面，针对对于细胞迁移的抑制的测定为细胞迁移测定，例如Du等人,JCell Sci,126:1440-1453,2013中描述的细胞迁移测定。在一些方面，在细胞迁移测定中测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，对于细胞迁移的抑制增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在细胞迁移测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对于细胞迁移的抑制降低至少30％，如在细胞迁移测定中测量的。
vi.对于肿瘤形成的阻抑
在一些方面，下游活性为对于肿瘤形成的阻抑。在一些方面，表1的蛋白质为CHL1，并且下游活性为对于肿瘤形成的阻抑。在一些方面，表1的蛋白质为CHL1，表2的蛋白质为CNTN1、CNTN5、SIRPA、L1CAM或TMEM132A，并且下游活性为对于肿瘤形成的阻抑。
在一些方面，针对对于肿瘤形成的阻抑的测定为体外致瘤性测定，例如Tang等人,Oncogene,doi:10.1038/s41388-018-0648-7,2019中描述的致瘤性测定，例如XTT细胞增殖测定、病灶形成测定、软琼脂中集落形成测定或裸鼠肿瘤形成测定。在一些方面，在致瘤性测定中测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，对于肿瘤形成的阻抑增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在致瘤性测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对于肿瘤形成的阻抑增加至少30％，如在致瘤性测定中测量的。
vii.对于细胞侵袭的阻抑
在一些方面，下游活性为细胞侵袭。在一些方面，表1的蛋白质为CNTN1，并且下游活性为细胞侵袭。在一些方面，表1的蛋白质为CNTN1，表2的蛋白质为CDH6、CHL1、FCGRT、PCDHB7或SGCG，并且下游活性为细胞侵袭。
在其他方面，表1的蛋白质为AXL，并且下游活性为细胞侵袭。在一些方面，表1的蛋白质为AXL，表2的蛋白质为IL1RL1或VSIG10L，并且下游活性为细胞侵袭。
在其他方面，表1的蛋白质为CHL1，并且下游活性为细胞侵袭。在一些方面，表1的蛋白质为CHL1，表2的蛋白质为CNTN1、CNTN5、SIRPA、L1CAM或TMEM132A，并且下游活性为细胞侵袭。
在一些方面，针对细胞侵袭的测定为凝胶侵袭测定，例如，如Yan等人,CancerRes,76(6):1603-1614,2016或He等人,Biochem Biophys Res Commun,438:433-438,2013中所述的凝胶侵袭测定。在一些方面，在凝胶侵袭测定中测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，细胞侵袭降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在凝胶侵袭测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，细胞侵袭降低至少30％，如在凝胶侵袭测定中测量的。
viii.巨噬细胞极化和吞噬功能
在一些方面，下游活性为对于吞噬细胞(例如巨噬细胞)的吞噬功能(例如抗体依赖性细胞吞噬作用)的阻抑(对于吞噬作用的阻抑)。在一些方面，表1的蛋白质为LILRB1，并且下游活性为对于吞噬作用的阻抑。在一些方面，表1的蛋白质为LILRB1，表2的蛋白质为CLEC6A、CXADR、EDAR、FLT4、IL6R、ILDR1或LILRA5，并且下游活性为对于吞噬作用的阻抑。
吞噬功能可以测量为例如包含荧光信号的巨噬细胞的比例，其中荧光的存在表明对荧光标记的靶细胞的吞噬作用。Barkal等人,Nature Immunol,19:76-84,2017中描述了针对吞噬作用的代表性测定。在一些方面，在调节剂存在下，对于吞噬作用的阻抑降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对吞噬作用的测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对于吞噬作用的阻抑降低至少30％，如在针对吞噬作用的测定中测量的。
在一些方面，在调节剂存在下，对于吞噬作用的阻抑增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对吞噬作用的测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，对于吞噬作用的阻抑增加至少30％，如在针对吞噬作用的测定中测量的。
在一些方面，下游活性为对于M2巨噬细胞极化的促进。在一些方面，表1的蛋白质为LILRB2，并且下游活性为对于M2巨噬细胞极化的促进。在一些方面，表1的蛋白质为LILRB2，表2的蛋白质为IGSF8或MOG，下游活性为对于M2巨噬细胞极化的促进。M2巨噬细胞极化可以如Chen等人,J Clin Invest,128(12),5647-5662中所述进行评估。在一些方面，在调节剂存在下，M2巨噬细胞极化降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，在调节剂存在下，M2巨噬细胞极化降低至少30％。
在一些方面，在调节剂存在下，M2巨噬细胞极化增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，在调节剂存在下，M2巨噬细胞极化增加至少30％。
ix.破骨细胞分化
在一些方面，下游活性为破骨细胞分化。
在一些方面，表1的蛋白质为LILRB1，并且下游活性为破骨细胞分化。在一些方面，表1的蛋白质为LILRB1，表2的蛋白质为CLEC6A、CXADR、EDAR、FLT4、IL6R、ILDR1或LILRA5，并且下游活性为破骨细胞分化。
在一些方面，表1的蛋白质为LILRB3，并且下游活性为破骨细胞分化。在某些方面，表1的蛋白质为LILRB3，表2的蛋白质为LRRC15或LY6G6F，并且下游活性为破骨细胞分化。
在一些方面，表1的蛋白质为LILRB4，并且下游活性为破骨细胞分化。在某些方面，表1的蛋白质为LILRB4，表2的蛋白质为CNTFR，并且下游活性为破骨细胞分化。
在一些方面，针对破骨细胞分化的测定为针对对于抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色呈阳性的多核细胞(TRAP+多核细胞)的测定。TRAP+状态和多个核(例如，三个或更多个核)是细胞是破骨细胞的指标。Mori等人,J Immunol,181(7):4742-4751,2008中提供了针对TRAP+多核细胞的代表性测定。在一些方面，在TRAP+多核细胞测定中测定的细胞另外用调节剂处理，例如通过添加到细胞培养基中。在一些方面，在调节剂存在下，破骨细胞分化降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对TRAP+多核细胞的测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，破骨细胞分化降低至少30％，如在针对TRAP+多核细胞的测定中测量的。
在其他方面，在调节剂存在下，破骨细胞分化增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％，如在针对TRAP+多核细胞的测定中测量的。在一些方面，在调节剂存在下，破骨细胞分化增加至少30％，如在针对TRAP+多核细胞的测定中测量的。
x.信号传导途径的活化
在一些方面，下游活性为信号传导途径的活化。在一些方面，表1的蛋白质为AXL，并且下游活性为RAS/RAF/MAPK/ERK1/2途径的活化、JAK/STAT途径的活化或PI3K信号传导途径的活化。在一些方面，表1的蛋白质为AXL，表2的蛋白质为IL1RL1或VSIG10L，并且下游活性为RAS/RAF/MAPK/ERK1/2途径的活化、JAK/STAT途径的活化或PI3K信号传导途径的活化。
在一些方面，表1的蛋白质为PTPRS，并且下游活性为PI3K信号传导途径的活化。在一些方面，表1的蛋白质为PTPRS，表2的蛋白质为C6orf25、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、LRFN1、LRFN5、LRRC4B、NCAM1、SLITRK1、SLITRK2、SLITRK3、SLITRK4或SLITRK6，并且下游活性为PI3K信号传导途径的活化。
在其他方面，表1的蛋白质为CNTN1，并且下游活性为RhoA途径或Akt途径的活化。在一些方面，表1的蛋白质为CNTN1，表2的蛋白质为CDH6、CHL1、FCGRT、PCDHB7或SGCG，并且下游活性为RhoA途径或Akt途径的活化。
在一些方面，在调节剂存在下，RAS/RAF/MAPK/ERK1/2途径的活化、JAK/STAT途径的活化、RhoA途径的活化、Akt途径的活化或PI3K信号传导途径的活化降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，在调节剂存在下，RAS/RAF/MAPK/ERK1/2途径的活化、JAK/STAT途径的活化、RhoA途径的活化、Akt途径的活化或PI3K信号传导途径的活化降低至少30％。
在一些方面，在调节剂存在下，RAS/RAF/MAPK/ERK1/2途径的活化、JAK/STAT途径的活化、RhoA途径的活化、Akt途径的活化或PI3K信号传导途径的活化增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，在调节剂存在下，RAS/RAF/MAPK/ERK1/2途径的活化、JAK/STAT途径的活化、RhoA途径的活化、Akt途径的活化或PI3K信号传导途径的活化增加至少30％。
xi.丝状伪足的形成
在一些方面，下游活性为丝状伪足的形成。在一些方面，表1的蛋白质为AXL，并且下游活性为丝状伪足的形成。在一些方面，表1的蛋白质为AXL，表2的蛋白质为IL1RL1或VSIG10L，并且下游活性为丝状伪足的形成。在一些方面，在调节剂存在下，丝状伪足的形成降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，在调节剂存在下，丝状伪足的形成降低至少30％。
xii.对于EMT的调节
在一些方面，下游活性为对于上皮-间充质转化(EMT)的抑制。EMT增加癌细胞的迁移和存活属性，从而促进恶性进展(Gjerdrum等人,PNAS,107(3):1124-1129,2010)。在一些方面，表1的蛋白质为AXL，并且下游活性为对于EMT的抑制。在一些方面，表1的蛋白质为AXL，表2的蛋白质为IL1RL1或VSIG10L，并且下游活性为对于EMT的抑制。EMT可以如Gjerdrum等人,PNAS,107(3):1124-1129,2010中所述进行量化。在一些方面，在调节剂存在下，对于EMT的抑制增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，在调节剂存在下，对于EMT的抑制增加至少30％。
xii.肿瘤生长
在一些方面，下游活性为肿瘤生长。在一些方面，表1的蛋白质为PDPN，表2的蛋白质为CD177，并且下游活性为肿瘤生长。在一些方面，在调节剂存在下，肿瘤生长降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些方面，在调节剂存在下，肿瘤生长降低至少30％。
IV.蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂
在一些方面，本公开的特征在于表1的蛋白质与表2的蛋白质之间的相互作用的分离调节剂，其中：(a)在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；(b)调节剂造成表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合相对于在调节剂不存在下的结合增加或降低。
在一些方面，本公开的特征在于表1的蛋白质或表2的蛋白质的下游活性的分离调节剂，其中(a)在表3中报告将相互作用的表1的蛋白质和表2的蛋白质；(b)调节剂造成表1的蛋白质或表2的蛋白质的下游活性相对于在调节剂不存在下的下游活性的改变。
在一些方面，调节剂为表1或表2的蛋白质的下游活性的抑制剂或活化剂。
在一些方面，下游活性的改变为下游活性的量、强度或持续时间的增加或降低，所述下游活性例如本文IIIB节中描述的下游活性，例如，CAF收缩性、免疫检查点抑制、对于细胞增殖的阻抑、对于靶标磷酸化作用的调节、对于细胞迁移的抑制、对于肿瘤形成的阻抑、对于细胞侵袭的阻抑、巨噬细胞极化、对于吞噬作用的调节、破骨细胞分化、信号传导途径的活化或丝状伪足的形成。
A.小分子
在一些方面，调节剂或候选调节剂为小分子。小分子为不同于如本文定义的结合多肽或抗体的分子，其可以结合，优选特异性地结合表1的蛋白质和/或表2的蛋白质。可以使用已知的方法(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)鉴定和化学合成结合小分子。结合小分子的大小通常小于约2000道尔顿(例如，大小为小于约2000、1500、750、500、250或200道尔顿)，其中此类有机小分子能够结合，优选特异性地结合本文所述的多肽，可以使用众所周知的技术在没有过度实验的情况下鉴定。在这点上，注意到筛选小分子文库中能够结合多肽靶标的分子的技术是本领域众所周知的(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合小分子可以为，例如，醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫缩酮、缩醛、硫缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸酯、烷基卤化物、烷基磺酸酯、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶类、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、酰氯等。
在一些方面，在小分子存在下，表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合降低(例如，降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些方面，在小分子存在下，表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)。在一些方面，在小分子存在下，表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的下游活性(例如，本文IIIB节中描述的下游活性，例如CAF收缩性、免疫检查点抑制、对于细胞增殖的阻抑、对于靶标磷酸化的调节、对于细胞迁移的抑制、对于肿瘤形成的阻抑、对于细胞侵袭的阻抑、巨噬细胞极化、对于吞噬作用的调节、破骨细胞分化、信号传导途径的活化或丝状伪足的形成)减少(例如减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些方面，在小分子存在下，表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的下游活性(例如，本文IIIB节中描述的下游活性)增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)。
B.抗体和抗原结合片段
在一些方面，调节剂或候选调节剂为结合表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域。
在一些方面，在抗体或抗原结合片段存在下，表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合降低(例如，降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些方面，在抗体或抗原结合片段存在下，表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)。在一些方面，在抗体或抗原结合片段存在下，表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的下游活性(例如，本文IIIB节中描述的下游活性，例如CAF收缩性、免疫检查点抑制、对于细胞增殖的阻抑、对于靶标磷酸化的调节、对于细胞迁移的抑制、对于肿瘤形成的阻抑、对于细胞侵袭的阻抑、巨噬细胞极化、对于吞噬作用的调节、破骨细胞分化、信号传导途径的活化或丝状伪足的形成)减少(例如减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些方面，在抗体或抗原结合片段存在下，表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的下游活性(例如，本文IIIB节中描述的下游活性)增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)。
C.肽
在一些方面，调节剂或候选调节剂为与表1的蛋白质和/或表2的蛋白质结合的肽。肽可以是天然存在的，或者可以是经过工程改造的。在一些方面，肽为表1的蛋白质、表2的蛋白质或与表1的蛋白质或表2的蛋白质结合的另一蛋白质的片段。肽可以以与全长蛋白质相等、更低或更高的亲和力与结合配偶体结合。在一些方面，肽执行全长蛋白质的所有功能。在其他方面，肽不执行全长蛋白质的所有功能。
在一些方面，在肽存在下，表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合降低(例如，降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些方面，在肽存在下，表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)。在一些方面，在肽存在下，表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的下游活性(例如，本文IIIB节中描述的下游活性，例如CAF收缩性、免疫检查点抑制、对于细胞增殖的阻抑、对于靶标磷酸化的调节、对于细胞迁移的抑制、对于肿瘤形成的阻抑、对于细胞侵袭的阻抑、巨噬细胞极化、对于吞噬作用的调节、破骨细胞分化、信号传导途径的活化或丝状伪足的形成)减少(例如减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些方面，在肽存在下，表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的下游活性(例如，本文IIIB节中描述的下游活性)增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)。
D.模拟物
在一些方面，调节剂或候选调节剂为与表1的蛋白质和/或表2的蛋白质结合的模拟物，例如分子模拟物。模拟物可以为表1的蛋白质、表2的蛋白质或与表1的蛋白质或表2的蛋白质结合的另一蛋白质的分子模拟物。在一些方面，模拟物可以执行所模拟多肽的所有功能。在其他方面，模拟物不执行所模拟多肽的所有功能。
在一些方面，在模拟物存在下，表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合降低(例如，降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些方面，在模拟物存在下，表1的蛋白质与表2的蛋白质的结合增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)。在一些方面，在模拟物存在下，表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的下游活性(例如，本文IIIB节中描述的下游活性，例如CAF收缩性、免疫检查点抑制、对于细胞增殖的阻抑、对于靶标磷酸化的调节、对于细胞迁移的抑制、对于肿瘤形成的阻抑、对于细胞侵袭的阻抑、巨噬细胞极化、对于吞噬作用的调节、破骨细胞分化、信号传导途径的活化或丝状伪足的形成)减少(例如减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些方面，在模拟物存在下，表1的蛋白质和/或表2的蛋白质的下游活性(例如，本文IIIB节中描述的下游活性)增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)。
V.包含经鉴定的蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂的治疗方法
在一些方面，本文IIC节中描述的蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂用于治疗或延迟病理状态、疾病、疾患或病症(例如癌症)的进展。
在一些方面，调节剂增加或降低已经对其施用调节剂的个体的本文IIIB节中描述的下游活性的量、强度或持续时间，所述下游活性例如CAF收缩性、免疫检查点抑制、对于细胞增殖的阻抑、对于靶标磷酸化作用的调节、对于细胞迁移的抑制、对于肿瘤形成的阻抑、对于细胞侵袭的阻抑、巨噬细胞极化、对于吞噬作用的调节、破骨细胞分化、信号传导途径的活化或丝状伪足的形成。
A.癌症
在一些方面，本文IIC节中描述的蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂(例如，小分子、抗体、抗原结合片段、肽、模拟物、反义寡核苷酸或siRNA)用于在治疗有其需要的受试者的癌症或延迟癌症的进展。在一些方面，受试者为人。癌症可以为实体瘤癌症或非实体瘤癌症。实体癌肿瘤包括但不限于膀胱癌、黑素瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、头颈部癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌或其转移形式。在一些方面，癌症为膀胱癌。膀胱癌的进一步方面包括尿路上皮癌、肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)或非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)。在一些方面，膀胱癌为转移性尿路上皮癌(mUC)。在一些方面，癌症为乳腺癌。乳腺癌的进一步方面包括激素受体阳性(HR+)乳腺癌，例如雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌、孕酮受体阳性(PR+)乳腺癌或ER+/PR+乳腺癌。乳腺癌的其他方面包括HER2阳性(HER2+)乳腺癌。乳腺癌的其他方面还包括三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面，乳腺癌为早期乳腺癌。在一些方面，癌症为肺癌。肺癌的进一步方面包括表皮生长因子受体阳性(EGFR+)肺癌。肺癌的其他方面包括表皮生长因子受体阴性(EGFR-)肺癌。肺癌的其他方面还包括非小细胞肺癌，例如鳞状肺癌或非鳞状肺癌。肺癌的其他方面包括小细胞肺癌。在一些方面，癌症为头颈部癌。头颈部癌的进一步方面包括头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。在一些方面，癌症为肾癌。肾癌的进一步方面包括肾细胞癌(RCC)。在一些方面，癌症为肝癌。肝癌的进一步方面包括肝细胞癌。在一些方面，癌症为前列腺癌。前列腺癌的进一步方面包括去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。在一些方面，癌症是实体瘤的转移形式。在一些方面，实体瘤的转移形式是黑素瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、头颈部癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌的转移形式。在一些方面，癌症为转移性尿路上皮癌(mUC)。在一些方面，癌症为非实体瘤癌症。非实体瘤癌症包括但不限于B细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的进一步方面包括，例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病(AML)或蕈状真菌病(MF)。在一些方面，癌症为结直肠癌。
B.递送方法
本文描述的方法中使用的组合物(例如，IIC节中描述的蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂，例如，小分子、抗体、抗原结合片段、肽、模拟物、反义寡核苷酸或siRNA)可以通过任何合适的方法来施用，包括例如静脉内地、肌内地、皮下地、皮内地、经皮地、动脉内地、腹膜内地、病灶内地、颅内地、关节内地、前列腺内地、胸膜内地、气管内地、鞘内地、鼻内地、阴道内地、直肠内地、外用地、肿瘤内地、腹膜地、结膜下地、囊内地、粘膜地、心包内地、脐内地、眼内地、眼眶内地、口服地、透皮地、玻璃体腔内地(例如，通过玻璃体腔内注射)、通过滴眼剂、通过吸入、通过注射、通过移植、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接灌洗靶标细胞、通过导管、通过灌洗、以乳剂或以脂质组合物的形式。本文所述方法中使用的组合物也可以全身或局部施用。施用方法可以根据多种因素而变化(例如，待施用的化合物或组合物以及待治疗的病症、疾病或疾患的严重程度)。在一些方面，静脉内地、肌内地、皮下地、外用地、口服地、透皮地、腹膜内地、眼眶内地、通过移植、通过吸入、鞘内地、心室内地或鼻内地施用蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
本文所述的蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂(和任何附加治疗剂)，可按照符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。调节剂不是必须的，而是任选地将其与目前用于预防或治疗所讨论疾患的一种或多种药剂同时配制和/或施用。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的调节剂的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
VI.包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗方法
A.对于阿特珠单抗的应答性的标志物
在一些方面，本发明包含一种鉴定患有可用PD-L1轴结合拮抗剂治疗的癌症(例如更可能用PD-L1轴结合拮抗剂治疗的癌症)的个体的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为患有可用PD-L1轴结合拮抗剂治疗的癌症的个体。
在一些方面，本发明包含一种鉴定可受益于包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为可受益于包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗的个体。
在一些方面，本发明包含一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为可受益于包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗的个体。
在一些方面，个体具有高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平，并且该方法进一步包含向个体施用有效量的PD-L1轴结合拮抗剂。
在一些方面，本发明包含一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括：(a)确定来自个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中基因对的第一成员的表达水平高于第一参考表达水平并且基因对的第二成员的表达水平高于第二参考表达水平；和(b)向该个体施用有效量的PD-L1轴结合拮抗剂。
在一些方面，本发明包含一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向个体施用PD-L1轴结合拮抗剂，该个体已经被确定为具有高于第一参考表达水平的表15的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平。
在一些方面，益处包含，与不使用PD-L1轴结合拮抗剂的治疗相比，个体的总存活(OS)延长。在其他方面，益处可以包含，例如，与不使用PD-L1轴结合拮抗剂的治疗相比，距复发的时间延长或治疗的持续时间缩短。
在一些方面，该基因对的第一成员为SIGLEC6，并且该基因对的第二成员为NCR1。
在一些方面，该基因对的第一成员为BTN3A1，并且该基因对的第二成员为LRRC4B。
在一些方面，该基因对的第一成员为CD80，并且该基因对的第二成员为CTLA4。
在一些方面，该基因对的第一成员为BTN3A3，并且该基因对的第二成员为LRRC4B。
在一些方面，该基因对的第一成员为NCR1，并且该基因对的第二成员为SIGLEC8。
在一些方面，该基因对的第一成员为CNTFR，并且该基因对的第二成员为LILRB4。
在一些方面，该基因对的第一成员为FGFR3，并且该基因对的第二成员为LRRTM2。
在一些方面，该基因对的第一成员为FGFR4，并且该基因对的第二成员为SIGLEC15。
在一些方面，该基因对的第一成员为FGFR1，并且该基因对的第二成员为KL。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为TRHDE。
在一些方面，该基因对的第一成员为CTLA4，并且该基因对的第二成员为PCDHGB4。
在一些方面，该基因对的第一成员为CTLA4，并且该基因对的第二成员为FAM200A。
在一些方面，该基因对的第一成员为CA12，并且该基因对的第二成员为SIGLEC6。
在一些方面，该基因对的第一成员为ILDR2，并且该基因对的第二成员为CLEC12B。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为ITLN1。
在一些方面，该基因对的第一成员为CADM1，并且该基因对的第二成员为CRTAM。
在一些方面，该基因对的第一成员为CD79B，并且该基因对的第二成员为CD244。
在一些方面，该基因对的第一成员为DAG1，并且该基因对的第二成员为EFNB1。
B.缺乏对于阿特珠单抗的应答性的标志物
在一些方面，本公开包含一种鉴定可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的表16的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的个体。
在一些方面，本发明包含一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的表16的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的个体。
在一些方面，本公开包含一种鉴定可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的表16的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为患有对使用PD-L1轴结合拮抗剂的治疗具有抗性的癌症的个体。
在一些方面，本发明包含一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的表16的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平将该个体鉴定为患有对使用PD-L1轴结合拮抗剂的治疗具有抗性的癌症的个体。
在一些方面，该个体具有高于第一参考表达水平的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的基因对的第二成员的表达水平，并且该方法包括向个体施用有效量的不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗、或PD-L1轴结合拮抗剂加上别的治疗。
在一些方面，益处包含，与不使用不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗、或PD-L1轴结合拮抗剂加上别的治疗的治疗相比，个体的总存活(OS)延长。
在一些方面，来自个体的样品是在施用抗癌疗法之前从该个体获得的。在一些方面，来自个体的样品是在施用抗癌疗法之后从该个体获得的。
在一些方面，来自个体的样品为肿瘤组织样品或肿瘤液体样品，例如，福尔马林固定和石蜡包埋的(FFPE)样品、存档样品、新鲜样品或冷冻样品。
在一些方面，(a)样品中的基因对的第一成员和第二成员的表达水平为蛋白质表达水平；或者(b)样品中的基因对的第一成员和第二成员的表达水平为mRNA表达水平。
在一些方面，样品中的基因对的第一成员和第二成员的表达水平分别为该基因对的第一成员和第二成员的mRNA表达水平。在一些方面，基因对的第一成员和第二成员的mRNA表达水平通过原位杂交(ISH)、RNA-seq、RT-qPCR、qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、FISH或其组合进行确定。在一些方面，RNA-seq为TruSeq RNAAccess技术
Figure BDA0003282058310001071
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为EVC2。
在一些方面，该基因对的第一成员为GPC4，并且该基因对的第二成员为FGFRL1。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB3，并且该基因对的第二成员为EPHB4。
在一些方面，该基因对的第一成员为PTPRD，并且该基因对的第二成员为LRFN4。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为AQPEP。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为DSG4。
在一些方面，该基因对的第一成员为LDLR，并且该基因对的第二成员为LILRB5。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB3，并且该基因对的第二成员为EPHB3。
在一些方面，该基因对的第一成员为PLXNB3，并且该基因对的第二成员为SEMA4G。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为EPHB6。
在一些方面，该基因对的第一成员为FLT4，并且该基因对的第二成员为FLRT2。
在一些方面，该基因对的第一成员为FLT1，并且该基因对的第二成员为ELFN1。
在一些方面，该基因对的第一成员为GPC4，并且该基因对的第二成员为FGFR4。
在一些方面，该基因对的第一成员为GPC3，并且该基因对的第二成员为TNFRSF11B。
在一些方面，该基因对的第一成员为FGFR4，并且该基因对的第二成员为GPC6。
在一些方面，该基因对的第一成员为PLXNB1，并且该基因对的第二成员为SEMA4B。
在一些方面，基因对的第一成员为EDA，并且基因对的第二成员为EDAR。
在一些方面，该基因对的第一成员为FGFR4，并且该基因对的第二成员为NRXN2。
在一些方面，该基因对的第一成员为SEMA4D，并且该基因对的第二成员为PLXNB2。
在一些方面，该基因对的第一成员为FLT4，并且该基因对的第二成员为NRP2。
在一些方面，该基因对的第一成员为FGFR4，并且该基因对的第二成员为GPC3。
在一些方面，该基因对的第一成员为FGFR2，并且该基因对的第二成员为RAMP1。
在一些方面，该基因对的第一成员为AXL1，并且该基因对的第二成员为IL1RL1。
在一些方面，该基因对的第一成员为CD320，并且该基因对的第二成员为IGSF5。
在一些方面，该基因对的第一成员为CD59，并且该基因对的第二成员为STAB1。
在一些方面，该基因对的第一成员为CNTN3，并且该基因对的第二成员为PTPRG。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB1，并且该基因对的第二成员为EPHA3。
在一些方面，该基因对的第一成员为EFNB3，并且该基因对的第二成员为EPHB2。
在一些方面，该基因对的第一成员为EGF，并且该基因对的第二成员为TNFRSF11B。
在一些方面，该基因对的第一成员为ENPEP，并且该基因对的第二成员为SLITRK1。
在一些方面，该基因对的第一成员为FCGR3B，并且该基因对的第二成员为EDA2R。
在一些方面，该基因对的第一成员为IL20RA，并且该基因对的第二成员为CLEC14A。
在一些方面，该基因对的第一成员为IL6R，并且该基因对的第二成员为BTNL9。
在一些方面，该基因对的第一成员为IZUMO1，并且该基因对的第二成员为LILRA5。
在一些方面，该基因对的第一成员为NGFR，并且该基因对的第二成员为LRRTM3。
在一些方面，该基因对的第一成员为NTM，并且该基因对的第二成员为AMIGO2。
在一些方面，该基因对的第一成员为PCDHB3，并且该基因对的第二成员为IGSF11。
在一些方面，该基因对的第一成员为PTGFRN，并且该基因对的第二成员为TMEM59L。
在一些方面，该基因对的第一成员为TREM1，并且该基因对的第二成员为VSIG8。
C.参考表达水平
在一些方面，蛋白质对的第一成员的参考表达水平(即，第一参考表达水平)为预先指定的表达水平，并且蛋白质对的第一成员的参考表达水平(即，第二参考表达水平)为预先指定的参考表达水平。
在一些方面，第一参考表达水平在约0.1至约0.5个计数每百万读段(CPM)之间，例如，在约0.15至约0.4CPM之间、在约0.2至0.3CPM之间或在约0.225至约0.275CPM之间。
在一些方面，第二参考表达水平在约0.1至约0.5个计数每百万读段(CPM)之间，例如，在约0.15至约0.4CPM之间、在约0.2至0.3CPM之间或在约0.225至约0.275CPM之间。
在一些方面，第一参考表达水平为介于约0.25至约0.5个计数每百万读段(CPM)之间，并且第二参考表达水平为介于约0.25至约0.5CPM之间。
在一些方面，第一参考表达水平为0.25CPM。在一些方面，第二参考表达水平为0.25CPM。在一些方面，第一参考表达水平为0.25CPM，并且第二参考表达水平为0.25CPM。
在一些方面，第一参考表达水平和第二参考表达水平分别是基因对的第一成员和第二成员在患有癌症(例如泌尿道癌症，例如泌尿道癌，例如转移性尿路上皮癌(mUC))的个体的参考群体中的表达水平。
D.癌症
在一些方面，PD-L1轴结合拮抗剂用于治疗有其需要的受试者的癌症(例如泌尿道癌症)或延缓其进展。在一些方面，受试者为人。泌尿道癌症包括尿路上皮癌(UC)、泌尿道的非泌尿路上皮癌和具有混合组织学的泌尿道癌。泌尿道非尿路上皮癌包括世界卫生组织分类中列出的所有亚型，例如鳞状细胞癌、疣状癌、腺癌(adenocarcinoma)、腺体癌(glandular carcinoma)、贝里尼集合管癌、神经内分泌癌或小细胞癌。腺癌可以是肠腺癌、粘液腺癌、印戒细胞腺癌或透明细胞腺癌。泌尿道癌症可能位于膀胱、肾盂、输尿管或尿道。在一些方面，根据TNM分类，在治疗开始时，泌尿道癌症(例如，尿路上皮癌、非尿路上皮癌或具有混合组织学的泌尿道癌)是局部晚期的，例如T4b Nany或Tany N2-3期。在一些方面，泌尿道癌症是转移性尿路上皮癌(mUC)、泌尿道非尿路上皮癌的转移形式或具有混合组织学的泌尿道癌的转移形式。在一些方面，根据TNM分类，泌尿道癌症在治疗开始时处于TNM M1期。
E.免疫检查点抑制剂
在一些方面，本发明的方法包括PD-L1轴结合拮抗剂的用途，该PD-L1轴结合拮抗剂可以为PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂或PD-L2结合拮抗剂。PD-1(程序性死亡1)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1”、“PDCD1”、“CD279”和“SLEB2”。示例性人PD-1示出在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q15116中。PD-L1(程序性死亡配体1)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体1”、“PDCD1LG1”、“CD274”、“B7-H”和“PDL1”。示例性人PD-L1示出在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中。PD-L2(程序性死亡配体2)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体2”、“PDCD1LG2”、“CD273”、“B7-DC”、“Btdc”和“PDL2”。示例性人PD-L2示出在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9BQ51中。在一些情况下，PD-1、PD-L1和PD-L2是人PD-1、PD-L1和PD-L2。
在一些方面，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一情况下，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配体结合的分子。在具体方面，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一情况下，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L2结合配体配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
在一些方面，PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)，例如如下文所述。在一些方面，抗PD-1抗体选自由以下项组成的组：MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810和BGB-108。MDX-1106也称为MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或纳武单抗，为WO2006/121168中所述的抗PD-1抗体。MK-3475也称为派姆单抗或Lambrolizumab，为WO 2009/114335中所述的抗PD-1抗体。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。AMP-224也称为B7-DCIg，为WO 2010/027827和WO 2011/066342中所述的PD-L2-Fc融合可溶性受体。
在一些方面，抗PD-1抗体为MDX-1106。“MDX-1106”的替代名称包括MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558和纳武单抗。在一些方面，抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)(CAS登记号：946414-94-4)。在更进一步方面，提供了一种分离的抗PD-1抗体，该抗体包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列；和/或轻链可变区，其包含SEQ IDNO:2的轻链可变区氨基酸序列。在更进一步方面，提供了一种分离的抗PD-1抗体，该抗体包含重链和/或轻链序列，其中：
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:1)，并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:2)。
在一些方面，PD-L1轴结合拮抗剂为PD-L2结合拮抗剂。在一些方面，PD-L2结合拮抗剂是抗PD-L2抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些方面，PD-L2结合拮抗剂为免疫粘附素。
在一些方面，PD-L1结合拮抗剂是例如如下所述的抗PD-L1抗体。在一些方面，抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1与PD-1之间和/或PD-L1与B7-1之间的结合。在一些方面，抗PD-L1抗体是单克隆抗体。在一些方面，抗PD-L1抗体是选自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段组成的组的抗体片段。在一些方面，抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些方面，抗PD-L1抗体是人抗体。在一些方面，抗PD-L1抗体选自由以下项组成的组：YW243.55.S70、MPDL3280A(阿特珠单抗)、MDX-1105、和MEDI4736(德瓦鲁单抗)以及MSB0010718C(阿维单抗)。抗体YW243.55.S70为WO 2010/077634中所述的抗PD-L1。MDX-1105，也称为BMS-936559，是WO2007/005874中所述的抗PD-L1抗体。MEDI4736(德瓦鲁单抗)是WO2011/066389和US2013/034559中描述的抗PD-L1单克隆抗体。可用于本发明的方法中的抗PD-L1抗体的实例及其制备方法描述于PCT专利申请WO 2010/077634、WO 2007/005874、WO 2011/066389、美国专利号8,217,149和US 2013/034559中，这些专利文献以引用方式并入本文。
WO 2010/077634 A1和US 8,217,149中描述的抗PD-L1抗体可用于本文所述的方法中。在一些方面，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:3的重链可变区序列和/或SEQ ID NO:4的轻链可变区序列。在更进一步方面，提供了一种分离的抗PD-L1抗体，该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区序列，其中：
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3)，和
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一个方面，抗PD-L1抗体包含重链可变区，该重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，其中：
(a)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO:5)；
(b)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO:6)；
(c)HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:7)；
进一步其中：X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S。在一个具体方面，X1是D；X2是S并且X3是T。在另一方面，该多肽进一步包含根据下式并列在HVR之间的可变区重链框架序列：(FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4)。在再另一方面，框架序列源自人共有框架序列。在进一步方面，框架序列是VH亚组III共有框架。在更进一步方面，框架序列中的至少一个如下：
FR-H1是EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:8)
FR-H2是WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:9)
FR-H3是RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:10)
FR-H4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)。
在更进一步方面，重链多肽进一步与包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的可变区轻链组合，其中：
(a)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO:12)；
(b)HVR-L2序列是SASX9LX10S,(SEQ ID NO:13)；
(c)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO:14)；
其中：X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y、G、F或S；X12是L、Y、F或W；X13是Y、N、A、T、G、F或I；X14是H、V、P、T或I；X15是A、W、R、P或T。在更进一步方面，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。
在更进一步方面，轻链进一步包含根据下式并列在HVR之间的可变区轻链框架序列：(FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4)。在更进一步方面，框架序列源自人共有框架序列。在更进一步方面，框架序列是VLκI共有框架。在更进一步方面，框架序列中的至少一个如下：
FR-L1是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:15)
FR-L2是WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)
FR-L3是GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)
FR-L4是FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:18)。
在另一方面，提供了一种分离的抗PD-L1抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含重链和轻链可变区序列，其中：
(a)重链包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中进一步：
(i)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH；(SEQ ID NO:5)
(ii)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO:6)
(iii)HVR-H3序列是RHWPGGFDY，以及(SEQ ID NO:7)
(b)轻链包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中进一步：
(i)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO:12)
(ii)HVR-L2序列是SASX9LX10S；以及(SEQ ID NO:13)
(iii)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T；(SEQ ID NO:14)其中：X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S；X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y、G、F、或S；X12是L、Y、F或W；X13是Y、N、A、T、G、F或I；X14是H、V、P、T或I；X15是A、W、R、P或T。在某一具体方面，X1是D；X2是S以及X3是T。在另一方面，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。在再另一方面，X1是D；X2是S以及X3是T、X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H以及X15是A。
在进一步方面，重链可变区包含并列在HVR之间的一个或多个框架序列，如下所示：(FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4)，以及轻链可变区包含并列在HVR之间的一个或多个框架序列，如下所示：(FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4)。在更进一步方面，框架序列源自人共有框架序列。在更进一步方面，重链框架序列源自Kabat亚组I、II或III序列。在更进一步方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在更进一步方面，一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO：8、9、10和11所示。在更进一步方面，轻链框架序列源自KabatκI、II、II或IV亚组序列。在更进一步方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在更进一步方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO：15、16、17和18所示。
在更进一步具体方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在更进一步方面，人恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。在更进一步具体方面，人恒定区是IgG1。在更进一步方面，鼠恒定区选自由IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3组成的组。在更进一步方面，鼠恒定区为IgG2A。在更进一步具体方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在更进一步具体方面，最小的效应子功能来自“无效应子的Fc突变”或无糖基化突变。在更进一步方面，较少效应子的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A取代。
在再另一方面，提供了抗PD-L1抗体，该抗体包含重链和轻链可变区序列，其中：
(a)所述重链进一步包含分别与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19)、AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:21)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，或
(b)所述轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22)、SASFLYS(SEQ IDNO:23)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在具体方面，序列同一性是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在另一方面，重链可变区包含并列在HVR之间的一个或多个框架序列，如下所示：(FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4)，以及轻链可变区包含并列在HVR之间的一个或多个框架序列，如下所示：(FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4)。在再另一方面，框架序列源自人共有框架序列。在更进一步方面，重链框架序列源自Kabat亚组I、II或III序列。在更进一步方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在更进一步方面，一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO：8、9、10和11所示。在更进一步方面，轻链框架序列源自KabatκI、II、II或IV亚组序列。在更进一步方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在更进一步方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ IDNO：15、16、17和18所示。
在进一步方面，重链可变区包含并列在HVR之间的一个或多个框架序列，如下所示：(FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4)，以及轻链可变区包含并列在HVR之间的一个或多个框架序列，如下所示：(FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4)。在更进一步方面，框架序列源自人共有框架序列。在更进一步方面，重链框架序列源自Kabat亚组I、II或III序列。在更进一步方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在更进一步方面，一个或多个重链框架序列如下：
FR-H1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:27)
FR-H2 WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:28)
FR-H3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:10)
FR-H4 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)。
在更进一步方面，轻链框架序列源自KabatκI、II、II或IV亚组序列。在更进一步方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在更进一步方面，一个或多个轻链框架序列如下：
FR-L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:15)
FR-L2 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)
FR-L3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)
FR-L4 FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:26)。
在更进一步具体方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在更进一步方面，人恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。在更进一步具体方面，人恒定区是IgG1。在更进一步方面，鼠恒定区选自由IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3组成的组。在更进一步方面，鼠恒定区为IgG2A。在更进一步具体方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在更进一步具体方面，最小的效应子功能来自“无效应子的Fc突变”或无糖基化。在更进一步方面，较少效应子的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A取代。
在再另一方面，提供了抗PD-L1抗体，该抗体包含重链和轻链可变区序列，其中：
(c)所述重链进一步包含分别与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19)、AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:21)具有至少85％序列同一性的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，和/或
(d)所述轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22)、SASFLYS(SEQ IDNO:23)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)具有至少85％序列同一性的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在具体方面，序列同一性是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在另一方面，重链可变区包含并列在HVR之间的一个或多个框架序列，如下所示：(FR-H1)-(HVR-H1)-(FR-H2)-(HVR-H2)-(FR-H3)-(HVR-H3)-(FR-H4)，以及轻链可变区包含并列在HVR之间的一个或多个框架序列，如下所示：(FR-L1)-(HVR-L1)-(FR-L2)-(HVR-L2)-(FR-L3)-(HVR-L3)-(FR-L4)。在再另一方面，框架序列源自人共有框架序列。在更进一步方面，重链框架序列源自Kabat亚组I、II或III序列。在更进一步方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在更进一步方面，一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO：8、9、10和WGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO:29)所示。
在更进一步方面，轻链框架序列源自KabatκI、II、II或IV亚组序列。在更进一步方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在更进一步方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ IDNO：15、16、17和18所示。在更进一步具体方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在更进一步方面，人恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。在更进一步具体方面，人恒定区是IgG1。在更进一步方面，鼠恒定区选自由IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3组成的组。在更进一步方面，鼠恒定区为IgG2A。在更进一步具体方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在更进一步具体方面，最小的效应子功能来自“无效应子的Fc突变”或无糖基化。在更进一步方面，较少效应子的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A取代。
在更进一步方面，提供了一种分离的抗PD-L1抗体，该抗体包含重链和轻链可变区序列，其中：
(a)重链可变区序列与以下序列具有至少85％的序列同一性：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO:25)，或
(b)轻链可变区序列与以下序列具有至少85％的序列同一性：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一些方面，提供了包含重链和轻链可变区序列的分离的抗PD-L1抗体，其中轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一些方面，提供了包含重链和轻链可变区序列的分离的抗PD-L1抗体，其中重链可变区序列与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一些方面，提供了包含重链和轻链可变区序列的分离的抗PD-L1抗体，其中轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且重链可变区序列与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一些方面，重链和/或轻链的N末端处的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基可被缺失、取代或修饰。
在更进一步方面，提供了一种分离的抗PD-L1抗体，该抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链序列与重链序列具有至少85％的序列同一性：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:30)，和/或
(b)轻链序列与轻链序列具有至少85％的序列同一性：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:31)。
在一些方面，提供了包含重链和轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中轻链序列与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些方面，提供了包含重链和轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中重链序列与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些方面，提供了包含重链和轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中轻链序列与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，并且重链序列与SEQID NO:30的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些方面，分离的抗PD-L1抗体是去糖基化的。抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸，是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，该羟基氨基酸最通常为丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列以除去上述三肽序列之一(对于N-连接的糖基化位点)，可以方便地从抗体上除去糖基化位点。可以通过将糖基化位点内的天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基取代为另一个氨基酸残基(例如，甘氨酸、丙氨酸或保守取代)来进行变异。
在本文的任何方面，分离的抗PD-L1抗体可以结合人PD-L1，例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中所示的人PD-L1，或其变体。
在更进一步方面，提供了编码本文所述的任何抗体的分离的核酸。在一些方面，核酸进一步包含适用于表达编码前述抗PD-L1抗体中的任一种的核酸的载体。在更进一步具体方面，载体在适用于表达核酸的宿主细胞中。在更进一步具体方面，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在更进一步具体方面，真核细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
抗体或其抗原结合片段可以使用本领域已知的方法来制备；例如，通过包括以下步骤的方法制备：在适用于产生此类抗体或片段的条件下，培养适用于表达的形式的含有编码前述抗PD-L1抗体或抗原结合片段中任一种的核酸的宿主细胞，并回收抗体或片段。
明确预期此类PD-L1轴结合拮抗剂抗体(例如抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L2抗体)或本文所述的其他抗体用于任何以上列举的方面可以单独或组合地具有任何特征。
在一些方面，免疫检查点抑制剂是针对共抑制分子(例如，CTLA-4拮抗剂(例如，抗CTLA-4抗体)、TIM-3拮抗剂(例如，抗TIM-3抗体)，或LAG-3拮抗剂(例如，抗LAG-3抗体))或其任何组合的拮抗剂。
在一些方面，免疫检查点抑制剂是针对TIGIT的拮抗剂(例如，抗TIGIT抗体)。示例性的抗TIGIT抗体在美国专利申请公开号2018/0186875和国际专利申请公开号WO 2017/053748中有所描述，其通过引用整体并入本文。
F.递送方法
在本文所述的方法中使用的组合物(例如，PD-L1轴结合拮抗剂)可以通过任何合适的方法施用，例如，如本文VB节中所述。
本文描述的免疫检查点抑制剂(例如，本文VIE节中描述的免疫检查点抑制剂，例如抗体、结合多肽和/或小分子)(和任何附加治疗剂)可以以符合良好的医疗实践的方式来配制、给药和施用。在该背景下需要考虑的因素包含所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。免疫检查点抑制剂不是必须地，而是任选地将其与目前用于预防或治疗所讨论的疾患的一种或多种药剂同时配制和/或施用。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的免疫检查点抑制剂的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
为了治疗癌症，例如本文VID节中描述的癌症，例如泌尿道癌症，本文所述的免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂、针对共抑制分子的拮抗剂(例如CTLA-4拮抗剂(例如抗CTLA-4抗体)、TIM-3拮抗剂(例如抗TIM-3抗体)或LAG-3拮抗剂(例如抗LAG-3抗体))或其任何组合(当单独使用或与一种或多种附加治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、PD-L1轴结合拮抗剂是否为预防或治疗目的而施用、既往疗法、患者的临床病史和对PD-L1轴结合拮抗剂的应答，以及主治医生的判断。免疫检查点抑制剂适当地一次或在一系列治疗中施用于个体。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得个体接受例如从约2至约20或例如约6个剂量的免疫检查点抑制剂)。可施用初始更高负荷剂量，然后施用一次或多次更低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
例如，作为一般提议，施用给人的免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体或抗LAG-3抗体的治疗有效量，无论是通过一次或多次施用，将在约0.01至约50mg/kg患者体重的范围内。在一些方面，所用的抗体以例如约0.01mg/kg至约45mg/kg、约0.01mg/kg至约40mg/kg、约0.01mg/kg至约35mg/kg、约0.01mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约25mg/kg、约0.01mg/kg至约20mg/kg、约0.01mg/kg至约15mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg或约0.01mg/kg至约1mg/kg来每日、每周、每两周、每三周或每月施用。在一些方面，抗体以15mg/kg施用。然而，其他剂量方案可能有用。在一个方面，将本文所述的抗PD-L1抗体在21天周期的第1天(每三周，q3w)以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg或约1800mg的剂量施用于人。在一些方面，抗PD-L1抗体MPDL3280A(阿特珠单抗)每三周(q3w)以1200mg静脉内施用。在一些方面，抗PD-L1抗体MPDL3280A(阿特珠单抗)每两周(q2w)以840mg静脉内施用。在一些方面，抗PD-L1抗体MPDL3280A(阿特珠单抗)每四周(q4w)以1680mg静脉内施用。该剂量可以以单剂量或以多剂量(例如，2个或3个剂量)诸如输注的形式施用。与单次治疗相比，可减少组合治疗中抗体的剂量。疗法的进展可以通过常规技术容易地监测。
在一些方面，个体之前未进行针对过泌尿道癌症的治疗。在一些方面，个体之前已经进行过针对泌尿道癌症(例如，局部晚期或转移性泌尿道癌，例如尿路上皮癌或非尿路上皮癌)的治疗。在一些方面，个体先前已用包含铂的疗法(例如，包含吉西他滨和顺铂的疗法；包含吉西他滨和卡铂的疗法；或包含甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星和顺铂的疗法(MVAC))进行过针对泌尿道癌症的治疗。在一些方面，个体先前已经用不包含铂的疗法进行过针对泌尿道癌症的治疗。在一些方面，个体既往没有施用过免疫检查点抑制剂。
G.附加治疗剂
在一些方面，PD-L1轴结合拮抗剂与一种或多种附加治疗剂例如联合疗法一起使用。在一些方面，包含PD-L1轴结合拮抗剂的组合物进一步包含附加治疗剂。在另一方面，另外的治疗剂以单独的组合物递送。在一些方面，一种或多种另外的治疗剂包括免疫调节剂、抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、放疗、细胞毒性剂、基于细胞的疗法或它们的组合。
如上所述的联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包括在相同或单独的制剂中)和单独施用(其中PD-L1轴结合拮抗剂的施用可以在施用一种或多种附加治疗剂之前、同时和/或之后发生)。在一个方面，PD-L1轴结合拮抗剂的施用与附加治疗剂的施用在彼此相距约一个月内，或在约一周、两周或三周内，或在约一天、二天、三天、四天、五天或六天内进行。
VII.包含CD177活性激动剂的治疗方法
A.治疗方法
在一些方面，本发明包含治疗患有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用包含有效量的CD177活性激动剂的治疗。
在一些方面，本发明包含一种鉴定可受益于包含CD177活性激动剂的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的平足蛋白(PDPN)表达水平，其中高于参考PDPN表达水平的样品中的PDPN表达水平将该个体鉴定为可受益于包含CD177活性激动剂的治疗的个体。
在一些方面，本发明包含一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包括确定来自个体的样品中的PDPN表达水平，其中高于参考PDPN表达水平的样品中的PDPN表达水平将该个体鉴定为可受益于包含CD177活性激动剂的治疗的个体。
在一些方面，个体具有高于参考PDPN表达水平的样品中的PDPN表达水平，并且该方法进一步包括向该个体施用有效量的CD177活性激动剂。
在一些方面，本发明包含一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括(a)确定来自个体的样品中的PDPN表达水平，其中样品中的PDPN表达水平高于参考PDPN表达水平；和(b)向该个体施用有效量的CD177活性激动剂。
在一些方面，本发明包含一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的CD177活性激动剂，其中来自该个体的样品中的PDPN表达水平已经被确定为高于参考PDPN表达水平。
在一些方面，CD177活性为对于PDPN的抑制。
在一些方面，来自个体的样品为肿瘤组织样品或肿瘤液体样品，例如，福尔马林固定和石蜡包埋的(FFPE)样品、存档样品、新鲜样品或冷冻样品。
在一些方面，样品中的PDPN表达水平为PDPN的蛋白质表达水平或PDPN的RNA表达水平。在一些方面，样品中的PDPN表达水平为PDPN的RNA表达水平。在一些方面，PDPN的RNA表达水平通过原位杂交(ISH)、RNA-seq、RT-qPCR、qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、FISH或其组合进行确定。
在一些方面，益处包含，与不使用CD177活性激动剂的治疗相比，个体的无复发存活(RFS)延长。在其他方面，益处可以包含，与不使用CD177活性激动剂的治疗相比，例如个体总存活(OS)的延长、距复发的时间的延长或治疗持续时间的缩短
B.参考表达水平
在一些方面，参考PDPN表达水平为患有癌症的个体的群体(例如患有结直肠癌(CRC)的个体的群体)中的PDPN表达水平。
在一些方面，参考PDPN表达水平为患有癌症的个体的群体中的表达水平的第33百分位、第35百分位、第40百分位、第45百分位、第50百分位、第55百分位、第60百分位、第65百分位、第66百分位、第70百分位、第75百分位、第80百分位、第85百分位、第90百分位、第95百分位或第99百分位。
在一些方面，参考PDPN表达水平为患有癌症的个体的群体中的表达水平的第50百分位。
在一些方面，参考PDPN表达水平为患有癌症的个体的群体中的表达水平的中值。
在一些方面，参考PDPN表达水平为患有癌症的个体的群体中的表达水平的第33百分位。
在一些方面，参考PDPN表达水平为患有癌症的个体的群体中的表达水平的第66百分位。
在一些方面，个体的群体的PDPN表达水平被分成三分位数，参考PDPN表达水平为第二个三分位数中的最低值。
在一些方面，个体的群体的PDPN表达水平被分成三分位数，参考PDPN表达水平为第三个三分位数中的最低值。
在一些方面，参考PDPN表达水平为预先指定的PDPN表达水平。
C.癌症
在一些方面，癌症为CRC、头颈部鳞状细胞癌或胶质瘤。
在一些方面，个体患有结直肠癌(CRC)。在一些方面，个体已经进行了CRC的手术切除。在一些方面，在治疗开始时，根据TNM分类系统，个体的CRC为I期、II期、或III期、或IV期CRC，例如II期CRC或IV期CRC。在一些方面，个体的CRC为左侧肿瘤，即发生在远端结肠(例如，横结肠的远端三分之一、降结肠的脾曲、乙状结肠或直肠)处的肿瘤；或右侧肿瘤，即发生在近端结肠(例如，横结肠的近端三分之二、升结肠和盲肠)处的肿瘤。
在一些方面，与在该激动剂不存在下的PDPN与CD177的结合相比，CD177活性激动剂导致所述两种蛋白质的结合增加。
在一些方面，与在CD177活性激动剂不存在下的PDPN的下游活性相比，CD177活性激动剂导致下游活性的改变。在一些方面，下游活性的改变为肿瘤生长的降低或癌症相关的成纤维细胞(CAF)收缩性的降低。
D.CD177活性激动剂
在一些方面，CD177活性激动剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽或模拟物。
在一些方面，CD177活性激动剂为肽，例如CD177肽，例如CD177的细胞外结构域。肽可以是多聚化的，例如二聚化、三聚化、四聚化或五聚化的。在一些方面，肽被四聚化，例如，使用链霉亲和素四聚化。
在一些方面，CD177活性激动剂为抗体或其抗原结合片段。在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合PDPN，例如为结合PDPN的拮抗剂抗体或其抗原结合片段。在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合CD177，例如为结合CD177的激动剂抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域。
可以例如使用本文IIIA和IIIB节中描述的鉴定对于相互作用的调节的方法或鉴定蛋白质下游活性的改变的方法来鉴定CD177活性激动剂。例如，包括表面等离子体共振(SPR)、生物层干涉(BLI)、ELISA或者细胞外或细胞表面相互作用在内的方法，如本文所述，可用于鉴定增加CD177与PDPN之间的相互作用的调节剂，即CD177活性激动剂。
在CD177活性激动剂为抗体(例如CD177激动剂抗体或PDPN拮抗剂抗体)的方面，可以通过筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库来分离抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法在，例如，Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人，编，Human Press,Totowa,NJ,2001)中综述并且进一步描述于，例如，在McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,in Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)；12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从该噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可选地，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)所描述的。最后，还可通过以下方式来制得天然文库:克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区域并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373，和美国公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
E.递送方法
在本文所述的方法中使用的组合物(例如，CD177活性激动剂)可以通过任何合适的方法施用，例如，如本文VB节中所述。
F.附加治疗剂
在一些方面，CD177活性激动剂与一种或多种附加治疗剂例如联合疗法一起使用，例如，如本文VIF节中所述。
VIII.制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。
在一些方面，本发明包含一个固体表面或一组固体表面(例如，一个多孔板或一组多孔板)，其包含多个位置，每个位置包含来自多肽集合的独特多肽，其中每个多肽包含细胞外结构域、标签和锚，并且其中多肽集合包含表7中的所有或一个子集的蛋白质的细胞外结构域。示例性的多肽集合在IIB节中描述。
在一些方面，本发明包含一个固体表面或一组固体表面(例如，一个多孔板或一组多孔板)，其包含多个位置，每个位置包含编码如上所述的独特多肽的质粒。在一些方面，该固体表面或该组固体表面已经用多肽压印。
在一些方面，本发明包含一个固体表面或一组固体表面(例如，一个多孔板或一组多孔板)，每个位置包含来自多肽集合的独特多肽，其中多肽集合包含表7的所有或一个子集的蛋白质的胞外结构域，其中所述多肽固定在一个或多个固体表面上，其中所述一个或多个多肽中的每一个固定在所述一个或多个固体表面上的不同位置(例如，在可明确地质询的位置，例如，可以通过本文所述方法明确地质询的位置)。不同的位置可以是铺有细胞系的表面上的区域，例如孔。
在一些方面，该固体表面或该组固体表面一起包含至少965个位置，每个位置包含来自多肽集合的独特多肽，其中每个多肽包含细胞外结构域、标签和锚，并且其中多肽的集合包含表7中的至少81％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，该固体表面或该组固体表面包含至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少1000、至少1050、至少1100、至少1150或1195个位置，例如，包含100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150或1195个位置，每个位置包含来自多肽集合的独特多肽或编码此类多肽的质粒。
在一些方面，多肽集合包含表7中的至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，多肽集合包含表7中的至少81％至100％的蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7中的至少85％、90％、95％或100％(例如，包含所有)的蛋白质，例如，包含表7中的至少81％-85％、83％-87％、85％-89％、87％-91％、89％-93％、91％-95％、93％-97％、95％-99％或100％的蛋白质的细胞外结构域。
在一些方面，多肽集合包含表7中的至少80％至81％的蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表7的至少80.1％、80.2％、80.3％、80.4％、80.5％、80.6％、80.7％、80.75％、80.8％或80.9％的蛋白质。
在一些方面，多肽集合包含表17的至少一种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表17的至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230种或所有231种蛋白质的细胞外结构域，例如，包含表17中的1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、101-105、105-110、110-115、115-120、120-125、125-130、130-135、135-140、140-145、145-150、150-155、155-160、160-165、165-170、170-175、175-180、180-185、185-190、190-195、195-200、200-205、205-210、210-215、214-220、220-225、225-230种或所有231种多肽的细胞外结构域。
在一些方面，本发明包含一组容器(例如，一组小瓶)，每个小瓶包含编码如上所述的独特多肽的质粒。
IX.实例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上面提供的一般描述，可以实践各种其他方面，并且实例不旨在限制权利要求的范围。
实例1.针对IgSF蛋白与人类STM受体文库之间的相互作用的测定
使用低亲和力相互作用的无偏检测技术，测定了包含大多数人类单跨膜(STM)受体(1,226种受体)的文库与445种免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白的结合。已知IgSF蛋白通过形成介导广泛功能(诸如对于轴突导向或突触可塑性的调节、对于细胞迁移和粘附的控制、以及自我与非自我识别)的同嗜性复合物和异嗜性复合物发挥作用，因此，这些蛋白质构成了药物开发工作的主要焦点。
A.IgSF查询物集合
免疫球蛋白超家族(IgSF)集合(查询物集合)是通过整合功能注释与来自用于预测蛋白质特征的各种计算算法的计算预测来定义的，然后是仔细的手动管理和审查。首先，根据InterPro(IPR036179)，从UniProt下载了一份预测的“免疫球蛋白样结构域超家族”蛋白质列表。这一列表补充了98种基于其参与相关生物学功能的选定蛋白质，然后根据与受体信号传导功能相关的细胞外结构域和基序的证据进一步整理，将其限制为445种蛋白质的子集(Clark等人,Genome Res,13:2265-2270,2003；Daeron等人,Immunol Rev,224:11-43,2008；Yap等人,J Mol Biol,426:945-961,2014)。最终的查询物集包含365种人类IgSF蛋白(根据InterPro注释，约为IgSF的82％)和98种附加蛋白质，其中的一些也在SwissProt中用“Ig样折叠”进行了注释(图1A；表4)。如前所述克隆IgSF蛋白(Bushell等人,GenomeRes,18:622-630,2008；Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。简而言之，每个IgSF查询蛋白的ECD与大鼠软骨寡聚基质蛋白(COMP)和β-内酰胺酶的五聚螺旋区域融合，增加了亲合力并允许在添加底物头孢硝噻后进行比色读数(图1B)。使用针对哺乳动物细胞表达进行密码子优化的序列合成所有克隆物。
先前已经证明了这一技术检测具有广泛亲和力的受体-配体相互作用(包括以微摩尔KD的瞬时相互作用)的能力(Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。为了进一步确定这一平台检测人类受体之间的相互作用的灵敏度和可重复性，遵循既定程序筛选PD-1/PDCD1和PD-L2/PDCD1LG2蛋白(图1B)。值得注意的是，所有预期的相互作用物都被检测到具有高的归一化信号(>0.75)、高结合特异性和出色的重现性(Pearson’s r>＝0.87)(图1C和图7C-7E)，进一步证明了受体相互作用发现平台的稳健性。
B.人类STM受体文库
单跨膜(STM)受体列表(猎物文库)是通过整合功能注释与来自用于预测蛋白质特征的各种计算算法的计算预测编制而成的，然后是仔细的手动管理和对已发表注释的审查(Clark等人,Genome Res,13:2265-2270,2003；Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。该文库由1,266种独特的人类STM受体组成(表5)。STM受体表达为与人类Fc标签(例如，可溶性ECD)融合的细胞外结构域(ECD)。这促进了蛋白质表达，避免了对于在洗涤剂存在下增溶的需要，并允许在蛋白质A包被的板上稳定捕获(图1B)。简而言之，细胞外结构域(ECD)的边界是通过使用公开可用的用于预测蛋白质特征的服务器(Phobius、TMHMM、SignalP3.0)来预测信号肽和跨膜螺旋或糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接位点而确定的。每个受体的ECD被合成并克隆到含有C端人类Fc标签的pRK5载体(基因泰克公司)中。对于II型STM蛋白，将HSV信号序列插入N端Fc标签的上游。
C.细胞培养和条件培养基的产生
i.细胞培养
STM受体文库的条件培养基使用Expi293F细胞(Thermo-Fisher)制备，该细胞是一种从HEK293细胞(人类上皮细胞、胚胎肾)适应的悬浮细胞系。细胞在以下条件下培养：37℃、8％CO2、80％湿度和150rpm搅拌速度。Expi293表达培养基(Life Technologies)用作种子培养和生产培养基。相同的细胞系和培养条件用于表达分泌的五聚IgSF蛋白。COS7细胞(源自猴肾组织的成纤维细胞系，购自ATCC)或HEK-293细胞用于相关结合配偶体的瞬时表达，表达为全长蛋白(基因泰克公司)。使用Lipofectamine LTX和PLUS试剂(LifeTechnologies)在Opti-MEM培养基(Life Technologies)中进行转染。细胞在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中在37℃加湿、5％CO2培养箱中培养。
ii.条件培养基的产生
STM受体的集合(猎物文库；克隆为与人类Fc标签(ECD-Fc)融合的细胞外结构域(ECD))在人类细胞中瞬时转染，以在条件培养基中表达为可溶性蛋白质。已详细描述了用于细胞转染自动化的细胞培养和仪器(Bos等人,Biotechnol Bioeng,112:1832-1842,2015)。简而言之，使用Expi293(Life Technologies)(一种适应悬浮的HEK293系)进行转染。Expi293表达培养基(Life Technologies)用作种子培养和生产培养基。细胞在烧瓶中作为种子培养物培养，并在瞬时转染之前在加湿培养箱中在37℃、5％CO2和150rpm搅拌速度下生长。Tecan EVO液体处理系统(Tecan)和集成的MultiDrop Combi试剂分配器(ThermoFisher)用于所有自动化细胞培养操作。使用最近描述的自动化平台，使用微量规模的1mL瞬时转染来制备猎物文库(Bos等人,Biotechnol Bioeng,112:1832-1842,2015；Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。简而言之，使用高通量质粒纯化系统以小量制备规模纯化DNA，并在每个孔中分配1μg DNA。为了生成富含寡聚查询蛋白的条件培养基，使用Biomek FX液体处理机器人(Beckman Coulter)在50ml离心管中进行30mL瞬时转染，每孔总共使用30μg，以96孔为一批进行处理，以提高效率，基本上如所述(Bos等人,Biotechnol Bioeng,112:1832-1842,2015)。25KDa线性聚乙烯亚胺(PEI)用于瞬时转染程序，并在转染后7天收获条件培养基。通过以3,000rpm旋转30分钟去除细胞，并将上清液储存在4℃直至处理。
iii.用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的STM文库包被板的制备
所使用的受体-配体筛选技术以基于亲合力的细胞外相互作用(AVEXIS)方法(Bushell等人,Genome Res,18:622-630,2008)为基础，进一步调整以用于384孔板格式的高通量自动筛选(Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。简而言之，为了准备用于高通量细胞外相互作用筛选的条件培养基，如上所述，在人类表达系统中产生STM猎物文库和IgSF查询蛋白，以最大限度地增加相关的翻译后修饰。如所述进行细胞转染，细胞培养物生长7天，然后通过以3,000g离心30分钟去除细胞。使用蛋白A包被的板(ThermoScientific)，通过培育过夜然后在4℃储存，从条件培养基中捕获猎物文库。使用相似的程序制备IgSF查询蛋白，直接在条件培养基中进行测定，无需任何捕获步骤。在筛选之前，使用条件培养基中的β-内酰胺酶活性将每个五聚IgSF受体的浓度归一化为读数。简而言之，将上清液的系列稀释液添加到头孢硝噻(0.125mg/mL)中，并立即转移到读板器中，每分钟记录485nm处的吸光度，共20分钟。将每个查询蛋白的表达水平归一化至先前确定的阈值水平，以识别≤10μM的相互作用，如所述(Bushell等人,Genome Res,18:622-630,2008)。
iv.条件培养基中ECD-Fc受体浓度的分析
使用人IgG Fcγ时间分辨(TR)-FRET测定法测量用于测定的条件培养基中每种STM受体(ECD-Fc)的浓度。与铕穴状化合物(Cisbio Bioassays)缀合的AffiniPur F(ab')2山羊抗人IgG Fcγ(Jackson ImmunoResearch)和AlexaFluor647R-AffiniPur F(ab')2驴抗人IgG Fcγ分别用作供体和受体。标准品、对照品和样品在测定稀释剂(PBS/0.5％BSA/0.05％Tween-20/15ppm Proclin)中稀释并添加到1536孔MaKO白板(AuroraBiotechnologies)中。然后将合并的供体和受体试剂溶液添加到每个孔中。将板在环境温度培育1小时，然后使用PHERAstar FS(BMG Labtech)读板器读取，激发波长为320nm，并且发射波长为665nm和620nm。TR-FRET信号报告为两个发射波长(665nm/620nm)的比率乘以10,000。通过对标准品的5个参数拟合的结果进行插值来获得样品定量。使用自定义软件处理数据。
D.细胞表面相互作用的自动化筛选
为了系统地探索IgSF成员的相互作用谱，每个查询蛋白都针对整个STM受体文库进行了单独筛选，从而测试了来自2,000多个单独384孔板的约600,000个二元结合事件(图8A)。
STM受体文库包被板的制备和寡聚IgSF蛋白针对STM受体文库的筛选是使用由自动液体处理设备(板分配器和洗涤器)组成的集成机器人系统进行的，以允许对蛋白质-蛋白质相互作用进行高通量分析并最小化手动操作以改善筛选数据质量(Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。该系统是一个全自动微孔板测定系统，由多个集成有机械臂的设备组成。这一系统配置有Biomek FX液体处理器(Beckman Coulter)，带有用于板到板样品转移的384通道移液器头、用于存放检测板和吸头盒的Thermo Cytomat 9旋转板架(Thermo Fisher Scientific)、用于清洗并将试剂分配到板的BioTek EL406组合清洗器/分配器(BioTek)以及用于分配附加试剂的BioTek MultiFlo分配器(BioTek)。TECANInfinite M1000多模式酶标仪(Tecan)用于记录来自筛选板的信号。该方法是使用BeckmanCoulter SAMI软件开发的，该软件根据运行中的测定板数量安排方法并控制整个自动化过程的执行。
本研究中使用的每个384孔筛选板配置有16个报告查询构建体的最大酶吸光度潜力的孔(用作自动化程序的阳性对照)、16个报告板背景的空白孔(阴性对照)和346个随机发现来自STM文库的猎物蛋白的孔。平均而言，这一工作流程允许每天针对由分布在4个筛选板上的1,364个猎物组成的文库筛选多达7种查询蛋白(图7C)。在筛选当天，用含有Ca2+和Mg2+的PBS将已与条件培养基文库一起培育过夜的蛋白A包被板洗涤三次。随后，用含有五聚化IgSF查询蛋白(50μL/孔)的条件培养基接种平板，并在室温培育1小时。然后用PBS洗涤板以去除任何未结合的IgSF五聚体。添加头孢硝噻(Calbiochem)(50μL/孔)。在β-内酰胺酶活性存在下观察到由颜色改变表示的头孢硝噻水解，表明IgSF查询蛋白与孔中捕获的单个STM受体结合(图1B)。将板在室温(RT)培育1小时，并通过测量485 nm处的吸光度来评估IgSF-STM受体相互作用。
实例2.IgSF细胞外相互作用筛选结果的分析和对IgSF相互作用组的预测
为了能够分析这一大型数据集并可靠地识别非特异性(假阳性)结合剂并以自动方式计算结合得分，我们开发了一种计算分类工具。
首先，对于所测的每个孔，通过减去平板的估计背景酶吸光度(10％-ile)并随后将这些值缩放到最大酶吸光度估计(99.5％-ile)来校正每个筛选的板的原始酶吸光度值，以推导出[0,1]范围内的归一化吸光度值。过滤掉所有吸光度对照和空孔值，并按查询物(行)乘猎物(列)数据矩阵编制归一化的吸光度值。使用数据矩阵，为每个查询物-猎物对计算了四个预测特征：1)归一化的吸光度值；2)查询物Z得分(单个查询物的跨4个STM文库板上所有猎物的Z得分)；3)猎物Z得分(STM受体文库中每个猎物的跨所有针对它筛选的查询物的Z得分)；和4)自定义特异性分数，计算如下：
Figure BDA0003282058310001371
Figure BDA0003282058310001372
在一个从文献编制的真阳性受体相互作用的基准数据集上，使用所有四个特征训练在Caret R包中实现的受监督的随机森林分类器，观察到来自正交文库筛选的“非特异性”猎物(表14)和真阴性相互作用，以1:10的阳性阴性比率从低于99％-ile的数据点采样(归一化的吸光度<0.057)(图8C-8E)。在训练和预测之前移除所有吸光度对照。Caret中的训练函数配置了以下参数：训练集大小为75％，测试集大小为25％，重复交叉验证(N＝10，R＝10)，多类预测(阳性、阴性、非特异性)，随机森林的网格搜索参数优化(mtry＝20，.ntree＝30)和作为性能指标的准确度。预测的“高置信度”IgSF相互作用组是通过按以下类别概率进行额外过滤来定义的：P(阳性)>＝0.75,P(非特异性)<＝0.25，并且P((阴性)<＝0.05(图2B和8B)。最后，出于表示和数据整合的目的，所有使用相同STM受体的多个猎物构建体鉴定的相互作用和双向鉴定的相互作用都汇总到一个非定向、非冗余的独特结合配偶体列表中。
这一分类练习产生了440种独特IgSF和STM蛋白之间的577种预测的高置信度相互作用，称为“IgSF相互作用组”(图2A，表6)。为了促进数据整合、分析和可视化，将IgSF相互作用组表示为Cytoscape相互作用网络，其中“节点”代表细胞外蛋白质，并且“边”代表它们之间的相互作用(图2A)。IgSF相互作用组网络高度连接(图2A)。生物网络中的连通性已成为许多研究的主题，这些研究假设它们的无标度特性有助于稳健性(Barabasi,Science,325:412-413,2009)。事实上，IgSF相互作用组的网络分析表明，每个蛋白质平均连接到2-3个相邻蛋白质，并且拓扑系数遵循幂律分布(图2C)，这是无标度网络的标志。这表明细胞外相互作用组不是由断开的受体-配体对组成，而是由具有密集的内部连接性和稀疏但相关的互连性的模块化组件组成(Albert,J Cell Sci,118:4947-4957,2005)。
IgSF相互作用组鉴定了数量惊人的472种新型相互作用，并在Biogrid、Bioplex和STRING数据库的聚集体中概括了105种先前记录的相互作用(图2D)。
实例3.IgSF相互作用组数据与公共数据集的整合
A.IgSF相互作用组和Bioplex、Biogrid和STRING数据集
将IgSF相互作用组数据集与Bioplex、Biogrid和STRING数据集比较(Chatr-Aryamontri等人,Nucleic Acids Res,45:D369-D379,2016；Huttlin等人,Nature,545:505-509,2017；Szklarczyk等人,Nucleic Acids Res.,43:D447-452,2015)，这些数据集是目前最系统地编制的人类蛋白质相互作用资源。Bioplex数据集是从Bioplex网页(v2.0)下载的。Biogrid数据集是从Biogrid网页(v3.4.160，物理相互作用)下载的。STRING数据集，包括所有STRING“证据渠道”，是从STRING网站(v.10.5)下载的，并根据之前描述的加权证据渠道进行过滤以仅保留STRING“综合得分>0.7”的相互作用(von Mering等人,NucleicAcids Res,33:D433-437,2005)。为了计算重叠百分比，所有三种蛋白质相互作用资源都被限制在这项工作中测试的二元相互作用的范围内，即按猎物蛋白的所有查询物的组合集。所有网络统计数据均在Cytoscape(v.3.6.1)中计算(Shannon等人,Genome Res,13:2498-2504,2003)。
相对来讲，就HEK293和HCT116细胞而言，我们的数据集与STRING数据库的重叠最大(82/1,037)并且与组合Bioplex的重叠最小(11/350)，考虑到Bioplex工作的规模(近15,000种蛋白质之间的约120,000种相互作用)以及我们的工作中研究的几乎所有蛋白质也是Bioplex和STRING数据库的一部分的事实，这是一个重要的观察结果(图7A)。来自人类蛋白质图谱的蛋白质定位信息的整合揭示，在Bioplex中发现的两种细胞外蛋白质之间的相互作用数非常低，这一数据集中只有约1％代表了由人类基因组编码的一组细胞外蛋白质之间的相互作用(图2E)。使用标准AP-MS工作流程捕获质膜表达的蛋白质的挑战以及Bioplex项目对细胞内的标记构建体的关注为这一观察结果提供了合乎逻辑的解释，并进一步突出显示了本研究与解决发生在细胞外环境中的相互作用的相关性。最后，考虑到网络上表示的238种STM蛋白质也作为查询蛋白而被包括，因此可以在我们的筛选中将这些蛋白质检测为交互相互作用。事实上，观察到了114种(共316种，约36％)作为查询物-猎物对和猎物-查询物对两者的相互作用(图2F)。
B.通过健康组织表达相关性进行网络聚类
与质膜蛋白研究相关的固有挑战严重阻碍了对人类受体之间功能关系的系统性探索。据我们所知，只有少数研究尝试通过从序列和结构特征预测共享配体相互作用来将细胞受体分类为功能家族，并且几乎所有的预测都缺乏实验验证。为了促进对IgSF相互作用组的功能解释，我们整合了来自基因型组织表达(GTEx)项目的IgSF相互作用组中所有蛋白质(网络节点)的健康组织mRNA表达谱(Pierson等人,PLoS Comput Biol,11,e1004220,2015)。
将GTEx中的节点对之间的组织表达相关性计算为跨所有组织细节类别的log2转换RPKM的Spearman系数。使用Benjamini-Hochberg方法针对多重假设检验调整所有检验p值。所有热图均使用pheatmap R包绘制。使用Euclidean距离和Ward链接进行无监督聚类。所有网络统计数据均在Cytoscape(v.3.6.1)中计算(Shannon等人,Genome Res,13:2498-2504,2003)。网络聚类也在Cytoscape中使用马尔可夫聚类算法(MCL)执行，在ClusterMaker2插件中实现，以Spearman相关系数作为边权重(膨胀参数＝1.4，如果残差增加＝假，则停止，迭代次数＝500)。使用GOstats R包算每个MCL聚类的基因本体论(GO)富集统计数据(Falcon和Gentleman,Bioinformatics,23:257-258,2007)。显著丰富的GO生物过程术语由q值<0.05确定。所有重要的术语都是手动策划的并且在图3A中描绘的支配性类别聚集的。
我们假设连接的IgSF和STM蛋白的模块化组件更有可能共享功能关系，并且通常将会在同一组织中表达。与这一假设一致，与我们的筛选中的非相互作用对相比，相互作用蛋白质对的全局组织相关系数确实显著更高(p<1.2 10-20，单侧Wilcoxon秩和检验)(图3B和9A)。鉴于物理和共表达关联之间存在明确的一致性，表达相关系数用于通知IgSF相互作用组聚类为模块化组件或“集群”(图3A)。正如预期的那样，与它们之间的所有相互作用相比，这些集群内的共表达系数显著更高(图9B)。
聚类的相互作用组在密切相关的IgSF成员之间显示出许多紧密连接的集群，这些成员包括CEACAM蛋白(图3A，聚类18)、PVR/Nectin受体(图3A，聚类13)、轴突导向因子/丛蛋白家族(图3A，聚类21)或ephrin家族的受体酪氨酸激酶(RTK)(图3A，聚类5)等。共表达和聚类结果也表明了许多以前未知的蛋白质对(包括MDGA1/neuroligins或免疫受体AXL及其推定的结合配偶体)的强关联，表明这些免疫受体在那些组织中的这些相互作用中的生理作用。接下来，所有网络集群都使用自定义基因本体论(GO)富集分析进行质询，以尝试对相互作用组集群内的蛋白质进行功能分类。这一富集分析表明，所有规模较大的集群(n>2)都捕获了与已知IgSF功能(诸如免疫应答调节、神经系统发育、信号转导和细胞间通讯)相关的生物学关联，并且使得能够基于与相对深入研究的结合配偶体的关联，向蛋白质特征化较差的蛋白质分配推定功能(图3A)。
尽管与非相互作用对相比，相互作用蛋白质具有显著更相关的组织表达模式，但两种分布之间的适度平均偏移表明，这一差异是由选定的相互作用和/或在特定组织环境中的相互作用驱动的。事实上，在前5％最相关的相互作用对中，许多已知的蛋白质对表现出更突出的在离散组织中的相关模式，例如Nectin1-Nectin 4(图3C)或CEACAM5-CEACAM7(图3D和图9C)，它们分别在皮肤和结肠中高度相关。
有趣的是，在IgSF相互作用组数据集中发现的许多新型相互作用也显示出相似的强烈的组织依赖性关联。例如，LILRA5与LILRB1在血液中高度关联(图3E和图9D)；PTPRZ1与CNTN1在大脑中高度关联(图3F)；NCR1与SIGLEC7(图9E)在多个组织中高度关联；或者CHL1与L1CAM(图3G和图9F)跨组织强烈关联，表明这些相互作用在某些生物场景中具有相关作用。我们接下来探询这些相互作用是否可以在细胞上“反式”发生，使用基于四聚化的方法对细胞表面上表达的推定结合物进行高灵敏度检测(图3H)。这些结果证明了NCR1与SIGLEC家族的特定成员的结合(图3I)，CHL1与L1CAM之间的相互作用(图3J以及图9G和9H)，以及CNTN1与PTPRZ1和其他推定的结合配偶体的结合(图3K以及图9H和9I)。共免疫沉淀研究表明，NCR1与质膜情境中所有新鉴定的结合配偶体相互作用，进一步支持对于这些相互作用的作用(图3L-3N)。总之，这些分析能够描述以前未记录的蛋白质家族之间可能的功能关联，这些关联由结合配偶体的共表达控制。因此，这项工作使对已知和特征不佳的蛋白质的推定分子功能的假设驱动研究成为可能，并为这些蛋白质可能起作用的生物学相关情境提供了基本原理。
GTEx数据集是从GTEx门户网页(v7，由我们的内部管道重新处理)下载的。
C.IgSF相互作用组和TCGA数据集
细胞外相互作用组的扰动通常通过未表征的机制与包括肿瘤生长和免疫逃避在内的病理过程密切相关。因此，我们试图研究，我们的相互作用组中的哪些边连接与癌症基因组图谱(TCGA)中报告的邻近正常组织的肿瘤组织中的基因表达相比显著失调(上调或下调)的节点。
对于具有至少3个匹配的正常样品的所有适应症(33种适应症中的N＝20)，评估了TCGA中的肿瘤与匹配的邻近正常组织的差异。使用双侧t检验对至少三个匹配的肿瘤与邻近正常样品的所有TCGA适应症测试差异表达。使用Benjamini-Hochberg方法针对多重假设检验调整所有检验p值。所有热图均使用pheatmap R包绘制。使用Euclidean距离和Ward链接进行无监督聚类。所有网络统计数据均在Cytoscape(v.3.6.1)中计算(Shannon等人,Genome Res,13:2498-2504,2003)。网络聚类也在Cytoscape中使用马尔可夫聚类算法(MCL)执行，在ClusterMaker2插件中实现，以Spearman相关系数作为边权重(膨胀参数＝1.4，如果残差增加＝假，则停止，迭代次数＝500)。
这一分析揭示，由543/703条边(约75％)连接的398/485个节点(约82％)在至少一个TCGA适应症中共同失调(图6A)，表明涉及IgSF和STM蛋白的相互作用在肿瘤中通常受到干扰。我们还观察到，在肺鳞状细胞癌(LUSC)、结直肠腺癌(COAD)和肾脏肾癌(KIRC)适应症中，失调的节点数以及连接这些节点的边数最高，其中大约150种网络基因显著过表达(图6B和11A)。这一分析证实并进一步验证了许多相对明确表征的相互作用对在多个共享的TCGA适应症中上调，诸如抑制性受体CTLA4和CD80(5/19适应症)、PVR/nectin家族(4/19适应症)或轴突导向因子和ephrin受体家族的几个成员等等(图6A)。相反，这些结果还揭示，功能相关的相互作用对，诸如CADM2和CADM3、FLRT2和UNC5C(各为9/19适应症)或PTPR家族的一些成员及其相互作用配偶体，在多种共享肿瘤类型中共同下调，与所提出的他们作为肿瘤抑制因子的功能一致。有趣的是，我们的分析还突出显示了本研究中许多新报告的相互作用的这种惊人的同义共调模式。值得注意的是，许多相互作用对，诸如抑制性受体对CD300LF-CD300LG和LILRB4-CNTFR或共刺激分子ICOS-ICOSLG，是负同步的(分别被上调和下调)中，表明缺乏这些相互作用可能在肿瘤进展中起作用。最后，这一分析揭示，大多数被鉴定为网络中心(由5条或更多条边连接的节点)的蛋白质，包括PTPRD、PTPRS、NTRK2、CNTN1或CD300LG，在多种适应症中均显著下调(图6A-6D)，表明由这些蛋白质介导的相互作用的破坏可能在癌症进展中发挥作用，以及对诸如CD300免疫受体家族等表征不佳的蛋白质的潜在作用。
TCGA RNA-Seq数据是从NCI Genomic Data Commons PanCanAtlas Publications网页下载的。
实例4.用于验证结合配偶体的方法
实例1和2中鉴定的选定相互作用使用一种或多种正交技术进行验证，例如，表面等离子体共振(SPR)、生物层干涉和免疫共沉淀(co-IP)。
A.表面等离子体共振
使用Biacore 8K(GE Healthcare)或Proteon仪器(Biorad)通过SPR分析推定的受体-配体相互作用。使用标准氨基偶合方法将指示的蛋白质分别固定在CM5(GEHealthcare)或GLC(Biorad)传感器芯片上。当使用Proteon仪器时，在HBS-P缓冲液(0.01MHepes、0.15M NaCl和0.005％表面活性剂P20，pH7.4)或PBS-0.01
Figure BDA0003282058310001431
20中以每种情况下指定的浓度运行分析物。对于动力学计算，以低共振单位固定配体，并在平衡状态下计算KD值。对于动力学实验，使用带有His标签的重组蛋白作为分析物。在所有情况下，通过减去参考流量响应去除整体折射率改变，并使用Proteon BiaEvaluation软件版本4.1(Biorad)分析传感图。
B.生物层干涉
如前所述，AXL与结合配偶体IL1RL1和Gas6之间的相互作用使用Octet Red系统通过生物层干涉法测定(Husain等人,Mol Cell Proteomics,18:2310-2323,2019)。简而言之，使用EZ-LINKTM Sulfo-NHS生物素化试剂盒(Thermo Scientific)在体外对重组AXL、MERTK或Tyro3胞外域进行生物素化，并捕获在链霉亲和素包被的传感器上。测试这些受体与Gas6或IL1RL1的结合，表达为在PBS缓冲液中测定的重组胞外域。使用Forte Pall(PortWashington,NY)软件9.0分析数据。
C.重组蛋白
以下蛋白质购自Sino Biologicals：CNTFR、LDLR、SLITRK4和BTN3A3。以下蛋白质获自R&D Biosystems：CHL1、MCAM、SIRPA、CNTN1、SLITRK2、SLITRK3、LRFN5、EDAR、FLT4、PD-L1、PD-1、EPHA3、EPHA4、BTNA2A、BTN3A1、AXL、IL1RL1、VSIG10L、FLRT1、FLRT2、FLRT3、NCR1、MDGA1、TREML2、IGSF9B、LILRA3、Gas6、MERTK和Tyro3。CEACAM4表达为ECD-Fc，在哺乳动物细胞中表达，并使用标准亲和层析技术在内部纯化(Ramani等人，2012)。
D.新型结合配偶体的免疫共沉淀
以下STM蛋白表达为与C端HA标签融合的全长蛋白：FAM187B、LRRC4B、LRRC4C、VSIG8、CDH9、ST14、TGOLN2、IGSF5、IL1RL1、VSIG10L、PD-L2、PD-L1、LILRA3、LILRB4、LILRB5和NCR1。以下STM蛋白表达为融合C端Flag标签的全长蛋白：BTN2A1、BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3、AXL、CD300A、CD300C、CD300LF、CEACAM4、EPHA3、IL6R、EDAR、ILDR1、CNTFR、LDLR、SIGLEC7、SIGLEC8和CD4。使用LIPOFECTAMINETM LTX试剂将HEK293细胞用相关蛋白质对(分别表示为HA和Flag标记的融合体)共转染。使用相对低的质粒浓度以避免蛋白质的高过度表达。通常，将6x105个细胞接种在M6孔板中，并用1μg 1:1DNA混合物反向转染。细胞裂解物用PBS洗涤并在转染后约18小时使用RIPA缓冲液(50mM Tris HCL pH 7.4、150mM NaCl、2mMEDTA、0.5(w/v)脱氧胆酸钠、0.1％(w/v)SDS、1％(v/v)NP40)裂解。按照制造商的说明，将等量的裂解物与EZVIEWTM Red
Figure BDA0003282058310001441
M2亲和凝胶(Millipore Sigma)在4℃培育过夜。用裂解缓冲液彻底清洗珠，并使用上样缓冲液SDS样品缓冲液(Thermo FisherScientific)在变性条件下洗脱蛋白质。使用抗Flag抗体(Cell Signaling Technologies)和抗HA抗体(Abcam)，使用LICOR仪器通过蛋白质印迹分析免疫沉淀物。
实例5.EPHA3和CEACAM4结合配偶体的验证
功能相互作用图(图3A)显示，相对于蛋白质群落内的其他成员，蛋白质家族内的相关受体显示出不同的结合剂或不同的组织表达。这种不同行为的两个值得注意的示例为ephrin受体EPHA3和细胞表面蛋白CEACAM4，它们分别被鉴定为免疫调节聚类中的PD-L1和PD-L2的结合配偶体(图4A)。
有趣的是，某些ephrin家族成员(EPHA3、EFNB1、EPHB4)相对于该家族的其他成员表现出更混杂的表达模式(图10A和10B)。同样，癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族明显分为两个组织聚类，其中由CEACAM4、CEACAM3和CEACAM8组成的组与免疫调节聚类在组织表达模式上表现出显著重叠，包括对于CEACAM4和PD-L2的共享组织共表达(图10A和10C)。
为了进一步研究这些推定的免疫调节剂，使用纯化的重组蛋白通过表面等离子体共振(SPR)研究了这两种相互作用。EPHA3与PD-L1(图4E)和CEACAM4与PD-L2(图4B)的特异性结合被证实具有中等结合亲和力(PD-L1/EPHA3：KD：2.8x10-8±2.7；PD-L2/CEACAM4，KD：8.4x10-8±69)(图10D和10E)，说明了通过发现渠道对受体-配体相互作用进行稳健和灵敏检测的能力。
SPR分析还证实了LILR家族成员LILRA3和EPHA3之间的新鉴定的相互作用(图4C)。PD-L1与细胞上表达的其已知结合配偶体PD-1和PD-L2，以及EPHA3相互作用，而未观察到与ephrin家族的相关成员或所测试的CEACAM蛋白的相互作用，进一步证明了PD-L1/EPHA3相互作用的特异性(图4F)。反过来，PD-L2与细胞表面上表达的PD-L1和PD-1以及新的相互作用因子CEACAM4结合。没有观察到与CEACAM5(一种与CEACAM4相关的蛋白质)或PD-L1结合剂EPHA3的结合，证实了PD-L2和CEACAM4之间的特异性相互作用(图4F)。有趣的是，治疗性抗体阿特珠单抗已知可阻断PD-1/PD-L1轴，并因此目前用作治疗实体瘤的免疫疗法(Shah等人,Hum Vaccin Immunother,14:269-276,2018)，还与EPHA3竞争相互作用(图4D)。
实例6.验证PTPR结合配偶体
IgSF相互作用组网络的功能聚类(实例2)揭示了受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPR)家族成员与神经系统相关蛋白之间的显著关联，神经系统相关蛋白包括神经营养因子受体(NTRK)、白细胞介素-1受体辅助蛋白(ILRAP)、Slit和NTRK样家族(Slitrk)以及富含亮氨酸和纤连蛋白III型结构域(LRFN)蛋白。有趣的是，还发现netrin-G配体-3(NGL-3/LRRC4B)与PTPR蛋白以及嗜乳脂蛋白(BTN)家族的特定成员相互作用(图3A)。
A.细胞表面相互作用测定
PTPR家族是最大的质膜表达受体蛋白酪氨酸磷酸酶家族(Du和Grandis,Chin JCancer,34:61-69,2015)。这一集群揭示了PTPR家族成员与四个不同的神经系统相关蛋白家族之间的复杂关联模式，该神经系统相关蛋白家族包括神经营养因子受体(NTRK)、白细胞介素1受体辅助蛋白(ILRAP)、Slit和NTRK样家族(SLITRK)以及富含亮氨酸和纤连蛋白III型结构域(LRFN)蛋白(图3A，聚类1；图5A)。此外，发现已知与PTPRs蛋白相互作用的netrin-G配体-3(NGL-3/LRRC4B)结合嗜乳脂蛋白家族的特定成员，这个家族是新兴的治疗相关免疫受体家族(Arnett和Viney,Nat Rev Immunol,14:559-569,2014)。为了确认和进一步研究这些蛋白质家族之间的复杂联系，PTPRD、PTPRS和PTPRF被表达为细胞表面蛋白质，并使用所描述的基于细胞的方法测试其与其鉴定的相互作用配偶体的结合。这些结果分别证实了SLITRK2和SLITRK3蛋白与PTPRD和PTPRS之间的特异性相互作用(图5B)。此外，观察到LFRN5(图5C)和IL1RAP(图5D)蛋白与所有三个家族成员PTPRD、PTPRS和PTPRF的直接结合。与这些结果一致，SPR分析进一步证实了PTPRD与SLITRK1、SLITRK4、LFRN1、LFRN4、IL1RAP和IL1RAPL1蛋白的结合(图5F)。最后，为了研究SLITRK、IL1RAP和LRFN家族成员是否特异性地识别选择的PTP受体，或者更确切地说是保持混杂串扰的能力，我们测试了与PTPR家族的八个成员的结合。有趣的是，这些测定证实了其在各自家族中的同源配体的选择性PTPR识别(图12A-12D)。
此外，我们证实了细胞表面表达的LRRC4B与嗜乳脂蛋白BTN3A1和BTN3A3的结合(图5E、5G和5H)，但不与同源家族成员BTN2A2结合(图12E)，如相互作用组结果所预测的。值得注意的是，这些新相互作用物在免疫共沉淀研究中得到了证实(图5G和5I)，这也证明了LRRC4B与BTN3A2之间的相互作用(图5H)。对嗜乳脂蛋白家族的其他成员(包括BTN2A1和BTN3A1)的进一步分析(图5G、5J和12F)证明了与新鉴定的相互作用物的特异性结合，表明这些蛋白质可以在细胞中形成复合物。
综上所述，这项全面的验证工作证实了之前针对PTPR家族描述的相互作用配偶体，确定了各个家族成员之间的新相互作用，并且据我们所知，这是首次评估家庭间的选择性。此外，发现了许多嗜乳脂蛋白的受体特异性相互作用物，揭示了一个表征不佳但高度相关的免疫受体家族。
B.疾病相关的PTPRD变体
尽管已经对一些基因进行了详尽的表征，但大多数与疾病相关的突变研究得很少，并且疾病中潜在的蛋白质相互作用组的改变仍然大部分未知，部分原因是对相互作用网络的了解非常有限。新出现的数据表明，PTPRD作为肿瘤抑制因子发挥作用，并且导致功能丧失表型的遗传和/或表观遗传失调可能导致信号转导的改变和肿瘤生长的增加。事实上，PTPRD在胶质母细胞瘤、恶性黑素瘤和肺腺癌等肿瘤中经常发生突变(Peyser等人,PLoSOne,10:e0135750,2015；Veeriah等人,Proc Natl Acad Sci USA,9435-9440,2009)。因此，我们利用本研究之前描述的受体相互作用发现渠道来检查与癌症相关的PTPRD变体集合。我们查询了癌症体细胞突变目录(COSMIC)和TCGA数据门户以及单独发表的研究，以鉴定在肿瘤类型中相对普遍的非同义突变(表9)。
有趣的是，除了蛋白质酪氨酸磷酸酶结构域中的改变外，构成ECD的免疫球蛋白(IG)和纤连蛋白(FN)结构域的整个范围内也出现了频繁的突变，这表明对介导细胞通讯的PTPRD相互作用的情况有影响(图5K)。为了检查这些与癌症相关的突变是否会干扰为PTPRD描述的相互作用网络，使用相互作用发现渠道筛选了代表ECD中所有结构域的14种突变体的集合(图5K和5L以及表9)。总体而言，FN结构域中的突变并未实质性地改变PTPRD相互作用文库，而集中在IG结构域中的突变具有显著影响(图5L)，显示与大多数结合配偶体的结合显著减少，这与迄今为止的报导和现有结构一致(,FEBS J,280:388-400,2012；Veeriah等人,Proc Natl Acad Sci USA,9435-9440,2009)。
有趣的是，所研究的突变大多数显著影响了与LRRC4B和NTRK3的相互作用，其中IG1-3和FN结构域1-3中的突变完全取消了结合，表明选定的相互作用在肿瘤情境中通常受到干扰。相反，与ILRAP家族成员IL1RAP、IL1RAPL1和ILRAPL2的结合没有受损或只是轻微受损，但IG1和IG2结构域中的突变体除外(图5K和5L)。有趣的是，我们还观察到选定的突变会选择性地影响与特定家族成员的结合。在SLITRK家族中，R232C/R233C双突变损害了与SLITRK1/3蛋白的结合，而与SLITRK6的结合通常与wt PTRPD相当。同样，在LRFN家族中，G203E/K204E双突变体显示不与LRFN4和LRFN5结合，而R232C/R233C双突变体显示与LRFN5的结合更显著降低，但与LRFN4的结合无此结果(图5L)。这些结果表明，通过PTPRD突变筛选鉴定的高度特异性相互作用网络重新布线事件可能在疾病中发挥作用，并表明尚未针对PTPRD进行表征的更广泛的生物学功能和信号传导特性。
实例7.CHL1和CNTN1结合配偶体的验证
IgSF相互作用组网络(实例2)揭示了神经细胞粘附分子CHL1与接触蛋白家族成员CNTN1之间的关联，这两种细胞表面蛋白质在神经系统中的细胞外基质、细胞粘附和突触形成中发挥作用(图3A)。CHL1与CNTN1和其他相互作用蛋白之间的相互作用通过细胞表面相互作用测定得到证实，并使用SPR进行进一步测定。
A.细胞表面相互作用测定
对CNTN1和CHL1进行如实例5A中所述的细胞表面相互作用测定。证实了在细胞表面上表达的CHL1与CNTN5和L1CAM相互作用，并且与免疫受体BTLA的相互作用更弱(图11C)。
在细胞表面上表达的CNTN1与可溶性查询PTPRZ1特异性地结合，但不与该受体家族的其他相关成员(包括PTPRD或PTPRS)结合(图12D)，它们被发现与LFRN、SLITRK和IL1RAP蛋白相关(图5A和12A-12D)。这一结果进一步突出显示了IgSF相互作用组筛选中鉴定的结合谱的准确性，并表明这些受体通过选择性识别结合配偶体发挥特定功能。
B.SPR测定
如实例4C和4D中所述，通过SPR测定选定的CNTN1结合剂。CNTN1表达为与人Fc标签融合的细胞外结构域(ECD)，并固定在CM5传感器芯片上。分析物NRCAM、NFASC、MCAM和CHL1以及对照如实例4B中所述配制并以250nM的浓度注射。这些实验证明了CNTN1与神经系统蛋白NRCAM、NFASC、MCAM和CHL1之间的直接相互作用(图9I)。
实例8.对LILR家族结合配偶体的验证
LILR蛋白是一个新兴的、尚未明确表征的免疫受体家族，其中一些已知与I类MHC结合。我们专注于LILRB1、LILRB3、LILRB4和LILRB5，这些受体的特征在于存在基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)并因此具有推定的免疫抑制功能(Brown等人,TissueAntigens,64:215-225,2004；van der Touw等人,Cancer Immunol Immunother,66:1079-1087,2017)。
有趣的是，我们的研究鉴定了LILR受体特异性相互作用，包括EDAR和LILRA5与质膜上表达的LILRB1的结合；以及CNTFR和LDLR分别与LILRB4和LILRB5受体之间的特异性相互作用(图5N)。此外，EDAR(图4G)、IL6R(图4H)和CNTFR(图4I)分别与LILRB1和LILRB4有效地共免疫沉淀，表明这些新鉴定的结合配偶体可以在质膜的情境中发生。
A.细胞表面相互作用测定
对LILR家族蛋白质和相关结合配偶体进行如实例5A中所述的细胞表面相互作用测定。FLT4、EDAR、IL6R、CNTFR和LDLR在细胞表面上表达，而LILRB1、LILRB4和LILRB5表达为可溶性多聚蛋白。这些测定证实了LILRB1与受体EDAR、IL6R和血管内皮生长因子受体3VEGFR3(FLT4)之间的相互作用，LILRB4与CNTFR之间的相互作用，以及LILRB5与LDLR之间的相互作用(图11B)。
B.对于网络集成中的LILRB1的分析
IgSF网络与TCGA的整合(实例3C)揭示了LILRB1和淋巴管生成受体FLT4/VEGFR3两者而不是其他LILRB1相互作用配偶体的跨多种肿瘤适应症的同步上调，这种模式在肾癌中尤为显著(图5M)。这些观察结果也与蛋白质细胞图谱中的注释以及表明FLT4在某些肿瘤中为消极预后的独立工作一致。此外，越来越多的证据表明LILRB1在免疫应答中起着关键作用。我们和其他人已经将LILRB1鉴定为一个突出的病毒靶标(Chan等人,Proc Natl AcadSci U S A,111:2722-2727,2014；Chapman等人,Immunity,11:603-613,1999；Hirayasu等人,Nat Microbiol,1:16054,2016；Martinez-Martin等人,Nat Commun,7:11473,2016)，并且最近的一项研究表明LILRB1在通过识别MHC-I来控制巨噬细胞的吞噬功能中发挥核心作用(Barkal等人,Nat Immunol,19:76-84,2018)，这些共同表明LILRB1代表了一个有希望的治疗靶点。
实例9.IgSF相互作用组与癌症
IgSF相互作用组在来自使用抗PD-L1治疗性抗体阿特珠单抗治疗的转移性尿路上皮癌患者的大型2期试验(IMvigor210)的转录分析样品的情境中进行了评估。这些发现揭示了与CD8+T效应(Teff)细胞功能和不同肿瘤免疫表型相关的相互作用蛋白质群落。进一步的研究发现，蛋白质相互作用识别标志与缺乏对于治疗的应答和存活高度相关，提高了对临床结果的预测能力。
A.肿瘤中的差异基因表达
体内平衡期间的组织完整性主要取决于细胞表面蛋白质之间的相互作用，因此，细胞外相互作用组的扰动与病理过程诸如肿瘤生长和免疫逃避密切相关。对蛋白质相互作用网络如何在疾病中被扰乱或重新连接的理解显著受限，这主要是由于细胞外相互作用组的覆盖率不佳。因此，为了将基因组信息和功能意义联系起来，将TCGA中报告的肿瘤与邻近的正常组织之间的差异mRNA表达数据整合到IgSF相互作用组中(图6A和图29A-29J)。值得注意的是，我们观察到超过90％的IgSF基因在至少一种肿瘤适应症中显著地差异表达(双侧t检验，|Log倍数改变|>1，q<0.05)(图6A)。事实上，本研究报告的IgSF相互作用组中的不相关基因对与相互作用对之间的系统比较表明，在所有TCGA适应症中，IgSF中的共同失调的相互作用数始终较高(图6B)。值得注意的是，IgSF相互作用组和TCGA的整合突出显示了在大多数肿瘤中共同下调的相互作用蛋白，包括CADM3-CADM2、UNC5C-FLRT2和PTPR家族的一些成员及其相互作用配偶体，观察结果与针对这些基因描述的肿瘤抑制因子功能一致这(Bae等人,Sci Rep,7:272,2017；Chang等人,Clin Cancer Res,16:5390-5401,2010)。相反，这一分析也证实并进一步支持了以下观察结果：充分表征的相互作用对通常在多个共享的TCGA适应症中共同上调，包括充分描述的免疫受体对，诸如CTLA4/CD80或PD-1/PD-L1(图6C和6D)。此外，正如通过LILR家族的某些成员所说明的那样，发现许多相互作用的蛋白质在多种肿瘤适应症中以相反的方向(分别上调和下调)差异表达(图29B和29C)，表明这些相互作用的破坏可能会影响肿瘤微环境中的细胞通讯。
接下来，我们试图研究哪些相互作用在蛋白质水平上是相关的，这可能在RNA水平上被遗漏了。为此，将最近发布的375种来自癌细胞系百科全书(CCLE)的癌症细胞系的蛋白质组学资源(Nusinow等人,Cell,180:387-402e316,2020)与IgSF相互作用组整合。与使用GTEX进行的观察相似，与非相互作用对的互补相比，相互作用对的子集的Pearson相关性显著更高，尽管不那么直观(单侧Wilcoxon秩和检验，p<0.05)并且总体而言与其GTEX对应物的相关性得分较低，这可能是由于GTEX中的患者数量比CCLE中的细胞系多，并且蛋白质组学数据集中的缺失值通常较大。尽管如此，IgSF相互作用组与蛋白质表达的比较也揭示了许多显著相关的相互作用，例如大肠谱系(图6F)以及肺癌细胞系(图29H)中的CEACAM5和CEACAM6；肺细胞系中新验证的蛋白质对CNTN1-NRCAM(图6G、9H和9I)；LRRC4B和BTN3A1(图6H、5H和5J)；UNC与FLRT家族之间的相互作用(图6I和10A-10J)，或CNTN1-PTPRZ1对，有趣的是，它们在健康脑组织中显示出很强的相关性(图3A)以及在造血和淋巴细胞系中的强关联(图6J)，表明这些相互作用在免疫细胞中的作用尚未表征。同样，IGSF3-PTGFRN对在本研究中首次被报告相互作用并且主要功能未知，在癌细胞谱系中显示出突出的相关性(图6K、6L和29E-29G)。我们还观察到针对TAM受体AXL(图6M)的强相关性，AXL为一种受体酪氨酸激酶和先天免疫的重要调节剂，越来越被认为是肿瘤耐药性的决定因素(Zhu等人,Mol Cancer,18:153,2020)。有趣的是，AXL蛋白水平与新的结合配偶体VSIG10L显著相关，能够在质膜中顺式相互作用(图6N)。虽然没有可用于所鉴定的第二推定相互作用物IL1RL1的蛋白质表达数据，但我们也能够使用多种方法确认AXL与IL1RL1之间的特异性相互作用，为这一重要的RTK提出了新的调节剂(图6O-6Q)。
最后，对于肺中的蛋白质对(诸如KIT-KITLG或ICOSLG-NTM)观察到紧密负相关的相互作用(图29I和29J)，这些模式可能表明这些相互作用具有重要的抑制作用(Chung等人,mSystems,4,2019)。
总之，这些发现表明IgSF与STM蛋白之间的细胞外蛋白质相互作用在肿瘤中通常受到干扰，这可能反映了肿瘤中免疫细胞浸润的差异或肿瘤细胞的免疫逃避过程。在TCGA的情境中评估IgSF相互作用组能够阐明在特定肿瘤类型中受到影响的相互作用蛋白质网络，提供对癌症中失调的特定途径的分子见解，从而为治疗开发提供机会。
B.与T细胞功能和临床结果相关的相互作用识别标志。
癌症免疫疗法的发展以重振先前存在的抗肿瘤反应标志着癌症治疗的一次前所未有的飞跃。特别地，阻断抑制性检查点诸如PD-1-PD-L1的治疗性抗体，已被证明可以在患有多种癌症的患者中诱导持久应答。尽管检查点疗法取得了可观的成功，但这些应答仅发生在一部分患者中，表明存在影响肿瘤发生的未知非冗余途径(Sharma等人,Cell,168:707-723,2017)。因此，为了全面阐明与临床结果相关的受体-配体网络并鉴定耐药性和对于治疗的应答的新决定因素，在来自包括298个来自使用PD-L1阻断抗体阿特珠单抗治疗的转移性尿路上皮癌患者的转录组样品的2期试验(IMvigor210)的大群组的情境中研究了IgSF相互作用组(Mariathasan等人,Nature,554:544-548,2018)。有趣的是，IgSF相互作用组蛋白的子集表现出与免疫冷(或非炎症)或热(炎症)肿瘤的强相关性，由与CD8+Teff细胞相关的基因集定义(Mariathasan等人,2018)。使用与基质高肿瘤相关的泛成纤维细胞TGFb识别标志进一步对与免疫排除表型相关的免疫热肿瘤进行分层(Mariathasan等人,Nature,554:544-548,2018)。值得注意的是，我们观察到新鉴定的相互作用对诸如PD-L2/CEACAM4、LILRB1/IL6R和LILRB4/CNTFR与热肿瘤密切相关，包括NCR1与SIGLEC6或SIGLEC8蛋白之间的相互作用，或者与PTPRD结合的主要与富含基质的肿瘤相关的SLITRK家族成员(图28A)。这些免疫受体相互作用在免疫冷肿瘤中基本上不存在，这与这些肿瘤缺乏主动免疫应答的观点一致(Chen和Mellman,Nature,541:321-330,2017)。相反，包括轴突导向因子和丛蛋白受体或者UNC和FLTR蛋白在内的细胞粘附家族，以及这些家族的新鉴定的相互作用物诸如UNC5D或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，是显著相关的免疫冷肿瘤(图28A)。这种Teff细胞识别特征已被证明与免疫细胞中的PD-L1表达和对于治疗的更好应答相关(Mariathasan等人,Nature,554:544-548,2018)。根据这一观察，我们的分析突出显示了与CD8+Teff基因集有明确关联的相互作用蛋白，包括PD-1/PD-L1家族，充分表征的免疫受体对诸如CTLA4/CD80、CD28/CD86和CD47/SIRPA，以及新鉴定的蛋白质对诸如PD-L1/EPHA3或LILRB1结合物EDAR和IL6R(图30A)。相反，某些蛋白质群落与CD8+Teff基因呈负相关，包括轴突导向因子/丛蛋白家族中的对和推定的FLT1相互作用物TREM2和EPHB6(图30A)。
然后，我们试图通过首先评估相互作用的蛋白质对与临床结果之间的关联，研究超出Teff细胞功能的IgSF相互作用组标志。如前所述，将患者分为对阿特珠单抗有应答者和无应答者(Mariathasan等人,Nature,554:544-548,2018)。大约80种蛋白质相互作用(相互作用组网络中的约15％)与该队列的临床结果改善或恶化显著相关(图28B以及表15和16)。正如预期的那样，CD80和PD-1免疫受体家族内的相互作用与对阿特珠单抗的应答密切相关。此外，新的推定蛋白质对诸如NCR1/SIGLEC6，或LRRC4B与特定嗜乳脂蛋白成员之间的相互作用，与应答密切相关(图28B)。相反，在轴突导向因子/丛蛋白家族内的相互作用以及特异性PTPRD调节剂诸如LFRN4和IL1RAP与缺乏对治疗的应答显著相关(图28B)。接下来，我们通过比较源自它们的共同表达的“蛋白质相互作用”风险比(HR)与它们的个体基因表达的风险比，研究了相互作用基因对是否对预测的临床结果显示出协同作用。值得注意的是，代表IgSF相互作用组网络中的约25％的137种蛋白质对显示出比单一蛋白质显著夸大的风险比(图28C)。针对其观察到这一协同作用的蛋白质对包括，与对于阿特珠单抗疗法的应答性关联的SIGLEC6与NCR1、BTN3A1与LRRC4B、CD80与CTLA4、BTN3A3与LRRC4B、EFNB1与TRHDE、CTLA4与PCDHGB4、CTLA4与FAM200A、CA12与SIGLEC6、ILDR2与CLEC12B、EFNB1与ITLN1、CADM1与CRTAM、CD79B与CD244和DAG1与EFNB1；以及与缺乏对于阿特珠单抗疗法的应答性关联的EFNB1与EVC2、GPC4与FGFRL1、EFNB3与EPHB4、PTPRD与LRFN4、EFNB1与AQPEP、EFNB1与DSG4、LDLR与LILRB5、EFNB3与EPHB3、PLXNB3与SEMA4G、EFNB1与EPHB6、FLT4与FLRT2、AXL1与IL1RL1、CD320与IGSF5、CD59与STAB1、CNTN3与PTPRG、EFNB1与EPHA3、EFNB3与EPHB2、EGF与TNFRSF11B、ENPEP与SLITRK1、FCGR3B与EDA2R、IL20RA与CLEC14A、IL6R与BTNL9、IZUMO1与LILRA5、NGFR与LRRTM3、NTM与AMIGO2、PCDHB3与IGSF11、PTGFRN与TMEM59L和TREM1与VSIG8。
其中，我们观察到在肿瘤中具有充分表征的作用的蛋白质的新相互作用，例如血管内皮生长因子受体FLT1和FLT4，或细胞死亡和免疫应答的调节剂EDAR、TNFRSF11B和CD47。正如预期的那样，PD-L1家族内的相互作用与对于阿特珠单抗的应答和总存活相关(图30B和30E)。此外，许多新型受体相互作用也与对治疗的应答密切相关，如通过LRRC4B/BTN3A1/BTN3A3或NCR1/SIGLEC6蛋白对所说明的(图30C和30F以及表15和16)。
相反，蛋白质家族内诸如成纤维细胞生长因子受体(FGFR)酪氨酸激酶或LILR家族成员的相互作用，被鉴定为与缺乏应答显著相关的相互作用(图28C以及表15和16)。这种协同相互作用的一个突出示例为ephrinB1(EFNB1)，为此我们确认了Ephrin家族内的结合成员，以及新鉴定的以前不相关的相互作用物(图30D)。当对中的两种基因都被表达时，相对于以分离形式表达该基因中的每一个，多种EFNB1相互作用，包括EVC2、AQPEP和EPHB6，显示出显著更高的与无应答者的关联(图28D)。一致地，相互作用蛋白质对的表达与缺乏对于治疗的应答和不良预后显著相关，这可以通过EFNB1与Hedgehog信号传导机制蛋白EVC2之间的协同预测作用来说明(图28E和28F)。
总的来说，在大群组患者的情境中对IgSF相互作用组的研究定义了与CD8+Teff功能以及特定肿瘤免疫表型相关的基因识别标志图，为受体功能、串扰和与癌症进展的关联提供了独特的见解。此外，这些结果突出显示了与对PD-L1阻断的应答相关的蛋白质群落，并鉴定了具有改善的临床结果预测能力的相互作用基因识别标志。
实例10.CAF表达的PDPN与CRC患者不良结果的相关性
肿瘤微环境(TME)由肿瘤和非恶性细胞的混合物组成，包括非造血基质细胞类型诸如血液内皮细胞(BEC)、淋巴管内皮细胞(LEC)和癌症相关成纤维细胞(CAF)，以及造血免疫细胞。肿瘤细胞和基质建立动态串扰，在调节肿瘤生长和进展中起关键作用(Turley等人,Nat Rev Immunol,15:669-682,2015；Peranzoni等人,Cell Mol Life Sci,70:4431-4448,2013)。尽管对基质与肿瘤浸润免疫细胞之间的关系仍然知之甚少，但令人信服的证据表明基质对于抗肿瘤免疫应答和对于免疫疗法的应答性有重要影响(Turley等人,NatRev Immunol,15:669-682,2015)。成纤维细胞构成TME内基质细胞的大部分，通过细胞外基质(ECM)重塑和分泌过多的炎症因子来调节组织的结构和功能。此外，越来越多的证据表明CAF损害抗肿瘤免疫，支持肿瘤细胞的生长和传播(Turley等人,Nat Rev Immunol,15:669-682,2015；Chen等人,Nat Rev Drug Discov,18:99-115)。与这一观点一致，最近的一份报导表明，CAF为响应TGF-b而增加的转移和结直肠癌(CRC)不良结果的主要驱动因素(Calon等人,Nat Genet,47:320-329,2015)。
尽管CAF和其他基质细胞在免疫抑制和免疫疗法抗性方面发挥着新兴作用，但对CAF与肿瘤浸润免疫细胞之间的串扰负责的下游分子回路仍然知之甚少。大量报导表明，平足蛋白(PDPN、gp38、Aggrus或T1α)，一种主要由CAF和LEC表达的单跨膜(STM)受体，在肿瘤中过度表达并且与不良预后关联(Astarita等人,Nat Immunol,16:75-84,2015)。然而，PDPN在肿瘤中的功能尚不清楚，而且PDPN生物学的基本方面在很大程度上仍未得到表征。我们已经证明，在小鼠淋巴结成纤维细胞中，PDPN是肌动球蛋白收缩性的主要调节因子，并被C型凝集素受体CLEC-2(Clec1b)抑制，该受体主要在血小板和树突细胞中表达(Astarita等人,Nat Immunol,16:75-84,2015；Acton等人,Nature,514:498-502,2014)。发生炎症时，CLEC-2削弱PDPN介导的收缩性，导致淋巴结僵硬降低和免疫力增强(Astarita等人,NatImmunol,16:75-84,2015)。目前尚不清楚PDPN在人类成纤维细胞中是否具有相似的功能以赋予收缩性并介导与免疫细胞的相互作用，尤其是在实体瘤周围的独特环境中。
在这里，发现代表PDPN+CAF存在的基因识别标志与患者存活的显著降低相关，表明PDPN在人成纤维细胞中的表达可能对肿瘤进展产生重要影响。
A.由CAF表达的PDPN与人类CRC的不良结果相关
PDPN表达在包括头颈部鳞状细胞癌、胶质瘤和结肠癌在内的多种癌症中高度升高，并且与不佳的存活结果相关。这些研究主要基于免疫组织化学分析，并不总是限定PDPN的细胞来源。在考虑这一蛋白质的功能时，这一区别很重要，因为它可以由肿瘤细胞、LEC、CAF甚至一些免疫细胞表达，所有这些细胞都在TME中发挥不同的作用(Astarita等人,Front Immunol,3:283,2012；Turley等人,Nat Rev Immunol,15:669-682,2015)。最近的一份报告将PDPN+FAP+CAF中的TGFb信号传导确定为CRC患者转移的主要驱动因素(Calon等人,Nat Genet,47:320-329,2015)。
因此，为了确定RNA水平上的PDPN表达是否为CRC的重要预后因素，我们查询了来自先前发表的两项人类CRC研究的大量肿瘤基因表达和无复发存活(RFS)数据。在由II期患者组成的群组中(de Sousa等人,Cell Stem Cell,9:476-485,2011)(GSE33113，n＝85)，我们发现PDPN表达
与存活降低显著相关(图13A)。同样，在包括所有期别患者的更大CRC群组中(Marisa等人,PLoS Med,10:e1001453,2013)(GSE39582，n＝511)，PDPN表达再次与整个群组和II期患者的RFS降低显著相关(图13B和19A)。在晚期疾病中，PDPN表达对于IV期CRC患者(图19B)为高度显著风险因素，但对于III期CRC患者则不是(表10)。
B.PDPN在原代人成纤维细胞中起细胞拉张/收缩的调节剂的作用
鉴于PDPN表达与CRC存活降低之间的显著关联，我们接下来试图确定PDPN在从CRC病灶中分离的原代成纤维细胞中的功能。Pdpn-/-细胞使用Cas9-RNP-CRISPR系统在从癌性结直肠组织生长的原代人CAF中产生，其表达高内源水平的PDPN(图26A)。在将这些细胞接种到3D胶原基质中后，我们观察到Pdpn-/-CAF与WT CAF相比表现出明显的极化形态，约70％具有伸长的表型(图26B-26C)。此外，为了测试PDPN缺失是否具有其他功能性后果，我们进行了各种测定以测量生长速率、细胞产生张力的能力以及细胞粘附于表面的能力。为了测试收缩，将CAF接种到3D基质中，并使凝胶进行历时三天的收缩。与我们的假设即PDPN是成纤维细胞收缩性的主要调节剂一致，PDPN缺陷细胞的凝胶收缩能力显著受损(图26D)。最后，鉴于成纤维细胞的收缩性可以控制细胞生长和存活，我们检查了缺乏PDPN是否会影响这些细胞的生长。值得注意的是，与WT细胞相比，Pdpn-/-成纤维细胞的生长明显更慢(图26E)。总之，这些结果表明PDPN在人类细胞的肌动球蛋白收缩性中起主要作用，并以细胞自主方式促进成纤维细胞生长。
C.活化的成纤维细胞识别标志
我们接下来探询肿瘤微环境(TME)中的PDPN表达是否主要与成纤维细胞或肿瘤细胞关联。我们首先从文献和我们自己的数据(表11)中整理了一系列活化的成纤维细胞基因(活化的成纤维细胞识别标志)，并用它来推断大量肿瘤RNA-seq数据中的成纤维细胞水平。然后，我们利用已发表的基于DNA拷贝数的肿瘤含量数据(Taylor等人,Cancer Cell,33:676-689,2018)并研究了PDPN表达、推断的成纤维细胞水平和肿瘤含量之间的关联。我们发现PDPN mRNA水平与推断的活化成纤维细胞水平呈强烈正相关(图13D)，但与肿瘤含量呈负相关(图13C)，表明TME中的PDPN表达主要来自成纤维细胞。
D.FAP+成纤维细胞识别标志
接下来，我们试图在RNA-seq数据集中更精细地捕获癌症相关成纤维细胞(CAF)的存在。我们利用了来自最近一项研究的数据，该研究定义了FAP+基质细胞在驱动CRC中的作用(Calon等人,Nat Genet,47:320-329,2015)。我们对研究的四个分选的细胞群(FAP+成纤维细胞、CD31+内皮细胞、免疫细胞(CD45+细胞)和肿瘤细胞(EpCAM+细胞))进行了差异表达测试，并从仅由成纤维细胞而不是其他细胞表达的前35种基因定义了FAP+成纤维细胞识别特征(表12)。
E.活化的成纤维细胞特征和FAP+成纤维细胞识别标志与存活的关联
然后，我们研究了活化的成纤维细胞识别标志和FAP+成纤维细胞识别标志是否在人类CRC中具有预后价值。在GSE33113和GSE39582两者中，这两个识别标志都与不良的无复发存活(RFS)显著相关(图13E-13F，19C-19D)。由于GSE33113仅包括II期患者，我们随后探询GSE39582中的II期队列是否证实这些识别标志为消极预后。我们发现，这两个识别标志也与GSE39582 II期群组中的不良RFS相关(图19E-19F)。当包括在适合所有患者并同时控制分期的多变量模型中时，两个成纤维细胞识别标志仍然是RFS的重要预测因子(表10)。这些数据表明PDPN是CRC不良结果的指标，并且TME中表达PDPN的成纤维细胞有助于肿瘤生长。
实例11.对于细胞外相互作用组的表征
为了更好地理解CAF中的PDPN功能并克服最常用的受体-配体筛选方法的局限性，我们构建了一个代表大多数STM人类受体的文库，这些受体经过工程化改造以用于在细胞表面进行受控展示。此外，我们开发了一种基于四聚体的筛选方法来检测瞬时的、低亲和力的相互作用。在这里，我们利用这个新平台来研究人类PDPN的STM相互作用组，并将嗜中性粒细胞标志物CD177鉴定为新型结合配偶体。
A.用于质膜上的蛋白质受控展示和对瞬时受体-配体相互作用的增强检测的新平台
细胞外环境中的蛋白质相互作用通常以瞬时、低亲和力结合(微摩尔到毫摩尔范围内的KD)为特征，这对通过最常用的方法进行鉴定提出了挑战(Martinez-Martin,2017)。为了便于检测这种相互作用，我们开发了一种基于四聚体的方法，用于增强蛋白质多聚化和结合亲合力。首先，这一方法用于测试免疫受体PD-L1/CD274与脊髓灰质炎病毒受体PVR及其各自配体之间的相互作用。简而言之，查询蛋白PD-L1或PVR被表达为重组生物素化的胞外域，然后使用荧光链霉亲和素进行四聚化，以能够对受体-配体相互作用进行量化。接下来，测试单体或四聚体PD-L1或PVR与瞬时地表达相关结合配偶体的细胞的结合。查询蛋白的四聚化显著增强了对单体胞外域上的受体-配体相互作用的检测，包括微摩尔亲和力相互作用诸如PD-1-PD-L1(图14A和14B)。
我们首先使用半自动化转染程序测试了这一蛋白质文库在经过瞬时转染的细胞上的表达。值得注意的是，从经过细胞表面表达分析的3,500多种STM蛋白中，超过75％的STM蛋白实现了中到高的细胞表面表达水平，而只有约10％的蛋白质在质膜上没有显示可检测的表达，表明文库中的大多数受体都展示在细胞表面上并且可用于与相关结合配偶体相互作用(图14D)。
接下来，我们试图利用新开发的胞外域-gD-GPI STM蛋白集合(图14C)与基于四聚体的筛选相结合，以提高对受体-配体相互作用的高通量发现。为此，实施了一种用于自动化细胞转染和筛选的方法，然后进行高内涵成像以检测与细胞表面结合的荧光四聚体(图14E)。我们首先使用这一平台来研究细胞表面相互作用物的免疫受体B7-H3/CD276(图14F)。检测到作为相互作用物的白细胞介素-20受体亚基α(IL20-RA)，这与最近的发现一致(Husain等人,Mol Cell Proteomics,18:2310-2323,2019)。为了证明gD标签和GPI锚不影响对细胞表面蛋白质相互作用的检测，还针对在任何标签都不存在下表达为全长蛋白质的STM蛋白文库筛选了B7-H3(图14G)。与之前的结果一致，这一测定将IL20-RA鉴定为高分命中，这表明胞外域-gD-GPI文库适合于检测细胞表面上的蛋白质相互作用。
B.gD-GPI标记的人类STM受体文库
STM受体列表是使用生物信息学分析编制的，使用各种算法来预测蛋白质特征诸如蛋白质结构域和亚细胞定位，然后手动管理并审查已发表的注释。这一列表用于创建由大多数人类STM受体蛋白组成的文库(表7)。STM受体表达为与糖基磷脂酰肌醇(GPI)-糖蛋白D(gD)标签(gD-GPI)融合的细胞外结构域(ECD)以增强细胞表面的表达(图14E)。细胞外结构域(ECD)的边界如实例1B中那样注释。合成每个受体的包含其天然信号序列的ECD，并克隆到带有gD-GPI标签的框架内的pRK5载体(基因泰克公司)中。
C.四聚化的查询蛋白
将查询蛋白PDPN表达为与允许进行定点生物素化的avi标签融合的PDPN细胞外结构域(ECD)，生物素化，并使用荧光链霉亲和素进行四聚化以增加结合亲合力(图14E)。为了四聚化ECD，别藻蓝蛋白(APC)缀合的链霉亲和素作为定制小瓶从Prozyme购买，浓度通常为2mg/mL。Avi标记的、生物素化的PDPN ECD遵循NIH Tetramer Core Facility提供的方案进行四聚化。简而言之，历经10个时间间隔，添加APC缀合的链霉亲和素，以最大限度地形成四聚体而不是二聚体或三聚体。添加的链霉亲和素的量是根据PDPN和链霉亲和素试剂的分子量计算的，假设100％生物素化。在室温添加链霉亲和素，样品避光，随后将四聚体储存在冰上直至进行测定。在测定当天新鲜制备四聚体。
D.基于单克隆细胞的自动化受体发现平台
如本文2A(ii)节所述，使用细胞表面受体相互作用筛选(图14E)来筛选人类STM受体文库与PDPN的相互作用。实例8B的四聚化PDPN构建体用作查询蛋白。实例8A的gD-GPI-标记的人类STM受体文库用作猎物文库。
i.细胞转染
STM人类受体文库在COS-7细胞上表达。使用半自动化程序遵循反向转染方案用单个受体克隆物瞬时转染细胞。遵循制造商的说明并稍作修改，使用Lipofectamine LTX-Plus试剂(Life Technologies)进行转染。简而言之，将25μL的含Lipofectamine LTX-Plus混合物的Opti-MEM培养基(Thermo)分配到每孔含有6ng DNA的384孔微量滴定板中。DNA-脂质体复合物在37℃培育30分钟，随后使用自动细胞分配器将细胞(以12.5万个细胞/mL重悬在DMEM培养基中)等分到测定板中。
ii.细胞表面相互作用筛选
在转染后48小时，对PDPN结合配偶体进行细胞表面相互作用筛选。包括许多GFP标记的克隆物以控制细胞转染效率。对于与细胞表面结合的PDPN ECD的分析是使用由自动液体处理设备(板分配器和洗涤器)组成的集成机器人系统进行的，以允许对PPI进行高通量分析，同时最小化手动操作以提高数据质量。从细胞培养物中去除生长培养基，洗涤细胞并与1％牛血清白蛋白(BSA)一起培育30分钟。洗涤后，将细胞与PDPN ECD四聚体在4℃培育45分钟。在补充钙和镁的含有0.1％BSA的PBS中测定细胞表面结合。与PDPN一起培育后，洗涤细胞并用4％PFA固定，并在4℃避光储存。使用由机械臂辅助的高内涵显微镜(In Cell6000，GE Healthcare)从单个孔获取图像。细胞表面四聚体染色表示为荧光信号强度(图14E)。
iii.图像处理
将图像数据导出为tiff文件，并使用Developer Toolbox版本X软件进行处理。使用自定义分析模块分析图像，并根据阳性细胞表面染色进行分割。通常，在10-500信噪比范围内的事件可能被视为分析模块中的“命中”。设置了最少的后处理分析和排除参数，以获得所需对象的最佳轮廓，并最小化由于筛选伪影引起的任何背景信号。与细胞表面结合的PDPN表示为信噪比(图14E)。
鉴定了单个新型结合PDPN结合配偶体CD177(NB1、PRV1)(图14H)。CD177是一种GPI连接的细胞表面糖蛋白，在嗜中性粒细胞和一小部分肿瘤内调节性T细胞(Treg)中表达(Plitas等人,Immunity,45:1122-1134,2016)。
对由表达为全长蛋白质的大多数STM样受体组成的文库进行的相似筛选证实了PDPN与人类CLEC-2之间的相互作用(图20A)；CLEC-2为小鼠模型中的已知PDPN结合配偶体(Astarita等人,Nat Immunol,16:75-84,2015)。
iv.对于PDPN与CD177和CLEC-2之间的相互作用的验证
为了进一步验证PDPN与CD177和CLEC-2之间的相互作用，我们使用表面等离子体共振(SPR)测定了结合。SPR使用Proteon XPR36仪器(Biorad)或Biacore 3000(GEHealthcare)进行测量。使用胺偶合方法将纯化的蛋白质(CD177或CLEC-2，表达为重组ECD)分别固定在GLC或CM5传感器芯片上。在含有0.01％Tween-20的PBS中(使用Proteon仪器时)，或者在HBS-P缓冲液(0.01M Hepes、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20，pH 7.4)中(用于Biacore分析)，将Avidity AVITAGTM(Avi)标记的PDPN以所指示浓度作为可溶性分析物运行。通过减去参考流量响应来去除整体折射率改变。对于KD计算，固定了300-400个共振单位，并将动力学数据拟合到平衡或Langmuir模型，以分别计算CD177和CLEC-2结合的动力学参数。对于动力学计算，使用Avi标记的单体PDPN胞外域作为分析物。所有传感图均使用BiaEvaluation 4.1(Biacore)或Proteon Manager 3.1.0.6(Proteon)软件进行分析。
这些研究证实了PDPN和CD177之间的相互作用(图14I-14J)以及PDPN与CLEC-2之间的相互作用(图20B)。有趣的是，PDPN以微摩尔结合亲和力(KD＝3.3±0.7μM)与CD177相互作用，比检测到的CLEC-2亲和力(KD＝210±0.3nM)低一个数量级(图14I)，说明了我们检测一定亲和力范围的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的方法的灵敏度。
v.评估小鼠PDPN、CD177和CLEC-2之间的相互作用
我们还使用SPR来测试小鼠CD177与PDPN是否会相互作用。我们能够重现小鼠CLEC-2与PDPN的结合，但无法检测到小鼠CD177与多种格式的小鼠PDPN的任何结合(未显示)，这可能是由于小鼠和人类CD177的低序列保守性，表明这种相互作用发挥了人类免疫系统特有的相关功能。
实例12.肿瘤微环境中的PDPN、CLEC-2和CD177表达细胞
分析原代人类血液和结肠组织以确定哪些细胞类型表达PDPN和CD177。
A.血液样品
根据基因泰克献血计划从健康献血者那里获得血液样品。使用MACSExpress嗜中性粒细胞分离试剂盒(Miltenyi)从血液中分离嗜中性粒细胞。通过Ficoll(Lymphoprep)梯度离心从肝素化血液中纯化外周血单核细胞(PBMC)，然后使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi)分离T细胞。
B.CAF
原代人类结直肠癌相关成纤维细胞(CAF)购自Vitro Biopharma并在MSC-Gro低血清生长培养基(Vitro Biopharma)中生长最多5-6代。HT-29细胞购自ATCC，并在具有10％FBS的McCoy's 5a培养基中生长。所有细胞均在37℃和5％CO2下培养。
C.血液和结肠细胞中的CD177
i.CD177在血液嗜中性粒细胞中的表达
我们首先证实了所报告的CD177在血液中的嗜中性粒细胞上的表达。正如之前报告的(Bai等人,Blood,130:2092-2100,2017)，我们发现表达CD177的嗜中性粒细胞百分比在个体之间差异很大，平均约60％的嗜中性粒细胞为CD177+(图15A)。
ii.微阵列数据中的PDPN和CD177表达
我们接下来研究了GSE33113和GSE39582微阵列数据集中的PDPN和CD177的RNA表达。PDPN的表达在肿瘤组织中显著高于在正常组织中，并且在肿瘤中，CD177的表达远低于PDPN的表达(图22A-22B)。
iii.PDPN和CD177在细胞区室中的表达
我们接下来检查了PDPN和CD177在来自健康个体和结直肠癌(CRC)患者的人类血液和结肠组织中的表达模式。与TCGA数据集中的正常组织相比，PDPN和CD177的RNA表达在肿瘤中显著更高(图22A和22B)。在图13A-13F中检查的两个数据集中，CD177和PDPN被表达，但在大量肿瘤RNA数据中无法辨别RNA的细胞来源(图22C和22D)。因此，为了在蛋白质水平上研究表达和细胞分布，使用消化方案将新鲜的人体组织消化成单细胞悬液，该方案允许所有细胞类型(包含基质细胞和免疫细胞)以良好的活力得到良好恢复。进行荧光活化细胞分选(FACS)，并如图15B所示对样品设门。
我们发现正常的邻近结肠组织含有相对较少的嗜中性粒细胞，而肿瘤具有大量的嗜中性粒细胞流入(图15B-15C)。与在血液中一样，肿瘤嗜中性粒细胞表达不同数量的CD177，但就个体而言，CD177+嗜中性粒细胞的比率在血液和肿瘤之间是相似的(图15D-15E)。有趣的是，相对于邻近的正常组织，CD177+嗜中性粒细胞在肿瘤中略有富集(图15D-15E)。
正如之前报告的(Plitas等人,Immunity,45:1122-1134,2016)，我们还观察到一小部分肿瘤Treg表达CD177，而CD177在非肿瘤组织、血液或扁桃体中的Treg上极少被观察到(数据未显示)。这些CD177+Treg比CD177+嗜中性粒细胞少得多。
然后我们检查了非造血基质区室。门被选择为包括实时事件(如不存在7-AAD染色所示)、单线态、CD45-(即不是免疫细胞)和EpCAM-(即不是肿瘤细胞)(图15F)。我们发现，大约40％的定义为总CD31-基质的癌症相关成纤维细胞(CAF)为PDPN+(图15G)。虽然PDPN也由一些淋巴管内皮细胞(LEC)和一小部分巨噬细胞表达，但在CAF上的以每个细胞为基准的PDPN水平显著更高(图15H)，表明在肿瘤微环境(TME)中，它们是PDPN的主要来源。这一发现证实了从我们的生物信息学分析中得出的结论(图13D)。此外，CAF上的PDPN染色比来自邻近的正常组织的成纤维细胞上的染色高6倍，并且更高百分比的细胞为PDPN+(图15I-15J)。
我们还使用上述方法检查了憩室炎(一种炎性病症)患者结肠样品中的成纤维细胞。有趣的是，相对于邻近肿瘤的正常组织，这些组织中的成纤维细胞也上调了PDPN(图15I-15J)。这一发现与之前的观察结果一致，即PDPN可以被各种炎性刺激物诸如TGF-β和IL-6上调(Astarita等人,Front Immunol,3:283,2012)。
总体而言，这些数据证实CAF是肿瘤组织中PDPN的主要来源，并表明PDPN+CAF和CD177+嗜中性粒细胞都在结肠肿瘤组织中富集。
D.PDPN和CD177的IHC和免疫荧光定位
为了检查PDPN+和CD177+细胞在TME内的定位，我们对来自CRC肿瘤(CRC结肠)和正常邻近组织(副结肠)的人类结肠组织中的PDPN和CD177进行了双重免疫组织化学(IHC)和免疫荧光染色。在正常组织中，PDPN染色主要限于淋巴管，并且观察到很少的嗜中性粒细胞(图16A、23A和23C)。相比之下，在肿瘤样品中，PDPN在周围肿瘤基质中的CAF中被强烈上调(图16B-16C和23B)，而在肿瘤细胞上很少观察到。PDPN+成纤维细胞通常是对齐的，在肿瘤床之间形成大片的基质(图16B-16C)。这些纤维往往与肿瘤床平行。总体而言，虽然只有约20％的正常结肠细胞展示出一些PDPN染色，但超过60％的肿瘤样品展示出PDPN染色(图16E)。与髓过氧化物酶(MPO)共染色证实，大多数CD177+细胞为嗜中性粒细胞(图16D和23D)；这一数据与FACS分析相结合，揭示了大多数CD177信号来自嗜中性粒细胞。与PDPN+细胞相似并且与我们的组织分析(图15D)一致，肿瘤样品中CD177+嗜中性粒细胞的量也大大增加，超过60％的肿瘤样品表现出CD177+染色(图16E)。在瘤周基质中鉴定了一些CD177+细胞，在那里它们与PDPN+细胞密切地相互作用(图16B-16C)；然而，大多数PDPN+细胞不与CD177+细胞接触，因为它们稀疏地定位在整个肿瘤微环境中。总的来说，这些结果表明，表达CD177的嗜中性粒细胞可以与CRC组织中表达PDPN的CAF相互作用，表明这种新发现的分子相互作用可能会影响CAF的功能。
实例13.PDPN、CLEC-2和CD177之间相互作用的功能效应
我们接下来研究了PDPN与CD177之间以及PDPN与CLEC-2之间相互作用对CAF中肌动球蛋白收缩性的功能效应。我们进行了如实例10B中所述的3D伸长实验。将100nM的重组CLEC-2或CD177添加到培养基中。这些实验表明CLEC-2和CD177都引起了CAF的伸长(图17A-17B)。
为了测试当CD177和CLEC-2在细胞上内源性表达时是否发生观察到的效应，我们进行了相似的测定，其中CAF与原代嗜中性粒细胞(CD177+CLEC-2+)或T细胞(CD177-CLEC2-)共培养。将CAF与从血液中分离出的嗜中性粒细胞(neut)或T细胞以5:1的比率接种。我们观察到嗜中性粒细胞导致CAF延长的程度与重组蛋白相似，而T细胞则不然(图17C)。
为了确认这一表型是否在多种类型的成纤维细胞中都是真实的，我们用来自健康结肠、膀胱和卵巢组织的原代人类成纤维细胞重复了这个实验。我们仅在表达PDPN的两种成纤维细胞即结肠和膀胱成纤维细胞中观察到伸长率增加(图17D-17E)。这些结果表明CLEC-2和CD177通过PDPN作用于质膜以调节成纤维细胞的伸长。
我们接下来测试了CLEC-2和CD177是否也抑制CAF收缩性。两种蛋白质都将收缩性抑制了约50％(图17F)。
实例14.磷酸化蛋白质组学分析
接下来，我们试图研究CD177在从CRC组织分离的原代人类CAF中调节PDPN功能的根本机制，这些CAF表达高内源性水平的PDPN。首先，我们分析了CAF转录谱在使用CLEC-2和CD177刺激后的改变。没有观察到CAF转录组的显著改变(数据未显示)，表明PDPN靶向可能对CAF蛋白质组产生更快速、更短暂的影响。因此，为了全面调查由CD177和CLEC-2调节的信号传导途径和效应蛋白，我们使用深度多重蛋白质组学方法对蛋白质组和磷酸蛋白质组进行了全局定量。
简而言之，用重组CD177或CLEC-2蛋白刺激CAF 2分钟和30分钟，并将所得全细胞提取物使用液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)进行全局磷酸化分析(图18A)。我们利用了一种蛋白质组学分析方法，所述方法结合了蛋白质组级分的10重串联质量标签(TMT)标记以用于在所有条件下对磷酸肽进行相对定量，并通过强阳离子交换分级分离和TiO2磷酸肽富集进行深度磷酸化蛋白质组学分析。还进行了全局蛋白质组分析以评估蛋白质丰度，然后进行计算数据处理以将总蛋白质和磷酸化位点定量，最后对处理组之间的相对差异进行统计测试(Beausoleil等人,Nat Biotechnol,24:1285-1292,2006)。重要的是，这种方法证明CD177或CLEC-2刺激在2分钟或30分钟时没有显著改变总蛋白质的水平，因此我们得出结论，观察到的差异磷酸化事件可以专门归因于信号传导改变，共同使得能够对近3,000(～70％)个量化的磷酸化位点的全局蛋白质水平进行评估(图18G和24A)。与刺激2分钟相比，刺激30分钟后，全局磷酸化蛋白质组的改变更为显著(图18B和24F)。在2分钟时，30种蛋白质被CD177或CLEC-2显著修饰(图18C)，而大约300个磷酸位点(对应于226种蛋白质)在用PDPN结合剂刺激30分钟后被显著调节(图18D)。
为了对PDPN参与调节的途径进行功能分类，分析了受CD177或CLEC-2显著调节的磷蛋白，以在基因本体论(GO)层面进行富集。这些结果突出显示了PDPN在细胞骨架重排、细胞运动、细胞外基质沉积和分泌途径中的主要作用，与我们实验室和其他人的之前数据一致(Astarita等人,Nat Immunol,16:75-84,2015；Acton等人,Nature,514:498-502,2014；Martinez等人,Cell Rep,29:2810-2822e2815,2019)(图18E和24A)。微管功能、细胞骨架组织和转运过程的重要调节剂在PDPN靶向时受到实质性调节，包括网蛋白(PLEC)、微管相关蛋白MAP1S或MAP4、鸟嘌呤核苷酸交换因子GBF1和RGH10或者普列克底物蛋白(pleckstrin)同源性样结构域家族B成员1和2(PHLB1和PHLB2)等(图18F)。此外，有趣的是，这些数据还表明了细胞生长和分化的突出改变，以及与细胞应激和对外源性刺激的应答相关的代谢过程，这些是与CAF生物学相关的生物学过程，之前从未与PDPN关联(图18E)。这些过程的几种关键调节剂在CLEC-2和CD177刺激下发生显著的翻译后修饰，包括许多转录调节剂和RNA结合分子诸如MED1、WWTR1/TAZ、LARP1和NCBP1(图18F)。
这种对于磷酸化蛋白质组的全局评估支持PDPN信号传导在改变CAF细胞形态和细胞骨架重排以及之前未被重视的过程(诸如细胞生长)中的关键作用。此外，这些数据表明，CLEC-2或CD177的结合可以深刻地将PDPN信号传导改变到CAF中，表明免疫细胞与CAF的相互作用可以以之前未被重视的方式改变TME。
A.磷酸化蛋白质组学方法
i.蛋白质组学样品制备
CAF在15cm培养皿上生长至约70％的汇合度。测定当天，细胞饥饿2小时，然后用重组CLEC-2或CD177刺激2或30分钟(表13)。在37℃在无血清培养基中进行刺激。刺激后，用冰冷的PBS洗涤细胞，随后在20mM HEPES pH 8.0、含有1mM原钒酸钠的9M尿素、2.5mM焦磷酸钠和1mMβ-甘油磷酸中收获并裂解。分析了来自5个条件的裂解物。它们是：未处理、CLEC-2处理2分钟和30分钟，以及CD177处理2分钟和30分钟。进行每个5重实验的两个生物学重复，并组合以进行10重实验。使用Misonix Microson XL超声仪对样品进行超声处理，然后在15℃以20,000g离心20分钟。使用Bradford测定法(BioRad)测量蛋白质浓度。蛋白质(1mg/条件)在37℃用5mM二硫苏糖醇(DTT)还原1小时，然后在室温用15mM碘乙酰胺(IAA)在黑暗中烷基化20分钟。将样品稀释至2M尿素的最终浓度，之后用Lys-C(Wako，日本)以酶：底物比率(E:S)为1:50在37℃消化4小时，然后进行胰蛋白酶(Promega)消化，即以1:50的E:S比率在37℃消化过夜。用20％三氟乙酸(TFA)酸化肽溶液，之后使用来自Waters的C18柱(50mg吸收剂)进行固相萃取。用2x0.5mL 40％乙腈(ACN)/0.1％TFA洗脱肽，然后使用定量比色肽测定试剂盒(Thermo)测量肽浓度。对每种条件等量进行冻干过夜。
ii.TMT标记
肽混合物在1000μL HEPES(200mM，pH 8.5)+300μL ACN中复溶，然后将100μL TMT试剂添加到十个样品的每一个中(每小瓶TMT试剂(Thermo)溶解在40μL ACN中)。标记在室温进行1.5小时。将每种条件下的一小部分(2μL)混合、脱盐并进行分析，以确定每个样品中的标记效率以及相对蛋白质丰度。一旦确定标记效率至少为95％，就用100μL 5％羟胺猝灭反应。将样品以等量混合，然后使用20％TFA酸化并冻干过夜。使用来自Waters的C18小柱(200mg吸收剂)对10重TMT标记的肽混合物进行脱盐。样品用3x1mL的60％ACN/0.1％TFA洗脱。少量(～0.5mg)被保存用于总蛋白质谱分析，～6.5mg用于全局磷酸化分析。
iii.全局磷酸化和全局蛋白质分析
在HP1100 HPLC系统(安捷伦科技公司)上使用PolySulfoethyl 4.6mm ID x200mm、5μm、
Figure BDA0003282058310001671
色谱柱(The Nest Group)以1mL/min的流速进行强阳离子交换(SCX)分级分离。收集16个分级分离物，然后脱盐，然后使用TiO2富集Phos-TiO试剂盒(GLSciences)富集磷酸肽。对于蛋白质谱分析，样品经过高pH值反相分级分离，其中收集了96个分级分离物并合并为24个分级分离物。在质谱分析之前，样品用C18 stagetip脱盐。
iv.质谱分析
将脱盐的肽在2％ACN/0.1％甲酸(FA)/水中复溶，使用NanoAcquity UPLC系统(Waters)以0.7μL/min流速加载到C18柱(1.7μm BEH，
Figure BDA0003282058310001681
Figure BDA0003282058310001682
0.1x250mm，New Objective)上。应用历时155分钟的0.5μL/min的2％至30％溶剂B(0.1％FA/2％水/ACN)的梯度，总分析时间为180分钟以分离肽。使用Orbitrap Fusion Lumos仪器(Thermo)分析肽。在Orbitrap中分析前体离子(MS1)(AGC靶标1E6，120,000质量分辨率，50ms最大进样时间)，并且
选择了10个最丰富的物质进行裂解(MS2)。根据电荷状态≥2(z＝2、3&4-6)过滤离子，并启用单同位素峰分配和动态排除(45s±10ppm)。每个前体以0.5Th的质量宽度分离，然后使用碰撞诱导解离(CID在35NCE)进行裂解，MS2 AGC靶标设置为2.0E4，最大进样时间为200ms。使用同步前体选择(SPS)分离多个碎片离子，之后进行HCD(55NCE，SPS槽口＝8，AGC靶标＝2.0E5，最大进样时间为150ms)MS3裂解和Orbitrap分析(分辨率为50,000)。对于全局磷酸化分析，指定了79.97Da的中性丢失来活化多阶段活化，从而更好地识别经过磷酸化的物质。此外，MS3的最大进样时间设置为350ms。
v.质谱数据分析
使用Mascot搜索算法(Matrix Sciences)针对由智人蛋白质和常见污染物序列组成的串联正向-反向靶标-诱饵数据库(2016年6月从UniProt下载)搜索MS/MS数据。使用50ppm的前体质量容差和0.8Da的碎片离子容差来分配光谱。静态修饰包括位于肽的N端和赖氨酸残基两者上的氨基甲酰甲基半胱氨酸(+57.0215Da)、TMT(229.1629Da)。可变修饰包括氧化的蛋氨酸(+15.994Da)以及用于磷酸化分析的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上的磷酸化作用(+79.9663Da)。指定了具有多达3个漏切位点的胰蛋白酶特异性。以5％的错误发现率(FDR)过滤肽谱匹配，然后以2％的FDR过滤蛋白质。对于经过磷酸化的物质，应用AScore算法来确定确切的磷酸化位点定位16。MS3 TMT量化是使用Mojave模块进行的，过滤掉MS3扫描中所有10个通道中总和小于30,000的TMT峰。通过对来自所有PSM的每个样品的TMT信号求和来量化每个肽。最后，过滤掉短于7个残基的肽。
vi.质谱统计分析
对于全局磷酸化蛋白质组学测定，所有覆盖一个或多个相同磷酸化位点的胰蛋白酶磷酸化肽都归入单一的磷酸化位点组标识符下，包括覆盖不止一个磷酸化位点的组。然后，对于每个磷酸化位点组(或全局蛋白质组分析中的蛋白质)，在MSstats v3.7.137中使用Tukey中值抛光汇总(Tukey Median Polish summary)对跨重复的所有量化的肽进行拟合，并对低于审查阈值28的缺失值进行插补。在MSstats中，针对所有比较的治疗组，计算模型估计的倍数改变和统计显著性。通过设置|Log2(倍数改变)|>1且p值<0.05的阈值来确定显著改变的磷酸化位点组。然后，在每组比较中，使用GoStats包对显著改变的磷酸化位点组的所有子集进行注释并测试过度代表的生物注释(基因本体论、PFAM和KEGG)(Falcon和Gentleman,2007)。重要注释由q值<0.05、组大小>2和基因组出现<1000阈值定义。然后将重要的术语进一步手动分组到简化的、非冗余的生物过程术语类别中，并使用Fisher精确检验测试过度代表性。
实例15.PDPN+CAF受CD177约束对于肿瘤生长的促进作用
鉴于我们的研究结果显示PDPN控制CAF生长和肌动球蛋白收缩性，以及PDPN在CRC患者中的预后意义，我们接下来决定评估CRC CAF是否可以直接支持肿瘤生长。生成表达红色荧光蛋白的SW480肿瘤细胞系，以能够进行对于肿瘤类器官生长的量化。肿瘤细胞单独生长或与WT或PDPN缺陷的CAF共培养，并评估CAF促进肿瘤类器官生长的能力。与单独生长的肿瘤细胞相比，WT CAF显著增强了肿瘤生长。值得注意的是，Pdpn-/-CAF在支持类器官生长方面明显更差，这表明PDPN信号传导在维持CAF的肿瘤支持功能方面发挥核心作用(图27A和27B)。接下来，鉴于CLEC-2和CD177显著影响CAF的形态和收缩性，我们试图评估CD177或CLEC-2是否会影响CAF支持肿瘤类器官生长的能力。为此，用CD177和CLEC-2刺激肿瘤细胞和CAF共培养物以模拟CAF与免疫细胞之间的相互作用。在培养物中评估肿瘤类器官的生长17天。值得注意的是，在CD177或CLEC-2刺激下，由PDPN+CAF引起的生长增加显著降低，表明这些分子抑制PDPN功能，从而限制了CAF的促肿瘤发生潜力(图27C和27D)。
A.肿瘤类器官培养方法
为了产生3D类器官培养物，将2,000个稳定地表达红色荧光蛋白(RFP)的SW-480肿瘤细胞与或不与100,000WT或Pdpn-/-CAF一起接种在100μL的
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基质(
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356231)中。如前所述制备肿瘤类器官(Dominguez等人,Cancer Discov,10:232-253,2019)。简而言之，将混合物接种在以100μL
Figure BDA0003282058310001703
包被的24孔玻璃底板中，以防止细胞附着在盖玻片上。接下来，在凝胶聚合后，将2mL肿瘤细胞生长培养基添加到培养物顶部，并监测培养物12-17天。对于CLEC-2和CD177处理，将150nM的四聚化CLEC-2或CD177(作为包含与链霉亲和素缀合的CD177或CLEC-2的生物素化胞外结构域的四聚体而提供)在铺板前直接添加到
Figure BDA0003282058310001704
-细胞混合物中。此外，在将类器官铺板后，向培养基中添加150nM的每种四聚体，并且每72小时重复添加四聚体，直到第15天。使用
Figure BDA0003282058310001705
4XPlan Fluor物镜(NA：0.13)在具有自动载物台的
Figure BDA0003282058310001706
Ti-E倒置显微镜(AppliedScientific Instrumentation)上每4天对板成像一次。图像记录在四甲基罗丹明(TRITC)和明场通道中，用扩展聚焦深度模块(EDF，
Figure BDA0003282058310001707
)将代表肿瘤类器官的球体缝合并聚焦在单个最大图像投影上。在
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(vR2018a，
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)中分析每个图像的肿瘤类器官的总面积。
表1.诱饵蛋白
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表2.猎物蛋白。
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表3.预测相互作用的蛋白质
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表4.IgSF查询物
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表5.用于IgSF实验的STM文库
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表6.预测的IgSF相互作用组
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表7.用于PDPN实验的标记STM文库
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表8.用于PDPN实验的未标记STM文库
Figure BDA0003282058310004212
Figure BDA0003282058310004221
Figure BDA0003282058310004231
Figure BDA0003282058310004241
Figure BDA0003282058310004251
Figure BDA0003282058310004261
Figure BDA0003282058310004271
Figure BDA0003282058310004281
Figure BDA0003282058310004291
Figure BDA0003282058310004301
Figure BDA0003282058310004311
Figure BDA0003282058310004321
Figure BDA0003282058310004331
Figure BDA0003282058310004341
Figure BDA0003282058310004351
Figure BDA0003282058310004361
Figure BDA0003282058310004371
Figure BDA0003282058310004381
Figure BDA0003282058310004391
Figure BDA0003282058310004401
Figure BDA0003282058310004411
Figure BDA0003282058310004421
Figure BDA0003282058310004431
Figure BDA0003282058310004441
Figure BDA0003282058310004451
Figure BDA0003282058310004461
Figure BDA0003282058310004471
Figure BDA0003282058310004481
Figure BDA0003282058310004491
Figure BDA0003282058310004501
Figure BDA0003282058310004511
Figure BDA0003282058310004521
Figure BDA0003282058310004531
Figure BDA0003282058310004541
Figure BDA0003282058310004551
Figure BDA0003282058310004561
Figure BDA0003282058310004571
Figure BDA0003282058310004581
Figure BDA0003282058310004591
Figure BDA0003282058310004601
Figure BDA0003282058310004611
Figure BDA0003282058310004621
Figure BDA0003282058310004631
Figure BDA0003282058310004641
Figure BDA0003282058310004651
表9.PTPRD突变体
Figure BDA0003282058310004652
Figure BDA0003282058310004661
Figure BDA0003282058310004671
Figure BDA0003282058310004681
Figure BDA0003282058310004691
Figure BDA0003282058310004701
Figure BDA0003282058310004711
Figure BDA0003282058310004721
Figure BDA0003282058310004731
Figure BDA0003282058310004741
Figure BDA0003282058310004751
Figure BDA0003282058310004761
表10.CRC患者数据存活分析的Cox比例风险
Figure BDA0003282058310004762
Figure BDA0003282058310004771
Figure BDA0003282058310004781
^p<0.1，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001
表11.活化的成纤维细胞识别标志中的基因
基因符号 EntrezID
ACTA2 59
CALD1 800
CDH11 1009
FAP 2191
LRRC15 131578
PDPN 10630
POSTN 10631
S100A4 6275
表12.FAP+成纤维细胞识别标志中的基因和跨分选细胞类型的表达水平
Figure BDA0003282058310004782
Figure BDA0003282058310004791
Figure BDA0003282058310004801
平均表达截止值如下：FAP+>5，EpCAM+<3，CD31+<3，CD45+<3。
表13.磷酸化蛋白质组学测定的参数
Figure BDA0003282058310004802
Figure BDA0003282058310004811
表14.IgSF预测训练集
Figure BDA0003282058310004812
Figure BDA0003282058310004821
Figure BDA0003282058310004831
Figure BDA0003282058310004841
(*)针对这个猎物筛选的所有查询物
表15.预测对于阿特珠单抗的应答性的基因对
Figure BDA0003282058310004842
Figure BDA0003282058310004851
Figure BDA0003282058310004861
Figure BDA0003282058310004871
Figure BDA0003282058310004881
Figure BDA0003282058310004891
Figure BDA0003282058310004901
Figure BDA0003282058310004911
表16.预测缺乏对于阿特珠单抗的应答性的基因对
Figure BDA0003282058310004912
Figure BDA0003282058310004921
Figure BDA0003282058310004931
Figure BDA0003282058310004941
Figure BDA0003282058310004951
Figure BDA0003282058310004961
Figure BDA0003282058310004971
Figure BDA0003282058310004981
Figure BDA0003282058310004991
Figure BDA0003282058310005001
Figure BDA0003282058310005011
Figure BDA0003282058310005021
表17.来自标记STM文库的基因子集，用于PDPN实验
Figure BDA0003282058310005022
Figure BDA0003282058310005031
Figure BDA0003282058310005041
尽管为了清楚理解的目的既往已经通过说明和实例相当详细地描述了发明，但是所述说明和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容的全部内容以引用方式明确地并入。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 细胞表面蛋白质相互作用的调节剂及
其相关方法和组合物
<130> 50474-182WO3
<150> US 63/000,466
<151> 2020-03-26
<150> US 62/826,904
<151> 2019-03-29
<160> 33
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa 为 Asp 或 Gly
<400> 5
Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa 为 Ser 或 Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa 为 Thr 或 Ser
<400> 6
Ala Trp Ile Xaa Pro Tyr Gly Gly Ser Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
1 5 10
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa 为 Asp 或 Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa 为 Val 或 Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 为 Ser 或 Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa 为 Ala 或 Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa 为 Val 或 Leu
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa 为 Phe 或 Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa 为 Tyr 或 Ala
<400> 13
Ser Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa 为 Tyr、Gly、Phe 或 Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa 为 Leu、Tyr、Phe 或 Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa 为 Tyr、Asn、Ala、Thr、Gly、Phe 或 Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa 为 His、Val、Pro、Thr 或 Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xa 为 Ala、Trp、Arg、Pro 或 Thr
<400> 14
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 25
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 27
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
1 5 10 15
<210> 30
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 32
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp Glu Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Asn Gly
20 25 30
Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Thr Ile Asn Lys Asp Ala Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Pro Ser Ser Thr Lys Val Asp Leu Lys Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Ile
85 90 95
Ala Phe Lys Thr Gly Thr Ser Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ile Gly Gly Lys Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Asp Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Arg
100 105 110

Claims (261)

1.一种鉴定可受益于包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包括确定来自所述个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的所述基因对的所述第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的所述基因对的所述第二成员的表达水平将所述个体鉴定为可受益于包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗的个体。
2.一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包括确定来自所述个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的所述基因对的所述第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的所述基因对的所述第二成员的表达水平将所述个体鉴定为可受益于包含PD-L1轴结合拮抗剂的治疗的个体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述个体具有高于第一参考表达水平的所述基因对的所述第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的所述基因对的所述第二成员的表达水平，并且所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的PD-L1轴结合拮抗剂。
4.一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括：
(a)确定来自所述个体的样品中的表15的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中所述基因对的所述第一成员的所述表达水平高于第一参考表达水平，并且所述基因对的所述第二成员的所述表达水平高于第二参考表达水平；以及
(b)向所述个体施用有效量的PD-L1轴结合拮抗剂。
5.一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向个体施用PD-L1轴结合拮抗剂，所述个体已经被确定为具有高于第一参考表达水平的表15的基因对的第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的所述基因对的第二成员的表达水平。
6.一种鉴定可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包括确定来自所述个体的样品中的表16的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的所述基因对的所述第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的所述基因对的所述第二成员的表达水平将所述个体鉴定为可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的个体。
7.一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包括确定来自所述个体的样品中的表16的基因对中的至少一对的第一成员和第二成员的表达水平，其中高于第一参考表达水平的所述基因对的所述第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的所述基因对的所述第二成员的表达水平将所述个体鉴定为可受益于不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗或除了PD-L1轴结合拮抗剂还可受益于别的治疗的个体。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述个体具有高于第一参考表达水平的所述基因对的所述第一成员的表达水平和高于第二参考表达水平的所述基因对的所述第二成员的表达水平，并且所述方法包括向所述个体施用有效量的不同于PD-L1轴结合拮抗剂的治疗、或PD-L1轴结合拮抗剂加上别的治疗。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一参考表达水平为预先指定的表达水平，并且所述第二参考表达水平为预先指定的参考表达水平。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中来自所述个体的所述样品是在施用抗癌疗法之前从所述个体获得的。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中来自所述个体的所述样品是在施用抗癌疗法之后从所述个体获得的。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中来自所述个体的所述样品为肿瘤组织样品或肿瘤液体样品。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述样品为福尔马林固定和石蜡包埋的(FFPE)样品、存档的样品、新鲜的样品或冷冻的样品。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤组织样品为FFPE样品。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中：
(a)所述样品中的所述基因对的所述第一成员和所述第二成员的所述表达水平为蛋白质表达水平；或者
(b)所述样品中的所述基因对的所述第一成员和所述第二成员的所述表达水平为mRNA表达水平。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述样品中的所述基因对的所述第一成员和所述第二成员的所述表达水平分别为所述基因对的所述第一成员和所述第二成员的mRNA表达水平。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员和所述第二成员的所述mRNA表达水平通过原位杂交(ISH)、RNA-seq、RT-qPCR、qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、FISH或其组合进行确定。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述第一参考表达水平为介于约0.25至约0.5个计数每百万读段(CPM)之间，并且所述第二参考表达水平为介于约0.25至约0.5CPM之间。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一参考表达水平为0.25CPM，并且所述第二参考表达水平为0.25CPM。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述第一参考表达水平和所述第二参考表达水平分别为患有癌症的个体的参考群体中的所述基因对的所述第一成员和所述第二成员的表达水平。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述癌症为泌尿道癌症。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述泌尿道癌症为泌尿道癌。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述泌尿道癌为局部晚期尿路上皮癌。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述泌尿道癌为转移性尿路上皮癌(mUC)。
25.根据权利要求1-3和6-24中任一项所述的方法，其中所述益处包括，与不使用所述PD-L1轴结合拮抗剂的治疗相比，所述个体的总存活期(OS)延长。
26.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为SIGLEC6，并且所述基因对的所述第二成员为NCR1。
27.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为BTN3A1，并且所述基因对的所述第二成员为LRRC4B。
28.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为CD80，并且所述基因对的所述第二成员为CTLA4。
29.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为BTN3A3，并且所述基因对的所述第二成员为LRRC4B。
30.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB1，并且所述基因对的所述第二成员为TRHDE。
31.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为CTLA4，并且所述基因对的所述第二成员为PCDHGB4。
32.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为CTLA4，并且所述基因对的所述第二成员为FAM200A。
33.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为CA12，并且所述基因对的所述第二成员为SIGLEC6。
34.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为ILDR2，并且所述基因对的所述第二成员为CLEC12B。
35.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB1，并且所述基因对的所述第二成员为ITLN1。
36.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为CADM1，并且所述基因对的所述第二成员为CRTAM。
37.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为CD79B，并且所述基因对的所述第二成员为CD244。
38.根据权利要求1-5和9-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为DAG1，并且所述基因对的所述第二成员为EFNB1。
39.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB1，并且所述基因对的所述第二成员为EVC2。
40.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为GPC4，并且所述基因对的所述第二成员为FGFRL1。
41.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB3，并且所述基因对的所述第二成员为EPHB4。
42.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为PTPRD，并且所述基因对的所述第二成员为LRFN4。
43.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB1，并且所述基因对的所述第二成员为AQPEP。
44.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB1，并且所述基因对的所述第二成员为DSG4。
45.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为LDLR，并且所述基因对的所述第二成员为LILRB5。
46.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB3，并且所述基因对的所述第二成员为EPHB3。
47.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为PLXNB3，并且所述基因对的所述第二成员为SEMA4G。
48.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB1，并且所述基因对的所述第二成员为EPHB6。
49.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为FLT4，并且所述基因对的所述第二成员为FLRT2。
50.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为AXL1，并且所述基因对的所述第二成员为IL1RL1。
51.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为CD320，并且所述基因对的所述第二成员为IGSF5。
52.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为CD59，并且所述基因对的所述第二成员为STAB1。
53.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为CNTN3，并且所述基因对的所述第二成员为PTPRG。
54.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB1，并且所述基因对的所述第二成员为EPHA3。
55.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EFNB3，并且所述基因对的所述第二成员为EPHB2。
56.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为EGF，并且所述基因对的所述第二成员为TNFRSF11B。
57.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为ENPEP，并且所述基因对的所述第二成员为SLITRK1。
58.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为FCGR3B，并且所述基因对的所述第二成员为EDA2R。
59.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为IL20RA，并且所述基因对的所述第二成员为CLEC14A。
60.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为IL6R，并且所述基因对的所述第二成员为BTNL9。
61.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为IZUMO1，并且所述基因对的所述第二成员为LILRA5。
62.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为NGFR，并且所述基因对的所述第二成员为LRRTM3。
63.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为NTM，并且所述基因对的所述第二成员为AMIGO2。
64.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为PCDHB3，并且所述基因对的所述第二成员为IGSF11。
65.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为PTGFRN，并且所述基因对的所述第二成员为TMEM59L。
66.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述基因对的所述第一成员为TREM1，并且所述基因对的所述第二成员为VSIG8。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述PD-L1轴结合拮抗剂选自由PD-L1结合拮抗剂、PD-1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂组成的组。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述PD-L1轴结合拮抗剂为PD-L1结合拮抗剂。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与其配体结合配偶体中的一个或多个的结合。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。
71.根据权利要求68所述的方法，其中所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。
72.根据权利要求68所述的方法，其中所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和B7-1两者的结合。
73.根据权利要求68-72中任一项所述的方法，其中所述PD-L1结合拮抗剂为抗体或其抗原结合片段。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述抗体选自由以下项组成的组：阿特珠单抗、MDX-1105、MEDI4736(德瓦鲁单抗)和MSB0010718C(阿维单抗)。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含以下高变区：
(a)GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19)的HVR-H1序列；
(b)AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)的HVR-H2序列；
(c)RHWPGGFDY(SEQ ID NO:21)的HVR-H3序列；
(d)RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22)的HVR-L1序列；
(e)SASFLYS(SEQ ID NO:23)的HVR-L2序列；和
(f)QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)的HVR-L3序列。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含：
(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含：
(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含：
(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列；
(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含：
(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；
(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含：
(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；
(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含：
(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；
(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含：
(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和
(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体为阿特珠单抗(MPDL3280A)。
84.根据权利要求67所述的方法，其中所述PD-L1轴结合拮抗剂为PD-1结合拮抗剂。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合配偶体中的一个或多个的结合。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和PD-L2两者的结合。
89.根据权利要求85-88中任一项所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂为抗体或其抗原结合片段。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述抗体选自由以下项组成的组：MDX 1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810和BGB-108。
91.根据权利要求85-88中任一项所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂为Fc融合蛋白。
92.一种治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的CD177活性激动剂。
93.一种鉴定可受益于包括CD177活性激动剂的治疗的患有癌症的个体的方法，所述方法包括确定来自所述个体的样品中的平足蛋白(PDPN)的表达水平，其中高于参考PDPN表达水平的所述样品中的PDPN表达水平将所述个体鉴定为可受益于包括CD177活性激动剂的治疗的个体。
94.一种为患有癌症的个体选择疗法的方法，所述方法包括确定来自所述个体的样品中的PDPN表达水平，其中高于参考PDPN表达水平的所述样品中的PDPN表达水平将所述个体鉴定为可受益于包括CD177活性激动剂的治疗的个体。
95.根据权利要求93或94所述的方法，其中所述个体具有高于参考PDPN表达水平的所述样品中的PDPN表达水平，并且所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的CD177活性激动剂。
96.一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括：
(a)确定来自所述个体的样品中的PDPN表达水平，其中所述样品中的所述PDPN表达水平高于参考PDPN表达水平；以及
(b)向所述个体施用有效量的CD177活性激动剂。
97.一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的CD177活性激动剂，其中来自所述个体的所述样品中的所述PDPN表达水平已经被确定为高于参考PDPN表达水平。
98.根据权利要求92-97中任一项所述的方法，其中所述CD177活性为对于PDPN的抑制。
99.根据权利要求93-98中任一项所述的方法，其中来自所述个体的所述样品为肿瘤组织样品或肿瘤液体样品。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述肿瘤组织样品为福尔马林固定和石蜡包埋的(FFPE)样品、存档的样品、新鲜的样品或冷冻的样品。
101.根据权利要求93-100中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述PDPN表达水平为PDPN的蛋白质表达水平或PDPN的RNA表达水平。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述样品中的所述PDPN表达水平为PDPN的RNA表达水平。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述PDPN的RNA表达水平通过原位杂交(ISH)、RNA-seq、RT-qPCR、qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、FISH或其组合进行确定。
104.根据权利要求93-103中任一项所述的方法，其中所述参考PDPN表达水平为患有癌症的个体的群体中的PDPN表达水平。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述癌症为结直肠癌(CRC)、头颈部鳞状细胞癌或胶质瘤。
106.根据权利要求104或105所述的方法，其中所述参考PDPN表达水平为所述群体中表达水平的第50百分位。
107.根据权利要求104或105所述的方法，其中所述参考PDPN表达水平为所述群体中表达水平的第66百分位。
108.根据权利要求93-107中任一项所述的方法，其中所述参考PDPN表达水平为预先指定的PDPN表达水平。
109.根据权利要求92-108中任一项所述的方法，其中所述癌症为CRC、头颈部鳞状细胞癌或胶质瘤。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述癌症为CRC。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述CRC为II期CRC。
112.根据权利要求110所述的方法，其中所述CRC为IV期CRC。
113.根据权利要求93-95和98-112中任一项所述的方法，其中所述益处包括，与不使用所述CD177活性激动剂的治疗相比，所述个体的无复发存活(RFS)延长。
114.根据权利要求92-113中任一项所述的方法，其中所述CD177活性激动剂导致PDPN与CD177的结合相对于在所述激动剂不存在下的所述两种蛋白质的结合的增加。
115.根据权利要求92-114中任一项所述的方法，其中所述CD177活性激动剂导致PDPN的下游活性相对于在所述CD177活性激动剂不存在下的所述下游活性的改变。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述下游活性的所述改变为肿瘤生长的降低。
117.根据权利要求115所述的方法，其中所述下游活性的所述改变为癌症相关成纤维细胞(CAF)收缩性的降低。
118.根据权利要求92-117中任一项所述的方法，其中所述CD177活性激动剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽或模拟物。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述CD177活性激动剂为肽。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述肽为CD177肽。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述CD177肽为CD177的细胞外结构域。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述肽为多聚化的。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述肽为四聚化的。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述肽为使用链霉亲和素四聚化的。
125.根据权利要求118所述的方法，其中所述CD177活性激动剂为抗体或其抗原结合片段。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合PDPN。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段为拮抗剂抗体或其抗原结合片段。
128.根据权利要求125所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合CD177。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段为激动剂抗体或其抗原结合片段。
130.根据权利要求118和125-129中任一项所述的方法，其中所述抗原结合片段为双Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域。
131.根据权利要求1-130中任一项所述的方法，其中所述个体为人。
132.一种多肽集合，其中每种多肽包括细胞外结构域、标签和锚，并且其中所述多肽集合包括表7中的至少81％的蛋白质的细胞外结构域。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述多肽集合包括表7中的至少85％的蛋白质的细胞外结构域。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述多肽集合包括表7中的至少90％的蛋白质的细胞外结构域。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述多肽集合包括表7中的至少95％的蛋白质的细胞外结构域。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述多肽集合包括表7中的全部蛋白质的细胞外结构域。
137.根据权利要求132-136中任一项所述的多肽集合，其中所述锚能够将所述细胞外结构域系结至细胞质膜的表面。
138.根据权利要求132-137中任一项所述的多肽集合，其中所述锚为糖基磷脂酰肌醇(GPI)多肽。
139.根据权利要求132-138中任一项所述的多肽集合，其中所述标签可以被直接或间接地可视化。
140.根据权利要求139所述的多肽集合，其中所述标签包括可以使用抗体或抗体片段检测的部分。
141.根据权利要求139或140所述的多肽集合，其中所述标签为糖蛋白D(gD)多肽。
142.根据权利要求139所述的多肽集合，其中所述标签包括荧光蛋白。
143.根据权利要求132-142中任一项所述的多肽集合，其中所述细胞外结构域具有天然构象。
144.根据权利要求132-143中任一项所述的多肽集合，其中所述细胞外结构域包括天然的翻译后修饰。
145.根据权利要求137-144中任一项所述的多肽集合，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
146.根据权利要求145所述的多肽集合，其中所述细胞为COS7细胞。
147.根据权利要求137-146中任一项所述的多肽集合，其中所述细胞已经使用编码所述多肽的质粒瞬时转染。
148.一种载体集合，其编码根据权利要求132-147中任一项所述的多肽集合。
149.一种细胞集合，其包含根据权利要求148所述的载体集合。
150.根据权利要求149所述的细胞集合，其中多个所述细胞能够表达至少一种根据权利要求132-147中任一项所述的多肽，任选地其中不同的细胞表达不同的多肽。
151.根据权利要求132-147中任一项所述的多肽集合，其中所述多肽中的一个或多个各自被固定至一个或多个固体表面上的不同位置。
152.一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求132-147中任一项所述的多肽集合，任选地其中所述多肽被固定在一个或多个固体表面上；
(b)使步骤(a)的所述集合与多聚化的查询蛋白在允许所述多聚化的查询蛋白与所述多肽的所述细胞外结构域中的至少一个结合的条件下接触；以及
(c)检测所述多聚化的查询蛋白与至少一个细胞外结构域之间的相互作用，从而鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述多肽中的一个或多个各自被固定至所述一个或多个固体表面上的不同位置。
154.根据权利要求152或153所述的方法，其中所述不同位置包括展示所述多肽的细胞。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
156.根据权利要求152-155中任一项所述的方法，其中接触步骤是半自动化的。
157.根据权利要求152-156中任一项所述的方法，其中检测相互作用包括检测位于所述固体表面上某一位置处的高于阈值水平的信号，任选地为荧光信号。
158.根据权利要求157所述的方法，其中所述检测是自动化的。
159.根据权利要求152-158中任一项所述的方法，其中所述相互作用为瞬时相互作用。
160.根据权利要求152-159中任一项所述的方法，其中所述相互作用为低亲和力相互作用。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述低亲和力相互作用为微摩尔亲和力相互作用。
162.根据权利要求152-161中任一项所述的方法，其中所述多聚化的查询蛋白为二聚化的、三聚化的、四聚化的或五聚化的查询蛋白。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述多聚化的查询蛋白为四聚化的查询蛋白。
164.根据权利要求152-163中任一项所述的方法，其中所述多聚化的查询蛋白包含所述查询蛋白的分离的细胞外结构域。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述查询蛋白的所述分离的细胞外结构域已经被生物素化并且缀合至荧光链霉亲和素以将所述查询蛋白四聚化。
166.一种鉴定表1的蛋白质与表2的蛋白质之间相互作用的调节剂的方法，所述方法包括：
(a)提供候选调节剂；
(b)使表1的蛋白质与表2的蛋白质在所述候选调节剂存在或不存在下在允许表1的所述蛋白质与表2的所述蛋白质的结合的条件下接触，其中在表3中报告将相互作用的表1的所述蛋白质和表2的所述蛋白质；以及
(c)测量表1的所述蛋白质与表2的所述蛋白质的结合，其中在所述候选调节剂存在下的结合相对于在所述候选结合剂不存在下的结合的增加或降低将所述候选调节剂鉴定为表1的所述蛋白质与表2的所述蛋白质之间相互作用的调节剂。
167.一种鉴定表1的蛋白质的下游活性的调节剂的方法，所述方法包括：
(a)提供候选调节剂；
(b)使表1的所述蛋白质与表2的蛋白质在所述候选调节剂存在或不存在下在允许表1的所述蛋白质与表2的所述蛋白质的结合的条件下接触，其中在表3中报告将相互作用的表1的所述蛋白质和表2的所述蛋白质；以及
(c)测量表1的所述蛋白质的下游活性，其中在所述候选调节剂存在下的所述下游活性相对于在所述候选结合剂不存在下的所述下游活性的改变将所述候选调节剂鉴定为表1的所述蛋白质的下游活性的调节剂。
168.一种鉴定表2的蛋白质的下游活性的调节剂的方法，所述方法包括：
(a)提供候选调节剂；
(b)使表2的所述蛋白质与表1的蛋白质在所述候选调节剂存在或不存在下在允许表2的所述蛋白质与表1的所述蛋白质的结合的条件下接触，其中在表3中报告将相互作用的表1的所述蛋白质和表2的所述蛋白质；以及
(c)测量表2的所述蛋白质的下游活性，其中在所述候选调节剂存在下的所述下游活性相对于在所述候选结合剂不存在下的所述下游活性的改变将所述候选调节剂鉴定为表2的所述蛋白质的下游活性的调节剂。
169.根据权利要求166所述的方法，其中所述结合的增加或降低为至少70％，如通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的。
170.根据权利要求167或168所述的方法，其中所述调节剂为表1或表2的所述蛋白质的所述下游活性的抑制剂。
171.根据权利要求167或168所述的方法，其中所述调节剂为表1或表2的所述蛋白质的所述下游活性的活化剂。
172.根据权利要求167或168所述的方法，其中所述下游活性的所述改变为所述下游活性的量、强度或持续时间的减少。
173.根据权利要求167或168所述的方法，其中所述下游活性的所述改变为所述下游活性的量、强度或持续时间的增加。
174.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中所述调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物、反义寡核苷酸或小干扰RNA(siRNA)。
175.根据权利要求174所述的方法，其中所述抗原结合片段为双Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域。
176.根据权利要求174所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合表1的所述蛋白质。
177.根据权利要求174所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合表2的所述蛋白质。
178.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为平足蛋白(PDPN)。
179.根据权利要求178所述的方法，其中表2的所述蛋白质为CD177。
180.根据权利要求178或179所述的方法，其中所述下游活性为癌症相关成纤维细胞(CAF)收缩性。
181.根据权利要求180所述的方法，其中CAF收缩性在所述调节剂存在下降低。
182.根据权利要求181所述的方法，其中CAF收缩性降低至少20％，如在凝胶收缩测定中测量的。
183.根据权利要求182所述的方法，其中CAF收缩性降低至少20％，如在3D凝胶伸长测定中测量的。
184.根据权利要求178或179所述的方法，其中所述下游活性为肿瘤生长。
185.根据权利要求184所述的方法，其中肿瘤生长在所述调节剂存在下降低。
186.根据权利要求185所述的方法，其中肿瘤生长降低至少20％，如在肿瘤生长测定中测量的。
187.根据权利要求178-186中任一项所述的方法，其中所述调节剂为靶向PDPN的抗体或其抗原结合片段。
188.根据权利要求178-186中任一项所述的方法，其中所述调节剂为靶向CD177的抗体或其抗原结合片段。
189.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为PD-L1(CD274)。
190.根据权利要求189所述的方法，其中表2的所述蛋白质为EPHA3。
191.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为PD-L2(PDCD1LG2)。
192.根据权利要求191所述的方法，其中表2的所述蛋白质为CEACAM4、ICAM5、NECTIN3、PSG9或TNFRSF11A。
193.根据权利要求192所述的方法，其中表2的所述蛋白质为CEACAM4。
194.根据权利要求189-193中任一项所述的方法，其中所述下游活性为免疫检查点抑制。
195.根据权利要求194所述的方法，其中免疫检查点抑制在所述调节剂存在下降低。
196.根据权利要求195所述的方法，其中免疫检查点抑制降低至少30％，如在基于细胞的测定中测量的。
197.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为PTPRD。
198.根据权利要求197所述的方法，其中所述PTPRD包含G203E和K204E；R232C和R233C；P249L；G285E；E406K；S431L；
R561Q；P666S；E755K；V892I；S912F；R995C或R1088C氨基酸取代突变或者ΔG61ΔE106氨基酸缺失突变。
199.根据权利要求197或198所述的方法，其中表2的所述蛋白质为BMP5、CEACAM3、IL1RAP、IL1RAPL2、LECT1、LRFN5、SIRPG、SLITRK3、SLITRK4、SLITRK6或TGFA。
200.根据权利要求197-199中任一项所述的方法，其中所述下游活性为对于细胞增殖的阻抑。
201.根据权利要求200所述的方法，其中对于细胞增殖的阻抑在所述调节剂存在下增加。
202.根据权利要求201所述的方法，其中对于细胞增殖的阻抑增加至少30％，如在集落形成测定中测量的。
203.根据权利要求197-199中任一项所述的方法，其中所述下游活性为对于STAT3磷酸化作用的阻抑。
204.根据权利要求203所述的方法，其中对于STAT3磷酸化作用的阻抑在所述调节剂存在下增加。
205.根据权利要求204所述的方法，其中对于STAT3磷酸化作用的阻抑增加至少30％，如在针对磷酸化的STAT3的蛋白质印迹中测量的。
206.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为PTPRS。
207.根据权利要求206所述的方法，其中表2的所述蛋白质为C6orf25、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、LRFN1、LRFN5、LRRC4B、NCAM1、SLITRK1、SLITRK2、SLITRK3、SLITRK4或SLITRK6。
208.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为PTPRF。
209.根据权利要求208所述的方法，其中表2的所述蛋白质为CD177、IL1RAP或LRFN5。
210.根据权利要求206-209中任一项所述的方法，其中所述下游活性为对于细胞迁移的抑制。
211.根据权利要求210所述的方法，其中对于细胞迁移的抑制在所述调节剂存在下增加。
212.根据权利要求211所述的方法，其中对于细胞迁移的抑制增加至少20％。
213.根据权利要求206-209中任一项所述的方法，其中所述下游活性为对EGFR的磷酸化作用。
214.根据权利要求213所述的方法，其中对EGFR的磷酸化作用在所述调节剂存在下降低。
215.根据权利要求214所述的方法，其中对EGFR的磷酸化作用降低至少30％，如在针对对EGFR的磷酸化作用的测定中测量的。
216.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为CHL1。
217.根据权利要求216所述的方法，其中表2的所述蛋白质为CNTN1、CNTN5、SIRPA、L1CAM或TMEM132A。
218.根据权利要求216或217所述的方法，其中所述下游活性为对于肿瘤形成的阻抑。
219.根据权利要求218所述的方法，其中对于肿瘤形成的阻抑在所述调节剂存在下增加。
220.根据权利要求219所述的方法，其中对于肿瘤形成的阻抑增加至少20％。
221.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为CNTN1。
222.根据权利要求221所述的方法，其中表2的所述蛋白质为CDH6、CHL1、FCGRT、PCDHB7或SGCG。
223.根据权利要求221或222所述的方法，其中所述下游活性为细胞增殖或细胞侵袭。
224.根据权利要求223所述的方法，其中细胞增殖或细胞侵袭在所述调节剂存在下降低。
225.根据权利要求224所述的方法，其中细胞增殖降低至少20％，如在集落形成测定中测量的。
226.根据权利要求224所述的方法，其中细胞侵袭降低至少20％，如在凝胶侵袭测定中测量的。
227.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为LILRB1。
228.根据权利要求227所述的方法，其中表2的所述蛋白质为CLEC6A、CXADR、EDAR、FLT4、IL6R、ILDR1或LILRA5。
229.根据权利要求227或228所述的方法，其中所述下游活性为对于吞噬作用的阻抑。
230.根据权利要求229所述的方法，其中对于吞噬作用的阻抑在所述调节剂存在下降低。
231.根据权利要求230所述的方法，其中对于吞噬作用的阻抑降低至少20％。
232.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为LILRB2。
233.根据权利要求232所述的方法，其中表2的所述蛋白质为IGSF8或MOG。
234.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为LILRB3。
235.根据权利要求234所述的方法，其中表2的所述蛋白质为LRRC15或LY6G6F。
236.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为LILRB4。
237.根据权利要求236所述的方法，其中表2的所述蛋白质为CNTFR。
238.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为LILRB5。
239.根据权利要求238所述的方法，其中表2的所述蛋白质为APLP2、CD177、CLEC10A、CLECSF13、LDLR、PILRA或UNC5C。
240.根据权利要求239所述的方法，其中表2的所述蛋白质为LDLR。
241.根据权利要求227、228和234-240中任一项所述的方法，其中所述下游活性为破骨细胞分化。
242.根据权利要求241所述的方法，其中破骨细胞分化在所述调节剂存在下降低至少20％。
243.根据权利要求242所述的方法，其中破骨细胞分化是在针对TRAP+多核细胞的测定中测量的。
244.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为AXL。
245.根据权利要求244所述的方法，其中表2的所述蛋白质为IL1RL1或VSIG10L。
246.根据权利要求244或245所述的方法，其中所述下游活性为RAS/RAF/MAPK/ERK1/2途径的活化、JAK/STAT途径的活化、PI3K信号传导途径的活化、细胞迁移、丝状伪足的形成或对AXL的磷酸化作用。
247.根据权利要求246所述的方法，其中细胞迁移降低至少20％，如在凝胶侵袭测定中测量的。
248.根据权利要求166-168中任一项所述的方法，其中表1的所述蛋白质为LRRC4B。
249.根据权利要求248所述的方法，其中表2的所述蛋白质为BTN3A1或BTN3A3。
250.根据权利要求166-249中任一项所述的方法，其中相对于健康组织，肿瘤组织中的表1的所述蛋白质或表2的所述蛋白质的表达被上调或下调。
251.一种表1的蛋白质与表2的蛋白质之间相互作用的分离的调节剂，其中：
i.在表3中报告将相互作用的表1的所述蛋白质和表2的所述蛋白质；并且
ii.所述调节剂造成表1的所述蛋白质与表2的所述蛋白质的结合相对于在所述调节剂不存在下的结合增加或降低。
252.一种表1的蛋白质或表2的蛋白质的下游活性的分离的调节剂，其中：
i.在表3中报告将相互作用的表1的所述蛋白质和表2的所述蛋白质；并且
ii.所述调节剂造成表1的所述蛋白质或表2的所述蛋白质的所述下游活性相对于在所述调节剂不存在下的所述下游活性的改变。
253.根据权利要求251所述的调节剂，其中所述结合的增加或降低为至少70％，如通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的。
254.根据权利要求251或252所述的调节剂，其中所述调节剂为表1或表2的所述蛋白质的所述下游活性的抑制剂。
255.根据权利要求251或252所述的调节剂，其中所述调节剂为表1或表2的所述蛋白质的所述下游活性的活化剂。
256.根据权利要求252所述的调节剂，其中所述下游活性的改变为所述下游活性的量、强度或持续时间的减少。
257.根据权利要求252所述的调节剂，其中所述下游活性的改变为所述下游活性的量、强度或持续时间的增加。
258.根据权利要求251-257中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽或模拟物。
259.根据权利要求258所述的调节剂，其中所述抗原结合片段为双Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域。
260.根据权利要求259所述的调节剂，其中所述抗体或其抗原结合片段结合表1的所述蛋白质。
261.根据权利要求259所述的调节剂，其中所述抗体或其抗原结合片段结合表2的所述蛋白质。
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