JP2022527192A - 細胞表面タンパク質相互作用のモジュレーター並びにそれに関する方法及び組成物 - Google Patents

細胞表面タンパク質相互作用のモジュレーター並びにそれに関する方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるのは、細胞表面タンパク質相互作用及び活性のモジュレーター、並びに細胞表面タンパク質相互作用及び活性のモジュレーターを同定するための方法である。【選択図】なし

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全内容は出典明示により本明細書に援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年３月２７日に作成され、５０４７４－１８２ＷＯ３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿３．２７．２０＿ＳＴ２５と命名され、大きさは２４，４９２バイトである。
発明の分野
本明細書で提供されるのは、細胞表面タンパク質相互作用及び活性のモジュレーター、並びに細胞表面タンパク質相互作用及び活性のモジュレーターを同定するための方法である。
背景
最近の注釈では、ヒトゲノムの５，０００を超える遺伝子が、原形質膜で発現又は分泌されるタンパク質、すなわち細胞表面で作用するタンパク質をコードしていると予測されている。細胞表面に存在するタンパク質のクラスには、細胞表面受容体（例えば、単一膜貫通（ＳＴＭ）受容体）及び免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）タンパク質が含まれる。これらのタンパク質の多くは、がんや他の疾患と関連づけられており、したがって、治療剤の開発の主要な標的である。しかし、多くの原形質膜タンパク質（例えば、ＳＴＭ及びＩｇＳＦタンパク質）の結合パートナーは、未だ特徴づけられていない。この矛盾は、原形質膜発現タンパク質を研究するために、現在使用されているプロテオミクス技術、例えば酵母ツーハイブリッドアッセイ及びアフィニティー精製／質量分析（ＡＰ／ＭＳ）の不一致によるものである。細胞外タンパク質間相互作用のハイスループットスクリーニングが最近開発されている。しかしながら、これらの相互作用の大部分を調節する治療剤はまだ同定されていない。
このように、細胞表面タンパク質間の相互作用の同定のための方法及び組成物、並びにそのような相互作用の新規モジュレーター及びそれを使用する方法に対する満たされていない必要性が存在する。
発明の概要
本発明は、細胞表面タンパク質相互作用及び活性のモジュレーター、並びに細胞表面タンパク質相互作用及び活性のモジュレーターを同定するための方法を提供する。
一態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療から利益を得る可能性のある個体として該個体を同定する、方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療から利益を得る可能性のある個体として該個体を同定する、方法を特徴とする。
いくつかの態様では、個体は、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルを有し、該方法は、有効量のＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを個体に投与することをさらに含む。
別の態様では、本開示は、がんを有する個体を治療する方法であって、（ａ）個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することであって、ここで、遺伝子対の第１のメンバーの発現レベルは、第１の参照発現レベルを上回り、且つ遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、第２の参照発現レベルを上回る、決定すること；及び（ｂ）有効量のＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを個体に投与すること、を含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、がんを有する個体を治療する方法であって、第１の参照発現レベルを上回る表１５の遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る該遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルを有すると決定された個体に、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを投与することを含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、個体からの試料において表１６の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のある個体として該個体を同定する、方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、個体からの試料において表１６の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のある個体として該個体を同定する、方法を特徴とする。
いくつかの態様では、個体は、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルを有し、方法は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える、有効量の治療を個体に投与することを含む。
いくつかの態様では、第１の参照発現レベルは、事前に割り当てられた発現レベルであり、且つ第２の参照発現レベルは、事前に割り当てられた参照発現レベルである。
いくつかの態様では、個体からの試料は、抗がん療法の投与前に個体から得られる。いくつかの態様では、個体からの試料は、抗がん療法の投与後に個体から得られる。
いくつかの態様では、個体からの試料は、腫瘍組織試料又は腫瘍流体試料である。
いくつかの態様では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、アーカイブ試料、新鮮な試料、又は凍結試料である。いくつかの態様では、腫瘍組織試料はＦＦＰＥ試料である。
いくつかの態様では、試料中の遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルは、タンパク質発現レベルであり；又は試料中の遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルは、ｍＲＮＡ発現レベルである。いくつかの態様では、試料中の遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルは、それぞれ、遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーのｍＲＮＡ発現レベルである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーのｍＲＮＡ発現レベルは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ若しくはＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、ＦＩＳＨ、又はそれらの組み合わせによって決定される。いくつかの態様では、第１の参照発現レベルは、約０．２５から約０．５カウント／ミリオン（ＣＰＭ）の間であり、第２の参照発現レベルは、約０．２５から約０．５ＣＰＭの間である。いくつかの態様では、第１の参照発現レベルは０．２５ＣＰＭであり、第２の参照発現レベルは０．２５ＣＰＭである。
いくつかの態様では、第１の参照発現レベル及び第２の参照発現レベルは、それぞれ、がんを有する個体の参照集団における遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルである。いくつかの態様では、がんは、尿路がん、例えば、尿路癌、例えば、局所進行性尿路上皮癌又は転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）である。
いくつかの態様では、利益は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストなしの治療と比較して、個体の全生存期間（ＯＳ）の延長を含む。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＳＩＧＬＥＣ６であり、遺伝子対の第２のメンバーはＮＣＲ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＢＴＮ３Ａ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＲＲＣ４Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＤ８０であり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＴＬＡ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＢＴＮ３Ａ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＲＲＣ４Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＴＲＨＤＥである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＴＬＡ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＰＣＤＨＧＢ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＴＬＡ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＦＡＭ２００Ａである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＡ１２であり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＩＧＬＥＣ６である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＩＬＤＲ２であり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＬＥＣ１２Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＩＴＬＮ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＡＤＭ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＲＴＡＭである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＤ７９Ｂであり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＤ２４４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＤＡＧ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＦＮＢ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＶＣ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＧＰＣ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＦＧＦＲＬ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＢ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＰＴＰＲＤであり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＲＦＮ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＡＱＰＥＰである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＤＳＧ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＬＤＬＲであり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＩＬＲＢ５である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＢ３である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＰＬＸＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＥＭＡ４Ｇである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＢ６である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＬＴ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＦＬＲＴ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＡＸＬ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＩＬ１ＲＬ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＤ３２０であり、遺伝子対の第２のメンバーはＩＧＳＦ５である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＤ５９であり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＴＡＢ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＮＴＮ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＰＴＰＲＧである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＡ３である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＢ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＧＦであり、遺伝子対の第２のメンバーはＴＮＦＲＳＦ１１Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＮＰＥＰであり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＬＩＴＲＫ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＣＧＲ３Ｂであり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＤＡ２Ｒである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＩＬ２０ＲＡであり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＬＥＣ１４Ａである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＩＬ６Ｒであり、遺伝子対の第２のメンバーはＢＴＮＬ９である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＩＺＵＭＯ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＩＬＲＡ５である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＮＧＦＲであり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＲＲＴＭ３である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＮＴＭであり、遺伝子対の第２のメンバーはＡＭＩＧＯ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＰＣＤＨＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＩＧＳＦ１１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＰＴＧＦＲＮであり、遺伝子対の第２のメンバーはＴＭＥＭ５９Ｌである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＴＲＥＭ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＶＳＩＧ８である。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、ＰＤ－１結合アンタゴニスト、及びＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストからなる群から選択される。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストはＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストである。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１の、そのリガンド結合パートナーのうちの１つ又は複数への結合を阻害する。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害する。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のＢ７－１への結合を阻害する。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１の、ＰＤ－１及びＢ７－１の両方への結合を阻害する。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、抗体は、アテゾリズマブ、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）からなる群から選択される。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、以下の超可変領域：（ａ）ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨのＨＶＲ－Ｈ１配列（配列番号１９）；（ｂ）ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧのＨＶＲ－Ｈ２配列（配列番号２０）；（ｃ）ＲＨＷＰＧＧＦＤＹのＨＶＲ－Ｈ３配列（配列番号２１）；（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡのＨＶＲ－Ｌ１配列（配列番号２２）；（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳのＨＶＲ－Ｌ２配列（配列番号２３）；及び（ｆ）ＱＱＹＬＹＨＰＡＴのＨＶＲ－Ｌ３配列（配列番号２４）を含む。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメインを含む。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメインを含む。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメインを含む。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメインを含む。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメインを含む。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメインを含む。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストはＰＤ－１結合アンタゴニストである。いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１の、そのリガンド結合パートナーのうちの１つ又は複数への結合を阻害する。
いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する。
いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ２への結合を阻害する。
いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１の、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方への結合を阻害する。
いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、抗体は、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペムブロリズマブ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ－１０８からなる群から選択される。
いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＦｃ融合タンパク質である。
別の態様では、本開示は、ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、該個体からの試料中のポドプラニン（ＰＤＰＮ）の発現レベルを決定することを含み、ここで、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療から利益を得る可能性がある個体として該個体を同定する、方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、該個体からの試料中のＰＤＰＮの発現レベルを決定することを含み、ここで、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療から利益を得る可能性がある個体として該個体を同定する、方法を特徴とする。
いくつかの態様では、個体は、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る試料中のＰＤＰＮの発現レベルを有し、方法は、ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与することをさらに含む。
別の態様では、本開示は、がんを有する個体を治療する方法であって、（ａ）個体からの試料中のＰＤＰＮの発現レベルを決定することであって、試料中のＰＤＰＮの発現レベルが参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る、決定すること；及び（ｂ）ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与すること、を含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、がんを有する個体を治療する方法であって、ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与することを含み、ここで、個体からの試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回ると決定されている、方法を特徴とする。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性はＰＤＰＮの阻害である。
いくつかの態様では、個体からの試料は、腫瘍組織試料又は腫瘍流体試料である。いくつかの態様では、腫瘍組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、アーカイブ試料、新鮮な試料、又は凍結試料である。
いくつかの態様では、試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、ＰＤＰＮのタンパク質発現レベル又はＰＤＰＮのＲＮＡ発現レベルである。いくつかの態様では、試料中のＰＤＰＮの発現レベルはＰＤＰＮのＲＮＡ発現レベルである。いくつかの態様では、ＰＤＰＮのＲＮＡ発現レベルは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ若しくはＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、ＦＩＳＨ、又はそれらの組み合わせによって決定される。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、がんを有する個体の集団におけるＰＤＰＮの発現レベルである。いくつかの態様では、がんは、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、頭頸部の扁平上皮癌、又は神経膠腫である。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、集団における発現レベルの５０パーセンタイルである。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、集団における発現レベルの６６パーセンタイルである。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、事前に割り当てられたＰＤＰＮ発現レベルである。
いくつかの態様では、がんは、ＣＲＣ、頭頸部の扁平上皮癌、又は神経膠腫である。いくつかの態様では、がんはＣＲＣ、例えばステージＩＩのＣＲＣ又はステージＩＶのＣＲＣである。
いくつかの態様では、利益は、ＣＤ１７７活性のアゴニストなしの治療と比較して、個体の無再発生存期間（ＲＦＳ）の延長を含む。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、アゴニストの非存在下での２つのタンパク質の結合と比較して、ＰＤＰＮとＣＤ１７７の結合の増加をもたらす。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、ＣＤ１７７活性のアゴニストの非存在下での下流活性と比較して、ＰＤＰＮの下流活性に変化をもたらす。
いくつかの態様では、下流活性の変化は、腫瘍増殖の減少である。
いくつかの態様では、下流活性の変化は、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）収縮性の減少である。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、又は模倣物である。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストはペプチドである。いくつかの態様では、ペプチドはＣＤ１７７ペプチドである。いくつかの態様では、ＣＤ１７７ペプチドは、ＣＤ１７７の細胞外ドメインである。いくつかの態様では、ペプチドは多量体化され、例えば、四量体化され、例えば、ストレプトアビジンを使用して四量体化されている。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＰＮに結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、アンタゴニスト抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ１７７に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、アゴニスト抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、抗原結合断片は、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
いくつかの態様では、個体はヒトである。
別の態様では、本開示は、ポリペプチドのコレクションを特徴とし、ここで、各ポリペプチドは、細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含み、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８１％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも９０％を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも９５％の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７の全てのタンパク質の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、アンカーは、細胞外ドメインを細胞の原形質膜の表面に係留することができる。いくつかの態様では、アンカーは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチドである。
いくつかの態様では、タグは直接的又は間接的に視覚化することができる。いくつかの態様では、タグは、抗体又は抗体断片を使用して検出することができる部分を含む。いくつかの態様では、タグは糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）ポリペプチドである。いくつかの態様では、タグは蛍光タンパク質を含む。
いくつかの態様では、細胞外ドメインは、天然のコンホメーションを有する。いくつかの態様では、細胞外ドメインは、天然の翻訳後修飾を含む。
いくつかの態様では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、細胞はＣＯＳ７細胞である。
いくつかの態様では、細胞は、ポリペプチドをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトされている。
別の態様では、本開示は、上記の態様のいずれか１つのポリペプチドのコレクションをコードするベクターのコレクションを特徴とする。
別の態様では、本開示は、上記の態様のベクターのコレクションを含む細胞のコレクションを特徴とする。いくつかの態様では、複数の細胞は、上記の態様のいずれか１つの少なくとも１つのポリペプチドを発現することができ、任意選択で、異なる細胞が異なるポリペプチドを発現する。
いくつかの態様では、前記ポリペプチドの１つ又は複数の各々は、１つ又は複数の固体表面上の別個の位置に固定化されている。
別の態様では、本開示は、タンパク質間相互作用を同定するための方法であって、上記の態様のいずれか１つのポリペプチドのコレクションを提供し、任意選択で、前記ポリペプチドが１つ又は複数の固体表面に固定化される、提供すること；多量体化されたクエリタンパク質とポリペプチドの細胞外ドメインの少なくとも１つとの結合を可能にする条件下で、工程（ａ）のコレクションを多量体化されたクエリタンパク質と接触させること；及び多量体化されたクエリタンパク質と少なくとも１つの細胞外ドメインとの間の相互作用を検出し、それによってタンパク質間相互作用を同定することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、前記ポリペプチドのうちの１つ又は複数はそれぞれ、前記１つ又は複数の固体表面上の別個の位置に固定化されている。いくつかの態様では、別個の位置は、ポリペプチドを提示する細胞を含む。
いくつかの態様では、細胞は哺乳動物細胞である。
いくつかの態様では、接触工程は半自動化されている。
いくつかの態様では、相互作用を検出することは、固体表面上の位置で、閾値レベルを上回るシグナル、任意選択で蛍光シグナルを検出することを含む。いくつかの態様では、検出は自動化されている。
いくつかの態様では、相互作用は一過性の相互作用である。
いくつかの態様では、相互作用は低親和性相互作用である。いくつかの態様では、低親和性相互作用は、マイクロモル親和性相互作用である。
いくつかの態様では、多量体化されたクエリタンパク質は、二量体化、三量体化、四量体化、又は五量体化されたクエリタンパク質である。いくつかの態様では、多量体化されたクエリタンパク質は、四量体化されたクエリタンパク質である。いくつかの態様では、多量体化されたクエリタンパク質は、クエリタンパク質の単離された細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、クエリタンパク質の単離された細胞外ドメインは、ビオチン化され、蛍光ストレプトアビジンにコンジュゲートされて、クエリタンパク質を四量体化する。
別の態様では、本開示は、表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、該方法は、（ａ）候補モジュレーターを提供すること；（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、接触させること；及び（ｃ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少は、候補モジュレーターを表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、測定することを含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、該方法は、（ａ）候補モジュレーターを提供すること；（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、接触させること；及び（ｃ）表１のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化は、候補モジュレーターを表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、測定することを含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、該方法は、（ａ）候補モジュレーターを提供すること；（ｂ）表２のタンパク質の表１のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表２のタンパク質を表１のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、接触させること；及び（ｃ）表２のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化は、候補モジュレーターを表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、測定することを含む方法を特徴とする。
いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも７０％である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、表１又は表２のタンパク質の下流活性の阻害剤である。いくつかの態様では、モジュレーターは、表１又は表２のタンパク質の下流活性の活性化因子である。
いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である。いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の増加である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの態様では、抗原結合断片は、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、表１のタンパク質に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、表２のタンパク質に結合する。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はポドプラニン（ＰＤＰＮ）である。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＣＤ１７７である。
いくつかの態様では、下流活性は、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）収縮性である。いくつかの態様では、ＣＡＦ収縮性は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、ＣＡＦ収縮性は、ゲル収縮アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する。いくつかの態様では、ＣＡＦ収縮性は、３Ｄゲル伸長アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する。
いくつかの態様では、下流活性は腫瘍増殖である。いくつかの態様では、腫瘍増殖は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、腫瘍増殖は、腫瘍増殖アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＰＤＰＮを標的とする抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＣＤ１７７を標的とする抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）である。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＥＰＨＡ３である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＤ－Ｌ２（ＰＤＣＤ１ＬＧ２）である。いくつかの態様では、表２のタンパク質は、ＣＥＡＣＡＭ４、ＩＣＡＭ５、ＮＥＣＴＩＮ３、ＰＳＧ９、又はＴＮＦＲＳＦ１１Ａである。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＣＥＡＣＡＭ４である。
いくつかの態様では、下流活性は免疫チェックポイント阻害である。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害は、細胞ベースのアッセイで測定して、少なくとも３０％減少する。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＤである。いくつかの態様では、ＰＴＰＲＤは、Ｇ２０３Ｅ及びＫ２０４Ｅ；Ｒ２３２Ｃ及びＲ２３３Ｃ；Ｐ２４９Ｌ；Ｇ２８５Ｅ；Ｅ４０６Ｋ；Ｓ４３１Ｌ；Ｒ５６１Ｑ；Ｐ６６６Ｓ；Ｅ７５５Ｋ；Ｖ８９２Ｉ；Ｓ９１２Ｆ；Ｒ９９５Ｃ；又はＲ１０８８Ｃアミノ酸置換変異又はΔＧ６１ΔＥ１０６アミノ酸欠失変異を含む。いくつかの態様では、表２のタンパク質は、ＢＭＰ５、ＣＥＡＣＡＭ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＥＣＴ１、ＬＲＦＮ５、ＳＩＲＰＧ、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、ＳＬＩＴＲＫ６、又はＴＧＦＡである。
いくつかの態様では、下流活性は細胞増殖の抑制である。いくつかの態様では、細胞増殖の抑制は、モジュレーターの存在下で増加する。いくつかの態様では、細胞増殖の抑制は、コロニー形成アッセイで測定して、少なくとも３０％増加する。
いくつかの態様では、下流活性はＳＴＡＴ３リン酸化の抑制である。いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制は、モジュレーターの存在下で増加する。いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制は、リン酸化ＳＴＡＴ３のウエスタンブロットで測定して、少なくとも３０％増加する。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＳである。いくつかの態様では、表２のタンパク質は、Ｃ６ｏｒｆ２５、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＲＦＮ１、ＬＲＦＮ５、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＮＣＡＭ１、ＳＬＩＴＲＫ１、ＳＬＩＴＲＫ２、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、又はＳＬＩＴＲＫ６である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＦである。いくつかの態様では、表２のタンパク質は、ＣＤ１７７、ＩＬ１ＲＡＰ、又はＬＲＦＮ５である。
いくつかの態様では、下流活性は細胞遊走の阻害である。いくつかの態様では、細胞遊走の阻害は、モジュレーターの存在下で増加する。いくつかの態様では、細胞遊走の阻害は、少なくとも２０％増加する。
いくつかの態様では、下流活性はＥＧＦＲのリン酸化である。いくつかの態様では、ＥＧＦＲのリン酸化は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、ＥＧＦＲのリン酸化は、ＥＧＦＲのリン酸化のアッセイで測定して、少なくとも３０％減少する。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＨＬ１である。いくつかの態様では、表２のタンパク質は、ＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ５、ＳＩＲＰＡ、Ｌ１ＣＡＭ、又はＴＭＥＭ１３２Ａである。
いくつかの態様では、下流活性は腫瘍形成の抑制である。いくつかの態様では、腫瘍形成の抑制は、モジュレーターの存在下で増加する。いくつかの態様では、腫瘍形成の抑制は、少なくとも２０％増加する。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＮＴＮ１である。いくつかの態様では、表２のタンパク質は、ＣＤＨ６、ＣＨＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＰＣＤＨＢ７、又はＳＧＣＧである。
いくつかの態様では、下流活性は、細胞増殖又は細胞浸潤である。いくつかの態様では、細胞増殖又は細胞浸潤は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、細胞増殖は、コロニー形成アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する。いくつかの態様では、細胞浸潤は、ゲル浸潤アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ１である。いくつかの態様では、表２のタンパク質は、ＣＬＥＣ６Ａ、ＣＸＡＤＲ、ＥＤＡＲ、ＦＬＴ４、ＩＬ６Ｒ、ＩＬＤＲ１、又はＬＩＬＲＡ５である。
いくつかの態様では、下流活性は食作用の抑制である。いくつかの態様では、食作用の抑制は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、食作用の抑制は少なくとも２０％増加する。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ２である。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＩＧＳＦ８又はＭＯＧである。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ３である。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＬＲＲＣ１５又はＬＹ６Ｇ６Ｆである。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ４である。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＣＮＴＦＲである。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ５である。いくつかの態様では、表２のタンパク質は、ＡＰＬＰ２、ＣＤ１７７、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＣＬＥＣＳＦ１３、ＬＤＬＲ、ＰＩＬＲＡ、又はＵＮＣ５Ｃである。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＬＤＬＲである。
いくつかの態様では、下流活性は破骨細胞分化である。いくつかの態様では、破骨細胞分化は、モジュレーターの存在下で少なくとも２０％減少する。いくつかの態様では、破骨細胞分化は、ＴＲＡＰ＋多核細胞のアッセイで測定される。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＡＸＬである。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＩＬ１ＲＬ１又はＶＳＩＧ１０Ｌである。
いくつかの態様では、下流活性は、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化、細胞遊走、糸状仮足の形成、又はＡＸＬのリン酸化である。いくつかの態様では、細胞遊走は、ゲル浸潤アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＲＲＣ４Ｂである。いくつかの態様では、表２のタンパク質はＢＴＮ３Ａ１又はＢＴＮ３Ａ３である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の発現は、健常組織と比較して腫瘍組織においてアップレギュレート又はダウンレギュレートされる。
別の態様では、本開示は、表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用の単離されたモジュレーターを特徴とし、ここで、（ａ）表１のタンパク質と表２のタンパク質は、表３において相互作用すると報告され；且つ（ｂ）モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での結合と比較して、表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合の増加又は減少を引き起こす。
別の態様では、本開示は、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の単離されたモジュレーターを特徴とし、ここで、（ａ）表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用すると報告され；且つ（ｂ）モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での下流活性と比較して、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の変化を引き起こす。
いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも７０％である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、表１又は表２のタンパク質の下流活性の阻害剤である。いくつかの態様では、モジュレーターは、表１又は表２のタンパク質の下流活性の活性化因子である。
いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である。いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の増加である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、又は模倣物である。いくつかの態様では、抗原結合断片は、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、表１のタンパク質に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、表２のタンパク質に結合する。
図１Ａは、研究においてペアワイズ相互作用について試験された免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）メンバー及び他の非ＩｇＳＦタンパク質のセットにおけるＵｎｉＰｒｏｔ注釈による主要なタンパク質ドメイン及びモチーフの出現を示す一対のグラフである。ＥＧＦ＝上皮成長因子、ＴＮＦ＝腫瘍壊死因子。 図１Ｂは、細胞外インタラクトーム発見（細胞外相互作用スクリーニング）のための自動ハイスループット技術を示す模式図である。（Ｉ）は、トランスフェクト細胞の馴化培地中での発現のために受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）－Ｆｃ融合タンパク質として発現される１３６４のヒトタンパク質からなるＳＴＭ受容体（プレイタンパク質）のライブラリを示している。（ＩＩ）は、ＳＴＭ受容体のコレクションに対する結合について試験されるＩｇＳＦ優先メンバー（クエリタンパク質）のライブラリを示している。ＩｇＳＦタンパク質は、結合の結合活性の増加及び結合パートナーの高感度検出のために、ベータラクタマーゼ酵素に融合した五量体構築物として発現された。（ＩＩＩ）は、自動細胞外相互作用スクリーニングを示す。各ＩｇＳＦクエリタンパク質は、全てのＳＴＭ受容体との結合についてスクリーニングされ、偽陽性を最小限に抑え、遺伝子発現データを取り込み、さらなる分析を可能にするために、計算パイプラインで処理された。（ＩＶ）は、８００を超える信頼性の高いタンパク質間相互作用を含む、ＩｇＳＦインタラクトームを示している。（Ｖ）は、選択された相互作用の検証のための方法を示している。検証方法には、細胞表面の結合パートナーの検出のための表面プラズモン共鳴及び免疫蛍光法が含まれる。 図１Ｃは、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１）及びＰＤ－Ｌ２（ＰＤＣＤ１ＬＧ２）のそれぞれについて、細胞外相互作用スクリーニングの２つの独立した複製を示す散布図である。文献から知られている結合パートナーは青で示されており、これらの結合パートナーはＰＤ－１についてはＰＤＣＤ１ＬＧ２及びＣＤ２７４、ＰＤ－Ｌ２についてはＰＤＣＤ１である。 図２Ａは、細胞外相互作用スクリーニング（「ＩｇＳＦインタラクトーム」）によって同定された、予測される全ての受容体相互作用対のネットワーク表現である。ノードはＩＧＳＦクエリとＳＴＭプレイタンパク質を表し、エッジはそれらの間の相互作用を表している。ノードサイズは、ネットワークハブを示すネットワークネイバーの数（ノード次数）に対応する。既知の相互作用（例えば、Ｂｉｏｐｌｅｘ、Ｂｉｏｇｒｉｄ、又はＳＴＲＩＮＧデータベースで以前に予測された相互作用）を表すエッジは赤で示されている。よく研究されている免疫グロブリン（Ｉｇ）ファミリーにマッピングされる再現されたサブネットワークは、以下のようにマークされている：（１）セマフォリン－プレキシンサブネットワーク；（２）エフリン受容体チロシンキナーゼサブネットワーク；（３）ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫調節軸；及び（４）ＰＶＲ／ＴＩＧＩＴサブネットワーク。 図２Ｂは、トレーニングセットにおける非特異的クラス、陽性クラス、陰性クラスの特異性スコア分布の分離を示すリッジプロットである。 図２Ｃは、ＩｇＳＦインタラクトームネットワーク内のトポロジー係数が、スケールフリーネットワークの特徴である、べき法則に従うことを示す回帰プロットである。 図２Ｄは、細胞外相互作用スクリーニングで同定された相互作用と、Ｂｉｏｐｌｅｘ、Ｂｉｏｇｒｉｄ、ＳＴＲＩＮＧデータベースで既知の相互作用との間の重なりを示すベン図である。 図２Ｅは、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓの細胞局在の関連性によれば、２つの細胞外タンパク質間で同定された相互作用のパーセンテージ（Ｂｉｏｐｌｅｘ；１％）が、ヒトプロテオームにおける細胞外タンパク質の推定パーセンテージ（１８％）に比べて、実質的に過小表示されていることを示す棒グラフである。 図２Ｆは、報告された一意の相互作用対（５７７）の数を方向性サブセットによって分類した棒グラフである：ＳＴＭライブラリにおけるプレイがクエリセットに含まれ、報告された相互作用が相互に確認された１１４対（赤）；ＳＴＭライブラリにおけるプレイがクエリセットに含まれ、報告された相互作用が相互に確認されなかった１２４対（オレンジ）；及びＳＴＭライブラリにおけるプレイがクエリセットに含まれていなかった４６３対。 図３Ａは、ネットワーク接続性及び遺伝子型－組織発現（ＧＴＥｘ）からの健常組織遺伝子発現プロファイルに基づいて、マルコフクラスタリング（ＭＣＬ）クラスターによって分析されたＩｇＳＦインタラクトームを示すネットワーク表現である。単一クラスター内のノードを接続するエッジには、黒で注釈が付けられている；異なるクラスター内のノードを接続するエッジは、薄い灰色で色分けされている。全てのクラスターには、以下の番号付きの説明文に対応する、最も一般的な統計的に有意に濃縮された生物学的プロセス遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語で注釈が付けられている。濃縮されたＧＯ用語の事前の注釈付けを伴うネットワークノードは、それらの用語に対応して異なる色で表示される。注釈が不明である、又はクラスターに割り当てられた用語への注釈が異なるノードは、菱形として示される。 図３Ｂは、全てのＧＴＥｘ組織にわたって測定されたｍＲＮＡ発現の平均相関（ピアソンのｒ）が、ネットワークノードの全ての可能な非相互作用対の補集合（右のプロット、青）と比較して、報告された相互作用タンパク質の全ての対（左のプロット、黄色）について有意に高くなっている（ｐ＜１．２ｘ１０－２０）ことを示すバイオリン図のセットである。点線は、相関分布の９５パーセンタイルを示し、その上に、この研究で検証された、選択された新しい相互作用が示されている。 図３Ｃは、食道ＧＴＥｘ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＮＥＣＴＩＮ１及びＮＥＣＴＩＮ４の正規化されたｍＲＮＡ発現（ｌｏｇ２ ｎＲＰＫＭ）の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．０５）。 図３Ｄは、結腸ＧＴＥｘ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ７の正規化されたｍＲＮＡ発現（ｌｏｇ２ ｎＲＰＫＭ）の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．０５）。 図３Ｅは、血液ＧＴＥｘ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＬＩＬＲＡ５及びＬＩＬＲＢ１の正規化されたｍＲＮＡ発現（ｌｏｇ２ ｎＲＰＫＭ）の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．０５）。 図３Ｆは、脳ＧＴＥｘ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＰＴＰＲＺ１及びＣＮＴＮ１の正規化されたｍＲＮＡ発現（ｌｏｇ２ ｎＲＰＫＭ）の比較を示す散布図である。 図３Ｇは、特定のＧＴＥｘ組織サブセット（左から右：結腸、小腸、神経、及び胃）における報告された結合パートナーＬ１ＣＡＭ及びＣＨＬ１の正規化されたｍＲＮＡ発現（ｌｏｇ２ ｎＲＰＫＭ）の比較を示す散布図のセットであり、発現パターンは重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．０５）。 図３Ｈは、細胞表面相互作用アッセイの設計を示す模式図である。結合パートナー（ＢＰ）を細胞上に発現させ、組換え精製ＥＣＤとして発現させた目的タンパク質の、非トランスフェクト（ＵＴ）及び受容体発現細胞の細胞表面への結合を免疫蛍光法を使用して分析した。組換えタンパク質をビオチン化し、結合の結合活性の増加と一過性相互作用の検出のために、蛍光ストレプトアビジンを使用して多量体化した。 図３Ｉは、対照ＵＴ細胞と比較した、可溶性クエリＮＣＲ１及び結合パートナーＳＩＧＬＥＣ６、ＳＩＧＬＥＣ７、及びＳＩＧＬＥＣ８の細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図３Ｊは、対照ＵＴ細胞と比較した、可溶性クエリＣＨＬ１及び結合パートナーＬ１ＣＡＭの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図３Ｋは、対照ＵＴ細胞と比較した、可溶性クエリＣＮＴＮ１及び結合パートナーＰＴＰＲＺ１の細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図３Ｌは、ＳＩＧＬＥＣ７－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＮＣＲ１－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図３Ｍは、ＳＩＧＬＥＣ８－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＮＣＲ１－ＦＬＡＧのｃｏ－ＩＰアッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図３Ｎは、ＣＤ４－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＮＣＲ１－ＦＬＡＧのｃｏ－ＩＰアッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図４Ａは、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）及びＰＤ－Ｌ２（ＰＤＣＤ１ＬＧ２）免疫調節クラスター（明るい赤の陰影）を示すＩｇＳＦインタラクトームネットワーク表現である。ＣＤ２７４－ＥＰＨＡ３及びＣＥＡＣＡＭ４－ＰＤＣＤ１ＬＧ２相互作用に対応するエッジを太線で示し、赤色で強調する。図３に示すように、ノードは、主に割り当てられたＧＯカテゴリに従って色分けされる。 図４Ｂは、ＳＰＲによって分析された、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２（ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質として発現される）のＣＥＡＣＡＭ４への結合を示すセンサーグラムである。組換えＣＥＡＣＡＭ４（ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質として発現される）をセンサーチップ上に固定化し、示されたタンパク質を２５０ｎＭ濃度で注入した。無関係なＦｃタグ付きタンパク質を対照として使用した。示されているセンサーグラムは、少なくとも３つの独立した実行の代表である。 図４Ｃは、ＳＰＲによって分析された、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＨＡ３、及びＥＰＨＡ５（ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質として発現される）のＬＩＬＲＡ３への結合を示すセンサーグラムである。組換えＬＩＬＲＡ３（ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質として発現される）をセンサーチップ上に固定化し、示されたタンパク質を２５０ｎＭ濃度で注入した。無関係なＦｃタグ付きタンパク質を対照として使用した。示されているセンサーグラムは、少なくとも３つの独立した実行の代表である。 図４Ｄは、増加する濃度の抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブの存在下での、ＰＤ－Ｌ１のそのパートナーであるＰＤ－１及びＥＰＨＡ３への結合を示すグラフである。反応単位は注入終了時に測定した。棒グラフは、平均±標準偏差を示している。実験は、２つの独立したアッセイの代表である。 図４Ｅは、ＳＰＲによって分析された、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２（ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質として発現される）のＥＰＨＡ３への結合を示すセンサーグラムである。組換えＥＰＨＡ３（ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質として発現される）をセンサーチップ上に固定化し、示されたタンパク質を２５０ｎＭ濃度で注入した。無関係なＦｃタグ付きタンパク質を対照として使用した。示されているセンサーグラムは、少なくとも３つの独立した実行の代表である。 図４Ｆは、可溶性クエリＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２、並びに結合パートナーであるＰＤ－１、ＣＤ８０、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＢ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１、ＣＥＡＣＡＭ４、及びＣＥＡＣＡＭ５についての細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。クエリタンパク質は赤で示され、ＤＡＰＩで染色した核は青で示される。スケールバー＝５０μｍ。 図４Ｇは、ＥＤＡＲ－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＬＩＬＲＢ１－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図４Ｈは、ＩＬ６Ｒ－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＬＩＬＲＢ１－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図４Ｉは、ＣＮＴＦＲ－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＬＩＬＲＢ４－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図５Ａは、ＳＬＩＴＲＫ、ＮＴＲＫ、ＬＦＲＮ、ＩＬ１ＲＡＰ、及びＬＲＲＣファミリー内のＰＴＰＲファミリー（図３Ａ、クラスター１）の個々の結合パートナーを中心とした神経系関連コミュニティにおける相互作用の単純化されたネットワーク表現である。赤いエッジは、図５Ｂ－５Ｅに示すように、細胞表面相互作用アッセイを使用して検証された相互作用を表す。点線のエッジは、弱い結合を有する相互作用を表す。 図５Ｂは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＳＬＩＴＲＫ２（上）及びＳＬＩＴＲＫ３（下）と結合パートナーＰＴＰＲＤ及びＰＴＰＲＳに対する細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｃは、対照ＵＴ細胞と比較した、可溶性クエリＬＦＲＮ５と結合パートナーＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＳ、及びＰＴＰＲＦの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｄは、対照ＵＴ細胞と比較した、可溶性クエリＩＬ１ＲＡＰと結合パートナーＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＳ、及びＰＴＰＲＦの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｅは、対照ＵＴ細胞と比較した、可溶性クエリＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ３、及びＢＴＮ２Ａ２と結合パートナーＬＲＲＣ４Ｂの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｆは、ＳＰＲによって分析された、ＩＬＲＡＰ、ＩＬＲＡＰＬ１、ＳＬＩＴＲＫ１、ＳＬＩＴＲＫ４、ＬＲＦＮ１、及びＬＲＦＮ４のＰＴＰＲＤへの結合を示すセンサーグラムのセットである。示されたタンパク質（ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質として発現される）をセンサーチップ上に固定化し、ＰＴＰＲＤ（Ｆｃタグに融合されたエクトドメインとして発現される）を示された濃度で注入した。 図５Ｇは、ＢＴＮ２Ａ１－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＦＡＭ－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図５Ｈは、ＢＴＮ３Ａ２－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＬＲＲＣ４Ｂ－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図５Ｉは、ＢＴＮ３Ａ３－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＬＲＲＣ４Ｂ－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図５Ｊは、ＥＤＡＲ－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＬＲＲＣ４Ｂ－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図５Ｋは、ＰＴＰＲＤにおけるがん関連アミノ酸置換変異を示す模式図である。 図５Ｌは、結合パートナーごとの正規化された吸光度の行クラスター化されたｌｏｇ２比を示すヒートマップであり、白（結合の喪失）から赤（保存された結合）に色分けされている。 図５Ｍは、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）におけるＬＩＬＲタンパク質の協調的なアップレギュレーションを示す、ＬＩＬＲファミリーメンバーとそれらのこれまで特徴づけられていない結合パートナーとの間の相互作用を示すネットワーク表現である。 図５Ｎは、対照ＵＴ細胞と比較した、可溶性クエリＥＤＡＲ、ＬＤＬＲ、ＬＩＬＲＡ５、及びＣＮＴＦＲと結合パートナーＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、及びＬＩＬＲＢ５の細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。クエリタンパク質は赤で示され、ＤＡＰＩで染色した核は青で示される。 図６Ａは、ネットワークコミュニティとして表されるＩｇＳＦインタラクトームを示すネットワーク図であり、ＴＣＧＡ適応症ごとに腫瘍と隣接する正常組織との間の差次的発現分析の結果で補強されている。ノードの色とサイズは、遺伝子が著しく調節不全であることが判明したＴＣＧＡ適応症の数を示す（｜ｌｏｇ２倍率変化｜＞１及びｐ＜０．０５）。 図６Ｂは、ＴＣＧＡ適応症ごとに有意に調節解除されたノードを接続するエッジの数を降順に示した棒グラフである。ＬＵＳＣ＝肺扁平上皮癌、ＫＩＲＣ＝腎臓腎明細胞癌、ＣＯＡＤ＝結腸腺癌、ＫＩＣＨ＝腎臓の嫌色素性細胞、ＬＵＡＤ＝肺腺癌、ＵＣＥＣ＝子宮体子宮内膜癌、ＫＩＲＰ＝腎臓腎乳頭状細胞癌、ＢＬＣＡ＝膀胱尿路上皮癌、ＬＩＨＣ＝肝臓肝細胞癌、ＢＲＣＡ＝乳房浸潤癌、ＴＨＣＡ＝甲状腺癌、ＥＳＣＡ＝食道癌、ＳＴＡＤ＝胃腺癌、ＨＮＳＣ＝頭頸部扁平上皮癌、ＰＲＡＤ＝前立腺腺癌。赤い棒はＩｇＳＦインタラクトームを表す。明るい赤の棒は、ＴＣＧＡで報告された無関係の遺伝子対の参照セットを表している。 図６Ｃは、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）における免疫調節コミュニティ（図３Ｂで定義される）におけるアップレギュレート又はダウンレギュレートされた遺伝子を示すネットワーク図である。 図６Ｄは、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）における免疫調節コミュニティ（図３Ｂで定義される）におけるアップレギュレート又はダウンレギュレートされた遺伝子を示すネットワーク図である。 図６Ｅは、全てのＣａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）細胞株にわたって測定されたｍＲＮＡ発現の平均相関（ピアソンのｒ）が、ネットワークノードの全ての可能な非相互作用対の補集合（右のプロット、青）と比較して、報告された相互作用タンパク質の全ての対（左のプロット、黄色）で有意に高くなっている（ｐ＜４ｘ１０－２）ことを示すバイオリンプロットのセットである。点線は、相関分布の９５パーセンタイルを示し、その上に、この研究で検証された、選択された新しい相互作用が示されている。 図６Ｆは、大腸ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図６Ｇは、肺ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＣＮＴＮ１及びＮＲＣＡＭの相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図６Ｈは、大腸ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＢＴＮ３Ａ１及びＬＲＲＣ４Ｂの相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図６Ｉは、乳房ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＦＬＲＴ３及びＵＮＣ５Ｃの相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図６Ｊは、造血及びリンパ組織のＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＣＮＴＮ１及びＰＴＰＲＺ１の相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図６Ｋは、大腸ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＩＧＳＦ３及びＰＴＧＦＲＮの相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図６Ｌは、乳房ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＩＧＳＦ３及びＰＴＧＦＲＮの相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図６Ｍは、造血及びリンパ組織のＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＡＸＬ及びＶＳＩＧ１０Ｌの相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図６Ｎは、ＡＸＬ－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＩＬ１ＲＬ１－ＦＬＡＧ及びＶＳＩＧ１０Ｌ－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図６Ｏは、バイオレイヤー干渉法を使用して分析された、ＩＬ１ＲＬ１又はＧＡＳ６へのＡＸＬ及びＴＹＲＯ３の結合を示すセンサーグラムのセットである。 図６Ｐは、バイオレイヤー干渉法を使用して分析された、ＩＬ１ＲＬ１又はＧＡＳ６へのＡＸＬ及びＭＥＲの結合を示すセンサーグラムのセットである。 図６Ｑは、対照ＵＴ細胞と比較した、可溶性クエリＡＸＬ及び結合パートナーＩＬ１Ｒｌ１の細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ａは、受容体ライブラリにおける１１２９個の固有な１回膜貫通タンパク質（「プレイ構築物」）のセットについて、ＵｎｉＰｒｏｔ注釈に従った関連するタンパク質ドメインとモチーフの分布を示すグラフである。ＩＴＩＭ／ＩＴＡＭ＝免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ／免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ、ＴＮＦＲ＝腫瘍壊死因子受容体、ＴＬＲ／ＩＬＲ＝Ｔｏｌｌ様受容体／インターロイキン受容体、Ｉｇ様＝免疫グロブリン様、ＥＧＦ＝上皮成長因子。 図７Ｂは、Ｂｉｏｇｒｉｄ、Ｂｉｏｐｌｅｘ、及びＳＴＲＩＮＧデータベース（３つの包括的なタンパク質間相互作用リソース）に存在する一意のタンパク質エントリーと、本研究との重複を示すベン図である。 図７Ｃは、１回膜貫通タンパク質（ＳＴＭ）受容体ライブラリに対して試験した、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１）に関する自動細胞表面相互作用アッセイの２つの独立した複製を示す、３８４ウェルプレートのセットの模式図である。 図７Ｄは、ＳＴＭ受容体ライブラリに対して試験した、ＰＤ－Ｌ２（ＰＤＣＤ１ＬＧ２）に関する自動細胞表面相互作用アッセイの２つの独立した複製を示す、３８４ウェルプレートのセットの模式図である。 図７Ｅは、上から下に、プレートあたりの生の酵素吸光度バックグラウンド推定値の分布；プレートあたりの最大酵素吸光度対照；ウェル間のスケーリングされていない酵素吸光度値；プレートあたりのバックグラウンド推定値によって補正された酵素吸光度値；及びプレートあたりの推定最大吸光度に対するその後の「正規化」吸光度値を示す箱ひげ図である。 図８Ａは、４４５個のスクリーニングされたＩｇＳＦクエリタンパク質による１，３６４個のプレイタンパク質（ＳＴＭ ＥＣＤ）のクラスター化正規化吸光度値のヒートマップである。 図８Ｂは、トレーニングセットにおける非特異的、真陽性、及び真陰性の相互作用の間の予測特徴の識別可能性を示すリッジプロットのセットである。上から下へ：正規化された吸光度；ＳＴＭライブラリ全体に対してスクリーニングされた１つのクエリのクエリＺスコア；スクリーニングされた全てのクエリタンパク質にわたるＳＴＭライブラリにおける単一プレイのプレイＺスコア；及びカスタム特異性スコア。 図８Ｃは、トレーニングセット陰性、トレーニングセット非特異的、トレーニングセット陽性、予測された非特異的／陰性、及び予測された陽性相互作用の主成分分析（ＰＣＡ）を示すプロットである。４次元特徴行列を第１及び第２主成分にマッピングすると、予測された真陽性相互作用（濃青）は、我々のトレーニングセットからの真陽性の相互作用（薄青）とよく一致し、既知の非特異的相互作用（オレンジ）及びサンプリングされた真陰性相互作用（赤）から十分に分離されることが示される。 図８Ｄは、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１、及びＰＤＣＤ１ＬＧ２の相互に観察された全ての相互作用について、予測されたクラス（赤：陰性；緑：陽性／特異的：青：非特異的）によって色分けされた正規化された強度を示すドットプロットであり、複数のクエリクローンにわたって優れた相互再現性と特異性を示している。 図８Ｅは、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１、及びＰＤＣＤ１ＬＧ２の相互に観察された全ての相互作用について、予測されたクラス（赤：陰性；緑：陽性／特異的：青：非特異的）によって色分けされた正規化された強度を示すドットプロットであり、複数のクエリクローンにわたって優れた相互再現性と特異性を示している。 図８Ｆは、Ｂｉｏｐｌｅｘにおける細胞外相互作用の総数（「Ｂｉｏｐｌｅｘ相互作用細胞外タンパク質（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ）」；６２７）、相互作用についてスクリーニングした２つのタンパク質間のＢｉｏｐｌｅｘ相互作用の数（「本研究におけるＢｉｏｐｌｅｘ相互作用タンパク質」；３５０）、及び本研究において報告された細胞外相互作用の総数（「本研究における全ての相互作用」；５７７）を示す棒グラフである。 図８Ｇは、ＩｇＳＦインタラクトームネットワークにおける最短経路分布が６を中心としていることを示すヒストグラムである。 図９Ａは、ＧＴＥｘ組織詳細カテゴリにわたる全てのＩｇＳＦインタラクトーム遺伝子の行スケール（Ｚ変換）、ｌｏｇ２ ｒｐｋｍカウントのクラスター化されたヒートマップである。 図９Ｂは、報告された相互作用タンパク質の全ての対の組織発現相関（ＧＴＥｘのピアソンのｒ）分布平均が、全ての可能な非相互作用対の分布（スクリーニングライブラリ補完）と比較して有意に高くなっている（ｐ＜１．２ｅ－２０）ことを示すバイオリン図である。クラスター化ネットワークでは、クラスター間相互作用の全ての分布と比較して、クラスター内相関も有意に高くなっている（ｐ＜０．０５）。 図９Ｃは、結合対ＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ７の散布図であり、全てのＧＴＥｘ組織にわたるｍＲＮＡ発現は高度に相関していた。 図９Ｄは、結合対ＬＩＬＲＢ１とＬＩＬＲＡ５の散布図であり、全てのＧＴＥｘ組織にわたるｍＲＮＡ発現は高度に相関していた。 図９Ｅは、結合対ＳＩＧＬＥＣ７とＮＣＲ１の散布図であり、全てのＧＴＥｘ組織にわたるｍＲＮＡ発現は高度に相関していた。 図９Ｆは、異なる脳領域にわたるＬ１ＣＡＭ及びＣＨＬ１ ｍＲＮＡ発現を示すファセット散布図のセットであり、小脳領域におけるＣＨＬ１の構成的に高い発現及び他の全ての領域の強く相関する発現パターンを示している。 図９Ｇは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＣＨＬ１並びに細胞表面発現結合パートナーＢＴＬＡ及びＣＮＴＮ５の細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。マージされた画像では、細胞表面に結合しているクエリタンパク質が赤で示され、ＤＡＰＩで染色された核が青で示されている。スケールバー＝５０μｍ。 図９Ｈは、ＣＮＴＮ１及びＣＨＬ１クラスターについての独立したアッセイを使用して同定された新たな相互作用を示すネットワーク図である。 図９Ｉは、ＳＰＲを使用した、ＮＲＣＡＭ、ＮＦＡＳＣ、ＭＣＡＭ、ＣＨＬ１、及び対照タンパク質のＣＮＴＮ１への結合の分析を示すグラフのセットである。組換えＮＲＣＡＭ、ＮＦＡＳＣ、ＭＣＡＭ、ＣＨＬ１、及び対照タンパク質をセンサーチップ上に固定化し、ＣＮＴＮ１（組換えＥＣＤ－Ｆｃとして発現される）を２５０ｎＭの濃度で注入した。 図９Ｊは、代表的なネットワーククラスター（クラスター１）について行スケールされた発現値のクラスター化されたヒートマップである。ネットワーククラスターは、しばしば、脳と全血、脾臓、肺、及び小腸のサブグループによって例示される、別個の組織発現サブグループを含む。 図９Ｋは、２つを超えるメンバーを有する全てのネットワーククラスター（列）について、簡略化されたＧＯカテゴリ（行）の表現を示すクラスター化されたヒートマップである。セル値は、各カテゴリのオッズ比（オッズ比＞５０で上限）に従って色分けされる。ネットワーククラスターは、複数の生物学的注釈を有する遺伝子を繰り返し含む。 図１０Ａは、エフリン（紫）及びＣＥＡＣＡＭ（オリーブ）ファミリーのメンバーと共に、ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４及びＰＤＣＤ１ＬＧ２／ＰＤ－Ｌ２免疫調節クラスター（緑）のメンバーについてのクラスター化された組織発現ヒートマップであり、ＣＥＡＣＡＭ４とＰＤ－Ｌ２との共発現の証拠、及びＥＰＨＡ３とエフリンクラスター間の共発現の相違を強調している。 図１０Ｂは、ＧＴＥｘデータに基づく正常組織におけるＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）及びＥＰＨＡ３の発現を示す箱ひげ図のセットである。 図１０Ｃは、ＧＴＥｘデータに基づく正常組織におけるＣＥＡＣＡＭ４及びＰＤ－Ｌ２の発現を示す箱ひげ図のセットである。 図１０Ｄは、ＰＤ－Ｌ１へのＥＰＨＡ３の結合を示す代表的なＳＰＲ実験を示すセンサーグラムである。ＰＤ－Ｌ１をセンサーチップ上に固定化し、組換えＨｉｓタグ付きＥＣＤとして発現させたＥＰＨＡ３を０、５０、１０、２０、５０、及び１００ｎＭの濃度で注入した。結合速度は平衡状態で計算された。 図１０Ｅは、ＰＤ－Ｌ２へのＣＥＡＣＡＭ４の結合を示す代表的なＳＰＲ実験を示すセンサーグラムである。ＰＤ－Ｌ２をセンサーチップ上に固定化し、組換えＨｉｓタグ付きＥＣＤとして発現させたＣＥＡＣＡＭ４を０、１０、２０、５０、１００、及び２００ｎＭの濃度で注入した。結合速度は平衡状態で計算された。 図１０Ｆは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＭＤＧＡ１並びに細胞表面発現結合パートナーＮＬＧＮ３及びＮＬＧＮ４Ｘの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。マージされた画像では、細胞表面に結合しているクエリタンパク質が赤で示され、ＤＡＰＩで染色された核が青で示されている。スケールバー＝５０μｍ。 図１０Ｇは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＴＲＥＭＬ２及び細胞表面発現結合パートナーＡＮＴＲＸ１の細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。マージされた画像では、細胞表面に結合しているクエリタンパク質が赤で示され、ＤＡＰＩで染色された核が青で示されている。スケールバー＝５０μｍ。 図１０Ｈは、ＣＤ３００Ａ－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＩＧＳＦ５－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図１０Ｉは、ＣＤ３００ＬＦ－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＩＧＳＦ５－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図１０Ｊは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＦＬＲＴ１、ＦＬＲＴ２、及びＦＬＲＴ３並びに細胞表面発現結合パートナーＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｃ、及びＵＮＣ５Ｄの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。マージされた画像では、細胞表面に結合しているクエリタンパク質が赤で示され、ＤＡＰＩで染色された核が青で示されている。スケールバー＝５０μｍ。 図１１Ａは、ＴＣＧＡ適応症によるネットワークノードのクラスター化されたヒートマップである。セル値は、腫瘍と隣接する正常の遺伝子発現レベルの間のｌｏｇ２平均変化を表す。 図１１Ｂは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＣＨＬ１並びに細胞表面発現結合パートナーＬ１ＣＡＭ、ＢＴＬＡ、及びＣＮＴＮ５の細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。マージされた画像では、細胞表面に結合しているクエリタンパク質が赤で示され、ＤＡＰＩで染色された核が青で示されている。スケールバー＝５０μｍ。 図１１Ｃは、ＣＮＴＮ１及びＣＨＬ１ ＩｇＳＦタンパク質について同定された推定上の相互作用を示すＩｇＳＦインタラクトームのサブネットワーク図である。黄色で表されたエッジは、独立した技術によって検証された相互作用を示す。 図１２Ａは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＬＦＲＮ５並びに結合パートナーＰＴＰＲＺ１、ＰＴＰＲＧ、ＰＴＰＲＴ、ＰＴＰＲＳ、ＰＴＰＲＯ、ＰＴＰＲＭ、ＰＴＰＲＦ、及びＰＴＰＲＤの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。示された実験は、２つの独立したアッセイを代表するものである。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１２Ｂは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＳＬＩＴＫＲ２並びに結合パートナーＰＴＰＲＺ１、ＰＴＰＲＧ、ＰＴＰＲＴ、ＰＴＰＲＳ、ＰＴＰＲＯ、ＰＴＰＲＭ、ＰＴＰＲＦ、及びＰＴＰＲＤの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。示された実験は、２つの独立したアッセイを代表するものである。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１２Ｃは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＩＬ１ＲＡＰ並びに結合パートナーＰＴＰＲＺ１、ＰＴＰＲＧ、ＰＴＰＲＴ、ＰＴＰＲＳ、ＰＴＰＲＯ、ＰＴＰＲＭ、ＰＴＰＲＦ、及びＰＴＰＲＤの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。示された実験は、２つの独立したアッセイを代表するものである。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１２Ｄは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＣＮＴＮ１並びに結合パートナーＰＴＰＲＺ１、ＰＴＰＲＧ、ＰＴＰＲＴ、ＰＴＰＲＳ、ＰＴＰＲＯ、ＰＴＰＲＭ、ＰＴＰＲＦ、及びＰＴＰＲＤの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。示された実験は、２つの独立したアッセイを代表するものである。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１２Ｅは、対照の非トランスフェクト（ＵＴ）細胞と比較した、可溶性クエリＢＴＮ２Ａ２及び結合パートナーＬＲＲＣ４Ｂの細胞表面相互作用アッセイの結果を示す顕微鏡写真のセットである。「結合」は、クエリタンパク質のみを灰色で示す。示された実験は、２つの独立したアッセイを代表するものである。「マージ」は、クエリタンパク質を赤色で示し、ＤＡＰＩで染色した核を青色で示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１２Ｆは、ＢＴＮ３Ａ１－ＨＡ又はベクター対照を共発現する細胞におけるＬＲＲＣ４Ｂ－ＦＬＡＧ、ＬＲＲＣ４Ｃ－ＦＬＡＧ、ＴＧＯＬＮ２－ＦＬＡＧ、ＶＳＩＧ８－ＦＬＡＧ、ＣＤＨ９－ＦＬＡＧ、及びＳＴ１４－ＦＬＡＧの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）アッセイの結果を示す免疫ブロットのセットである。 図１２Ｇは、野生型ＰＴＰＲＤと比較した、示されたＰＴＰＲＤバリアントの示された結合パートナーへの結合特異性を示す棒グラフである。 図１３Ａはカプランマイヤー曲線のセットと、公的に利用可能なＣＲＣ（ステージＩＩ）マイクロアレイ遺伝子発現データセットＧＳＥ３３１１３におけるポドプラニン（ＰＤＰＮ）発現のレベル（Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）によって三分位に分割されたステージＩＩ疾患の患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値（Ｌｏｇｒａｎｋ ｐ）は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザード（ＣｏｘＰＨ）のｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図１３Ｂはカプランマイヤー曲線のセットと、公的に利用可能なＣＲＣ（全てのステージ）マイクロアレイ遺伝子発現データセットＧＳＥ３９５８２におけるＰＤＰＮ発現のレベルによって三分位に分割された任意のステージの患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザードｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図１３Ｃは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）におけるＰＤＰＮ発現と腫瘍含有量（がん細胞のパーセンテージ）との間の相関関係を示すプロットである。 図１３Ｄは、ＴＣＧＡにおけるＰＤＰＮと活性化線維芽細胞シグネチャー（線維芽細胞スコア）との相関を示すプロットである。 図１３Ｅは、カプランマイヤー曲線のセットと、ＧＳＥ３３１１３及びＧＳＥ３９５８２データセットにおける活性化線維芽細胞シグネチャー（Ａｃｔ． Ｆｉｂ ｔｅｒｔｉｌｅｓ）の発現レベルによって三分位に分割されたステージＩＩのＣＲＣの患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザードｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図１３Ｆは、カプランマイヤー曲線のセットと、ＧＳＥ３３１１３及びＧＳＥ３９５８２データセットにおける活性化線維芽細胞シグネチャー（Ａｃｔ． Ｆｉｂ ｔｅｒｔｉｌｅｓ）の発現レベルによって三分位に分割されたＣＲＣの任意のステージの患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザードｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図１４Ａは、単量体又は四量体のＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２への結合を示す図及び顕微鏡写真のセットである。図（上）は、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、２００ｎＭ、又は５００ｎＭの単量体又は四量体ＰＤ－Ｌ１と接触させた、細胞表面上にＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２を発現する細胞について検出された正規化蛍光強度を示す。顕微鏡写真（下）は、５００ｎＭの単量体又は四量体のＰＤ－Ｌ１と接触させた、細胞表面上にＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２を発現する細胞についての蛍光の代表的な画像である。 図１４Ｂは、単量体又は四量体ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）のＣＤ９６、ＣＤ２２６又はＴＩＧＩＴへの結合を示す図及び顕微鏡写真のセットである。図（上）は、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、２００ｎＭ、又は５００ｎＭの単量体又は四量体ＰＶＲと接触させた、細胞表面上にＣＤ９６、ＣＤ２２６、又はＴＩＧＩＴを発現する細胞について検出された蛍光ストレプトアビジンの正規化蛍光強度を示す。顕微鏡写真（下）は、５００ｎＭの単量体又は四量体ＰＶＲと接触させた、細胞表面上にＣＤ９６、ＣＤ２２６、又はＴＩＧＩＴを発現する細胞についての蛍光の代表的な画像である。 図１４Ｃは、エクトドメイン－ｇＤ－ＧＰＩライブラリのメンバーの設計を示す模式図である。左：タグなしの完全長単一膜貫通（ＳＴＭ）タンパク質。右：ＳＴＭタンパク質のエクトドメイン、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ、及びグリコシルホスファチジル－イノシトール（ＧＰＩ）リンカーを含むエクトドメイン－ｇＤ－ＧＰＩタンパク質。 図１４Ｄは、抗ｇＤ抗体を使用して測定された、エクトドメイン－ｇＤ－ＧＰＩライブラリのメンバーの表面発現（細胞あたりの蛍光強度として）の定量化を示すグラフである。検出不能（ｎｏ）、低、中、高の発現体の表面染色の代表的な画像が示されている。点線は、異なる発現レベルに対する任意のカットオフ値を示す。発現は、２つの独立したアッセイの代表である。 図１４Ｅは、受容体発見のための自動化された細胞ベースのプラットフォームの模式図である（細胞表面相互作用スクリーニング）。（１）ｇＤ－ＧＰＩタグに融合したＳＴＭ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）として発現される約１２００個の一意の単一膜貫通（ＳＴＭ）受容体からなるライブラリを示す。（２）クエリタンパク質ポドプラニン（ＰＤＰＮ）の四量体化を示す。ＰＤＰＮは、部位特異的ビオチン化のためにＡｖｉｄｉｔｙＡＶＩＴＡＧＴＭ（Ａｖｉタグ）に融合したＰＤＰＮ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）として発現され、ビオチン化され、蛍光ストレプトアビジン（ＳＡ）にコンジュゲートさせて高結合活性四量体を形成させた。（３）自動化された受容体－リガンド相互作用スクリーニング（細胞表面相互作用スクリーニング）を示す。個々の単一膜貫通（ＳＴＭ）受容体を哺乳動物細胞にトランスフェクトし、プレート上の個々のウェルで培養した。高結合活性ＰＤＰＮ四量体を４℃で細胞と共にインキュベートした。ＰＤＰＮがＳＴＭ受容体と相互作用すると、蛍光ＳＡタグは細胞表面に保持された。（４）（３）のアッセイの個々のウェルのハイコンテント蛍光イメージングを示す。（５）蛍光シグナル強度の表示を示す。バックグラウンドは、ライブラリ内の全ての受容体との相互作用のシグナル強度を平均することによって計算される。（６）代表的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）プロットを示す。ＳＰＲは、相互作用をさらに検証するための直交手法として使用される。 図１４Ｆは、免疫受容体Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）が、エクトドメイン－ｇＤ－ＧＰＩ ＳＴＭタンパク質のライブラリとの相互作用について試験された、自動細胞表面相互作用スクリーニングの結果を示す交差プロットである。各丸は、Ｂ７－Ｈ３とＳＴＭ受容体との間の結合相互作用を表している。一意の高得点のヒットを赤丸で示す。灰色の丸で示されるヒットは、経験的に決定された非特異的バインダーである。インターロイキン‐２０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ２０－ＲＡ）が、相互作用パートナーとして同定された。 図１４Ｇは、免疫受容体Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）が、タグを含まない完全長ＳＴＭタンパク質のライブラリとの相互作用について試験された、自動細胞表面相互作用スクリーニングの結果を示す交差プロットである。各丸は、Ｂ７－Ｈ３とＳＴＭ受容体との間の結合相互作用を表している。一意の高得点のヒットを赤丸で示す。灰色の丸で示されるヒットは、経験的に決定された非特異的バインダーである。インターロイキン‐２０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ２０－ＲＡ）が、相互作用パートナーとして同定された。 図１４Ｈは、ポドプラニン（ＰＤＰＮ）がＳＴＭタンパク質のライブラリとの相互作用について試験された、自動化細胞表面相互作用スクリーニングの結果を示す交差プロットである。灰色の丸で示されるヒットは、経験的に決定された非特異的バインダーである。各相互作用は二重に試験された。各丸はＰＤＰＮとＳＴＭ受容体との間の結合相互作用を表している。ＣＤ１７７は新規の相互作用パートナーとして同定された。 図１４Ｉは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析されたＰＤＰＮとＣＤ１７７の結合を示すセンサーグラムである。組換えＣＤ１７７（ＥＣＤとして発現される）をセンサーチップ上に固定化し、組換えＰＤＰＮ（Ｆｃタグ付きＥＣＤとして発現される）及び対照タンパク質を示された濃度で注入した。単量体エクトドメインとして発現される組換えＰＤＰＮを使用して測定された、各相互作用の解離定数（ＫＤ）値が示されている。 図１４Ｊは、ＳＰＲによって分析された、対照ＥＣＤとＰＤＰＮとの間に結合がないことを示すセンサーグラムである。対照ＥＣＤをセンサーチップ上に固定化し、組換えＰＤＰＮ（Ｆｃタグ付きＥＣＤとして発現される）及び対照タンパク質を示された濃度で注入した。単量体エクトドメインとして発現される組換えＰＤＰＮを使用して測定された、各相互作用の解離定数（ＫＤ）値が示されている。 図１５Ａは、好中球上のＣＤ１７７発現を示す一対のグラフである。左のパネルは、３人の異なるドナー及びアイソタイプ対照からの健常血液中の好中球上のＣＤ１７７発現を示す代表的なヒストグラムである。右のパネルは、ドナーの血液試料（ｎ＝３１）においてＣＤ１７７＋であった好中球のパーセンテージを示すグラフである。 図１５Ｂは、フローサイトメトリーを使用して、健常ボランティア血液、ＣＲＣ患者血液、隣接する正常結腸組織（隣接結腸）、及びがん性結腸組織（ＣＲＣ結腸）における好中球を同定するためのゲーティング戦略を示すプロットのセットである。血液プロットは、赤血球（ＲＢＣ）が溶解された血液試料のデータを表している。結腸組織プロットは、赤血球が溶解され、懸濁液が７０ミクロンのメッシュで濾過された結腸組織試料の単一細胞懸濁液からのデータを表す。全ての試料を７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）で染色して死細胞をゲートアウトし、指示された抗体とインキュベートした。影付きの領域は、分析のために選択したデータ（「ゲート」）を表す。ゲートは、生きている（７－ＡＡＤ染色がないことで示される）、一重項である、及びＣＤ４５＋であるイベントを含むように選択された。データは４～７人の独立したドナーを代表するものである。 図１５Ｃは、健常ボランティアの血液（正常血液）、ＣＲＣ患者の血液（ｐｔ血液）、隣接する正常な結腸組織（ａｄｊ結腸）、及びがん性結腸組織（ＣＲＣ結腸）について、４～７人の独立したドナーからの試料において好中球であった細胞のパーセンテージを示すグラフである。＊＊＊ｐ＜０．００１、クラスカル・ウォリスとダンの多重比較検定。 図１５Ｄは、健常ボランティアの血液、ＣＲＣ患者の血液、隣接する正常な結腸組織、及びがん性結腸組織について、４～７人の独立したドナーからの試料においてＣＤ１７７＋であった好中球のパーセンテージを示すグラフである。 図１５Ｅは、アイソタイプ対照と比較した、健常血液、患者血液、隣接する正常（ａｄｊ）結腸組織、及びがん性（ＣＲＣ）結腸組織における好中球のＣＤ１７７発現レベルを示す代表的なヒストグラムである。データは４～７人の独立したドナーを代表するものである。 図１５Ｆは、フローサイトメトリーを使用した、隣接する正常結腸組織、がん性（ＣＲＣ）結腸組織、及び憩室炎（Ｄｉｖ）結腸組織における間質細胞の同定のためのゲーティング戦略を示すプロットのセットである。プロットは、組織試料の単一細胞懸濁液からのデータを表す。試料は、示されているように染色された。ゲートは、間質細胞の検査のために生きている（７－ＡＡＤ染色がないことで示される）、一重項である、ＣＤ４５－である（すなわち、免疫細胞ではない）、及びＥｐＣＡＭ－である（すなわち、腫瘍細胞ではない）イベントを含むように選択された。ＤＮ＝ダブルネガティブＴ細胞；ＢＥＣ＝血管内皮細胞。データは、３～７の独立した試料を代表するものである。 図１５Ｇは、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）細胞（ＥｐＣＡＭ－、ＣＤ４５－、ＣＤ３１－）；内皮細胞（ＥＣ）（ＥｐＣＡＭ－、ＣＤ４５－、ＣＤ３１＋）；腫瘍細胞（ＴＣ）（ＥｐＣＡＭ＋）、骨髄細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１Ｂ＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）；又はＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋）であるＣＲＣ結腸細胞においてＰＤＰＮ＋である細胞のパーセンテージを示すグラフである。データは、３～７の独立した試料を代表するものである。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、クラスカル・ウォリスとダンの多重比較検定。 図１５Ｈは、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）細胞（ＥｐＣＡＭ－、ＣＤ４５－、ＣＤ３１－）；内皮細胞（ＥＣ）（ＥｐＣＡＭ－、ＣＤ４５－、ＣＤ３１＋）；腫瘍細胞（ＴＣ）（ＥｐＣＡＭ＋）、骨髄細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１Ｂ＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）；又はＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋）であるＣＲＣ結腸細胞におけるＰＤＰＮの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。データは、３～７の独立した試料を代表するものである。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、クラスカル・ウォリスとダンの多重比較検定。 図１５Ｉは、隣接する正常（ａｄｊ）結腸組織、がん性（ＣＲＣ）結腸組織、及び憩室炎（ｄｉｖ）結腸組織においてＰＤＰＮ＋である線維芽細胞のパーセンテージを示すグラフである。データは、３～７の独立した試料を代表するものである。 図１５Ｊは、隣接する正常（ａｄｊ）結腸組織、がん性（ＣＲＣ）結腸組織、及び憩室炎（ｄｉｖ）結腸組織におけるＰＤＰＮ線維芽細胞のＭＦＩを示すグラフである。データは、３～７の独立した試料を代表するものである。 図１６Ａは、ＣＤ１７７（青）及びＰＤＰＮ（ピンク）で染色された隣接する正常な結腸組織を示す組織マイクロアレイからの一対の顕微鏡写真である。ＰＤＰＮ染色は、線維芽細胞にはほとんど見られず、リンパ管をマークしていた。ＣＤ１７７染色はほとんど観察されなかった。下のパネルは拡大画像を示している。 図１６Ｂは、ＣＤ１７７（青）及びＰＤＰＮ（ピンク）について染色されたがん性（ＣＲＣ）結腸組織を示す組織マイクロアレイからの一対の顕微鏡写真である。ＰＤＰＮ染色は、線維芽細胞にはほとんど見られず、リンパ管をマークしていた。ＣＤ１７７染色はほとんど観察されなかった。この腫瘍は、腫瘍床を取り巻く間質に強いＰＤＰＮ染色を示したが、上皮細胞自体には染色が見られなかった。下のパネルは拡大画像を示している。 図１６Ｃは、がん性（ＣＲＣ）結腸細胞におけるＰＤＰＮ及びＣＤ１７７に対する二重免疫蛍光染色の代表的な画像を示す顕微鏡写真のセットである。第１のパネルは、ＰＤＰＮ（緑）及びＣＤ１７７（赤）染色による組織の概要を示している。第２、第３、及び第４のパネルは、第１のパネルのボックスで示されているように、第１のパネルの顕微鏡写真の挿入図を示す。第２のパネルはＰＤＰＮ及びＣＤ７７染色を示す。第３のパネルはＣＤ１７７染色のみを示す。第４のパネルはＰＤＰＮ染色のみを示す。スケールバー５０μｍ。 図１６Ｄは、ＣＲＣ細胞におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ；好中球のマーカー）及びＣＤ１７７の二重免疫蛍光染色の代表的な画像を示す顕微鏡写真のセットである。第１のパネルは、ＭＰＯ（緑）及びＣＤ１７７（赤）染色による組織の概要を示している。第２、第３、及び第４のパネルは、第１のパネルのボックスで示されているように、第１のパネルの顕微鏡写真の挿入図を示す。第２のパネルは、ＭＰＯ及びＣＤ７７染色を示す。第３のパネルはＣＤ１７７染色のみを示す。第４のパネルはＭＰＯ染色のみを示す。スケールバー５０μｍ。 図１６Ｅは、ＰＤＰＮ又はＣＤ１７７の染色について陰性（－）又は陽性（＋）であった正常隣接結腸（正常）及びＣＲＣがん（腫瘍）細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。 図１７Ａは、３Ｄゲルに播種され、アイソタイプ対照、組換えヒトＣＬＥＣ－２（ｒＣＬＥＣ－２）、又は組換えヒトＣＤ１７７（ｒ－ＣＤ１７７）で処理された野生型がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の形態指数を示す棒グラフである。ドットは５０を超える細胞を含む単一ウェルと、６回の独立した実験を表す。データは、各実験のアイソタイプ対照に対してプロットされている。＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリスとダンの多重比較検定。 図１７Ｂは、アクチン及びＤＡＰＩについて染色された３Ｄゲル中のがん関連線維芽細胞の代表的な画像を示す顕微鏡写真のセットである。左のパネルは、アイソタイプ対照で処理された細胞を示す。中央のパネルは、組換えヒトＣＬＥＣ－２（ｒＣＬＥＣ－２）で処理された細胞を示す。右のパネルは、組換えヒトＣＤ１７７（ｒＣＤ１７７）で処理された細胞を示す。スケールバー：２０μｍ． 図１７Ｃは、野生型がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を単独で（－）、又は血液から単離された初代好中球（好中球）若しくはＴ細胞と５：１の比率で３Ｄゲルに播種した場合の形態指数を示す棒グラフである。ドットは、５０を超える細胞を含む単一のウェルと、それぞれ５人のドナーを表す２～３回の独立した実験を表す。＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリスとダンの多重比較検定。 図１７Ｄは、３Ｄゲルに播種され、アイソタイプ対照、組換えヒトＣＬＥＣ－２（ｒ－ＣＬＥＣ２）又は組換えヒトＣＤ１７７（ｒ－ＣＤ１７７）で処理された健常ヒト膀胱、結腸、又は卵巣（ＨＯＦ）組織からの初代ヒト線維芽細胞の形態指数を示す棒グラフである。ドットは５０を超える細胞を含む単一ウェルと、３回の独立した実験を表す。＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリスとダンの多重比較検定。 図１７Ｅは、健常ヒト膀胱、結腸、及び卵巣（ＨＯＦ）組織及びアイソタイプ対照からの線維芽細胞上のＰＤＰＮ発現の染色を示す代表的なヒストグラムである。 図１７Ｆは、アイソタイプ対照、組換えヒトＣＬＥＣ－２（ｒＣＬＥＣ－２）、又は組換えヒトＣＤ１７７（ｒ－ＣＤ１７７）で処理した野生型がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の収縮（μｍ）を、非刺激細胞（ｕｎ）と比較して示した棒グラフである。ドットは、条件あたり２～３ウェルの平均を表す。グラフは４つの独立した実験からのデータを含む。＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリスとダンの多重比較検定。 図１８Ａは、深いカバレージのためのタンデムマスタギング及び分画と並行した、多重化されたグローバルプロテオミクス及びホスホプロテオミクス実験のワークフローを示す模式図である。がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を、ＤＭＳＯ対照、ＣＬＥＣ－２、又はＣＤ１７７で２分間又は３０分間、二重に処理した後、溶解した。タンパク質溶解物を還元し、ＬｙｓＣとトリプシンで消化した後、ペプチドを規格化した。ペプチドはタンデムマスタグ（ＴＭＴ）で標識した。一部のペプチド（約０．５ｍｇ）をタンパク質プロファイリングに使用した。これらのペプチドを高ｐＨ逆相分画（Ｈｉ ｐＨ ＲＰ）により分画した。試料をＨＰＬＣ上で泳動し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ ＭＳ／ＭＳ）の分析によってペプチドを同定した。残りのペプチド（約６．５ｍｇ）をグローバルリン酸化分析に使用した。ペプチドを強陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＣＸ）により分画し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ ＭＳ／ＭＳ）により分析した。 図１８Ｂは、ＣＬＥＣ－２又はＣＤ１７７で２分間（２’）又は３０分間（３０’）処理したＣＡＦにおいて有意に変化した（｜Ｌｏｇ２ＦＣ｜＞１及びｐ＜０．０５）全てのリン酸化部位についてタンパク質リン酸化の倍率変化（未処理の対照と比較）を示すヒートマップである。 図１８Ｃは、２分後の未処理細胞と比較して、ＣＤ１７７（丸）又はＣＬＥＣ－２（三角）で刺激されたＣＡＦにおけるタンパク質リン酸化の有意な変化を示す火山プロットである。 図１８Ｄは、３０分後の未処理細胞と比較して、ＣＤ１７７（丸）又はＣＬＥＣ－２（三角）で刺激されたＣＡＦにおけるタンパク質リン酸化の有意な変化を示す火山プロットである。 図１８Ｅは、未処理のＣＡＦと比較して、ＣＬＥＣ－２又はＣＤ１７７処理群においてリン酸化部位が有意に変化したタンパク質によって表される濃縮された（ｑ＜０．０５）遺伝子オントロジー（ＧＯ）経路を示す棒グラフである。数字は、キュレートされた各ＧＯ用語に関連するリン酸化部位グループを示す。 図１８Ｆは、生物学的プロセス経路が濃縮されたタンパク質上の選択されたリン酸化部位について、処理条件ごとの相対的な存在量の変化（非刺激対照との比較）を示した表である。グループ化されたリン酸化部位は、「／」を隔てて示されている。 図１８Ｇは、グローバルプロテオーム（６，３０９タンパク質）及びホスホプロテオーム（４，１２２タンパク質）において同定された一意のタンパク質間の約７０％の重複（２，９１２タンパク質）を示すベン図である。全体として、高品質のレポーターイオン強度を有する１８，５５８個の一意のリン酸化ペプチドが同定され、少なくとも１つのリン酸化残基を有する４，１２２個の一意のタンパク質にマッピングされた。 図１８Ｈは、ＣＬＥＣ－２（１９０リン酸化部位）、ＣＤ１７７（５４リン酸化部位）、又は両方（３２リン酸化部位）によって３０分で有意に変化した（ｐ＜０．０５及び｜ Ｌｏｇ２倍数変化｜＞１）リン酸化部位の数をまとめたベン図である。 図１８Ｉは、ホスホプロテオームアッセイで検出された全てのリン酸化ペプチドを示す三角プロットである。有意に変化したリン酸化部位は、上向きの三角形（非刺激と比較して脱リン酸化）又は下向きの三角形（非刺激と比較して高リン酸化）として示され、３０分でのＣＬＥＣ－２（紫）又は３０分でのＣＤ１７７（緑）との間で測定された倍率変化に従って色分けされる。 図１９Ａはカプランマイヤー曲線のセットと、公的に利用可能なＣＲＣマイクロアレイ遺伝子発現データセットＧＳＥ３９５８２におけるポドプラニン（ＰＤＰＮ）発現のレベル（Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）によって三分位に分割されたステージＩＩ疾患の患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値（Ｌｏｇｒａｎｋ ｐ）は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザード（ＣｏｘＰＨ）のｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図１９Ｂはカプランマイヤー曲線のセットと、公的に利用可能なＣＲＣマイクロアレイ遺伝子発現データセットＧＳＥ３９５８２におけるポドプラニン（ＰＤＰＮ）発現のレベル（Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）によって三分位に分割されたステージＩＶ疾患の患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値（Ｌｏｇｒａｎｋ ｐ）は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザード（ＣｏｘＰＨ）のｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図１９Ｃはカプランマイヤー曲線のセットと、公的に利用可能なＣＲＣマイクロアレイ遺伝子発現データセットＧＳＥ３３１１３におけるＦＡＰ＋線維芽細胞（ＦＡＰ＋ ｆｉｂ）シグネチャー発現のレベル（Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）によって三分位に分割されたステージＩＩ疾患の患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値（Ｌｏｇｒａｎｋ ｐ）は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザード（ＣｏｘＰＨ）のｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図１９Ｄはカプランマイヤー曲線のセットと、公的に利用可能なＣＲＣマイクロアレイ遺伝子発現データセットＧＳＥ３９５８２におけるＦＡＰ＋線維芽細胞シグネチャー発現のレベル（Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）によって三分位に分割された全ステージの疾患の患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値（Ｌｏｇｒａｎｋ ｐ）は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザード（ＣｏｘＰＨ）のｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図１９Ｅはカプランマイヤー曲線のセットと、公的に利用可能なＣＲＣマイクロアレイ遺伝子発現データセットＧＳＥ３９５８２における活性（Ａｃｔ．）線維芽細胞シグネチャー発現のレベル（Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）によって三分位に分割されたステージＩＩ疾患の患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値（Ｌｏｇｒａｎｋ ｐ）は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザード（ＣｏｘＰＨ）のｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図１９Ｆはカプランマイヤー曲線のセットと、公的に利用可能なＣＲＣマイクロアレイ遺伝子発現データセットＧＳＥ３９５８２におけるＦＡＰ＋線維芽細胞シグネチャー発現のレベル（Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）によって三分位に分割されたステージＩＩの疾患の患者の生存確率を示す表である。ログランクｐ値（Ｌｏｇｒａｎｋ ｐ）は、カプランマイヤー曲線と関連している。Ｃｏｘ比例ハザード（ＣｏｘＰＨ）のｐ値は、表１０に詳述される単変量モデルと関連している。 図２０は、蛍光ストレプトアビジンを用いて四量体として発現させたポドプラニン（ＰＤＰＮ）が、完全長、タグなしＳＴＭタンパク質のライブラリとの相互作用について二重に試験された、自動化細胞表面相互作用スクリーニングの結果を示す交差プロットである。新たに同定された結合パートナーＣＤ１７７は、この受容体ライブラリには存在しなかった。ハイコンテント顕微鏡を使用して個々のウェルから画像を取得し、ＩｎＣｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒソフトウェアを使用して画像を処理し、細胞表面に結合するＰＤＰＮの量をバックグラウンドに対するシグナル（Ｓ／Ｎ比）として表した。各丸はＰＤＰＮとＳＴＭ受容体との間の結合相互作用を表している。緑のドットは、無関係のスクリーニングにおいてヒットとして観察された非特異的なバインダーを表す。ＣＬＥＣ－２は新規の相互作用パートナーとして同定された。 図２１は、ＳＰＲによって分析されたＰＤＰＮとＣＬＥＣ－２の結合を示すセンサーグラムである。組換えＣＬＥＣ－２をセンサーチップ上に固定化し、精製されたＰＤＰＮ（Ｆｃタグ付きＥＣＤとして発現される）及び無関係なＦＣタグ付きＥＣＤ対照タンパク質を示された濃度で注入した。単量体エクトドメインとして発現される組換えＰＤＰＮを使用して測定された、各相互作用の解離定数（ＫＤ）値が示されている。 図２２Ａは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データセットにおける正常な結腸組織及びＣＲＣ腫瘍におけるＣＤ１７７ ＲＮＡ発現（ｌｏｇ２ ｎＲＰＫＭ）のレベルを示す箱ひげ図である。 図２２Ｂは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データセットにおける正常な結腸組織及びＣＲＣ腫瘍におけるＰＤＰＮ ＲＮＡ発現（ｌｏｇ２ ｎＲＰＫＭ）のレベルを示す箱ひげ図である。 図２２Ｃは、ＧＳＥ３９５８２データセットのＣＲＣ腫瘍におけるＰＤＰＮ及びＣＤ１７７ ＲＮＡ発現のレベルを示す箱ひげ図である。 図２２Ｄは、ＧＳＥ３３１１３データセットのＣＲＣ腫瘍におけるＰＤＰＮ及びＣＤ１７７ ＲＮＡ発現のレベルを示す箱ひげ図である。 図２３Ａは、ＰＤＰＮ（左パネル）及びＣＤ１７７（右パネル）について染色された正常な隣接（ａｄｊ）結腸組織の連続切片を示す顕微鏡写真のセットである。ＰＤＰＮ染色は、線維芽細胞にはほとんど見られず、リンパ管をマークしていた。ＣＤ１７７染色はほとんど観察されなかった。 図２３Ｂは、ＰＤＰＮ（左パネル）及びＣＤ１７７（右パネル）について染色されたがん性（ＣＲＣ）結腸組織の連続切片を示す顕微鏡写真のセットである。挿入図は拡大画像を示す。この腫瘍は、腫瘍床を取り巻く間質に強いＰＤＰＮ染色を示したが、上皮細胞自体には染色が見られなかった。 図２３Ｃは、隣接する正常な結腸組織におけるＰＤＰＮ及びＣＤ１７７に対する二重免疫蛍光染色の代表的な画像を示す顕微鏡写真のセットである。第１のパネルは、ＰＤＰＮ及びＣＤ１７７染色による組織の概要を示している。第２、第３、及び第４のパネルは、第１のパネルのボックスで示されているように、第１のパネルの顕微鏡写真の挿入図を示す。第２のパネルはＰＤＰＮ及びＣＤ７７染色を示す。第３のパネルはＣＤ１７７染色のみを示す。第４のパネルはＰＤＰＮ染色のみを示す。 図２３Ｄは、隣接する正常な結腸組織におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ；好中球のマーカー）及びＣＤ１７７の二重免疫蛍光染色の代表的な画像を示す顕微鏡写真のセットである。第１のパネルは、ＭＰＯ及びＣＤ１７７染色による組織の概要を示している。第２、第３、及び第４のパネルは、第１のパネルのボックスで示されているように、第１のパネルの顕微鏡写真の挿入図を示す。第２のパネルはＰＤＰＮ及びＣＤ７７染色を示す。第３のパネルはＣＤ１７７染色のみを示す。第４のパネルはＭＰＯ染色のみを示す。 図２４Ａは、ＣＤ１７７又はＣＬＥＣ－２で２分間又は３０分間刺激されたＣＡＦにおいて、プロテオミクスアッセイとホスホプロテオミクスアッセイの両方で同定されたタンパク質について、リン酸化残基で観察された変化（ｘ軸）と総タンパク質存在量の変化（ｙ軸）を示す密度プロットのセットである。 図２４Ｂは、図１８Ｂに示すように、有意な変化が観察されたリン酸化タンパク質の同一性を含めて、ＣＬＥＣ－２又はＣＤ１７７で２分間（２’）又は３０分間（３０’）処理したＣＡＦにおいて有意に変化した（｜Ｌｏｇ２ＦＣ｜＞１及びｐ＜０．０５）全てのリン酸化部位についてタンパク質リン酸化の倍率変化（未処理の対照と比較）を示すヒートマップである。 図２５は、腫瘍微小環境におけるＣＤ１７７とＰＤＰＮの相互作用のモデルを示す一対の図である。左のパネルは、組織の概要を示す。ＣＡＦの密なバンドが腫瘍床の島の間に形成される。これらの線維は一般に腫瘍床と平行に走り、多くの免疫細胞を含む。特に、好中球と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、これらの間質に富む領域に見いだすことができる。これらのＣＤ１７７＋免疫細胞と接触していないＰＤＰＮ＋ ＣＡＦはまだ多数存在するが、一部のＣＡＦはこれらの細胞と相互作用し、ＰＤＰＮの下流で抑制性シグナルを受け取るであろう。右のパネルは、ＣＤ１７７とＰＤＰＮとの間の分子相互作用のモデルと、ＣＡＦにおける下流の結果を示す。ＣＤ１７７の結合は、ＣＡＦにおける収縮、運動性、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリング、及び代謝を変化させる。 図２６Ａは、アイソタイプ対照試料と比較した、野生型（ＷＴ）がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）及びＰｄｐｎ－／－ＣＡＦ上のポドプラニン（ＰＤＰＮ）の発現を示すヒストグラムである。 図２６Ｂは、３Ｄゲルに播種されたＷＴ及びＰｄｐｎ－／－ＣＡＦの形態指数（周囲長２／４＊面積）を示すグラフである。各ドットは、５０を超える細胞を含む１つのウェルの平均を表し、プロットは３つの独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーのＵ検定。 図２６Ｃは、アクチン（赤）及び核（ＤＡＰＩ；青）を染色した３Ｄゲル中のＷＴ（左）及びＰｄｐｎ－／－（右）ＣＡＦを示す一対の顕微鏡写真である。 図２６Ｄは、ＷＴ細胞と比較したＰｄｐｎ－／－細胞の相対的収縮を示すグラフである。各ドットは、４つの独立した実験からの各３～４ウェルの平均を表す。＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーのＵ検定。 図２６Ｅは、ＷＴ及びＰｄｐｎ－／－ＣＡＦの経時的なパーセント培養密度を示すグラフである。各ポイントは、条件ごとに４つのウェルからの１６の異なる視野の平均を表し、プロットは４～６の独立した実験の代表である。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。 図２７Ａは、ＣＡＦを含まない（腫瘍のみ）、Ｐｄｐｎ－／－ＣＡＦを含む、又は野生型（ＷＴ）ＣＡＦを含む、増殖８日目の３Ｄ培養において、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するＳＷ４８０腫瘍オルガノイドの単一ウェルからの代表的な画像を示す顕微鏡写真のセットである。腫瘍細胞のないウェル（ＷＴ ＣＡＦのみ、及びＰｄｐｎ－／－ＣＡＦのみ）が対照として示される。 図２７Ｂは、培養１日～８日の間の時点における図２７Ａのウェルの最大強度投影からのスフェロイドの総面積（μｍ２単位）を示すグラフである。データは、２つの独立した実験（各実験の条件ごとにｎ＝４ウェル）の代表である。腫瘍のみの対照に対して全ての条件でダンの多重比較検定を行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図２７Ｃは、ＣＡＦを含まない（腫瘍のみ）、ＷＴ ＣＡＦを含む、又は対照、四量体ＣＤ１７７、若しくは四量体ＣＬＥＣ－２で処理された野生型ＷＴ ＣＡＦを含む、増殖１７日目の３Ｄ培養において、ＲＦＰを発現するＳＷ４８０腫瘍オルガノイドの単一ウェルからの代表的な画像を示す顕微鏡写真のセットである。腫瘍細胞のないウェル（ＷＴ ＣＡＦのみ）が対照として示されている。 図２７Ｄは、培養１日～１７日の間の時点における図２７Ｃのウェルの最大強度投影からのスフェロイドの総面積（μｍ２単位）を示すグラフである。データは、２つの独立した実験（各実験の条件ごとにｎ＝４ウェル）の代表である。ダンの多重比較検定は、腫瘍＋ＷＴ ＣＡＦ＋対照群を除く他の全ての条件に対して、腫瘍ＷＴ ＣＡＦ群では＊＊＊＊ｐ＜０．０００１の有意差を示した。 図２８Ａは、ＩｇＳＦインタラクトームの全遺伝子と、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞シグネチャー、汎線維芽細胞ＴＦＧｂシグネチャー、及び免疫砂漠型（ＵｒｏＡ：尿路上皮様Ａ）、免疫排除型（Ｉｎｆ：浸潤）又は免疫炎症型腫瘍（ＵｒｏＢ：尿路上皮様Ｂ、ＳＣＣＬ：基底／ＳＣＣ様）のＬｕｎｄサブタイピングスキームに基づく遺伝子セットとの関連性を示すヒートマップである。 図２８Ｂは、陽性（青）又は陰性（赤）の臨床転帰と有意に関連するタンパク質相互作用を示す火山プロットである。選択した相互作用が強調される。 図２８Ｃは、相互作用する対の共同発現から計算されたハザード比を個々の遺伝子の複合ハザード比と比較することによって視覚化された、高い相乗効果を伴う相互作用を示す散布図である。単一遺伝子よりも臨床転帰の予測力が向上した選択された相互作用が強調される。赤は反応の欠如を予測する相互作用を表し、青は反応と関連する相互作用を示す。 図２８Ｄは、ＥＦＮＢ１相互作用のそれぞれについて、個々の遺伝子と比較して、反応の欠如及び患者の生存との関連について有意性が増加したことを示すフォレストプロットである。ＥＦＮＢ１（ＨＲ：１．２５；９５％ ＣＩ：０．９７；１．６２、Ｐ＝０．０８７）及びＥＶＣ２（ＨＲ：１．３２；９５％ ＣＩ：１．０２；１．７１、Ｐ＝０．０３５、ｎ＝３４８の患者）の個々の遺伝子よりもＥＦＮＢ１／ＥＶＣ２相互作用（ＨＲ：１．６１；９５％ ＣＩ：１．２４；２．０９、Ｐ＝３．７８ｅ－４）の全生存率が低いという予測が改善される。 図２８Ｅは、ＥＦＮＢ１の発現レベルが、発現レベルの中央値超又は未満又は同等である個体、ＥＶＣ２の発現レベルが、発現レベルの中央値超又は未満又は同等である個体、又は、ＥＦＮＢ１及びＥＶＣ２の発現レベルが、発現レベルの中央値超又は未満又は同等である個体の生存確率を示す生存プロットである。 図２８Ｆは、ＥＦＮＢ１／ＥＣＶ２の相互作用と各遺伝子を個別に示した箱ひげ図である。ウィスカープロットは最小値と最大値を表し、黒丸は外れ値である。Ｙ軸：Ｚスコア発現。応答者群：完全寛解（ＣＲ）及び部分寛解（ＰＲ）；非応答者群：進行性疾患（ＰＤ）及び安定疾患（ＳＤ）。（ｐ値：ＥＦＢＮ１：０．０００８９０１、ＥＶＣ２：０．００９０４６、ＥＦＢＮ１／ＥＶＣ２：９．１９ｘ１０－５、ｎ＝２９８人の患者）。 図２９Ａは、全てのＩｇＳＦインタラクトーム遺伝子（行）について、ＴＣＧＡ腫瘍適応症（列）ごとに、腫瘍と隣接する正常試料との間でクラスター化された差次的な発現を示すヒートマップである。セル値は、腫瘍と隣接する正常のｌｏｇ２ ｒｓｅｍ値の間の平均変化を表す。 図２９Ｂは、ＴＣＧＡ腫瘍適応症ＨＮＳＣ（頭頸部扁平上皮癌）において、ＬＩＬＲファミリーのタンパク質のうち、共同してアップレギュレート（赤）及びダウンレギュレート（青）された遺伝子を示すネットワーク図である。 図２９Ｃは、ＴＣＧＡ腫瘍適応症ＫＩＲＣ（腎臓腎明細胞癌）において、ＬＩＬＲファミリーのタンパク質のうち、共同してアップレギュレート（赤）及びダウンレギュレート（青）された遺伝子を示すネットワーク図である。 図２９Ｄは、組織によって分割された、ＣＣＬＥにおけるネットワーク遺伝子の正規化されたタンパク質発現値を示すクラスター化されたヒートマップである。 図２９Ｅは、肺ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＩＧＳＦ３及びＰＴＧＦＲＮの相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図２９Ｆは、上部気道消化管ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＩＧＳＦ３及びＰＴＧＦＲＮの相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図２９Ｇは、食道ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＩＧＳＦ３及びＰＴＧＦＲＮの相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図２９Ｈは、肺ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に相関した（ｑ＜０．２）。 図２９Ｉは、肺ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の相対的なタンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に負に相関した（ｑ＜０．２）。 図２９Ｊは、肺ＣＣＬＥ組織サブセットにおける報告された結合パートナーＩＣＯＳＬＧ及びＮＴＭの相対的タンパク質発現の比較を示す散布図である。発現パターンは、重ね合わせた回帰モデル（赤）と有意に負に相関した（ｑ＜０．２）。 図３０Ａは、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞と有意に相関するタンパク質相互作用を示す火山プロットである。選択した相互作用が強調される。 図３０Ｂは、ハザード比によって色分けされた免疫関連相互作用のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１コミュニティを示すネットワーク図であり、アテゾリズマブによる相互作用の阻害を視覚的に示している。 図３０Ｃは、ハザード比によって色分けされた、ＬＲＲＣ４Ｂの選択された結合パートナーを示すネットワーク図である。 図３０Ｄは、ハザード比によって色分けされた、エフリンファミリー内の選択された相互作用を示すネットワーク図である。 図３０Ｅは、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）相互作用のそれぞれについて、個々の遺伝子と比較して、反応の欠如及び患者の生存との関連について有意性が増加したことを示すフォレストプロットである。 図３０Ｆは、ＬＲＲＣ４Ｂ相互作用のそれぞれについて、個々の遺伝子と比較して、反応の欠如及び患者の生存との関連について有意性が増加したことを示すフォレストプロットである
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
ここで使用する用語「約」とは、この技術分野の当業者に容易に知られるそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書中の値又はパラメータに関する「約」の言及は、その値又はパラメータそれ自体に向けられる態様を含む（及び記述する）。
本明細書で使用される用語「単一膜貫通受容体」、「単一膜貫通受容体」、又は「ＳＴＭ受容体」は、単一膜貫通ドメインを有するタンパク質を指す。いくつかの態様では、ＳＴＭ受容体は細胞表面上に発現される。例示的なＳＴＭ受容体が、表５、表７、及び表８、並びにMartinez-Martin et al., Cell, 174(5): 1158-1171, 2018及びClark et al., Genome Res, 13: 2265-2270, 2003に提供される。いくつかの態様では、ＳＴＭタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ注釈の「ロイシンリッチ」、「システインリッチ」、「ＩＴＩＭ／ＩＴＡＭ」（免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ／免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）、「ＴＮＦＲ」（腫瘍壊死因子受容体）、「ＴＬＲ／ＩＬＲ」（Ｔｏｌｌ様受容体／インターロイキン受容体）、「セマフォリン」、「キナーゼ様」、「Ｉｇ様」（免疫グロブリン様）、「フィブロネクチン」、「エフリン」、「ＥＧＦ」、「サイトカインＲ」、又は「カドヘリン」を有する。ＳＴＭ受容体は、例えば、アミノ酸配列中のシグナルペプチド又は予測される膜貫通領域の存在に基づいて同定され得る。いくつかの態様では、ＳＴＭ受容体は細胞外ドメインとして発現される。
本明細書中で使用される用語「免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質」又は「ＩｇＳＦタンパク質」とは、少なくとも１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン又は免疫グロブリンフォールドを含み、例えばＵｎｉＰｒｏｔデータベースに「免疫グロブリン様スーパーファミリー」という注釈を有するか、又は別の方法でそのようなタンパク質と構造的若しくは機能的類似性を有することが示されるタンパク質を指す。いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおける「免疫グロブリン様ドメインスーパーファミリー」という注釈を有する。いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は、主要な生物学的活性、例えば、白血球活性化、細胞－細胞接着、細胞コミュニケーション、又はシグナル伝達への関与に基づいて含まれる。いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ注釈「ＴＦＮＲ」（転写因子様核制御因子）、「ＴＬＲ／ＩＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体／インターロイキン受容体）」、「セマフォリン」、「キナーゼ様」、「ＩｇＳＦ／Ｉｇ様フォールド」、「Ｉｇ様フォールド」、「フィブロネクチン」、「エフリン」、「ＥＧＦ」、「サイトカインＲ」、又は「カドヘリン」を有する。いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は細胞表面上に発現される。他の態様では、ＩｇＳＦタンパク質が分泌される。例示的なＩｇＳＦタンパク質は表４及びOzkan et al., Cell, 154(1): 228-239, 2013並びにYap et al., J Mol Biol, 426(4), 945-961に提供される。いくつかの態様では、ＩｇＳＦスーパーファミリータンパク質は、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１；ＣＤ２７４）、プログラム細胞死１リガンド２（ＰＤ－Ｌ２；ＣＤ２７４；ＰＤＣＤ１ＬＧ２）、受容体型チロシンプロテインホスファターゼデルタ（ＰＴＰＲＤ）、受容体型チロシンプロテインホスファターゼＳ（ＰＴＰＲＳ）、受容体型チロシンタンパク質ホスファターゼＳ（ＰＴＰＲＦ）、神経細胞接着分子Ｌ１様タンパク質（「Ｌ１の近接ホモログ」；ＣＨＬ１）、コンタクチン１（ＣＮＴＮ１）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー３（ＬＩＬＲＢ３）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー４（ＬＩＬＲＢ４）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー５（ＬＩＬＲＢ５）、ＭＡＭドメイン含有グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質１（ＭＤＧＡ１）、又はチロシンプロテインキナーゼ受容体ＡＸＬ（ＵＦＯ）である。いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は細胞外ドメインとして発現される。いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は分泌タンパク質である。
本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリンドメイン」又は「Ｉｇドメイン」は、約７０～１２５アミノ酸残基にわたる２層βシートサンドイッチを含む約７～９個の逆平行β鎖によって特徴づけられるＩｇＳＦタンパク質のドメインを指す。いくつかの態様では、免疫グロブリンドメインには、そのＢ鎖とＦ鎖を接続する保存されたジスルフィド結合を含む。例示的なＩｇＳＦタンパク質はBork et al., JMB, 242(4): 309-320, 1194 及びYap et al., J Mol Biol, 426(4), 945-961に記載される。
本明細書で使用される場合、用語「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、細胞の外側の原形質膜の外側に局在すると予測されるタンパク質ドメインを指す。いくつかの例では、ＥＣＤは、受容体、例えばＳＴＭ受容体のＥＣＤである。いくつかの態様では、ＥＣＤはＩｇＳＦタンパク質のＥＣＤである。いくつかの態様では、ＥＣＤはＰＤＰＮのＥＣＤである。いくつかの態様では、細胞外ドメインの境界は、タンパク質が原形質膜を通過することを示すドメイン、例えば、膜貫通ドメイン（例えば、膜貫通ヘリックス）の予測によって識別され得る。いくつかの態様では、細胞外ドメインの存在は、タンパク質が原形質膜に輸送されることを示すドメイン、配列、又はモチーフ、例えば、シグナル配列又はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合部位の存在によって予測され得る。いくつかの態様では、ＥＣＤの境界はＵｎｉＰｒｏｔ注釈に従って決定される。いくつかの態様では、ＥＣＤは可溶性である。いくつかの態様では、細胞外ドメインは、完全長タンパク質との関連において発現される。他の態様では、細胞外ドメインは、単離された細胞外ドメイン、例えば、細胞外であると予測されるタンパク質のアミノ酸残基のみを含むアミノ酸残基の配列として発現される。
いくつかの態様では、単離されたＥＣＤは融合タンパク質に含まれる。いくつかの態様では、融合タンパク質に含まれることは、溶解性、発現の容易さ、捕捉の容易さ（例えば、プロテインＡでコーティングされたプレート上）、多量体化、又はＥＣＤの他の望ましい特性を増加させる。いくつかの態様では、ＥＣＤ又はＥＣＤ融合タンパク質は単量体である。他の態様では、ＥＣＤ又はＥＣＤ融合タンパク質は、多量体、例えば四量体又は五量体である。いくつかの態様では、ＥＣＤはヒトＩｇＧに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤはヒトＦｃタグに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤはＡｖｉｄｉｔｙ ＡＶＩＴＡＧＴＭ（Ａｖｉタグ）に融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤはポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤは、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）リンカー、例えばｇＤ－ＧＰＩタグに融合される。他の態様では、ＥＣＤは、例えばBushell et al., Genome Res, 18: 622-630, 2008に記載されているように、ラット軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の五量体化ドメイン及びβ－ラクタマーゼタンパク質に融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤ融合タンパク質は、１つ又は複数のドメインの除去を可能にするために、切断配列、例えば、ＴＥＶ切断配列をさらに含む。いくつかの例では、切断配列で切断可能なＡｖｉタグ及びＦｃタグを有するＥＣＤ融合タンパク質をさらに処理してＦｃタグを除去し、Ａｖｉタグをビオチン化し、ビオチン化ＥＣＤ融合タンパク質を蛍光ストレプトアビジン（ＳＡ）に融合させ、例えば、四量体化ＥＣＤ融合タンパク質を形成する。いくつかの例では、単離されたＥＣＤ又はＥＣＤ融合タンパク質は精製される。
本明細書で使用される場合、「モジュレーター」は、所与の生物学的活性、例えば、相互作用又は相互作用から生じる下流活性を調節する（例えば、増加させる、減少させる、活性化する、又は阻害する）薬剤である。モジュレーター又は候補モジュレーターは、例えば、小分子、抗体、抗原結合断片（例えば、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメイン）、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。
「増加させる」又は「活性化する」とは、例えば、２０％以上、５０％以上、又は７５％、８５％、９０％、又は９５％以上の全体的な増加を引き起こす能力を意味する。特定の態様では、増加させる又は活性化するとは、タンパク質間相互作用の下流活性を指すことができる。
「減少させる」又は「阻害する」とは、例えば、２０％以上、５０％以上、又は７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。特定の態様では、減少させる又は阻害するとは、タンパク質間相互作用の下流活性を指すことができる。
「親和性」は、分子（例えば、受容体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用される「結合親和性」は、特に指示されない限り、結合対（例えば、受容体及びリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。通常、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含め、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。
本明細書で使用される「複合体」又は「複合体型」は、ペプチド結合ではない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス、疎水性、親水性力）を介して互いに相互作用する２つ以上の分子の会合を指す。ある態様では、複合体はヘテロ多量体である。本明細書で使用される用語「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」は、タンパク質複合体中のタンパク質にコンジュゲートした非タンパク質実体（例えば、限定しないが、毒素又は検出剤などの化学分子を含む）を有する複合体が含まれることを理解するべきである。
「障害」は、哺乳動物を問題の障害に罹患させる病態を含む、慢性及び急性の障害又は疾患を含むがこれらに限定されない、治療から利益を得るであろういずれかの状態である。ある態様では、障害はがんである。
用語「がん」及び「がん性」は、制御されない細胞成長／増殖を典型的な特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す又は説明する。がんの態様としては、固形腫瘍がん及び非固形腫瘍がんが挙げられる。固形がん腫瘍には、限定されないが、結腸直腸がん、頭頸部がん（例えば、頭頸部の扁平上皮癌）、神経膠腫、黒色腫、乳がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がん、若しくは前立腺がん、又はそれらの転移型が含まれる。いくつかの態様では、がんは結腸直腸がん（ＣＲＣ）である。いくつかの態様では、がんは頭頸部がんである。頭頸部がんのさらなる態様は、頭頸部の扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）が含まれる。いくつかの態様では、がんは乳がんである。乳がんのさらなる態様には、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）乳がん、例えば、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がん、プロゲステロン受容体陽性（ＰＲ＋）乳がん、又はＥＲ＋／ＰＲ＋乳がんが含まれる。乳がんの他の態様には、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）乳がんが含まれる。乳がんのさらに他の態様には、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）が含まれる。いくつかの態様では、乳がんは早期乳がんである。いくつかの態様では、がんは肺がんである。肺がんのさらなる態様には、上皮成長因子受容体陽性（ＥＧＦＲ＋）肺がんが含まれる。肺がんの他の態様には、上皮成長因子受容体陰性（ＥＧＦＲ－）肺がんが含まれる。肺がんのさらに他の態様には、非小細胞肺がん、例えば、扁平上皮肺がん又は非扁平上皮肺がんが含まれる。肺がんの他の態様には、小細胞肺がんが含まれる。いくつかの態様では、がんは尿路がんである。尿路がんには、尿路上皮癌（ＵＣ）、尿路の非尿路上皮癌、及び混合組織構造を有する尿路癌が含まれる。尿路の非尿路上皮癌には、世界保健機関の分類に記載されている全てのサブタイプ、例えば、扁平上皮癌、いぼ状癌、腺癌、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ベリニ集合管の癌、神経内分泌癌、又は小細胞癌が含まれる。腺癌は、腸腺癌、粘液性腺癌、印環細胞腺癌、又は明細胞腺癌であり得る。尿路がんは、膀胱、腎盂、尿管、又は尿道に発生することがある。いくつかの態様では、尿路がん（例えば、尿路上皮癌、非尿路上皮癌、又は混合組織構造を有する尿路癌）は、治療開始時に、ＴＮＭ分類によれば、例えば、ステージＴ４ｂ Ｎａｎｙ又はＴａｎｙ Ｎ２－３など、局所的に進行している。いくつかの態様では、尿路がんは、転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）、尿路の非尿路上皮癌の転移型、又は混合組織構造を有する尿路癌の転移型である。いくつかの態様では、尿路がんは、治療の開始時に、ＴＮＭ分類によれば、ＴＮＭステージＭ１である。いくつかの態様では、がんは膀胱がんである。膀胱がんのさらなる態様には、尿路上皮膀胱がん（ＵＢＣ）、筋肉浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）、又は筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）が含まれる。いくつかの態様では、がんは腎臓がんである。腎臓がんのさらなる態様には、腎細胞癌（ＲＣＣ）が含まれる。いくつかの態様では、がんは肝がんである。肝がんのさらなる態様には、肝細胞癌が含まれる。いくつかの態様では、がんは前立腺がんである。前立腺がんのさらなる態様には、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）が含まれる。いくつかの態様では、がんは固形腫瘍の転移型である。いくつかの態様では、固形腫瘍の転移型は、黒色腫、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がん、又は前立腺がんの転移型である。いくつかの態様では、がんは非固形腫瘍がんである。非固形腫瘍がんには、限定されないが、Ｂ細胞リンパ腫が含まれる。Ｂ細胞リンパ腫のさらなる態様には、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は菌状息肉症（ＭＦ）が含まれる。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「トランスフェクトされた細胞」、「形質転換された細胞」、及び「形質転換体」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。いくつかの態様では、宿主細胞は、外因性核酸で安定して形質転換される。他の態様では、宿主細胞は、外因性核酸で一過性に形質転換される。
用語「がん関連線維芽細胞」（「ＣＡＦ」）又は「腫瘍関連線維芽細胞」は、本明細書で使用される場合、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）、例えば間質に存在する、又はそれに関連する線維芽細胞（例えば、哺乳動物間質細胞）を指す。いくつかの態様では、ＣＡＦは活性線維芽細胞である。ＣＡＦは、例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリング並びに／又は可溶性因子、例えば成長因子及び／若しくは炎症性因子の分泌を介して、ＴＭＥの構造及び／又は機能を調節し得る。ＣＡＦは、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍浸潤、血管新生又は転移に寄与し得る。ＣＡＦは抗腫瘍免疫を損なう可能性がある。いくつかの態様では、ＣＡＦはポドプラニン（ＰＤＰＮ）を発現する。いくつかの態様では、ＣＡＦは、組織の硬さに影響する特性であるアクトミオシン収縮性によって特徴づけられる。いくつかの態様では、ＣＡＦは、活性化線維芽細胞シグネチャー及び／又はＦＡＰ＋線維芽細胞シグネチャーと関連し、例えば、表１１及び／又は表１２に提供される遺伝子を発現する。
本明細書で使用される用語「ポドプラニン」又は「ＰＤＰＮ」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＰＤＰＮを広く指す。ＰＤＰＮは、ｇｐ３８、Ａｇｇｒｕｓ、及びＴ１αとも呼ばれる。用語は、完全長ＰＤＰＮ及びＰＤＰＮの単離された領域又はドメイン、例えばＰＤＰＮ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を包含する。この用語は、天然に存在するＰＤＰＮのバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＰＤＰＮのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ８６ＹＬ７の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＰＤＰＮの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＰＤＰＮの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「表面抗原分類１７７」又は「ＣＤ１７７」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＣＤ１７７を広く指す。用語は、完全長ＣＤ１７７及びＣＤ１７７の単離された領域又はドメイン、例えばＣＤ１７７ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＣＤ１７７のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＣＤ１７７のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ８Ｎ６Ｑ３の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＣＤ１７７の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＣＤ１７７の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
用語「ＣＤ１７７活性のアゴニスト」又は「ＣＤ１７７アゴニスト」は、ＣＤ１７７とその結合パートナーの１つ又は複数、例えば、ＰＤＰＮとの相互作用から生じるシグナル伝達を増加させる分子を指す。ＣＤ１７７活性のアゴニストは、アゴニストの非存在下での２つのタンパク質の結合と比較して、ＣＤ１７７の、その結合パートナーの１つ又は複数（例えば、ＰＤＰＮ）への結合の増加をもたらし得る。ＣＤ１７７活性のアゴニストには、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、ペプチド（例えば、多量体化ペプチド、例えば、多量体化ＣＤ１７７ポリペプチド）、オリゴペプチド、及びＣＤ１７７とその結合パートナーの１つ又は複数、例えばＰＤＰＮとの相互作用から生じるシグナル伝達を増加させる他の分子を含み得る。
本明細書で使用される用語「プログラム細胞死１リガンド１」又は「ＰＤ－Ｌ１」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＰＤ－Ｌ１を広く指す。ＰＤ－Ｌ１はＣＤ２７４とも呼ばれる。用語は、完全長ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ１の単離された領域又はドメイン、例えばＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＰＤ－Ｌ１のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＺＱ７の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＰＤ－Ｌ１の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＰＤ－Ｌ１の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「エフリンＡ型受容体３」又は「ＥＰＨＡ３」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＥＰＨＡ３を広く指す。用語は、完全長ＥＰＨＡ３及びＥＰＨＡ３の単離された領域又はドメイン、例えばＥＰＨＡ３ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＥＰＨＡ３のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＥＰＨＡ３のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２９３２０の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＥＰＨＡ３の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＥＰＨＡ３の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「プログラム細胞死１リガンド２」又は「ＰＤ－Ｌ２」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＰＤ－Ｌ２を広く指す。ＰＤ－Ｌ２はＰＤＣＤ１ＬＧ２とも呼ばれる。用語は、完全長ＰＤ－Ｌ２及びＰＤ－Ｌ２の単離された領域又はドメイン、例えばＰＤ－Ｌ２ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＰＤ－Ｌ２のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＰＤ－Ｌ２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９ＢＱ５１の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＰＤ－Ｌ２の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＰＤ－Ｌ２の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「ＣＥＡＣＡＭ４」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＣＥＡＣＡＭ４を広く指す。用語は、完全長ＣＥＡＣＡＭ４及びＣＥＡＣＡＭ４の単離された領域又はドメイン、例えばＣＥＡＣＡＭ４ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＣＥＡＣＡＭ４のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＣＥＡＣＡＭ４のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｏ７５８７１の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＣＥＡＣＡＭ４の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＣＥＡＣＡＭ４の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「受容体型チロシン－プロテインホスファターゼデルタ」又は「ＰＴＰＲＤ」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＰＴＰＲＤを広く指す。用語は、完全長ＰＴＰＲＤ及びＰＴＰＲＤの単離された領域又はドメイン、例えばＰＴＰＲＤ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＰＴＰＲＤのバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＰＴＰＲＤのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２３４６８の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＰＴＰＲＤの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＰＴＰＲＤの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「受容体型チロシン－プロテインホスファターゼＦ」又は「ＰＴＰＲＦ」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＰＴＰＲＦを広く指す。用語は、完全長ＰＴＰＲＦ及びＰＴＰＲＦの単離された領域又はドメイン、例えばＰＴＰＲＦ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＰＴＰＲＦのバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＰＴＰＲＦのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１０５８６の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＰＴＰＲＦの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＰＴＰＲＦの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「受容体型チロシン－プロテインホスファターゼＳ」又は「ＰＴＰＲＳ」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＰＴＰＲＳを広く指す。用語は、完全長ＰＴＰＲＳ及びＰＴＰＲＳの単離された領域又はドメイン、例えばＰＴＰＲＳ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＰＴＰＲＳのバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＰＴＰＲＳのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ１３３３２の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＰＴＰＲＳの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＰＴＰＲＳの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「ＣＨＬ１」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＣＨＬ１を広く指す。用語は、完全長ＣＨＬ１及びＣＨＬ１の単離された領域又はドメイン、例えばＣＨＬ１ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＣＨＬ１のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＣＨＬ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｏ００５３３の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＣＨＬ１の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＣＨＬ１の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「コンタクチン１」又は「ＣＮＴＮ１」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＣＮＴＮ１を広く指す。用語は、完全長ＣＮＴＮ１及びＣＮＴＮ１の単離された領域又はドメイン、例えばＣＮＴＮ１ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＣＮＴＮ１のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＣＮＴＮ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ１２８６０の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＣＮＴＮ１の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＣＮＴＮ１の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１」又は「ＬＩＬＬＲＢ１」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＬＩＬＲＢ１を広く指す。用語は、完全長ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ１の単離された領域又はドメイン、例えばＬＩＬＲＢ１ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＬＩＬＲＢ１のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＬＩＬＲＢ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ８ＮＨＬ６の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＬＩＬＲＢ１の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＬＩＬＲＢ１の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２」又は「ＬＩＬＲＢ２」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＬＩＬＲＢ２を広く指す。用語は、完全長ＬＩＬＲＢ２及びＬＩＬＲＢ２の単離された領域又はドメイン、例えばＬＩＬＲＢ２ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＬＩＬＲＢ２のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＬＩＬＲＢ２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ８Ｎ４２３の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＬＩＬＲＢ２の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＬＩＬＲＢ２の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー３」又は「ＬＩＬＲＢ３」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＬＩＬＲＢ３を広く指す。用語は、完全長ＬＩＬＲＢ３及びＬＩＬＲＢ３の単離された領域又はドメイン、例えばＬＩＬＲＢ３ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＬＩＬＲＢ３のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＬＩＬＲＢ３のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｏ７５０２２の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＬＩＬＲＢ３の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＬＩＬＲＢ３の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー４」又は「ＬＩＬＲＢ４」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＬＩＬＲＢ４を広く指す。用語は、完全長ＬＩＬＲＢ４及びＬＩＬＲＢ４の単離された領域又はドメイン、例えばＬＩＬＲＢ４ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＬＩＬＲＢ４のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＬＩＬＲＢ４のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ８ＮＨＪ６の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＬＩＬＲＢ４の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＬＩＬＲＢ４の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー５」又は「ＬＩＬＲＢ５」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＬＩＬＲＢ５を広く指す。用語は、完全長ＬＩＬＲＢ５及びＬＩＬＲＢ５の単離された領域又はドメイン、例えばＬＩＬＲＢ５ ＥＣＤを包含する。この用語は、天然に存在するＬＩＬＲＢ５のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＬＩＬＲＢ５のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｏ７５０２３の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＬＩＬＲＢ５の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＬＩＬＲＢ５の保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される用語「ＡＸＬ」は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の哺乳動物源からの任意の天然ＡＸＬを広く指す。用語は、完全長ＡＸＬ及びＡＸＬの単離された領域又はドメイン、例えばＡＸＬ ＥＣＤを包含する。ＡＸＬはＵＦＯとしても知られる。この用語は、天然に存在するＡＸＬのバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＡＸＬのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ３０５３０の下に示されている。軽微な配列バリエーション、特にＡＸＬの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＡＸＬの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
特に断らない限り、本明細書で使用される用語「タンパク質」は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然タンパク質を指す。この用語は、「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内での処理から生じるあらゆる形態のタンパク質を包含する。この用語はまた、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアント、例えば、アミノ酸置換変異又はアミノ酸欠失変異を包含する。この用語はまた、タンパク質の単離された領域又はドメイン、例えば、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
「単離された」タンパク質又はペプチドは、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様では、タンパク質又はペプチドは、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に、又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
本明細書で使用される用語「インタラクトーム」は、一組の分子内で起こる一組の分子相互作用、例えば、タンパク質間相互作用を指す。いくつかの態様では、インタラクトームはネットワークとして表現され、例えば、ノードが特定の分子を表し、エッジが、アッセイ（例えば、細胞表面相互作用アッセイ又は細胞外相互作用アッセイ）が２つのノード間の相互作用を検出するノードを接続するネットワークである。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と言う。
本明細書中で使用される場合、用語「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫反応の調節を変化させるために少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質を標的とする治療剤、例えば、免疫反応をダウンモジュレートする、阻害する、アップモジュレートする、又は活性化する治療剤を指す。用語「免疫チェックポイント遮断」は、免疫チェックポイント阻害剤を含む治療を指すために使用され得る。免疫チェックポイントタンパク質は、当技術分野で公知であり、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰａｌｐｈａ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＯＸ４０、及びＡ２ａＲが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、免疫チェックポイントタンパク質は、活性化されたＴ細胞の表面上に発現され得る。本発明の方法において有用な免疫チェックポイント阻害剤として作用することができる治療剤には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰａｌｐｈａ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＯＸ４０及びＡ２ａＲのうちの１つ又は複数を標的とする治療剤が含まれるが、これらに限定されない。免疫チェックポイント阻害剤は、１つ又は複数の標的免疫チェックポイントタンパク質の機能を増強又は抑制する。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブなどのＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストである。
用語「ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト」は、ＰＤ－１シグナル伝達軸上のシグナル伝達に起因するＴ細胞機能不全を除去するために、ＰＤ－１軸結合パートナーとその結合パートナーのうちの１つ又は複数との相互作用を阻害し、その結果Ｔ細胞機能（例えば、増殖、サイトカイン生成、標的細胞殺傷）が回復又は増強される分子を指す。本明細書で使用される場合、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストには、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、ＰＤ－１結合アンタゴニスト、及びＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストが含まれる。
用語「ＰＤ－１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ－１と、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２といったその結合パートナーのうちの１つ又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を、低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する分子を指す。いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１の、その結合パートナーのうちの１つ又は複数に対する結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２への結合を阻害する。例えば、ＰＤ－１結合アンタゴニストには、抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、並びにＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２との相互作用に起因するシグナル伝達を低減、遮断、阻害、抑止又は妨害する他の分子が含まれる。一態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、機能不全のＴ細胞を機能不全にしないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ように、ＰＤ－１を介するシグナル伝達を介してＴリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によって又はそれを介して媒介される負の共刺激シグナルを低減する。いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは抗ＰＤ－１抗体である。特定の態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ）である。別の特定の態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＭＫ－３４７５（ペムブロリズマブ）である。別の特定の態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＡＭＰ－２２４である。別の特定の態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＭＥＤ１－０６８０である。別の特定の態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＰＤＲ００１（スパルタリズマブ）である。別の特定の態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ）である。別の特定の態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＢＧＢ－１０８である。
用語「ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ－Ｌ１と、ＰＤ－１及びＢ７－１といったその結合パートナーのいずれか１つ又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を、低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する分子を指す。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１及び／又はＢ７－１への結合を阻害する。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、並びにＰＤ－Ｌ１と、ＰＤ－１及びＢ７－１といったその結合パートナーの１つ又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、機能不全のＴ細胞を機能不全にしないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ように、ＰＤ－Ｌ１を介するシグナル伝達を介してＴリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によって又はそれを介して媒介される負の共刺激性シグナルを低減する。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。さらに別の特定の態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＭＰＤＬ３２８０Ａである（アテゾリズマブ、ＷＨＯ薬物情報（医薬品の国際一般名）ではＴＥＣＥＮＴＲＩＱＴＭとして販売される、推奨ＩＮＮ：Ｌｉｓｔ ７４，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．３，２０１５（３８７ページを参照））。特定の一態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の特定の態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＭＤＸ－１１０５である。別の特定の態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＭＳＢ００１５７１８Ｃである。また別の特定の態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６である。
用語「ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニスト」は、ＰＤ－Ｌ２と、ＰＤ－１といったその結合パートナーのいずれか１つ又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する分子を指す。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２のその結合パートナーの１つ又は複数への結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合を阻害する。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ２アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びＰＤ－Ｌ２と、ＰＤ－１といったその結合パートナーのいずれか１つ又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一態様では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、機能不全のＴ細胞を機能不全にしないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ように、ＰＤ－Ｌ２を介するシグナル伝達を介してＴリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によって又はそれを介して媒介される負の共刺激シグナルを低減する。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストはイムノアドヘシンである。
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片（例えば、ｂｉｓ－Ｆａｂ）を含む。
「抗原結合断片」又は「抗体断片」とは、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む分子を指す。抗原結合断片の例としては、限定されないが、ｂｉｓ－Ｆａｂ；Ｆｖ；Ｆａｂ；Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ；Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、或いは軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片を指す。特定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（例えば、米国特許第６２４８５１６号参照）である。単一ドメイン抗体の例には、ＶＨＨが含まれるが、これに限定されない。
「Ｆａｂ」断片は、抗体のパパイン消化によって生成される抗原結合断片であり、Ｌ鎖全体と、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のパパイン消化により、２つの同一のＦａｂ断片を生成する。抗体のペプシン処理により単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が生じ、これは二価の抗原結合活性を有するジスルフィド結合した２つのＦａｂ断片にほぼ対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加のいくつかの残基を有している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
本明細書の用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基から又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することによって取り除かれ得る。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのＬｙｓ４４７残基が除かれた抗体集団、Ｌｙｓ４４７残基が除かれていない抗体集団、及びＬｙｓ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。
「Ｆｖ」は、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を与える６つの超可変ループ（Ｈ鎖とＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。ただし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であることが多いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖中に接続するＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995を参照。
用語「小分子」とは、分子量約２０００ダルトン以下、例えば約１０００ダルトン以下の任意の分子を指す。いくつかの態様では、小分子は小さな有機分子である。
本明細書で使用される用語「模倣物」又は「分子模倣物」とは、コンホメーション及び／又は結合能力において、所定のポリペプチドに対して又は前記ポリペプチドの結合パートナーに結合するための部分に対して十分な類似性（例えば、二次構造、三次構造）を有するポリペプチドを指す。模倣物は、それが模倣するポリペプチドと等しい、より少ない、又はより大きな親和性で結合パートナーと結合し得る。分子模倣物は、それが模倣するポリペプチドと明らかなアミノ酸配列類似性を有していても、有していなくてもよい。模倣物は、自然に発生することもあれば、操作されることもある。いくつかの態様では、模倣物は表１のタンパク質の模倣物である。他の態様では、模倣物は表２のタンパク質の模倣物である。さらに別の態様では、模倣物は、表１のタンパク質又は表２のタンパク質に結合する別のタンパク質の模倣物である。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行し得る。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行するわけではない。
本明細書で使用される場合、２つ以上のタンパク質（例えば、表１のタンパク質及び表２のタンパク質）の相互の「結合を可能にする条件」という用語は、２つ以上のタンパク質がモジュレーター又は候補モジュレーターの非存在下で相互作用するであろう条件（例えば、タンパク質濃度、温度、ｐＨ、塩濃度）を指す。結合を可能にする条件は個々のタンパク質によって異なり、タンパク質間相互作用アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴アッセイ、バイオレイヤー干渉法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、細胞外相互作用アッセイ、及び細胞表面相互作用アッセイ）の間で異なる可能性がある。
用語「生存期間」は、生存している患者を指し、全生存期間及び無増悪生存期間を含む。
本明細書で使用される場合、「無再発生存期間」又は「ＲＦＳ」は、がんの一次治療後、患者がそのがんの徴候又は症状なしに生存する時間の長さを指す。ＲＦＳは「無病生存期間」又は「ＤＦＳ」とも呼ばれることがある。いくつかの態様では、無病生存期間（ＲＦＳ）は、無作為化（例えば、補助療法群への割り当て）から疾患（例えば、がん）の再発、疾患（例えば、がん）の新たな発生、又は何らかの原因による死亡までの期間と定義される。
本明細書で使用される場合、「無増悪生存期間」（ＰＦＳ）は、治療されている疾患（例えばがん）が悪化しない治療中及び治療後の時間の長さを指す。無増悪生存期間は、患者が完全寛解又は部分寛解を経験した時間の量、並びに患者が安定した疾患を経験した時間の量を含み得る。
本明細書で使用される場合、「全生存期間」又は「ＯＳ」は、特定の期間後に生存する可能性が高いグループ内の個体のパーセンテージを指す。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。ただし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、ユーザー文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、ここで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされていなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの（又はこれに対する）％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと（又はこれに対して）特定の％アミノ酸配列同一性を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａ、ということもできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理学の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの態様では、薬剤（例えば、モジュレーター、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト、又はＣＤ１７７活性のアゴニスト）は、疾患の発症を遅らせるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「対象」又は「個体」は哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。特定の態様では、対象又は個体はヒトである。
本明細書で使用される場合、「投与すること」は、化合物の投薬量を対象に与える方法を意味する。いくつかの態様では、本明細書の方法で利用される組成物は、静脈内投与される。本明細書に記載される方法で利用される組成物は、例えば、筋肉内に、静脈内に、皮内に、経皮的に、動脈内に、腹膜内に、病変内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹膜に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、経口的に、局所的に、局在的に、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所灌流浴標的細胞により直接に、カテーテルにより、灌流により、クリーム中で、又は脂質組成物中で投与することができる。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物若しくは組成物、及び治療される状態、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化し得る。
本明細書で使用される用語「試料」は、例えば、物理的、生化学的、化学的及び／又は生理学的特性に基づいて特徴づけられる及び／又は同定される細胞実体及び／又は他の分子実体を含有する、目的の対象及び／又は個体から得られるか又は由来する組成物を指す。例えば、「疾患試料」という句及びその変形は、特徴づけられるべき細胞及び／又は分子実体を含有することが期待されるか又は含有することが知られている、目的の対象から得られた任意の試料を指す。試料は、限定されないが、組織試料、初代若しくは培養細胞又は細胞株、細胞上清、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳汁、全血、血漿、血清、血液由来細胞、尿、脳脊髄液、唾液、頬スワブ、痰、涙液、発汗、粘液、腫瘍溶解物、及び組織培養培地、ホモジナイズした組織などの組織抽出物、腫瘍組織、細胞抽出物、及びそれらの組み合わせを含む。試料は、アーカイブ試料、新鮮な試料、又は凍結試料であってよい。いくつかの態様では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。
ＩＩ． タンパク質間相互作用を同定する方法
Ａ．タンパク質間相互作用のアッセイ
２つのタンパク質間の相互作用は、酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）アッセイ及び／又は生化学的精製アッセイ（例えば、アフィニティー精製‐質量分析（ＡＰ／ＭＳ））を使用して一般的に試験される；しかし、これらの方法は細胞表面タンパク質間の相互作用を試験するのに十分に適していない。細胞表面タンパク質は、細胞質及び／又は核質に溶解しないことが多く（例えば、疎水性膜貫通領域のため）、したがってＹ２Ｈアッセイには不適切である。さらに、細胞表面タンパク質間の相互作用は、しばしば低親和性且つ／又は非常に一過性であり、例えば、半減期が１秒未満であり、したがって、長い精製プロトコル（例えば、ＡＰ／ＭＳ）を含むアッセイとは適合しない（Bushell et al., Genome Res, 18: 622-630, 2008）。本明細書に記載されているタンパク質間相互作用アッセイ、例えば、細胞外相互作用アッセイ及び細胞表面相互作用アッセイは、細胞表面タンパク質と適合性があり、したがって、これらのタンパク質間の新規な相互作用を同定することができる。
ｉ．細胞外相互作用アッセイ
本発明のいくつかの態様では、タンパク質間相互作用アッセイは、細胞外相互作用アッセイ、例えば、結合活性に基づく細胞外相互作用スクリーニング（ＡＶＥＸＩＳ）である（Bushell et al., Genome Res, 18: 622-630, 2008; Martinez-Martin et al.,J Immunol Res, 2197615, 2017）。このタイプのアッセイでは、１つ又は複数のプレイタンパク質（例えば、１つ又は複数のＳＴＭ受容体）及び１つ又は複数のベイトタンパク質（例えば、１つ又は複数のＩｇＳＦタンパク質）が、以下に記載するように、可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）融合タンパク質として発現され、馴化培地で相互作用について（例えば、比色アッセイを使用して）アッセイされる。
ｉａ．プレイタンパク質の細胞外相互作用アッセイ
いくつかの態様では、１つ又は複数のプレイタンパク質は、１つ又は複数の融合タンパク質（例えば、プレイ融合タンパク質のライブラリ）を含み、その融合タンパク質中では、目的のプレイタンパク質（例えば、ＳＴＭタンパク質）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、プレイ融合タンパク質が可溶性であるように、１つ又は複数の付加的な部分（例えば、ＩｇＧ又はＦｃタグ、例えば、ヒトＦｃタグ）にコンジュゲート（例えば、融合）されている。ＥＣＤは、セクション２Ｂ（ｉ）に記載されているように同定することができる。
ｉｂ．ベイトタンパク質の細胞外相互作用アッセイ
いくつかの態様では、ベイトタンパク質（クエリタンパク質）は、１つ又は複数の融合タンパク質（例えば、ベイト融合タンパク質のライブラリ）を含み、その融合タンパク質中では、目的のベイトタンパク質のＥＣＤが、ベイト融合タンパク質が可溶性であるように、１つ又は複数の付加的な部分にコンジュゲート（例えば、融合）されている。付加的な部分はまた、例えば、ベイトタンパク質ＥＣＤを多量体化することによって、プレイタンパク質に対するベイト融合タンパク質の結合活性を増加させ得る。結合活性の増大は、低親和性相互作用の検出を増加させ得る。いくつかの態様では、付加的な部分又は複数の部分は、ベイトタンパク質ＥＣＤの五量体化を引き起こす。いくつかの態様では、付加的な部分はラット軟骨オリゴマー維持タンパク質（ＣＯＭＰ）の五量体化ドメインである。ＥＣＤは、セクション２Ｂ（ｉ）に記載されているように同定することができる。
ベイトタンパク質はまた、ベイトタンパク質、例えば、ベータラクタマーゼ（β－ラクタマーゼ）タンパク質の検出を可能にする部分にコンジュゲートされ得る。β－ラクタマーゼは基質であるニトロセフィンを加水分解し、黄色から赤色への色の変化を生じ、これを比色分析法（例えば、４８５ｎｍにおける吸光度の測定）で検出することができる。
いくつかの態様では、ベイト融合タンパク質は、ＣＯＭＰ五量体化ドメイン及びβ－ラクタマーゼタンパク質の両方を含む。
ｉｃ．発現
ベイト融合タンパク質及び／又はプレイ融合タンパク質は、細胞内で発現され得る（例えば、トランスフェクトされ得、例えば、一時的にトランスフェクトされ得る）。細胞は、ヒト細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞（例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞）であり得る。いくつかの態様では、ベイト融合タンパク質及び／又はプレイ融合タンパク質は、馴化培地、例えば、トランスフェクトされた細胞の馴化培地、例えば、トランスフェクトされたヒト細胞の馴化培地において発現される。ヒト細胞における発現は、翻訳後修飾（例えば、ジスルフィド結合、１つ又は複数のグリカンの付加）が起こる可能性を増加させ、したがって、機能的に関連する相互作用が検出される可能性を増加させ得る。
細胞は、増殖の期間（例えば、７日間）後に、馴化培地から（例えば、遠心分離により）除去することができ；ベイト融合タンパク質及び／又はプレイ融合タンパク質は、細胞が除去された馴化培地（例えば、遠心分離工程の上清）中に存在する。
ｉｄ．相互作用のアッセイ
プレイ融合タンパク質は、馴化培地から捕捉され得、例えば、プロテインＡとプレイ融合タンパク質のＦｃタグとの間の親和性に基づいて、プロテインＡでコーティングされた基質上に捕捉され得る。基質は、ウェル、例えば、３８４ウェルプレートのウェルであり得る。
ベイト融合タンパク質は、馴化培地中で直接アッセイされ得る。相互作用のアッセイを実施する前に、例えば希釈により、ベイトタンパク質の濃度を正規化することができる。
タンパク質間相互作用アッセイを実施するために、ベイトタンパク質を含む溶液を、プレイタンパク質を含む１つ又は複数の基質に（例えば、３８４ウェルプレートの１つ又は複数のウェルに）加えることができる。次いで、このアッセイをインキュベートし、１回以上洗浄して、結合していないベイトタンパク質を除去することができる。ベイト融合タンパク質がβ－ラクタマーゼを含む態様では、ベイト融合タンパク質とプレイ融合タンパク質との間の相互作用は、基質ニトロセフィンの添加及びニトロセフィン加水分解の測定によって、例えば、４８５ｎｍでの吸光度を測定することによって検出され得る。比較的高い吸光度は、ベイト融合タンパク質が保持されていること、すなわち、ベイト融合タンパク質とプレイ融合タンパク質が相互作用していることを示している。
いくつかの態様では、アッセイは定量的であり、吸光度のレベルを使用して、相互作用の相対的強度を測定することができる（例えば、図６Ｇのように）。
ｉｅ．自動細胞外相互作用スクリーニング
細胞外相互作用アッセイは、ハイスループットアッセイ、例えばスクリーニングであり得る。スクリーニングには、１から１５００を超えるプレイ融合タンパク質（例えば、１を超える、１０を超える、１００を超える、２５０を超える、５００を超える、７５０を超える、１０００を超える、１２５０を超える、又は１５００を超えるプレイ融合タンパク質）及び１から１５００を超えるベイト融合タンパク質（例えば、１を超える、１０を超える、１００を超える、２５０を超える、５００を超える、７５０を超える、１０００を超える、１２５０を超える、又は１５００を超えるベイト融合タンパク質）が含まれ得る。いくつかの態様では、このアッセイは統合されたロボットシステムを使用する。いくつかの態様では、アッセイは、１つ又は複数の３８４ウェルプレートにおいて実施される。いくつかの態様では、アッセイは、相互作用が生じたかどうかを決定するために、例えば教師つき分類アルゴリズムのような計算パイプラインによって評価される。
ｉｉ．細胞表面相互作用アッセイ
本発明のいくつかの態様では、タンパク質間相互作用アッセイは、細胞表面相互作用アッセイである。このタイプのアッセイでは、１つ又は複数のプレイタンパク質（例えば、１つ又は複数のＳＴＭ受容体）が、細胞表面上の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）融合タンパク質として発現され、そして例えば、ベイトタンパク質が蛍光タグを含む蛍光アッセイを使用して、可溶性細胞外ドメインとして発現される１つ又は複数のベイトタンパク質（例えば、ＩｇＳＦタンパク質又はＰＤＰＮ）との相互作用について試験される。
いくつかの態様では、本発明は、タンパク質間相互作用を同定するための方法であって、（ａ）ポリペプチドのコレクションを提供することであって、ここで、各ポリペプチドは、細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含み、ここで、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質の全て又はサブセットの細胞外ドメインを含み、任意選択で、前記ポリペプチドは、１つ又は複数の固体表面、例えば、プレート又はプレートのセットのウェル上に固定化される（例えば、付着される又は固定される）、提供すること；（ｂ）多量体化されたクエリタンパク質とポリペプチドの細胞外ドメインの少なくとも１つとの結合を可能にする条件下で、工程（ａ）のコレクションを多量体化されたクエリタンパク質と接触させること；及び（ｃ）多量体化されたクエリタンパク質と少なくとも１つの細胞外ドメインとの間の相互作用を検出し、それによってタンパク質間相互作用を同定すること、を含む方法を含む。ポリペプチドの各々は、１つ又は複数の固体表面上の別個の位置（例えば、別個に探索可能な位置、例えば、本明細書に記載される方法によって別個に探索可能な位置）に局在化（例えば、固定化）され得る。例えば、各々の別個の位置は、ポリペプチドを提示する１つ又は複数の細胞を含み得る。方法で使用され得るポリペプチドの例示的なコレクションは、セクションＩＩＢに記載されている。
いくつかの態様では、本発明は、タンパク質間相互作用を同定するための方法であって、（ａ）多数の位置を含む固体表面又は固体表面のセットを提供し、位置の各々は、ポリペプチドのコレクションからの一意のポリペプチドを含み、ここで、各ポリペプチドは、細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含み、ここで、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質の全て又はサブセットの細胞外ドメインを含む、提供すること；（ｂ）工程（ａ）の固体表面を、多量体化されたクエリタンパク質とポリペプチドの細胞外ドメインとの結合を可能にする条件下で、多量体化されたクエリタンパク質と接触させること；及び（ｃ）多量体化されたクエリタンパク質とポリペプチドのコレクションからの少なくとも１つのポリペプチドとの間の相互作用を検出し、それによってタンパク質間相互作用を同定すること、を含む方法を含む。
いくつかの態様では、固体表面又は固体表面のセットは、合わせて少なくとも９６５の位置を含み、位置の各々はポリペプチドのコレクションからの一意のポリペプチドを含み、ここで、各ポリペプチドは細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含み、ここで、ポリペプチドのコレクションは表７のタンパク質の少なくとも８１％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、位置の各々は、一意のポリペプチドを提示する細胞、例えば、哺乳動物細胞を含む。いくつかの態様では、細胞は、一意のポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトされており、例えば、一過性にトランスフェクトされている。いくつかの態様では、一過性トランスフェクションは半自動化されている。
いくつかの態様では、多量体化されたクエリタンパク質は、セクションＩＩＡ（ｉｉｂ）に記載されているクエリタンパク質である。多量体化されたクエリタンパク質は、例えば、二量体化、三量体化、四量体化、又は五量体化されたクエリタンパク質であり得る。いくつかの態様では、多量体化されたクエリタンパク質は、四量体化されたクエリタンパク質である。多量体化されたクエリタンパク質は、クエリタンパク質の単離された細胞外ドメインを含み得る。例えば、単離された細胞外ドメインは、ビオチン化され、蛍光ストレプトアビジンにコンジュゲートさせて、クエリタンパク質を四量体化することができる。
いくつかの態様では、タンパク質間相互作用は、セクションＩＩＡ（ｉｉｄ）に記載されているように同定される。
ｉｉａ．プレイタンパク質の細胞表面相互作用アッセイ
いくつかの態様では、１つ又は複数のプレイタンパク質は、１つ又は複数の融合タンパク質（例えば、プレイ融合タンパク質のライブラリ）を含み、その融合タンパク質中では、目的のプレイタンパク質（例えば、ＳＴＭタンパク質）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、プレイ融合タンパク質が可溶性であるように、１つ又は複数の付加的な部分（プレイ融合タンパク質が細胞表面に発現されるように、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）－ｇＤ（ｇＤＧＰＩ）タグ）にコンジュゲート（例えば、融合）されている。ＥＣＤは、セクション２Ｂ（ｉ）に記載されているように同定され得る。
ポリペプチドが細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含むいくつかの態様では、アンカーは、細胞外ドメインを細胞の原形質膜の表面に係留することができる。いくつかの態様では、アンカーは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチドである。いくつかの態様では、アンカーは、タンパク質の脂質化に使用される部分、例えば、システインパルミトイル化、グリシンミリストイル化、リジン脂肪アシル化、コレステロールエステル化、システインプレニル化、又はセリン脂肪アシル化に使用される部分である。
いくつかの態様では、タグは、直接的又は間接的に視覚化され得るか、又は別の方法で検出され得る。例えば、タグは、抗体又は抗体断片を使用して検出することができる部分を含み得、例えば、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）ポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、タグは蛍光タンパク質を含む。
ｉｉｂ．ベイトタンパク質の細胞表面相互作用アッセイ
ベイトタンパク質（クエリタンパク質）は、１つ又は複数の融合タンパク質（例えば、ベイト融合タンパク質のライブラリ）を含み得、その融合タンパク質中では、目的のベイトタンパク質のＥＣＤが、ベイト融合タンパク質が可溶性であるように、１つ又は複数の付加的な部分にコンジュゲートされている。付加的な部分又は複数の部分はまた、例えば、ベイトタンパク質ＥＣＤを多量体化することによって、プレイタンパク質に対するベイト融合タンパク質の結合活性を増加させ得る。結合活性の増大は、低親和性相互作用の検出を増加させ得る。いくつかの態様では、付加的な部分はベイトタンパク質ＥＣＤの四量体化を引き起こす。
いくつかの態様では、ベイト融合タンパク質は、酵素ＴＥＶプロテアーゼの添加によりＦｃタグをタンパク質から切断できるように、Ａｖｉタグ、切断配列（例えば、ＴＥＶ切断配列）、及びＦｃタグを含む。細胞表面相互作用アッセイ用にこのタンパク質を調製するために、Ｆｃタグを切断し、Ａｖｉタグをビオチン化し、ビオチン化ベイト融合タンパク質を蛍光ストレプトアビジン（ＳＡ）、例えばアロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートしたストレプトアビジンにコンジュゲートさせて、蛍光アッセイで検出可能な四量体ベイト融合タンパク質を形成する。
ｉｉｃ．発現
プレイ融合タンパク質は、細胞内で発現され得る（例えば、トランスフェクトされ得、例えば、一過性にトランスフェクトされ得る）。細胞は、ヒト細胞、例えばＣＯＳ７細胞であり得る。トランスフェクトされた細胞は、ウェル、例えば３８４ウェルプレート中のウェルに配置され得る。
ベイト融合タンパク質は、細胞、例えば哺乳動物細胞において発現され得る（例えば、トランスフェクトされ得、例えば、一過性にトランスフェクトされ得る）。ベイト融合タンパク質は、例えばRamani et al., Anal Biochem, 420: 127-138, 2012に記載されているように、標準的なプロトコルを用いて精製され得る。
ｉｉｄ．相互作用のアッセイ
タンパク質間相互作用アッセイを実施するために、ベイトタンパク質（例えば、蛍光ＳＡにコンジュゲートした精製ベイト融合タンパク質）を含む溶液を、プレイタンパク質を発現する細胞を含む１つ又は複数のウェルに（例えば、３８４ウェルプレートの１つ又は複数のウェルに）加えることができる。次いで、このアッセイをインキュベートし、１回以上洗浄して、結合していないベイトタンパク質を除去することができる。次いで、タンパク質間相互作用を維持するために、細胞を、例えば、４％パラホルムアルデヒドで固定することができる。
いくつかの態様では、相互作用を検出することは、固体表面上の位置で、閾値レベルを上回るシグナル、例えば蛍光シグナル（例えば、その位置におけるクエリタンパク質の存在を示すシグナル、例えば、ベイト融合タンパク質（例えば、多量体化クエリタンパク質）によって構成される部分からのシグナル）を検出することを含む。シグナルは、直接的又は間接的に視覚化可能であり得るか、そうでなければ検出可能であり得る。いくつかの態様では、検出は半自動化又は自動化されている。相互作用は、一過性相互作用及び／又は低親和性相互作用、例えば、マイクロモル親和性相互作用であり得る。
ベイト融合タンパク質（例えば、多量体化クエリタンパク質）が蛍光ＳＡを含む態様では、ベイト融合タンパク質とプレイ融合タンパク質との間の相互作用は、蛍光顕微鏡によって検出され得る。比較的高い蛍光は、ベイト融合タンパク質が存在すること、すなわち、ベイト融合タンパク質とプレイ融合タンパク質が相互作用することを示している。
ｉｉｅ．自動細胞表面相互作用スクリーニング
細胞外相互作用アッセイは、ハイスループットアッセイ、例えばスクリーニングであり得る。スクリーニングには、１から１５００を超えるプレイ融合タンパク質（例えば、１を超える、１０を超える、１００を超える、２５０を超える、５００を超える、７５０を超える、１０００を超える、１２５０を超える、又は１５００を超えるプレイ融合タンパク質）及び１から１５００を超えるベイト融合タンパク質（例えば、１を超える、１０を超える、１００を超える、２５０を超える、５００を超える、７５０を超える、１０００を超える、１２５０を超える、又は１５００を超えるベイト融合タンパク質）が含まれ得る。いくつかの態様では、このアッセイは統合されたロボットシステムを使用する。いくつかの態様では、アッセイは、１つ又は複数の３８４ウェルプレートにおいて実施される。いくつかの態様では、アッセイは、相互作用が発生したかどうかを判断するために、カスタム分析モジュールなどの計算パイプラインによって評価される。
ｉｉｉ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法
タンパク質間相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用してアッセイすることもできる。いくつかの態様では、ＳＰＲアッセイは、細胞外相互作用アッセイ又は細胞表面相互作用アッセイ、例えば、ハイスループット細胞外相互作用スクリーニング又はハイスループット細胞表面相互作用スクリーニングにおいて検出されたアッセイを確認又は検証するために使用される。
いくつかの態様では、プレイタンパク質は、付加的な部分、例えば、Ｆｃタグに結合したタンパク質のＥＣＤを含む融合タンパク質として発現される。プレイ融合タンパク質は精製され得る。プレイタンパク質は、アミンカップリングによって、センサーチップ、例えばＧＬＣ又はＣＭ５センサーチップ上に固定され得る。
ベイトタンパク質は、可溶性形態、例えば、可溶性タグに融合されたＥＣＤとして提供され得る。ベイト融合タンパク質は精製され得る。
Ｂ．タンパク質、ベクター、及び細胞ライブラリ
本発明においてアッセイされるタンパク質には、細胞表面タンパク質、例えば、ＳＴＭ受容体及びＩｇＳＦタンパク質が含まれる。タンパク質は、完全長タンパク質（例えば、分泌タンパク質）、完全長タンパク質の１つ若しくは複数のドメイン若しくは領域（例えば、細胞外ドメイン）、又は目的のタンパク質の１つ若しくは複数のドメイン及び１つ若しくは複数の付加的なポリペプチド配列を含む融合タンパク質であり得る。いくつかの態様では、タンパク質は、目的のタンパク質、例えば、ＳＴＭ受容体又はＩｇＳＦタンパク質の細胞外ドメイン、及び１つ又は複数の付加的なポリペプチド配列、例えば、タンパク質をアッセイで使用することを可能にする付加的なポリペプチド配列を有する融合タンパク質である。タンパク質は、「ライブラリ」、すなわち、共有フォーマット、構築、又は修飾を有する特定のクラスのタンパク質（すなわち、ＳＴＭ受容体又はＩｇＳＦタンパク質）のコレクションに分類され得る（例えば、目的のタンパク質のＥＣＤ、及び同一又は類似の付加的なポリペプチド配列を含む融合タンパク質）。ライブラリの特定の例を以下に記載する。
ｉ．細胞外ドメイン
いくつかの態様では、タンパク質は、完全長タンパク質の１つ又は複数のドメイン、例えば細胞外ドメイン（ＥＣＤ）として発現される。ＥＣＤは、細胞の原形質膜の外側に局在すると予測されるタンパク質のドメインである。したがって、タンパク質のこのドメインは、細胞外環境と相互作用するために利用可能であり、例えば、可溶性タンパク質及び細胞上又は隣接する細胞上の他のタンパク質のＥＣＤと相互作用する。いくつかの態様では、ＥＣＤは可溶性である。
タンパク質の１つ又は複数のＥＣＤは、バイオインフォマティクス分析、例えばＵｎｉＰｒｏｔ注釈の分析によって同定され得る。例えば、ＥＣＤの境界は、隣接する予測される膜貫通領域、例えば、膜貫通ヘリックスの境界に対して同定され得る。いくつかの態様では、細胞外ドメインの存在は、タンパク質が原形質膜に輸送されることを示すドメイン、配列、又はモチーフ、例えば、シグナル配列又はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合部位の存在によって予測され得る。
いくつかの態様では、細胞外ドメインは、完全長タンパク質との関連において発現される。他の態様では、細胞外ドメインは、単離された細胞外ドメイン、例えば、細胞外であると予測されるタンパク質のアミノ酸残基のみを含むアミノ酸残基の配列として発現される。いくつかの態様では、単離された細胞外ドメインは融合タンパク質で発現される。
ｉａ．ＥＣＤ融合タンパク質
いくつかの態様では、単離されたＥＣＤは融合タンパク質に含まれ、例えば、１つ又は複数の他のポリペプチド配列を含むポリペプチド鎖の一部として発現される。単離されたＥＣＤは、溶解性、発現の容易さ、捕捉の容易さ、多量化など、１つ又は複数の望ましい特性を付与又は向上させる１つ又は複数の部分に直接的又は間接的に融合され得る。いくつかの態様では、ＥＣＤ融合タンパク質は、アッセイ、例えば、細胞外相互作用アッセイ、細胞表面相互作用アッセイ、又は表面プラズモン共鳴アッセイにおける使用のためのものであり得る。
いくつかの態様では、ＥＣＤ融合タンパク質は単量体である。他の態様では、ＥＣＤ融合タンパク質は、多量体、例えば四量体又は五量体である。いくつかの態様では、ＥＣＤはヒトＩｇＧに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤはヒトＦｃタグに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤはＡｖｉタグに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤはポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグに融合される。いくつかの態様では、ＥＣＤは（ＧＰＩ）－ｇＤ（ｇＤＧＰＩ）タグに融合される。他の態様では、ＥＣＤは、例えばBushell et al., Genome Res, 18: 622-630, 2008に記載されているように、ラット軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の五量体化ドメイン及びβ－ラクタマーゼタンパク質に融合される。
いくつかの態様では、ＥＣＤ融合タンパク質は、１つ又は複数のドメインの選択的除去を可能にするために、切断配列、例えば、ＴＥＶ切断配列をさらに含む。いくつかの例では、切断配列で切断可能なＡｖｉタグ及びＦｃタグを有するＥＣＤ融合タンパク質をさらに処理して、Ｆｃタグを除去し、Ａｖｉタグをビオチン化し、ビオチン化ＥＣＤ融合タンパク質を蛍光ストレプトアビジン（ＳＡ）に融合させ、例えば、四量体化ＥＣＤ融合タンパク質を形成する。いくつかの例では、単離されたＥＣＤ又はＥＣＤ融合タンパク質は精製される。
いくつかの態様では、融合タンパク質は、本明細書に記載の他のポリペプチド配列の１つ又は複数に融合されたタンパク質の完全配列（例えば、分泌されたタンパク質の完全配列、例えば、分泌されたＩｇＳＦタンパク質）を含む。
ｉｉ．ＳＴＭ受容体
単一膜貫通（ＳＴＭ）受容体タンパク質は、原形質膜を通過する単一ドメインを有する膜結合受容体の大きなカテゴリである。多くのＳＴＭ受容体は細胞表面に発現しているため、細胞外インタラクトームに関与している可能性がある。例示的なＳＴＭ受容体が、表５、表７、及び表８並びにMartinez-Martin et al., Cell, 174(5): 1158-1171, 2018及びClark et al., Genome Res, 13: 2265-2270, 2003に提供される。
ＳＴＭライブラリに含まれるＳＴＭ受容体は、バイオインフォマティクス分析によって、例えば、タンパク質の特徴、例えば、タンパク質ドメイン及び細胞内局在を予測するためのアルゴリズムを使用することによって同定された。タンパク質ドメイン及び／又は細胞内局在を予測するための例示的なアルゴリズムには、ＴＭＨＭＭ及びＳｉｇｎａｌＰサーバー（デンマーク大学）及びＰｈｏｂｉｕｓ（ストックホルムバイオインフォマティクスセンター）が含まれる。
いくつかの態様では、ＳＴＭ受容体は、ＵｎｉＰｒｏｔ注釈の「ロイシンリッチ」、「システインリッチ」、「ＩＴＩＭ／ＩＴＡＭ」（免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ／免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）、「ＴＮＦＲ」（腫瘍壊死因子受容体）、「ＴＬＲ／ＩＬＲ」（Ｔｏｌｌ様受容体／インターロイキン受容体）、「セマフォリン」、「キナーゼ様」、「Ｉｇ様」（免疫グロブリン様）、「フィブロネクチン」、「エフリン」、「ＥＧＦ」、「サイトカインＲ」、又は「カドヘリン」を有する。
ｉｉａ．細胞外相互作用アッセイのためのＳＴＭ受容体ライブラリ
いくつかの態様では、本発明は、細胞外相互作用アッセイにおける使用のためのＳＴＭ受容体ライブラリを特徴とする。このライブラリに含まれるタンパク質は表５に記載されており、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉａ）に記載されているように構築された「プレイ」融合タンパク質である。
ｉｉｂ．細胞表面相互作用アッセイのためのＳＴＭ受容体ライブラリ
いくつかの態様では、本発明は、細胞表面相互作用アッセイにおける使用のためのＳＴＭ受容体ライブラリを特徴とする。このライブラリに含まれるタンパク質は表７に記載されており、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉｉａ）に記載されているように構築された「プレイ」融合タンパク質である。
ポリペプチドライブラリ
いくつかの態様では、本発明は、ポリペプチドのコレクション（例えば、ポリペプチドライブラリ）を特徴とし、ここで、各ポリペプチドは、細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含み、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質の全て又はサブセットの細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、アンカーはポリペプチドのＮ末端にあり、細胞外ドメインはポリペプチドのＣ末端にある。他の態様では、アンカーはポリペプチドのＣ末端にあり、細胞外ドメインはポリペプチドのＮ末端にある。いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８１％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８１％から１００％の細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％を含み（例えば、全てを含む）、例えば、表７のタンパク質のうちの８１％～８５％、８３％～８７％、８５％～８９％、８７％～９１％、８９％～９３％、９１％～９５％、９３％～９７％、９５％～９９％、又は１００％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８０％から８１％の細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８０．１％、８０．２％、８０．３％、８０．４％、８０．５％、８０．６％、８０．７％、８０．７５％、８０．８％、又は８０．９％を含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１０５０、少なくとも１１００、少なくとも１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインを含み、例えば、表７のポリペプチドのうちの１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１０５０、１０５０～１１００、１１００～１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも９６５個から少なくとも９７０個の細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、又は９７０個の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表１７のタンパク質のうちの少なくとも１つの細胞外ドメインを含み、例えば、表１７のタンパク質のうちの少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、又は２３１個全ての細胞外ドメインを含み、例えば、表１７のポリペプチドのうちの１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１０１～１０５、１０５～１１０、１１０～１１５、１１５～１２０、１２０～１２５、１２５～１３０、１３０～１３５、１３５～１４０、１４０～１４５、１４５～１５０、１５０～１５５、１５５～１６０、１６０～１６５、１６５～１７０、１７０～１７５、１７５～１８０、１８０～１８５、１８５～１９０、１９０～１９５、１９５～２００、２００～２０５、２０５～２１０、２１０～２１５、２１４～２２０、２２０～２２５、２２５～２３０、又は２３１個全ての細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、プレイタンパク質（例えば、ＳＴＭタンパク質）の細胞外ドメインは、天然のコンホメーション、例えば、野生型タンパク質において観察されるコンホメーションを有する。いくつかの態様では、プレイタンパク質（例えば、ＳＴＭタンパク質）の細胞外ドメインは、天然の翻訳後修飾を含む。
いくつかの態様では、細胞はＣＯＳ７細胞である。
いくつかの態様では、細胞は、ポリペプチドをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトされている。
プラスミドライブラリ
いくつかの態様では、本発明は、各々が細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含むポリペプチドをコードするベクター（例えば、プラスミド）のコレクションを含み、ここで、該ベクターによってコードされるポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質の全て又はサブセットの細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を含むポリペプチドのコレクションをコードする。プラスミドによってコードされ得るポリペプチドの例示的なコレクションは、セクションＩＩＢに記載されている。
いくつかの態様では、ベクターによってコードされるポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８１％を含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８１％から１００％の細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８５％、９０％、９５％、又はは１００％を含み（例えば、全てを含む）、例えば、表７のタンパク質のうちの８１％～８５％、８３％～８７％、８５％～８９％、８７％～９１％、８９％～９３％、９１％～９５％、９３％～９７％、９５％～９９％、又は１００％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ベクターによってコードされるポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１０５０、少なくとも１１００、少なくとも１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ベクターによってコードされるポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも９６５個を含む。いくつかの態様では、ベクターによってコードされるポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも９６５個から少なくとも９７０個の細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、又は９７０個の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ベクターによってコードされるポリペプチドのコレクションは、表１７のタンパク質のうちの少なくとも１つの細胞外ドメインを含み、例えば、表１７のタンパク質のうちの少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、又は２３１個全ての細胞外ドメインを含み、例えば、表７のポリペプチドのうちの１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１０１～１０５、１０５～１１０、１１０～１１５、１１５～１２０、１２０～１２５、１２５～１３０、１３０～１３５、１３５～１４０、１４０～１４５、１４５～１５０、１５０～１５５、１５５～１６０、１６０～１６５、１６５～１７０、１７０～１７５、１７５～１８０、１８０～１８５、１８５～１９０、１９０～１９５、１９５～２００、２００～２０５、２０５～２１０、２１０～２１５、２１４～２２０、２２０～２２５、２２５～２３０、又は２３１個全ての細胞外ドメインを含む。
細胞ライブラリ
いくつかの態様では、本発明は、上記のベクター（例えば、プラスミド）で形質転換された細胞のコレクション、すなわち、各々が細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含むポリペプチドをコードするベクターで形質転換された細胞のコレクションを含み、ここで、該ベクターによってコードされるポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質の全て又はサブセットの細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の細胞外ドメインを含む。細胞によって含まれ得るポリペプチドの例示的なコレクションは、セクションＩＩＢに記載されている。
いくつかの態様では、細胞に含まれるベクターのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８１％の細胞外ドメインをコードし、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８１％から１００％の細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８５％、９０％、９５％、又はは１００％を含み（例えば、全てを含む）、例えば、表７のタンパク質のうちの８１％～８５％、８３％～８７％、８５％～８９％、８７％～９１％、８９％～９３％、９１％～９５％、９３％～９７％、９５％～９９％、又は１００％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、細胞に含まれるベクターのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１０５０、少なくとも１１００、少なくとも１１５０、又は１１９５個全ての細胞外ドメインをコードする。
いくつかの態様では、細胞に含まれるベクターのコレクションは、表７のタンパク質のうち少なくとも９６５個をコードする。
いくつかの態様では、細胞に含まれるベクターのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも９６５個から少なくとも９７０個の細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、又は９７０個の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、細胞に含まれるベクターのコレクションは、表１７のタンパク質のうちの少なくとも１つの細胞外ドメインを含み、例えば、表１７のタンパク質のうちの少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、又は２３１個全ての細胞外ドメインを含み、例えば、表１７のポリペプチドのうちの１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１０１～１０５、１０５～１１０、１１０～１１５、１１５～１２０、１２０～１２５、１２５～１３０、１３０～１３５、１３５～１４０、１４０～１４５、１４５～１５０、１５０～１５５、１５５～１６０、１６０～１６５、１６５～１７０、１７０～１７５、１７５～１８０、１８０～１８５、１８５～１９０、１９０～１９５、１９５～２００、２００～２０５、２０５～２１０、２１０～２１５、２１４～２２０、２２０～２２５、２２５～２３０、又は２３１個全ての細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、細胞のコレクションの各細胞は、それが形質転換されたベクターによってコードされるポリペプチドを発現することができる。いくつかの態様では、細胞のコレクションの複数の細胞の各々は、それが形質転換されたベクターによってコードされるポリペプチドを発現することができる。
ｉｉｃ．ＰＤＰＮ
ポドプラニン（ＰＤＰＮ）はＳＴＭ受容体である。ＰＤＰＮは、線維芽細胞（がん関連線維芽細胞など）、リンパ管内皮細胞、及びＩ型肺胞細胞の表面上に高度に発現され得る。ＰＤＰＮは多くの腫瘍組織において過剰発現しており、腫瘍組織における発現は予後不良と関連している。ＰＤＰＮは、Ｃ型レクチン受容体ＣＬＥＣ－２（ＣＬＥＣ１Ｂ）との相互作用を介して、マウス線維芽細胞におけるアクトミオシン収縮性の主要制御因子として機能することが知られている（Astarita et al., Nat Immunol, 16: 75-84, 2015; Acton et al., Nature, 514: 498-502, 2014）。いくつかの態様では、ＰＤＰＮはヒトＣＡＦのアクトミオシン収縮性の制御因子として機能する。
細胞表面相互作用アッセイのためのＰＤＰＮ
いくつかの態様では、本発明は、細胞表面相互作用アッセイにおける使用のためのＰＤＰＮ融合タンパク質を特徴とする。このタンパク質は、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉｉｂ）に記載されているように構築された「ベイト」融合タンパク質である。
ｉｉｉ．ＩｇＳＦタンパク質
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、ヒトゲノムによってコードされる分泌型及び細胞表面発現型タンパク質の最大のファミリーであり、ヒトにおいて最も高度に示される細胞外タンパク質ドメインである。ＩｇＳＦタンパク質は、例えば、軸索ガイダンスの調節、シナプス可塑性の調節、細胞遊走の制御、細胞接着の制御、及び自己認識と非自己認識などの広範な機能性を媒介する同種親和性及びヘテロ親和性複合体の形成を通じて機能することが知られている。このように、これらのタンパク質は医薬品開発の取り組みの主要な焦点となっている。一部のＩｇＳＦタンパク質は細胞表面上に発現しており（例えば、膜貫通タンパク質）；他は分泌される。例示的なＩｇＳＦタンパク質は、表４及びOzkan et al., Cell, 154(1): 228-239, 2013に提供される。
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ライブラリは、少なくとも１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン又は免疫グロブリンフォールドを含有するタンパク質を含み、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに「免疫グロブリン様スーパーファミリー」という注釈を有するか、又は別の方法でそのようなタンパク質と構造的若しくは機能的類似性を有することが示されるタンパク質を含む。いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース内のタンパク質の注釈「免疫グロブリン様ドメインスーパーファミリー」によって同定される。いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は、主要な生物学的活性におけるタンパク質の関与に基づいて同定される。
いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ注釈「ＴＦＮＲ」（転写因子様核制御因子）、「ＴＬＲ／ＩＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体／インターロイキン受容体）」、「セマフォリン」、「キナーゼ様」、「ＩｇＳＦ／Ｉｇ様フォールド」、「Ｉｇ様フォールド」、「フィブロネクチン」、「エフリン」、「ＥＧＦ」、「サイトカインＲ」、又は「カドヘリン」を有する。
いくつかの態様では、ＩｇＳＦスーパーファミリータンパク質は、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１；ＣＤ２７４）、プログラム細胞死１リガンド２（ＰＤ－Ｌ２；ＣＤ２７４；ＰＤＣＤ１ＬＧ２）、受容体型チロシンプロテインホスファターゼデルタ（ＰＴＰＲＤ）、受容体型チロシンプロテインホスファターゼＳ（ＰＴＰＲＳ）、受容体型チロシンタンパク質ホスファターゼＦ（ＰＴＰＲＦ）、神経細胞接着分子Ｌ１様タンパク質（「Ｌ１の近接ホモログ」；ＣＨＬ１）、コンタクチン１１（ＣＮＴＮ１）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー３（ＬＩＬＲＢ３）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー４（ＬＩＬＲＢ４）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー５（ＬＩＬＲＢ５）、ＭＡＭドメイン含有グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質１（ＭＤＧＡ１）、又はチロシンプロテインキナーゼ受容体ＡＸＬである。
ｉｉｉａ．細胞外相互作用アッセイのためのＩｇＳＦライブラリ
いくつかの態様では、本発明は、細胞外相互作用アッセイにおける使用のためのＩｇＳＦ受容体ライブラリを特徴とする。このライブラリに含まれるタンパク質は表４に記載されており、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉｂ）に記載されているように構築された「ベイト」融合タンパク質である。
ｉｉｉｂ．細胞表面相互作用アッセイのためのＩｇＳＦタンパク質
いくつかの態様では、本発明は、細胞表面相互作用アッセイにおける使用のためのＩｇＳＦ受容体を特徴とする。このライブラリに含まれるタンパク質は表４に記載されており、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉｉｂ）に記載されているように構築された「ベイト」融合タンパク質である。
ｉｖ．ベイトタンパク質及びプレイタンパク質ライブラリ
いくつかの態様では、本発明は、表１に提供されるタンパク質を含むベイトタンパク質ライブラリを特徴とする。タンパク質は、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉｂ）又はセクションＩＩＡ（ｉｉｂ）に記載されている「ベイト」融合タンパク質として構築され得る。
いくつかの態様では、本発明は、表２に提供されるタンパク質を含むプレイタンパク質ライブラリを特徴とする。タンパク質は、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉａ）又はセクションＩＩＡ（ｉｉａ）に記載されている「プレイ」融合タンパク質として構築され得る。
Ｃ．タンパク質間相互作用ネットワーク
いくつかの態様では、ベイトタンパク質（表１）とプレイタンパク質（表２）との間の相互作用は、細胞外相互作用アッセイ（ハイスループット細胞外相互作用スクリーニングを含む）、細胞表面アッセイ（ハイスループット細胞表面相互作用スクリーニングを含む）、及びセクションＩＩＡに記載されているような表面プラズモン共鳴アッセイを使用して試験され得る。いくつかの態様では、アッセイには、１から１５００を超えるプレイタンパク質（例えば、１を超える、１０を超える、１００を超える、２５０を超える、５００を超える、７５０を超える、１０００を超える、１２５０を超える、又は１５００を超えるプレイ融合タンパク質）及び１から１５００を超えるベイトタンパク質（例えば、１を超える、１０を超える、１００を超える、２５０を超える、５００を超える、７５０を超える、１０００を超える、１２５０を超える、又は１５００を超えるベイトタンパク質）が含まれ得る。いくつかの態様では、アッセイは、１から９００の間のタンパク質間相互作用（例えば、１、１を超える、１０を超える、１００を超える、２５０を超える、５００を超える、７５０を超える、８５０を超える、又は９００のタンパク質間相互作用）を同定する。いくつかの態様では、これらの分析は、機能的に関連するタンパク質のこれまで認識されていなかったコミュニティを同定し、オーファンタンパク質の結合パートナーを明らかにし、がんで顕著に調節解除された受容体－リガンド相互作用を明らかにする。
ｉ．ＳＴＭ受容体－ＩｇＳＦインタラクトーム
いくつかの態様では、表４に提供されるＩｇＳＦタンパク質及び表５に提供されるＳＴＭタンパク質は、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉｅ）に記載されているように、ハイスループット細胞外相互作用スクリーニングにおいて相互作用について試験される。いくつかの態様では、ＩｇＳＦタンパク質は（セクションＩＩＢ（ｉｉｉａ）のように）ベイトライブラリとして構築され、ＳＴＭタンパク質は（セクションＩＩＢ（ｉｉａ）のように）プレイライブラリとして構築される。いくつかの態様では、検出された相互作用はネットワークに組み立てられる。いくつかの態様では、選択された相互作用は、例えば、細胞表面相互作用スクリーニング（セクションＩＩａ（ｉｉ）に記載されている）又はＳＰＲアッセイ（セクションＩＩａ（ｉｉ）に記載されている）においてさらに試験される。
ｉａ．ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２と相互作用するタンパク質
ＩｇＳＦタンパク質であるＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）及びＰＤ－Ｌ２（ＰＤＣＤ１ＬＧ２）は免疫チェックポイントタンパク質であり、腫瘍免疫逃避をもたらし得る免疫抑制機能において重要な役割を果たしている（Chen and Mellman, Immunity, 39: 1-10, 2013）。したがって、ＰＤ－Ｌ１を標的とする治療法は研究の主要な焦点となっている。ＰＤ－Ｌ１の抗体遮断は、固形腫瘍の治療のための好ましい免疫療法戦略である；しかしながら、多くの患者はＰＤ－Ｌ１の抗体遮断に対して応答しないか又は持続的な応答を示さず、このことは他の免疫抑制経路を標的とする治療が必要であることを示している。
いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＰＤ－Ｌ１とエフリンＡ型受容体３（ＥＰＨＡ３）との間の相互作用を同定し得る。ＥＰＨＡ３は、エフリンタンパク質の結合によって活性化される受容体型チロシンキナーゼであり、シグナル伝達、並びに細胞の増殖、遊走、及び接着などの複数の細胞プロセスの制御において役割を果たしている（Lisabeth et al., Cold Spring Harb Perspect Biol, 5, 2013）。ＥＰＨＡ３は、特定の腫瘍で最も頻繁に変異する遺伝子の１つとしても同定されている（Andretta et al., Sci Rep, 7: 41576, 2017）。したがって、ＰＤ－Ｌ１とＥＰＨＡ３との間の相互作用の下流効果には、免疫チェックポイント機能の調節、例えば、免疫抑制、及び／又はＥＰＨＡ３キナーゼ機能の調節を含み得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＰＤ－Ｌ２とＣＥＡＣＡＭ４との間の相互作用を同定し得る。ＣＥＡＣＡＭファミリーは、免疫系の調節において役割を有することが示されている：ＣＥＡＣＡＭ１は、抑制性受容体ＴＩＭ－３のリガンドとして同定されている（Huang et al., Nature, 517: 386-390, 2002）。ＣＥＡＣＡＭ４とＰＤ－Ｌ２との間の相互作用は、ＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１非依存性機能、例えば、Liu et al., J Exp Med, 197: 1721-1730, 2003に記載されている機能、例えば、食作用に寄与し得る。したがって、ＰＤ－Ｌ２とＣＥＡＣＡＭ４との間の相互作用の下流効果には、免疫抑制などの免疫チェックポイント機能の調節が含まれ得る（Delgado Tascon et al., J Leukoc Biol, 97: 521-531, 2015; Xiao et al., J Exp Med, 211: 943-959, 2014）。
いくつかの態様では、本明細書に記載の１つ又は複数のアッセイは、ＰＤ－Ｌ２とＣＥＡＣＡＭ４；ＰＤ－Ｌ２とＩＣＡＭ５；ＰＤ－Ｌ２とＮＥＣＴＩＮ３；ＰＤ－Ｌ２とＰＳＧ９；及びＰＤ－Ｌ２とＴＮＦＲＳＦ１１Ａの間の相互作用を同定し得る。
ｉｂ．ＰＴＰＲタンパク質と相互作用するタンパク質
ＰＴＰＲタンパク質ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＳ、及びＰＴＰＲＦは、受容体型チロシンプロテインホスファターゼである。チロシンのリン酸化と脱リン酸化は多数の細胞プロセスを調節し、チロシンのリン酸化／脱リン酸化の異常は腫瘍形成に関連している。特に、ＰＴＰＲＤ及びＰＴＰＲＳは、神経系プロセス、例えばシナプス形成及び軸索成長の重要なモジュレーターとして説明されており、神経芽細胞腫、神経膠腫、結腸がん、及び乳がんにおいて高い変異率を有する腫瘍抑制因子としても同定されている（Veeriah et al., Proc Natl Acad Sci USA, 106: 9435-9440, 2009; Wang et al., Hepatology, 62: 1201-1214, 2015）。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるアッセイは、ＰＴＰＲＳ、ＰＴＰＲＤ、及び／又はＰＴＰＲＦと、ＳＬＩＴ及びＮＴＲＫ様（ＳＬＩＴＲＫ）ファミリーのメンバー（ＳＬＩＴＲＫ１、ＳＬＩＴＲＫ２、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、及びＳＬＩＴＲＫ６など）との間の相互作用を同定し得、且つ、ＰＴＰＲＳ、ＰＴＰＲＦ、及び／又はＰＴＰＲＤと、ロイシンリッチリピート及びフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有タンパク質（ＬＲＦＮ）ファミリーのメンバー、インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）、及び関連タンパク質ＩＬ１ＲＡＰＬ１及びＩＬ１ＲＡＰＬ２との相互作用を同定し得る。ＳＬＩＴＲＫ、ＬＲＦＮ、及びＩＬ１ＲＡＰ様タンパク質は、腫瘍を含む神経系障害に関与している。例えば、ＩＬ１ＲＡＰは、慢性骨髄性白血病幹細胞のバイオマーカーであることが報告されているようにＩＬ－１シグナル伝達に必要である（Zhao et al., Int J Clin Exp Med, 7: 4787-4798, 2014）。したがって、同定された相互作用の下流効果には、ホスファターゼ活性の変化、例えば、チロシンリン酸化／脱リン酸化の変化、例えば、がんを含む疾患に関係するタンパク質のチロシンリン酸化／脱リン酸化が含まれ得る。
いくつかの態様では、１つ又は複数のアッセイは、ＰＴＰＲＤと、ＢＭＰ５、ＣＥＡＣＡＭ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＥＣＴ１、ＬＲＦＮ５、ＳＩＲＰＧ、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、ＳＬＩＴＲＫ６、及びＴＧＦＡとの間の相互作用を同定し得る。ＰＴＰＲＤは、細胞増殖及びＳＴＡＴ３リン酸化の抑制と関連している（Veeriah et al., PNAS, 106(23): 9435-9440, 2009; Peyser et al., PLoS ONE, 10.1371/journal.pone.0135750, 2015）。
いくつかの態様では、１つ又は複数のアッセイは、ＰＴＰＲＳと、Ｃ６ｏｒｆ２５、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＲＦＮ１、ＬＲＦＮ５、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＮＣＡＭ１、ＳＬＩＴＲＫ１、ＳＬＩＴＲＫ２、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、及びＳＬＩＴＲＫ６との間の相互作用を同定し得る。ＰＴＰＲＳは、細胞遊走の抑制（Wang et al., Hepatology, 62(4): 1201-1214, 2015）及びＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化（Suarez Pestana et al., Oncogene, 18: 4069-4079, 1999; Morris et al., PNAS, 108(47): 19024-19029, 2011）と関連している。
いくつかの態様では、１つ又は複数のアッセイは、ＰＴＰＲＦと、ＣＤ１７７、ＩＬ１ＲＡＰ、及びＬＲＦＮ５との間の相互作用を同定し得る。ＰＴＰＲＦは、細胞遊走及びＥＧＦＲのリン酸化の阻害に関連している（Du et al., J Cell Sci, 126: 1440-1453, 2013）。
ＰＴＰＲＤ変異体と相互作用するタンパク質
いくつかの態様では、１つ又は複数のアッセイは、１つ又は複数の疾患関連（例えば、がん関連）変異（ＰＴＰＲＤ変異体）、例えばアミノ酸置換変異又はアミノ酸欠失変異を有するＰＴＰＲＤの形態と、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＲＦＮ４、ＬＲＦＮ５、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＮＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ１、ＳＬＩＴＲＫ３、又はＳＬＩＴＲＫ６との間の相互作用を同定し得る。ＰＴＰＲＤの疾患関連バリエーション（表９）は、ＰＴＰＲＤ ＥＣＤの免疫グロブリン（ＩＧ）ドメインＩＧ１、ＩＧ２、ＩＧ３、及びフィブロネクチン（ＦＮ）ドメインＦＮ１－ＦＮ８に生じる（図６Ｆ）。特定のアミノ酸置換又は欠失変異には、ΔＧ６１ΔＥ１０６（ＩＧ１）、Ｇ２０３ＥＫ２０４Ｅ（ＩＧ２）、Ｒ２３２ＣＲ２３３Ｃ（ＩＧ２）、Ｐ２４９Ｌ（ＩＧ３）、Ｇ２８５Ｅ（ＩＧ３）、Ｅ４０６Ｋ（ＦＮ１）、Ｓ４３１Ｌ（ＦＮ２）、Ｒ５６１Ｑ（ＦＮ３）、Ｐ６６６Ｓ（ＦＮ４）、Ｅ７５５Ｋ（ＦＮ５）、Ｖ８９２Ｉ（ＦＮ６）、Ｓ９１２Ｆ（ＦＮ７）、Ｒ９９５Ｃ（ＦＮ７）、及びＲ１０８８Ｃ（ＦＮ８）が含まれる。いくつかの態様では、ＰＴＰＲＤバリアントは、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉｂ）に記載されるようにベイトタンパク質として発現され、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉ）に記載される細胞外相互作用アッセイにおいてプレイタンパク質との相互作用についてアッセイされる。いくつかの態様では、ＰＴＰＲＤバリアントと結合パートナーとの間の相互作用の強さは、野生型ＰＴＰＲＤタンパク質と結合パートナーとの間の相互作用の強さと比較して減少し得る。他の態様では、相互作用の強さは、バリアント及び野生型ＰＴＰＲＤタンパク質について類似していてもよい。
ｉｃ．ＣＨＬ１及び／又はＣＮＴＮ１と相互作用するタンパク質
神経細胞接着分子Ｌ１様タンパク質（ＣＨＬ１）とコンタクチン１（ＣＮＴＮ１）は、細胞接着分子（ＣＡＭ）として機能するＩｇＳＦタンパク質である。ＣＡＭの過剰発現は、がん患者の予後不良と関連している（Yan et al., Cancer Res., 76(6), 1603-1614, 2016）。
ＣＨＬ１は神経細胞の接着に関与し、中枢神経系（ＣＮＣ）の発達に役割を有する。ＣＨＬ１は、細胞増殖の抑制（Tang et al., Oncogene, doi: 10.1038/s41388-018-0648-7）；腫瘍形成の抑制（Tang et al., Oncogene, doi: 10.1038/s41388-018-0648-7）；及び細胞浸潤の抑制（He et al., Biochem Biophys Res Commun, 438: 433-438, 2013）と関連している。
いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＣＨＬ１とコンタクチン５（ＣＮＴＮ５）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、細胞接着に関与する２つのタンパク質、及びＢ及びＴリンパ球アッテネータ（ＢＴＬＡ）との間の相互作用を特定し得る。
ＣＮＴＮ１のアップレギュレーションは、前立腺がん細胞の浸潤と強く関連している。ＣＮＴＮ１は、細胞増殖の抑制；細胞浸潤の抑制（Yan et al., Cancer Res, 76(6): 1603-1614, 2016）及びＲｈｏＡ及びＡＫＴシグナル伝達経路の活性化（Yan et al, PLoS ONE, 8(5): e65463, 2013; Chen et al., Front Mol Neurosci, 11, Article 422 (2018); Su et al., Cancer Res, 66(5): 2553-2561, 2006）と関連している。
いくつかの態様では、１つ又は複数のアッセイは、ＣＨＬ１と、ＳＩＲＰＡ、ＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ５、Ｌ１ＣＡＭ、及びＴＭＥＭ１３２Ａとの間の相互作用を同定し得る。
いくつかの態様では、１つ又は複数のアッセイは、ＣＮＴＮ１と、ＣＤＨ６、ＣＨＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＰＣＤＨＢ７、及びＳＧＣＧとの間の相互作用を同定し得る。同定された相互作用の下流効果には、細胞接着、例えば神経細胞接着の調節が含まれ得る。
ｉｄ．ＬＩＬＲＢタンパク質と相互作用するタンパク質
白血球免疫グロブリン様受容体Ｂタンパク質（ＬＩＬＲＢ）は、細胞質ゾル免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）の存在を特徴とするＩｇＳＦタンパク質である（Brown et al., Tissue Antigens, 64: 215-225, 2004）。ＬＩＬＬＲタンパク質は、活性化又は抑制性受容体であり得、主に骨髄細胞及びリンパ球で発現され、がん、自己免疫疾患、感染症、及びマクロファージによる食作用における役割と関連している。
いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＬＩＬＬＲＢ５と低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）との間の相互作用を同定し得る。ＬＤＬＲは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のエンドサイトーシスを媒介し、家族性高コレステロール血症及び冠状動脈疾患を含む疾患に関与している。
本明細書に記載のアッセイはまた、ＬＩＬＲＢ１と、ＣＬＥＣ６Ａ、ＣＸＡＤＲ、ＥＤＡＲ、ＦＬＴ４、ＩＬ６Ｒ、ＩＬＤＲ１、及びＬＩＬＲＡ５との間の相互作用を同定し得る。ＬＩＬＲＢ１は、ＭＨＣクラス１－ＬＩＬＲＢ１シグナル伝達軸の構成要素であり、細胞（腫瘍細胞など）を食作用から保護することが示されている（Barkal et al., Nature Immunol, 19: 76-84, 2017）。したがって、同定された相互作用の下流効果には、食作用の調節が含まれ得る（セクションＩＩＩＢ（ｖｉｉ））。ＬＩＬＲＢ１が関与する相互作用のダウンレギュレーションは、食作用の増加、例えば、腫瘍細胞の食作用の増加につながる可能性がある。ＬＩＬＬＲＢ１は、破骨細胞分化とも関連している（Mori et al., J Immunol, 181(7): 4742-4751, 2008）。
本明細書に記載のアッセイはまた、ＬＩＬＲＢ２とＩＧＳＦ８及びＭＯＧとの間の相互作用を同定し得る。ＬＩＬＬＲＢ２は、Ｍ２マクロファージ極性化と関連している（Chen et al., J Clin Invest, 128(12), 5647-5662）。
本明細書に記載のアッセイはまた、ＬＩＬＲＢ３とＬＲＲＣ１５及びＬＹ６Ｇ６Ｆとの間の相互作用を同定し得る。ＬＩＬＬＲＢ３は破骨細胞の分化と関連している（Mori et al., J Immunol, 181(7): 4742-4751, 2008）。
本明細書に記載のアッセイはまた、ＬＩＬＲＢ４とＣＮＴＦＲとの間の相互作用を同定し得る。ＬＩＬＬＲＢ４は破骨細胞の分化と関連している（Mori et al., J Immunol, 181(7): 4742-4751, 2008）。
いくつかの態様では、１つ又は複数のアッセイは、ＬＩＬＬＲＢ５とＡＰＬＰ２、ＣＤ１７７、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＬＤＬＲ、ＰＩＬＲＡ、及びＵＮＣ５Ｃとの間の相互作用を同定し得る。
ｉｅ．ＭＤＧＡ１と相互作用するタンパク質
グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー１（ＭＤＧＡ１）を含むＭＡＭドメインは、神経系で発現するＩｇＳＦタンパク質中にある。いくつかの態様では、本明細書に記載される１つ又は複数のアッセイは、ＭＤＧＡ１とＮＬＧＮ３及びＮＬＧＮ４Ｘとの間の相互作用を同定し得る。
ｉｆ．ＡＸＬと相互作用するタンパク質
チロシン－プロテインキナーゼ受容体ＡＸＬは、自然免疫反応の阻害剤であるＩｇＳＦタンパク質である。ＡＸＬの過剰発現は、多数のがん（例えば、結腸がん、食道がん、甲状腺がん、乳がん、肺がん、肝臓がん、及び星状細胞腫－神経膠芽腫（Verma et al., Mol Cancer Ther, 10(10): 1763-1773, 2011））と関連している。
ＡＸＬは、細胞浸潤の調節（Verma et al., Mol Cancer Ther, 10(10): 1763-1773, 2011）；ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の調節、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の調節及びＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の調節（Verma et al., Mol Cancer Ther, 10(10): 1763-1773, 2011）；細胞運動性及び形態の変化、例えば糸状仮足の形成（Verma et al., Mol Cancer Ther, 10(10): 1763-1773, 2011）；並びに上皮間葉転換（ＥＭＴ）の調節（Gjerdrum et al., PNAS, 107(3): 1124-1129, 2010; Divine et al.; Oncotarget, 7: 77291-77305, 2016; Rankin et al., Cancer Res, 70(19), 7570-7579, 2010; Chichon et al., Oncogene, 33: 4185-4192, 2013）と関連している。
いくつかの態様では、本明細書に記載される１つ又は複数のアッセイは、ＡＸＬとＩＬ１ＲＬ１及びＶＳＩＧ１０Ｌとの間の相互作用を同定し得る。
ｉｇ．ＬＲＲＣ４Ｂと相互作用するタンパク質
いくつかの態様では、本明細書に記載される１つ又はは複数のアッセイは、ＬＲＲＣ４ＢとＢＴＮ３Ａ１又はＢＴＮ３Ａ３との間の相互作用を同定し得る。
ｉｉ．ＳＴＭ受容体とＰＤＰＮとの間の相互作用
いくつかの態様では、表７に提供されるＳＴＭタンパク質は、本明細書のセクションＩＩＡ（ｉｉｅ）に記載されるように、ハイスループット細胞表面相互作用スクリーンにおいてＰＤＰＮとの相互作用について試験され得る。ＰＤＰＮは（セクションＩＩＢ（ｉｉｃ）のように）ベイトタンパク質として構築され得、ＳＴＭタンパク質は（セクションＩＩＢ（ｉｉｂ）のように）プレイライブラリとして構築され得る。いくつかの態様では、選択された相互作用は、ＳＰＲアッセイ（セクションＩＩａ（ｉｉｉ）に記載）でさらに試験され得る。
ポドプラニン（ＰＤＰＮ）は、ＣＡＦにおけるアクトミオシン収縮性の制御因子として機能するＳＴＭ受容体である。いくつかの態様では、本明細書に記載のアッセイは、ＰＤＰＮと、腫瘍常在Ｔｒｅｇのマーカーとして最近同定された好中球受容体である表面抗原分類１７７（ＣＤ１７７）との間の相互作用を同定し得る（Plitas et al., Immunity, 45: 1122-1134, 2016）。いくつかの態様では、１つ又は複数のアッセイは、ＰＤＰＮと、ＣＤ１７７、ＣＬＥＣ－２（ＣＬＥＣ１Ｂ）、及びＳＩＧＬＥＣ７との間の相互作用を同定し得る。
いくつかの態様では、ＰＤＰＮとの相互作用の下流効果（例えば、ＣＬＥＣ－２及び／又はＣＤ１７７とＰＤＰＮとの相互作用）には、線維芽細胞伸長の増加（例えば、ＣＡＦ伸長の増加）及び線維芽細胞収縮性の減少（例えば、ＣＡＦ収縮性の減少）が含まれ得る（セクションＩＩＩＢ（ｉ））。
ＩＩＩ．タンパク質間相互作用のモジュレーターを同定する方法
Ａ．相互作用の調節に関するアッセイ
いくつかの態様では、本発明は、表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定することを特徴とし、該方法は、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＶに記載されている候補モジュレーター）を提供すること；（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、接触させること；及び（ｃ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少は、候補モジュレーターを表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、測定することを含む。
いくつかの態様では、候補モジュレーターは、細胞（例えば、哺乳動物細胞）に、細胞培養培地に、馴化培地に、並びに／又は表１のタンパク質及び／若しくは表２のタンパク質の精製された形態に提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、少なくとも０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、又は１０μＭの濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、０．１ｎＭ～１０μＭの濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、溶液中、例えば、可溶性の形態で提供される。
いくつかの態様では、結合の増加が少なくとも７０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、結合の増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は１００％を超える。いくつかの態様では、結合の増加は少なくとも７０％である。
いくつかの態様では、結合の減少が少なくとも７０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、結合の減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％である。いくつかの態様では、結合の減少は少なくとも７０％である。
ｉ．タンパク質間相互作用の調節のためのアッセイ
いくつかの態様では、候補モジュレーターの存在下又は非存在下における表１のタンパク質及び表２のタンパク質の結合は、タンパク質間相互作用のアッセイにおいて評価される。表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用の調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質間相互作用と比較したモジュレーターの存在下でのタンパク質間相互作用の増加として同定され得、例えば、タンパク質間相互作用における５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超の増加として同定され得る。あるいは、調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質間相互作用と比較したモジュレーターの存在下でのタンパク質間相互作用の減少として同定され得、例えば、タンパク質間相互作用における５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の減少として同定され得る。タンパク質間相互作用のアッセイは、例えば、ＳＰＲアッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、セクションＩＩＡｉに記載されている細胞外相互作用アッセイ又はセクションＩＩＡｉｉに記載されている細胞表面相互作用アッセイであり得る。
ｉａ．タンパク質間相互作用の調節のためのＳＰＲアッセイ
いくつかの態様では、タンパク質間相互作用のアッセイは、本明細書のセクションＩＩＡｉｉに記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイである。いくつかの態様では、表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合の調節は、モジュレーターの非存在下と比較したその存在下でのＳＰＲシグナル応答単位（ＲＵ）の差として測定される。
ｉｂ．タンパク質間相互作用の調節のためのＢＬＩアッセイ
いくつかの態様では、タンパク質間相互作用のアッセイはＢＬＩアッセイである。いくつかの態様では、ＢＬＩアッセイは、本明細書のセクションＩＩＢ（ｉ）に記載されているように、単離されたＥＣＤ、例えば、単離されたＥＣＤを使用して実施される。いくつかの態様では、表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合の調節は、モジュレーターの非存在下と比較したその存在下でのバイオセンサーチップで測定された波長シフト（Δλ）の差として測定される。
ｉｃ．タンパク質間相互作用の調節のためのＥＬＩＳＡ
いくつかの態様では、タンパク質間相互作用のアッセイはＥＬＩＳＡである。いくつかの態様では、第１のタンパク質はプレートに結合され（例えば、プレートに直接結合されるか、又はプレートに結合された抗体によって認識される親和性タグを介してプレートに結合される）、第２のタンパク質は可溶性形態で提供され、例えば、本明細書のセクションＩＩＢ（ｉ）に記載されているような単離されたＥＣＤとして提供される。第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用は、第２のタンパク質又はその親和性タグに結合する抗体を提供することによって検出され得、ここで、抗体はその抗体の存在についてのアッセイにおいて検出され、例えば視覚化され得る。
ｉｄ．タンパク質間相互作用の調節のための他のアッセイ
いくつかの態様では、アッセイは、本明細書のセクションＩＩＡｉに記載されているように、細胞外相互作用アッセイである。いくつかの態様では、アッセイは、本明細書のセクションＩＩＡｉｉに記載されいるように、細胞表面相互作用アッセイである。いくつかの態様では、アッセイは、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）アッセイ、免疫沈降を含むアッセイ、又はＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮＴＭ技術を含むアッセイである。
Ｂ．下流活性における変化のアッセイ
別の態様では、本発明は、表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、該方法は、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＶに記載されている候補モジュレーター）を提供すること；（ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、接触させること；及び（ｃ）表１のタンパク質の下流活性（例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成）を測定することであって、ここで、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化は、候補モジュレーターを表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、測定することを含む方法を特徴とする。
別の態様では、本発明は、表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、該方法は、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＶに記載されている候補モジュレーター）を提供すること；（ｂ）表２のタンパク質の表１のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表２のタンパク質を表１のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、接触させること；及び（ｃ）表２のタンパク質の下流活性（例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成）を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化は、候補モジュレーターを表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、測定することを含む方法を特徴とする。
いくつかの態様では、候補モジュレーターは、少なくとも０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、又は１０μＭの濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、０．１ｎＭ～１０μＭの濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、例えば、図４Ｆのように、ある範囲の濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、溶液中で、例えば可溶性の形態で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、表１のタンパク質と表２のタンパク質を含む生物に、表１のタンパク質と表２のタンパク質を含む組織に、細胞（例えば、哺乳動物細胞）に、細胞培養培地に、馴化培地に、並びに／又は表１のタンパク質及び／若しくは表２のタンパク質の精製された形態に提供される。
いくつかの態様では、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の増加が少なくとも３０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、下流活性の増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は１００％を超える。いくつかの態様では、下流活性の増加は少なくとも３０％である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の減少が少なくとも３０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、下流活性の減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％である。いくつかの態様では、下流活性の減少は少なくとも３０％である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性は、以下に記載されるように、１つ又は複数のアッセイにおいて評価される。
いくつかの態様では、下流活性は、疾患、例えばがんの発症又は進行に関連する活性である。
ｉ．ＣＡＦ収縮性
いくつかの態様では、下流活性は、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）アクトミオシン収縮性（ＣＡＦ収縮性）である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＤＰＮであり、下流活性はＣＡＦ収縮性である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＤＰＮであり、表２のタンパク質はＣＤ１７７であり、下流活性はＣＡＦ収縮性である。
いくつかの態様では、ＣＡＦ収縮性のアッセイは、ゲル収縮アッセイである。このアッセイでは、表１のタンパク質及び表２のタンパク質のうちの少なくとも１つを含む線維芽細胞（例えば、がん関連線維芽細胞）の集団（例えば、１００，０００個の細胞）が、マトリゲル－コラーゲン混合物中に混合され、ウェル、例えば、９６ウェルプレートのウェルに配置される。個々の細胞が表１のタンパク質及び表２のタンパク質の両方を含まない態様では、細胞に含まれないタンパク質は、別の細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、好中球又はＴ細胞）に提供され得、又はマトリゲル－コラーゲン培地若しくは細胞培養培地中に提供されても、加えてもよい。細胞は、例えば、マトリゲル－コラーゲン培地又は細胞培養培地への添加によって、モジュレーターでさらに処理され得る。ゲルを２０分間固化した後、ゲルをウェルの側面から剥離し、細胞培養培地を加える。ゲルを、イメージング前に、例えば７２時間インキュベートする。細胞集団の収縮性は、ウェル直径と最終ゲル直径を比較することによって測定される。収縮性の増加又は減少は、モジュレーターが提供されている細胞のゲル収縮とモジュレーターが提供されていない細胞のゲル収縮を比較することによって計算される。いくつかの例において、モジュレーターで処理された細胞の集団は、モジュレーターで処理されていない細胞の集団と比較してゲル収縮が減少しており、例えば、ＣＡＦ収縮性は、モジュレーターの存在下で減少している。いくつかの態様では、ＣＡＦ収縮性は、ゲル収縮アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、ＣＡＦ収縮性は、ゲル収縮アッセイで測定して、少なくとも３０％減少する。いくつかの態様では、ＣＡＦ収縮性は、ゲル収縮アッセイで測定して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％減少する。
他の態様では、ＣＡＦ収縮性は、３Ｄゲル伸長アッセイ、例えば、実施例８Ｂに記載されるようなアッセイを使用して測定される。このアッセイにおいて、線維芽細胞（例えば、ＣＡＦ）は、表１のタンパク質及び表２のタンパク質の少なくとも１つを含む。細胞が表１のタンパク質及び表２のタンパク質の両方を含まない態様では、細胞に含まれないタンパク質は、別の細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、好中球又はＴ細胞）に提供され得、又は細胞培養培地中に提供されても、加えてもよい。細胞は、例えば、細胞培養培地への添加によって、モジュレーターでさらに処理され得る。線維芽細胞の収縮性の減少は、アイソタイプ対照と比較して３Ｄゲル内の細胞の伸長の増加によって示される（図１７Ａ－１７Ｄ）。いくつかの例では、モジュレーターで処理される細胞は、対照細胞と比較して伸長され、例えば、モジュレーターの存在下で、ＣＡＦ収縮性が低下する。いくつかの態様では、ＣＡＦ収縮性は、３Ｄゲル伸長アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、ＣＡＦ収縮性は、３Ｄゲル伸長アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。形態指数は、Astarita et al., Nat Immunol, 16: 75-84, 2015に記載されるように算出することができる。いくつかの態様では、形態指数は、周囲長２／４πｘ面積の式を用いて計算され、ここで、「周囲長」は細胞の周長であり、「面積」は細胞の面積である。いくつかの態様では、細胞の形態指数は、１０～３０であり、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０である。
ｉｉ．免疫チェックポイント阻害
いくつかの態様では、下流活性は免疫チェックポイント阻害である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＤ－Ｌ１であり、下流活性は免疫チェックポイント阻害である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＤ－Ｌ１であり、表２のタンパク質はＥＰＨＡ３であり、下流活性は免疫チェックポイント阻害である。
他の態様では、表１のタンパク質はＰＤ－Ｌ２であり、下流活性は免疫チェックポイント阻害である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＤ－Ｌ２であり、表２のタンパク質はＣＥＡＣＡＭ４、ＩＣＡＭ５、ＮＥＣＴＩＮ３、ＰＳＧ９、又はＴＮＦＲＳＦ１１Ａであり、下流活性は免疫チェックポイント阻害である。
いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害のアッセイは、細胞ベースのアッセイであり、例えば、Skalniak et al., Oncotarget, 8: 72167-72181, 2017に記載されているような細胞ベースのアッセイである。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害のアッセイは、Mariathasan et al., Nature, 554: 544-548に記載されているアッセイである。いくつかの態様では、アッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害は、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害は、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
ｉｉｉ．細胞増殖の抑制
いくつかの態様では、下流活性は細胞増殖の抑制である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＤであり、下流活性は細胞増殖の抑制である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＤであり、表２のタンパク質はＢＭＰ５、ＣＥＡＣＡＭ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＥＣＴ１、ＬＲＦＮ５、ＳＩＲＰＧ、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、ＳＬＩＴＲＫ６、又はＴＧＦＡであり、下流活性は細胞増殖の抑制である。いくつかの態様では、ＰＴＰＲＤタンパク質は、Ｇ２０３Ｅ及びＫ２０４Ｅ；Ｒ２３２Ｃ及びＲ２３３Ｃ；Ｐ２４９Ｌ；Ｇ２８５Ｅ；Ｅ４０６Ｋ；Ｓ４３１Ｌ；Ｒ５６１Ｑ；Ｐ６６６Ｓ；Ｅ７５５Ｋ；Ｖ８９２Ｉ；Ｓ９１２Ｆ；Ｒ９９５Ｃ；又はＲ１０８８Ｃアミノ酸置換変異又はΔＧ６１ΔＥ１０６アミノ酸欠失変異を含み、下流活性は細胞増殖の抑制である。
他の態様では、表１のタンパク質はＣＮＴＮ１であり、下流活性は細胞増殖の抑制である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＮＴＮ１であり、表２のタンパク質はＣＤＨ６、ＣＨＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＰＣＤＨＢ７、又はＳＧＣＧであり、下流活性は細胞増殖の抑制である。
さらに他の態様では、表１のタンパク質はＣＨＬ１であり、下流活性は細胞増殖の抑制である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＨＬ１であり、表２のタンパク質はＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ５、ＳＩＲＰＡ、Ｌ１ＣＡＭ、又ＴＭＥＭ１３２Ａであり、下流活性は細胞増殖の抑制である。
いくつかの態様では、細胞増殖の抑制のアッセイは、コロニー形成アッセイ、例えば、Yan et al., Cancer Res, 76(6): 1603-1614, 2016又はOgnibene et al., Oncotarget, 9(40): 25903-25921, 2018に記載されるようなコロニー形成アッセイである。いくつかの態様では、コロニー形成アッセイにおいてアッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、細胞増殖は、コロニー形成アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、細胞増殖は、コロニー形成アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
いくつかの態様では、細胞増殖の抑制のアッセイは、細胞増殖アッセイ、例えば、Yan et al., Cancer Res, 76(6): 1603-1614, 2016に記載されているような細胞増殖アッセイである。いくつかの態様では、細胞増殖アッセイにおいてアッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、細胞増殖は、細胞増殖アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、細胞増殖は、細胞増殖アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
ｉｖ．標的リン酸化の調節
いくつかの態様では、下流活性は、標的タンパク質のリン酸化又はリン酸化の抑制、例えば、ＥＧＦＲのリン酸化又はＳＴＡＴ３リン酸化の抑制である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＤであり、下流活性はＳＴＡＴ３リン酸化の抑制である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＤであり、表２のタンパク質はＢＭＰ５、ＣＥＡＣＡＭ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＥＣＴ１、ＬＲＦＮ５、ＳＩＲＰＧ、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、ＳＬＩＴＲＫ６、又はＴＧＦＡであり、下流活性はＳＴＡＴ３リン酸化の抑制である。いくつかの態様では、ＰＴＰＲＤタンパク質は、Ｇ２０３Ｅ及びＫ２０４Ｅ；Ｒ２３２Ｃ及びＲ２３３Ｃ；Ｐ２４９Ｌ；Ｇ２８５Ｅ；Ｅ４０６Ｋ；Ｓ４３１Ｌ；Ｒ５６１Ｑ；Ｐ６６６Ｓ；Ｅ７５５Ｋ；Ｖ８９２Ｉ；Ｓ９１２Ｆ；Ｒ９９５Ｃ；又はＲ１０８８Ｃアミノ酸置換変異又はΔＧ６１ΔＥ１０６アミノ酸欠失変異を含み、下流活性はＳＴＡＴ３リン酸化の抑制である。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制のアッセイは、リン酸化ＳＴＡＴ３のウエスタンブロット、例えば、Veeriah et al., PNAS, 106(23): 9435-9440, 2009又はPeyser et al., PLoS ONE, 10.1371/journal.pone.0135750, 2015に記載されるようなウエスタンブロットである。いくつかの態様では、ウエスタンブロットにおいてアッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制は、リン酸化ＳＴＡＴ３のウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制は、リン酸化ＳＴＡＴ３のウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制は、リン酸化ＳＴＡＴ３のウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制は、リン酸化ＳＴＡＴ３のウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
他の態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＦであり、下流活性はＥＧＦＲのリン酸化である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＦであり、表２のタンパク質はＣＤ１７７、ＩＬ１ＲＡＰ、又はＬＲＦＮ５であり、下流活性はＥＧＦＲのリン酸化である。
いくつかの態様では、ＥＧＦＲのリン酸化のアッセイは、リン酸化ＥＧＦＲのウエスタンブロット、例えば、Du et al., J Cell Sci, 126: 1440-1453, 2013に記載されるようなウエスタンブロットである。いくつかの態様では、ウエスタンブロットにおいてアッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、ＥＧＦＲのリン酸化は、リン酸化ＥＧＦＲのウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、ＥＧＦＲのリン酸化は、リン酸化ＥＧＦＲのウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
いくつかの態様では、ＥＧＦＲのリン酸化は、リン酸化ＥＧＦＲのウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、ＥＧＦＲのリン酸化は、リン酸化ＥＧＦＲのウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
他の態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、下流活性はＡＸＬのリン酸化である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、表２のタンパク質はＩＬ１ＲＬ１又はＶＳＩＧ１０Ｌであり、下流活性はＡＸＬのリン酸化である。
いくつかの態様では、ＡＸＬのリン酸化のアッセイは、リン酸化ＡＸＬのウエスタンブロットである。いくつかの態様では、ウエスタンブロットにおいてアッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、ＡＸＬのリン酸化は、リン酸化ＡＸＬのウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、ＡＸＬのリン酸化は、リン酸化ＡＸＬのウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
いくつかの態様では、ＡＸＬのリン酸化は、リン酸化ＡＸＬのウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、ＡＸＬのリン酸化は、リン酸化ＡＸＬのウエスタンブロットで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
ｖ．細胞遊走の阻害
いくつかの態様では、下流活性は細胞遊走の阻害である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＦであり、下流活性は細胞遊走の阻害である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＦであり、表２のタンパク質はＣＤ１７７、ＩＬ１ＲＡＰ、又はＬＲＦＮ５であり、下流活性は細胞遊走の阻害である。
いくつかの態様では、下流活性は細胞遊走の阻害である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＳであり、下流活性は細胞遊走の阻害である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＳであり、表２のタンパク質は、Ｃ６ｏｒｆ２５、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＲＦＮ１、ＬＲＦＮ５、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＮＣＡＭ１、ＳＬＩＴＲＫ１、ＳＬＩＴＲＫ２、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、又はＳＬＩＴＲＫ６であり、下流活性は細胞遊走の阻害である。
いくつかの態様では、細胞遊走の阻害のアッセイは、細胞遊走アッセイ、例えば、Du et al., J Cell Sci, 126: 1440-1453, 2013に記載されているような細胞遊走アッセイである。いくつかの態様では、細胞遊走アッセイにおいてアッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、細胞遊走の阻害は、細胞遊走アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、細胞遊走の阻害は、細胞遊走アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
ｖｉ．腫瘍形成の抑制
いくつかの態様では、下流活性は腫瘍形成の抑制である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＨＬ１であり、下流活性は腫瘍形成の抑制である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＨＬ１であり、表２のタンパク質はＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ５、ＳＩＲＰＡ、Ｌ１ＣＡＭ、又ＴＭＥＭ１３２Ａであり、下流活性は腫瘍形成の抑制である。
いくつかの態様では、腫瘍形成の抑制のアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍原性アッセイ、例えば、Tang et al., Oncogene, doi: 10.1038/s41388-018-0648-7, 2019に記載されるような腫瘍原性アッセイ、ＸＴＴ細胞増殖アッセイ、病巣形成アッセイ、軟寒天におけるコロニー形成アッセイ、又はヌードマウスにおける腫瘍形成アッセイである。いくつかの態様では、腫瘍原性アッセイにおいてアッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、腫瘍形成の抑制は、腫瘍原性アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、腫瘍形成の抑制は、腫瘍原性アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
ｖｉｉ．細胞浸潤の抑制
いくつかの態様では、下流活性は細胞浸潤である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＮＴＮ１であり、下流活性は細胞浸潤である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＮＴＮ１であり、表２のタンパク質はＣＤＨ６、ＣＨＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＰＣＤＨＢ７、又はＳＧＣＧであり、下流活性は細胞浸潤である。
他の態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、下流活性は細胞浸潤である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、表２のタンパク質はＩＬ１ＲＬ１又はＶＳＩＧ１０Ｌであり、下流活性は細胞浸潤である。
さらに他の態様では、表１のタンパク質はＣＨＬ１であり、下流活性は細胞浸潤である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＨＬ１であり、表２のタンパク質はＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ５、ＳＩＲＰＡ、Ｌ１ＣＡＭ、又はＴＭＥＭ１３２Ａであり、下流活性は細胞浸潤である。
いくつかの態様では、細胞浸潤のアッセイは、ゲル浸潤アッセイ、例えば、Yan et al., Cancer Res, 76(6): 1603-1614, 2016又はHe et al., Biochem Biophys Res Commun, 438: 433-438, 2013に記載されるようなゲル浸潤アッセイである。いくつかの態様では、ゲル浸潤アッセイにおいてアッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、細胞浸潤は、ゲル浸潤アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、細胞浸潤は、ゲル浸潤アッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
ｖｉｉｉ．マクロファージ極性化と食作用機能
いくつかの態様では、下流活性は、食細胞（例えば、マクロファージ）の食作用機能の抑制、例えば、抗体依存性細胞食作用（食作用の抑制）である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ１であり、下流活性は食作用の抑制である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ１であり、表２のタンパク質はＣＬＥＣ６Ａ、ＣＸＡＤＲ、ＥＤＡＲ、ＦＬＴ４、ＩＬ６Ｒ、ＩＬＤＲ１、又はＬＩＬＲＡ５であり、下流活性は食作用の抑制である。
食作用機能は、例えば、蛍光シグナルを含むマクロファージの割合として測定することができ、ここで、蛍光の存在は、蛍光標識された標的細胞の食作用を示す。食作用についての代表的なアッセイは、Barkal et al., Nature Immunol, 19: 76-84, 2017に記載されている。いくつかの態様では、食作用の抑制は、食作用のアッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、食作用の抑制は、食作用のアッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
いくつかの態様では、食作用の抑制は、食作用のアッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、食作用の抑制は、食作用のアッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
いくつかの態様では、下流活性は、Ｍ２マクロファージ極性化の促進である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ２であり、下流活性はＭ２マクロファージ極性化の促進である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ２であり、表２のタンパク質はＩＧＳＦ８又はＭＯＧであり、下流活性はＭ２マクロファージ極性化の促進である。Ｍ２マクロファージ極性化は、Chen et al., J Clin Invest, 128(12), 5647-5662に記載のように評価され得る。いくつかの態様では、Ｍ２マクロファージ極性化は、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、Ｍ２マクロファージ極性化は、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
いくつかの態様では、Ｍ２マクロファージ極性化は、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、Ｍ２マクロファージ極性化は、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
ｉｘ．破骨細胞分化
いくつかの態様では、下流活性は破骨細胞分化である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ１であり、下流活性は破骨細胞分化である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ１であり、表２のタンパク質はＣＬＥＣ６Ａ、ＣＸＡＤＲ、ＥＤＡＲ、ＦＬＴ４、ＩＬ６Ｒ、ＩＬＤＲ１、又はＬＩＬＲＡ５であり、下流活性は破骨細胞分化である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ３であり、下流活性は破骨細胞分化である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ３であり、表２のタンパク質はＬＲＲＣ１５又はＬＹ６Ｇ６Ｆであり、下流活性は破骨細胞分化である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ４であり、下流活性は破骨細胞分化である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＬＩＬＲＢ４であり、表２のタンパク質はＣＮＴＦＲであり、下流活性は破骨細胞分化である。
いくつかの態様では、破骨細胞分化のアッセイは、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色について陽性の多核細胞（ＴＲＡＰ＋多核細胞）のアッセイである。ＴＲＡＰ＋状態と複数の核（例えば、３つ以上の核）は、細胞が破骨細胞であることの指標である。ＴＲＡＰ＋多核細胞についての代表的なアッセイは、Mori et al., J Immunol, 181(7): 4742-4751, 2008に記載されている。いくつかの態様では、ＴＲＡＰ＋多核細胞アッセイにおいてアッセイされた細胞は、例えば細胞培養培地に加えることによって、モジュレーターでさらに処理される。いくつかの態様では、破骨細胞分化は、ＴＲＡＰ＋多核細胞のアッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、破骨細胞分化は、ＴＲＡＰ＋多核細胞のアッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
他の態様では、破骨細胞分化は、ＴＲＡＰ＋多核細胞のアッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、破骨細胞分化は、ＴＲＡＰ＋多核細胞のアッセイで測定して、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
ｘ．シグナル伝達経路の活性化
いくつかの態様では、下流活性はシグナル伝達経路の活性化である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、下流活性は、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化、又はＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、表２のタンパク質はＩＬ１ＲＬ１又はＶＳＩＧ１０Ｌであり、下流活性は、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化、又はＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化である。
いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＳであり、下流活性はＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＴＰＲＳであり、表２のタンパク質は、Ｃ６ｏｒｆ２５、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＲＦＮ１、ＬＲＦＮ５、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＮＣＡＭ１、ＳＬＩＴＲＫ１、ＳＬＩＴＲＫ２、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、又はＳＬＩＴＲＫ６であり、下流活性はＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化である。
他の態様では、表１のタンパク質はＣＮＴＮ１であり、下流活性は、ＲｈｏＡ経路又はＡｋｔ経路の活性化である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＣＮＴＮ１であり、表２のタンパク質はＣＤＨ６、ＣＨＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＰＣＤＨＢ７、又はＳＧＣＧであり、下流活性はＲｈｏＡ経路又はＡｋｔ経路の活性化である。
いくつかの態様では、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化、ＲｈｏＡ経路の活性化、Ａｋｔ経路の活性化、又はＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化は、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化、ＲｈｏＡ経路の活性化、Ａｋｔ経路の活性化、又はＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化は、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
いくつかの態様では、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化、ＲｈｏＡ経路の活性化、Ａｋｔ経路の活性化、又はＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化は、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化、ＲｈｏＡ経路の活性化、Ａｋｔ経路の活性化、又はＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化は、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
ｘｉ．糸状仮足の形成
いくつかの態様では、下流活性は糸状仮足の形成である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、下流活性は糸状仮足の形成である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、表２のタンパク質はＩＬ１ＲＬ１又はＶＳＩＧ１０Ｌであり、下流活性は糸状仮足の形成である。いくつかの態様では、糸状仮足の形成は、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、糸状仮足の形成は、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
ｘｉｉ．ＥＭＴの調節
いくつかの態様では、下流活性は上皮間葉転換（ＥＭＴ）の阻害である。ＥＭＴは、癌細胞の遊走性及び残存特性を高め、悪性の進行を促進する（Gjerdrum et al., PNAS, 107(3): 1124-1129, 2010）。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、下流活性はＥＭＴの阻害である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＡＸＬであり、表２のタンパク質はＩＬ１ＲＬ１又はＶＳＩＧ１０Ｌであり、下流活性はＥＭＴの阻害である。ＥＭＴは、Gjerdrum et al., PNAS, 107(3): 1124-1129, 2010に記載されるように定量化され得る。いくつかの態様では、ＥＭＴの阻害は、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％増加する。いくつかの態様では、ＥＭＴの阻害は、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％増加する。
ｘｉｉ．腫瘍増殖
いくつかの態様では、下流活性は腫瘍増殖である。いくつかの態様では、表１のタンパク質はＰＤＰＮであり、表２のタンパク質はＣＤ１７７であり、下流活性は腫瘍増殖である。いくつかの態様では、腫瘍増殖は、モジュレーターの存在下で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％減少する。いくつかの態様では、腫瘍増殖は、モジュレーターの存在下で少なくとも３０％減少する。
ＩＶ．タンパク質間相互作用のモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用の単離されたモジュレーターを特徴とし、ここで、（ａ）表１のタンパク質と表２のタンパク質は、表３において相互作用すると報告され；且つ（ｂ）モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での結合と比較して、表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合の増加又は減少を引き起こす。
いくつかの態様では、本開示は、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の単離されたモジュレーターを特徴とし、ここで、（ａ）表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用すると報告され；且つ（ｂ）モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での下流活性と比較して、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の変化を引き起こす。
いくつかの態様では、モジュレーターは、表１又は表２のタンパク質の下流活性の阻害剤であるか又は活性化因子である。
いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性、例えば本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性、例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞の分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成の量、強度、又は持続時間の増加又は減少である。
Ａ．小分子
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは小分子である。小分子は、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質に、好ましくは特異的に結合し得る、本明細書で定義される結合ポリペプチド又は抗体以外の分子である。結合する小分子は、既知の方法論を使用して同定され、化学的に合成され得る（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。結合する小分子のサイズは、通常約２０００ダルトン未満（例えば、サイズが約２０００、１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満）であり、ここで、本明細書に記載のポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、既知の技術を使用して、過度の実験をすることなく同定され得る。この点については、ポリペプチド標的に結合することができる分子について小分子ライブラリをスクリーニングするための技術が当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。結合小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ－置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、小分子の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超増加する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性、例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成）は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性）は、小分子の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超増加する）。
Ｂ．抗体及び抗原結合断片
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗原結合断片は、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、抗体又は抗原結合断片の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、抗体又は抗原結合断片の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超増加する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性、例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成）は、抗体又は抗原結合断片の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性）は、抗体又は抗原結合断片の存在下で増加する（例えば、５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超増加する）。
Ｃ．ペプチド
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質に結合するペプチドである。ペプチドは、天然に存在するペプチドであり得るか、又は操作され得るペプチドであり得る。いくつかの態様では、ペプチドは、表１のタンパク質、表２のタンパク質、又は表１のタンパク質若しくは表２のタンパク質に結合する別のタンパク質の断片である。ペプチドは、完全長タンパク質と等しい、より少ない、又はより大きな親和性で結合パートナーと結合し得る。いくつかの態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行する。他の態様では、ペプチドは完全長タンパク質の全ての機能を実行するわけではない。
いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、ペプチドの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超増加する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性、例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成）は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性）は、ペプチドの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超増加する）。
Ｄ．模倣物
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質に結合する模倣物、例えば、分子模倣物である。模倣物は、表１のタンパク質、表２のタンパク質、又は表１のタンパク質若しくは表２のタンパク質に結合する別のタンパク質の分子模倣物であり得る。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行し得る。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドの全ての機能を実行するわけではない。
いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質と表２のタンパク質との結合は、模倣物の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超増加する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性、例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成）は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する）。いくつかの態様では、表１のタンパク質及び／又は表２のタンパク質の下流活性（例えば、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載されている下流活性）は、模倣物の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１００％超増加する）。
Ｖ．同定されたタンパク質間相互作用のモジュレーターを含む治療方法
いくつかの態様では、本明細書のセクションＩＩＣに記載されるタンパク質間相互作用のモジュレーターは、病的状態、疾患、障害、又は状態、例えば、がんを治療する又はその進行を遅延させるために使用される。
いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターが投与された個体において、本明細書のセクションＩＩＩＢに記載される下流活性、例えば、ＣＡＦ収縮性、免疫チェックポイント阻害、細胞増殖の抑制、標的リン酸化の調節、細胞遊走の阻害、腫瘍形成の抑制、細胞浸潤の抑制、マクロファージ極性化、食作用の調節、破骨細胞の分化、シグナル伝達経路の活性化、又は糸状仮足の形成の量、強度、又は持続時間を増加又は減少させる。
Ａ．がん
いくつかの態様では、本明細書のセクションＩＩＣに記載されるタンパク質間相互作用のモジュレーター（例えば、小分子、抗体、抗原結合断片、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ）は、それを必要とする対象におけるがんを治療する又はその進行を遅延させるために使用される。いくつかの態様では、対象はヒトである。がんは、固形腫瘍がん又は非固形腫瘍がんであり得る。固形がん腫瘍には、限定されないが、膀胱がん、黒色腫、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がん、若しくは前立腺がん、又はそれらの転移型が含まれる。いくつかの態様では、がんは膀胱がんである。膀胱がんのさらなる態様には、尿路上皮癌、筋肉浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）、又は筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）が含まれる。いくつかの態様では、膀胱がんは転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）である。いくつかの態様では、がんは乳がんである。乳がんのさらなる態様には、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）乳がん、例えば、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がん、プロゲステロン受容体陽性（ＰＲ＋）乳がん、又はＥＲ＋／ＰＲ＋乳がんが含まれる。乳がんの他の態様には、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）乳がんが含まれる。乳がんのさらに他の態様には、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）が含まれる。いくつかの態様では、乳がんは早期乳がんである。いくつかの態様では、がんは肺がんである。肺がんのさらなる態様には、上皮成長因子受容体陽性（ＥＧＦＲ＋）肺がんが含まれる。肺がんの他の態様には、上皮成長因子受容体陰性（ＥＧＦＲ－）肺がんが含まれる。肺がんのさらに他の態様には、非小細胞肺がん、例えば、扁平上皮肺がん又は非扁平上皮肺がんが含まれる。肺がんの他の態様には、小細胞肺がんが含まれる。いくつかの態様では、がんは頭頸部がんである。頭頸部がんのさらなる態様は、頭頸部の扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）が含まれる。いくつかの態様では、がんは腎臓がんである。腎臓がんのさらなる態様には、腎細胞癌（ＲＣＣ）が含まれる。いくつかの態様では、がんは肝がんである。肝がんのさらなる態様には、肝細胞癌が含まれる。いくつかの態様では、がんは前立腺がんである。前立腺がんのさらなる態様には、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）が含まれる。いくつかの態様では、がんは固形腫瘍の転移型である。いくつかの態様では、固形腫瘍の転移型は、黒色腫、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がん、又は前立腺がんの転移型である。いくつかの態様では、がんは転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）である。いくつかの態様では、がんは非固形腫瘍がんである。非固形腫瘍がんには、限定されないが、Ｂ細胞リンパ腫が含まれる。Ｂ細胞リンパ腫のさらなる態様には、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は菌状息肉症（ＭＦ）が含まれる。いくつかの態様では、がんは結腸直腸がんである。
Ｂ．送達の方法
本明細書に記載の方法において利用される組成物（例えば、セクションＩＩＣに記載のタンパク質間相互作用のモジュレーター、例えば、小分子、抗体、抗原結合断片、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ）は任意の適切な方法で投与することができ、これには限定されないが、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮的、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所的、腫瘍内、腹膜、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、眼窩内、経口的、経皮的、硝子体内（例えば、硝子体内注射による）、点眼による、吸入による、注射による、移植による、注入による、連続的注入による、局所灌流浴標的細胞により直接、カテーテルによる、灌流による、クリーム中、又は脂質組成物中が含まれる。本明細書に記載の方法において利用される組成物はまた、全身的又は局所的に投与することができる。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物又は組成物、及び治療される状態、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化し得る。いくつかの態様では、タンパク質間相互作用のモジュレーターは、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口で、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植により、吸入により、髄腔内に、脳室内に、又は鼻腔内に投与される。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが想定される。
本明細書に記載されるタンパク質間相互作用のモジュレーター（及び任意の付加的治療剤）は、良好な医学的実践と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与され得る。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。モジュレーターは、必要ではないが、任意に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と共に製剤化され且つ／又は同時に投与される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するモジュレーターの量、障害又は治療のタイプ、及び上述の他の因子に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載されている投与量の約１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び任意の経路により使用される。
ＶＩ． ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療の方法
Ａ．アテゾリズマブに対する反応性のマーカー
いくつかの態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストで治療可能ながん（例えば、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストで治療可能である可能性が高いがん）を有する個体を同定する方法であって、個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストで治療可能ながんを有する個体を同定する、方法を含む。
いくつかの態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療から利益を得る可能性のある個体として該個体を同定する、方法を含む。
いくつかの態様では、本発明は、がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療から利益を得る可能性のある個体として該個体を同定する、方法を含む。
いくつかの態様では、個体は、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルを有し、方法は、有効量のＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを個体に投与することをさらに含む。
いくつかの態様では、本発明は、がんを有する個体を治療する方法であって、（ａ）個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することであって、ここで、遺伝子対の第１のメンバーの発現レベルは、第１の参照発現レベルを上回り、且つ遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、第２の参照発現レベルを上回る、決定すること；及び（ｂ）有効量のＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを個体に投与すること、を含む方法を含む。
いくつかの態様では、本発明は、がんを有する個体を治療する方法であって、第１の参照発現レベルを上回る表１５の遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る該遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルを有すると決定された個体に、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを投与することを含む方法を含む。
いくつかの態様では、利益は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストなしの治療と比較して、個体の全生存期間（ＯＳ）の延長を含む。他の態様では、利益は、例えば、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストなしの治療と比較して、再発までの時間の増加又は治療期間の短縮を含み得る。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＳＩＧＬＥＣ６であり、遺伝子対の第２のメンバーはＮＣＲ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＢＴＮ３Ａ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＲＲＣ４Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＤ８０であり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＴＬＡ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＢＴＮ３Ａ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＲＲＣ４Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＮＣＲ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＩＧＬＥＣ８である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＮＴＦＲであり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＩＬＲＢ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＧＦＲ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＲＲＴＭ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＧＦＲ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＩＧＬＥＣ１５である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＧＦＲ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＫＬである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＴＲＨＤＥである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＴＬＡ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＰＣＤＨＧＢ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＴＬＡ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＦＡＭ２００Ａである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＡ１２であり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＩＧＬＥＣ６である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＩＬＤＲ２であり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＬＥＣ１２Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＩＴＬＮ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＡＤＭ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＲＴＡＭである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＤ７９Ｂであり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＤ２４４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＤＡＧ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＦＮＢ１である。
Ｂ．アテゾリズマブに対する反応性の欠如のマーカー
いくつかの態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、個体からの試料において表１６の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のある個体として該個体を同定する、方法を含む。
いくつかの態様では、本発明は、がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、個体からの試料において表１６の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のある個体として該個体を同定する、方法を含む。
いくつかの態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、個体からの試料において表１６の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストによる治療に耐性のあるがんを有する個体を同定する、方法を含む。
いくつかの態様では、本発明は、がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、個体からの試料において表１６の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストによる治療に耐性のあるがんを有する個体を同定する、方法を含む。
いくつかの態様では、個体は、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルを有し、方法は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える、有効量の治療を個体に投与することを含む。
いくつかの態様では、利益は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加えた治療なしの治療と比較して、個体の全生存期間（ＯＳ）の延長を含む。
いくつかの態様では、個体からの試料は、抗がん療法の投与前に個体から得られる。いくつかの態様では、個体からの試料は、抗がん療法の投与後に個体から得られる。
いくつかの態様では、個体からの試料は、腫瘍組織試料又は腫瘍流体試料、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、アーカイブ試料、新鮮な試料、又は凍結試料である。
いくつかの態様では、（ａ）試料中の遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルは、タンパク質発現レベルである；又は（ｂ）試料中の遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルは、ｍＲＮＡ発現レベルである。
いくつかの態様では、試料中の遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルは、それぞれ、遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーのｍＲＮＡ発現レベルである。いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーのｍＲＮＡ発現レベルは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ若しくはＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、ＦＩＳＨ、又はそれらの組み合わせによって決定される。いくつかの態様では、ＲＮＡ－ｓｅｑは、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ａｃｃｅｓｓ技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＶＣ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＧＰＣ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＦＧＦＲＬ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＢ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＰＴＰＲＤであり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＲＦＮ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＡＱＰＥＰである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＤＳＧ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＬＤＬＲであり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＩＬＲＢ５である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＢ３である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＰＬＸＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＥＭＡ４Ｇである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＢ６である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＬＴ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＦＬＲＴ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＬＴ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＬＦＮ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＧＰＣ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＦＧＦＲ４である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＧＰＣ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＴＮＦＲＳＦ１１Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＧＦＲ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＧＰＣ６である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＰＬＸＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＥＭＡ４Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＤＡであり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＤＡＲである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＧＦＲ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＮＲＸＮ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＳＥＭＡ４Ｄであり、遺伝子対の第２のメンバーはＰＬＸＮＢ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＬＴ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＮＲＰ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＧＦＲ４であり、遺伝子対の第２のメンバーはＧＰＣ３である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＧＦＲ２であり、遺伝子対の第２のメンバーはＲＡＭＰ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＡＸＬ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＩＬ１ＲＬ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＤ３２０であり、遺伝子対の第２のメンバーはＩＧＳＦ５である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＤ５９であり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＴＡＢ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＣＮＴＮ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＰＴＰＲＧである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＡ３である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＦＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＰＨＢ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＧＦであり、遺伝子対の第２のメンバーはＴＮＦＲＳＦ１１Ｂである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＥＮＰＥＰであり、遺伝子対の第２のメンバーはＳＬＩＴＲＫ１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＦＣＧＲ３Ｂであり、遺伝子対の第２のメンバーはＥＤＡ２Ｒである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＩＬ２０ＲＡであり、遺伝子対の第２のメンバーはＣＬＥＣ１４Ａである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＩＬ６Ｒであり、遺伝子対の第２のメンバーはＢＴＮＬ９である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＩＺＵＭＯ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＩＬＲＡ５である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＮＧＦＲであり、遺伝子対の第２のメンバーはＬＲＲＴＭ３である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＮＴＭであり、遺伝子対の第２のメンバーはＡＭＩＧＯ２である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＰＣＤＨＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーはＩＧＳＦ１１である。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＰＴＧＦＲＮであり、遺伝子対の第２のメンバーはＴＭＥＭ５９Ｌである。
いくつかの態様では、遺伝子対の第１のメンバーはＴＲＥＭ１であり、遺伝子対の第２のメンバーはＶＳＩＧ８である。
Ｃ．参照発現レベル
いくつかの態様では、タンパク質対の第１のメンバーに対する参照発現レベル（すなわち、第１の参照発現レベル）は事前に割り当てられた発現レベルであり、タンパク質対の第１のメンバーに対する参照発現レベル（すなわち、第２の参照発現レベル）は事前に割り当てられた参照発現レベルである。
いくつかの態様では、第１の参照発現レベルは、約０．１から約０．５カウント／ミリオン（ＣＰＭ）の間、例えば、約０．１５から約０．４ＣＰＭの間、約０．２から０．３ＣＰＭの間、又は約０．２２５から約０．２７５ＣＰＭの間である。
いくつかの態様では、第２の参照発現レベルは、約０．１から約０．５カウント／ミリオン（ＣＰＭ）の間、例えば、約０．１５から約０．４ＣＰＭの間、約０．２から０．３ＣＰＭの間、又は約０．２２５から約０．２７５ＣＰＭの間である。
いくつかの態様では、第１の参照発現レベルは、約０．２５から約０．５カウント／ミリオン（ＣＰＭ）の間であり、第２の参照発現レベルは、約０．２５から約０．５ＣＰＭの間である。
いくつかの態様では、第１の参照発現レベルは０．２５ＣＰＭである。いくつかの態様では、第２の参照発現レベルは０．２５ＣＰＭである。いくつかの態様では、第１の参照発現レベルは０．２５ＣＰＭであり、第２の参照発現レベルは０．２５ＣＰＭである。
いくつかの態様では、第１の参照発現レベル及び第２の参照発現レベルは、それぞれ、がん、例えば、尿路がん、例えば、尿路癌、例えば、転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）を有する個体を有する個体の参照集団における遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルである。
Ｄ．がん
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストは、それを必要とする対象におけるがん、例えば尿路がんを治療する又はその進行を遅延させるために使用される。いくつかの態様では、対象はヒトである。尿路がんには、尿路上皮癌（ＵＣ）、尿路の非尿路上皮癌、及び混合組織構造を有する尿路の癌が含まれる。尿路の非尿路上皮癌には、世界保健機関の分類に記載されている全てのサブタイプ、例えば、扁平上皮癌、いぼ状癌、腺癌、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ベリニ集合管の癌、神経内分泌癌、又は小細胞癌が含まれる。腺癌は、腸腺癌、粘液性腺癌、印環細胞腺癌、又は明細胞腺癌であり得る。尿路がんは、膀胱、腎盂、尿管、又は尿道に発生することがある。いくつかの態様では、尿路がん（例えば、尿路上皮癌、非尿路上皮癌、又は混合組織構造を有する尿路癌）は、治療開始時に、ＴＮＭ分類によれば、例えば、ステージＴ４ｂ Ｎａｎｙ又はＴａｎｙ Ｎ２－３など、局所的に進行している。いくつかの態様では、尿路がんは、転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）、尿路の非尿路上皮癌の転移型、又は混合組織構造を有する尿路癌の転移型である。いくつかの態様では、尿路がんは、治療の開始時に、ＴＮＭ分類によれば、ＴＮＭステージＭ１である。
Ｅ．免疫チェックポイント阻害剤
いくつかの態様では、本発明の方法は、ＰＤ－１結合アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、又はＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストであり得るＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストの使用を含む。ＰＤ－１（プログラム死１）はまた、当技術分野において「プログラム細胞死１」、「ＰＤＣＤ１」、「ＣＤ２７９」、及び「ＳＬＥＢ２」としても言及される。例示的なヒトＰＤ－１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１５１１６に示されている。ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）はまた、当技術分野において「プログラム細胞死１リガンド１」、「ＰＤＣＤ１ＬＧ１」、「ＣＤ２７４」、「Ｂ７－Ｈ」、及び「ＰＤＬ１」としても言及される。例示的なヒトＰＤ－Ｌ１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＺＱ７．１に示されている。ＰＤ－Ｌ２（プログラム死リガンド２）はまた、当技術分野において「プログラム細胞死１リガンド２」、「ＰＤＣＤ１ＬＧ２」、「ＣＤ２７３」、「Ｂ７－ＤＣ」、「Ｂｔｄｃ」、及び「ＰＤＬ２」としても言及される。例示的なヒトＰＤ－Ｌ２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＢＱ５１に示されている。いくつかの例では、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２は、ヒトＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２である。
いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１の、そのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２である。別の例では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１の、その結合リガンドへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１結合パートナーは、ＰＤ－１及び／又はＢ７－１である。別の例では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２の、そのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ２結合リガンドパートナーはＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。
いくつかの態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、例えば、以下に記載されるように、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。いくつかの態様では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペムブロリズマブ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ－１０８からなる群から選択される。ＭＤＸ－１１０６、別名ＭＤＸ－１１０６－０４、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、又はニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、別名ペムブロリズマブ又はランブロリズマブは、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの例では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２の細胞外又はＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの例では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＡＭＰ－２２４である。ＡＭＰ－２２４、別名Ｂ７－ＤＣＩｇは、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。
いくつかの態様では、抗ＰＤ－１抗体はＭＤＸ－１１０６である。「ＭＤＸ－１１０６」の別名には、ＭＤＸ－１１０６－０４、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、及びニボルマブが含まれる。いくつかの態様では、抗ＰＤ－１抗体はニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４－９４－４）である。さらに別の態様では、配列番号１からの重鎖可変領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号２からの軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗ＰＤ－１抗体が提供される。さらに別の態様では、提供されるのは、重鎖及び／又は軽鎖配列を含む単離された抗ＰＤ－１抗体であり、ここで、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し、且つ
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストはＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストである。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ２抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストはイムノアドヘシンである。
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、例えば、以下に記載されるように、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の間及び／又はＰＤ－Ｌ１とＢ７－１の間の結合を阻害することができる。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び／又（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒト抗体である。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）からなる群から選択される。抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０は、ＷＯ２０１０／０７７６３４に記載されている抗ＰＤ－Ｌ１である。ＭＤＸ－１１０５、別名ＢＭＳ－９３６５５９は、ＷＯ２００７／００５８７４に記載されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）は、ＷＯ２０１１／０６６３８９及びＵＳ２０１３／０３４５５９に記載されている抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体である。この発明の方法に有用な抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例、及びその製造方法は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ２０１０／０７７６３４、ＷＯ２００７／００５８７４、ＷＯ２０１１／０６６３８９、米国特許第５，０８８，０９６号に記載されており、これらは出典明示により本明細書に援用される。
ＷＯ２０１０／０７７６３４Ａ１及びＵＳ８，２１７，１４９に記載されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載されている方法において使用され得る。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号３の重鎖可変領域配列及び／又は配列番号４の軽鎖可変領域配列を含む。さらに別の態様では、提供されるのは、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、ここで、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し、且つ
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）
に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。
一態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２及びＨＶＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ－Ｈ１配列はＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ（配列番号５）であり；
（ｂ）ＨＶＲ－Ｈ２配列はＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６）であり；
（ｃ）ＨＶＲ－Ｈ３配列はＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号７）であり；
さらに、Ｘ１はＤ又はＧであり；Ｘ２はＳ又はＬであり；Ｘ３はＴ又はＳである。特定の一態様では、Ｘ１はＤであり；Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴである。別の態様では、ポリペプチドは、式：（ＦＲ－Ｈ１）－（ＨＶＲ－Ｈ１）－（ＦＲ－Ｈ２）－（ＨＶＲ－Ｈ２）－（ＦＲ－Ｈ３）－（ＨＶＲ－Ｈ３）－（ＦＲ－Ｈ４）に従って、ＨＶＲ間に並置された可変領域重鎖フレームワーク配列をさらに含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる態様では、フレームワーク配列はＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下の通りである：
ＦＲ－Ｈ１はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号８）であり、
ＦＲ－Ｈ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号９）であり、
ＦＲ－Ｈ３はＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１０）であり、
ＦＲ－Ｈ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１）である。
さらに別の態様では、重鎖ポリペプチドは、ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２及びＨＶＲ－Ｌ３を含む可変領域軽鎖とさらに組み合わされ、ここで、
（ａ）ＨＶＲ－Ｌ１配列はＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ（配列番号１２）であり；
（ｂ）ＨＶＲ－Ｌ２配列はＳＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ（配列番号１３）であり；
（ｃ）ＨＶＲ－Ｌ３配列はＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ（配列番号１４）であり；
ここで：Ｘ４はＤ又はＶであり；Ｘ５はＶ又はＩであり；Ｘ６はＳ又はＮであり；Ｘ７はＡ又はＦであり；Ｘ８はＶ又はＬであり；Ｘ９はＦ又はＴであり；Ｘ１０はＹ又はＡであり；Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｆ、又はＳであり；Ｘ１２はＬ、Ｙ、Ｆ又はＷであり；Ｘ１３はＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｆ又はＩであり；Ｘ１４はＨ、Ｖ、Ｐ、Ｔ又はＩであり；Ｘ１５はＡ、Ｗ、Ｒ、Ｐ又はＴである。さらなる態様では、Ｘ４はＤであり；Ｘ５はＶであり；Ｘ６はＳであり；Ｘ７はＡであり；Ｘ８はＶであり；Ｘ９はＦであり；Ｘ１０はＹであり；Ｘ１１はＹであり；Ｘ１２はＬであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ１４はＨであり；Ｘ１５はＡである。
さらに別の態様では、軽鎖は、式：（ＦＲ－Ｌ１）－（ＨＶＲ－Ｌ１）－（ＦＲ－Ｌ２）－（ＨＶＲ－Ｌ２）－（ＦＲ－Ｌ３）－（ＨＶＲ－Ｌ３）－（ＦＲ－Ｌ４）に従って、ＨＶＲ間に並置された可変領域軽鎖フレームワーク配列をさらに含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下の通りである：
ＦＲ－Ｌ１はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１５）であり、
ＦＲ－Ｌ２はＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１６）であり、
ＦＲ－Ｌ３はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１７）であり、
ＦＲ－Ｌ４はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１８）である。
別の態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片が提供され、ここで、
（ａ）重鎖は、ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２及びＨＶＲ－Ｈ３を含み、さらに、
（ｉ）ＨＶＲ－Ｈ１配列はＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ（配列番号５）であり、
（ｉｉ）ＨＶＲ－Ｈ２配列はＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６）であり、
（ｉｉｉ）ＨＶＲ－Ｈ３配列はＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号７）であり；且つ
（ｂ）軽鎖は、ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２、及びＨＶＲ－Ｌ３を含み、さらに、
（ｉ）ＨＶＲ－Ｌ１配列はＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ（配列番号１２）であり、
（ｉｉ）ＨＶＲ－Ｌ２配列はＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ（配列番号１３）であり、
（ｉｉｉ）ＨＶＲ－Ｌ３配列はＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ（配列番号１４）であり、
ここで、Ｘ１はＤ又はＧであり；Ｘ２はＳ又はＬであり；Ｘ３はＴ又はＳであり；Ｘ４はＤ又はＶであり；Ｘ５はＶ又はＩであり；Ｘ６はＳ又はＮであり；Ｘ７はＡ又はＦであり；Ｘ８はＶ又はＬであり；Ｘ９はＦ又はＴであり；Ｘ１０はＹ又はＡであり；Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｆ、又はＳであり；Ｘ１２はＬ、Ｙ、Ｆ又はＷであり；Ｘ１３はＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｆ又はＩであり；Ｘ１４はＨ、Ｖ、Ｐ、Ｔ又はＩであり；Ｘ１５はＡ、Ｗ、Ｒ、Ｐ又はＴである。特定の態様では、Ｘ１はＤであり；Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴである。別の態様において、Ｘ４はＤであり；Ｘ５はＶであり；Ｘ６はＳであり；Ｘ７はＡであり；Ｘ８はＶであり；Ｘ９はＦであり；Ｘ１０はＹであり；Ｘ１１はＹであり；Ｘ１２はＬであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ１４はＨであり；Ｘ１５はＡである。また別の態様では、Ｘ１はＤであり；Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＤであり；Ｘ５はＶであり；Ｘ６はＳであり；Ｘ７はＡであり；Ｘ８はＶであり；Ｘ９はＦであり；Ｘ１０はＹであり；Ｘ１１はＹであり；Ｘ１２はＬであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ１４はＨであり、Ｘ１５はＡである。
さらなる態様では、重鎖可変領域は、（ＦＲ－Ｈ１）－（ＨＶＲ－Ｈ１）－（ＦＲ－Ｈ２）－（ＨＶＲ－Ｈ２）－（ＦＲ－Ｈ３）－（ＨＶＲ－Ｈ３）－（ＦＲ－Ｈ４）のようにＨＶＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＦＲ－Ｌ１）－（ＨＶＲ－Ｌ１）－（ＦＲ－Ｌ２）－（ＨＶＲ－Ｌ２）－（ＦＲ－Ｌ３）－（ＨＶＲ－Ｌ３）－（ＦＲ－Ｌ４）のようにＨＶＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔサブグループＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ配列に由来する。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列の１つ又は複数は、配列番号８、９、１０、及び１１として記載されている。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列の１つ又は複数は、配列番号１５、１６、１７、及び１８として記載されている。
さらに特定の態様では、抗体は、ヒト又はマウスの定常領域をさらに含む。さらに別の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択される。さらに特定の態様では、ヒト定常領域はＩｇＧ１である。さらに別の態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、及びＩｇＧ３からなる群から選択される。さらに別の態様では、マウス定常領域はＩｇＧ２Ａである。さらに特定の態様では、抗体は、低下した又は最小のエフェクター機能を有する。さらに特定の態様では、「エフェクターレスＦｃ変異（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｌｅｓｓ Ｆｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」又は非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）変異に起因する。さらに別の態様では、エフェクターレスＦｃ変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
さらに別の態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供され、ここで、
（ａ）重鎖は、ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１９）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２０）及びＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号２１）に対してそれぞれ少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２及びＨＶＲ－Ｈ３配列をさらに含み、又は
（ｂ）軽鎖は、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号２２）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２３）及びＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号２４）に対してそれぞれ少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２及びＨＶＲ－Ｌ３配列をさらに含む。
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
別の態様では、重鎖可変領域は、（ＦＲ－Ｈ１）－（ＨＶＲ－Ｈ１）－（ＦＲ－Ｈ２）－（ＨＶＲ－Ｈ２）－（ＦＲ－Ｈ３）－（ＨＶＲ－Ｈ３）－（ＦＲ－Ｈ４）のようにＨＶＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＦＲ－Ｌ１）－（ＨＶＲ－Ｌ１）－（ＦＲ－Ｌ２）－（ＨＶＲ－Ｌ２）－（ＦＲ－Ｌ３）－（ＨＶＲ－Ｌ３）－（ＦＲ－Ｌ４）のようにＨＶＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔサブグループＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ配列に由来する。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列の１つ又は複数は、配列番号８、９、１０、及び１１として記載されている。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列の１つ又は複数は、配列番号１５、１６、１７、及び１８として記載されている。
さらなる態様では、重鎖可変領域は、（ＦＲ－Ｈ１）－（ＨＶＲ－Ｈ１）－（ＦＲ－Ｈ２）－（ＨＶＲ－Ｈ２）－（ＦＲ－Ｈ３）－（ＨＶＲ－Ｈ３）－（ＦＲ－Ｈ４）のようにＨＶＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＦＲ－Ｌ１）－（ＨＶＲ－Ｌ１）－（ＦＲ－Ｌ２）－（ＨＶＲ－Ｌ２）－（ＦＲ－Ｌ３）－（ＨＶＲ－Ｌ３）－（ＦＲ－Ｌ４）のようにＨＶＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔサブグループＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ配列に由来する。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列の１つ又は複数は以下のとおりである：
ＦＲ－Ｈ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号２７）
ＦＲ－Ｈ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号２８）
ＦＲ－Ｈ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１０）
ＦＲ－Ｈ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１）。
さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列の１つ又は複数は以下の通りである：
ＦＲ－Ｌ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１５）
ＦＲ－Ｌ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１６）
ＦＲ－Ｌ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１７）
ＦＲ－Ｌ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ （配列番号２６）。
さらに特定の態様では、抗体は、ヒト又はマウスの定常領域をさらに含む。さらに別の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択される。さらに特定の態様では、ヒト定常領域はＩｇＧ１である。さらに別の態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、及びＩｇＧ３からなる群から選択される。さらに別の態様では、マウス定常領域はＩｇＧ２Ａである。さらに特定の態様では、抗体は、低下した又は最小のエフェクター機能を有する。さらに特定の態様では、「エフェクターレスＦｃ変異（ｅｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｌｅｓｓ Ｆｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」又は非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に起因する。さらに別の態様では、エフェクターレスＦｃ変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
さらに別の態様では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供され、ここで、
（ａ）重鎖は、ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１９）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２０）及びＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号２１）に対してそれぞれ少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２及びＨＶＲ－Ｈ３配列をさらに含み、及び／又は
（ｂ）軽鎖は、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号２２）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２３）及びＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号２４）に対してそれぞれ少なくとも８５％の配列同一性を有するＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２及びＨＶＲ－Ｌ３配列をさらに含む。
特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
別の態様では、重鎖可変領域は、（ＦＲ－Ｈ１）－（ＨＶＲ－Ｈ１）－（ＦＲ－Ｈ２）－（ＨＶＲ－Ｈ２）－（ＦＲ－Ｈ３）－（ＨＶＲ－Ｈ３）－（ＦＲ－Ｈ４）のようにＨＶＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、（ＦＲ－Ｌ１）－（ＨＶＲ－Ｌ１）－（ＦＲ－Ｌ２）－（ＨＶＲ－Ｌ２）－（ＦＲ－Ｌ３）－（ＨＶＲ－Ｌ３）－（ＦＲ－Ｌ４）のようにＨＶＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔサブグループＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ配列に由来する。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、重鎖フレームワーク配列の１つ又は複数は、配列番号８、９、１０、及びＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号２９）として記載されている。
さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ又はＩＶサブグループ配列に由来する。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらに別の態様では、軽鎖フレームワーク配列の１つ又は複数は、配列番号１５、１６、１７、及び１８として記載されている。さらに特定の態様では、抗体は、ヒト又はマウスの定常領域をさらに含む。さらに別の態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択される。さらに特定の態様では、ヒト定常領域はＩｇＧ１である。さらに別の態様では、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、及びＩｇＧ３からなる群から選択される。さらに別の態様では、マウス定常領域はＩｇＧ２Ａである。さらに特定の態様では、抗体は、低下した又は最小のエフェクター機能を有する。さらに特定の態様では、「エフェクターレスＦｃ変異（ｅｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｌｅｓｓ Ｆｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」又は非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に起因する。さらに別の態様では、エフェクターレスＦｃ変異は、定常領域におけるＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。
さらに別の態様では、提供されるのは、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、ここで、
（ａ）重鎖可変領域配列は、配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号２５）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、又は
（ｂ）軽鎖可変領域配列は、配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
いくつかの様態では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供され、ここで、軽鎖可変領域配列は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの様態では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供され、ここで、重鎖可変領域配列は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの様態では、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供され、ここで、軽鎖可変領域配列は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、重鎖可変領域配列は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸残基が、削除、置換、又は修飾され得る。
さらに別の態様では、提供されるのは、重鎖及び軽鎖配列を含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、ここで、
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３０）
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、且つ／又は
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１）
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
いくつかの様態では、重鎖及び軽鎖配列を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供され、ここで、軽鎖配列は、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの様態では、重鎖及び軽鎖配列を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供され、ここで、重鎖配列は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの様態では、重鎖及び軽鎖配列を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供され、ここで、軽鎖配列は、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、重鎖配列は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
いくつかの様態では、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体は非グリコシル化されている（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ－結合型又はＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ－結合型グリコシル化とは、糖のＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの１つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに結合することを指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンも使用され得る。抗体からのグリコシル化部位の除去は、上記のトリペプチド配列（Ｎ－結合型グリコシル化部位用）の１つが除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に達成される。改変は、グリコシル化部位内のアスパラギン、セリン又はスレオニン残基を別のアミノ酸残基（例えば、グリシン、アラニン又は保存的置換）で置換することによりなされ得る。
本明細書のいずれの態様においても、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＺＱ７．１に示されるヒトＰＤ－Ｌ１、又はそのバリアントに結合することができる。
さらに別の態様では、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードする単離された核酸が提供される。いくつかの態様では、核酸は、上述の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかをコードする核酸の発現に適したベクターをさらに含む。さらに特定の態様では、ベクターは、核酸の発現に適した宿主細胞内にある。さらに特定の態様では、宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞である。さらに特定の態様では、真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。
抗体又はその抗原結合断片は、例えば、当技術分野で知られている方法を使用して、例えば、発現に適した形態の前述の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片のいずれかをコードする核酸を含む宿主細胞を、そのような抗体又は断片を産生するのに適した条件下で培養すること、及び抗体又は断片を回収することを含む方法により作製することができる。
そのようなＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト抗体（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、及び抗ＰＤ－Ｌ２抗体）、又は上記に列挙された態様のいずれかで使用するための本明細書に記載の他の抗体は、その特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて有することが明示的に企図される。
いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、共阻害分子（例えば、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、又はＬＡＧ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＬＡＧ－３抗体））、又はそれらの任意の組み合わせに対して向けられるアンタゴニストである。
いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＧＩＴに対して向けられるアンタゴニストである（例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体）。例示的な抗ＴＩＧＩＴ抗体は、米国特許出願公開第２０１８／０１８６８７５号及び国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５３７４８号に記載されており、これらは出典明示によりその全内容が本明細書に援用される。
Ｆ．送達方法
本明細書に記載の方法で利用される組成物（例えば、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト）は、例えば、本明細書のセクションＶＢに記載されているように、任意の適切な方法によって投与することができる。
本明細書に記載の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、本明細書のセクションＶＩＥに記載の免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗体、結合ポリペプチド、及び／又は小分子）（並びに任意の付加的治療剤）は、良好な医学的実践と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与され得る。この文脈において考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個体の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療従事者に知られている他の因子が含まれる。免疫チェックポイント阻害剤は、必要ではないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と共に製剤化され且つ／又は同時に投与される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する免疫チェックポイント阻害剤の量、障害又は治療のタイプ、及び上述の他の因子に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載されている投与量の約１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び任意の経路により使用される。
がん、例えば、本明細書のセクションＶＩＤに記載されているがん、例えば、尿路がんの治療のために、本明細書に記載される、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト、共阻害分子に対するアンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、又はＬＡＧ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＬＡＧ－３抗体））、又はそれらの任意の組み合わせの適切な投与量は（単独で、又は１つ以上の複数の他の付加的治療剤と組み合わせて使用される場合）、治療される疾患の種類、疾患の重症度と経過、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストが予防目的又は治療目的で投与されるか否か、患者の病歴とＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストに対する反応、及び主治医の裁量に依存するであろう。免疫チェックポイント阻害剤は、一度に、又は一連の治療にわたって、個体に適切に投与される。典型的な１日投与量は、上記の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。このような用量は、間欠的に、例えば、毎週又は３週間ごとに投与され得る（例えば、個体が、例えば、約２回から約２０回、又は例えば、約６回の免疫チェックポイント阻害剤の用量を受けるように）。初回の高負荷用量の後、それより低い用量を１回又は複数回投与してもよい。しかし、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
例えば、一般的な提案として、ヒトに投与される免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ－３抗体又は抗ＬＡＧ－３抗体の治療的有効量は、１回又複数回の投与によるかどうかにかかわらず、患者の体重１ｋｇあたり約０．０１から約５０ｍｇの範囲にあるであろう。いくつかの態様では、使用される抗体は、例えば、毎日、毎週、２週間ごと、３週間ごと、又は毎月、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの態様では、抗体は１５ｍｇ／ｋｇで投与される。しかし、他の投与レジメンも有用であり得る。一態様では、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、２１日サイクルの１日目（３週間ごと、ｑ３ｗ）に、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、又は約１８００ｍｇの用量でヒトに投与される。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）は、３週間ごとに（ｑ３ｗ）１２００ｍｇで静脈内投与される。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）は、２週間ごとに（ｑ２ｗ）８４０ｍｇで静脈内投与される。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）は、４週間ごとに（ｑ４ｗ）１６８０ｍｇで静脈内投与される。用量は、単回の用量又は複数回の用量（例えば、２又は３回の用量）として、例えば点滴で投与され得る。併用治療において投与される抗体の用量は、単一治療と比較して低減され得る。この治療法の進捗は、従来の技術によって容易にモニターされる。
いくつかの態様では、個体は、尿路がんに対して以前に治療されていない。いくつかの態様では、個体は、尿路がん（例えば、局所進行性又は転移性尿路癌、例えば、尿路上皮癌又は非尿路上皮癌）に対して以前に治療されている。いくつかの態様では、個体は、尿路がんに対して、プラチナを含む治療法（例えば、ゲムシタビン及びシスプラチンを含む療法；ゲムシタビン及びカルボプラチンを含む療法；又はメトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、及びシスプラチン（ＭＶＡＣ）を含む療法）で以前に治療されている。いくつかの態様では、個体は、プラチナを含まない治療法で、尿路がんに対して以前に治療されている。いくつかの態様では、個体は、以前に免疫チェックポイント阻害剤を投与されていない。
Ｇ．付加的治療剤
いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストは、１つ又は複数の付加的治療剤、例えば、併用療法と共に使用される。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む組成物は、付加的治療剤をさらに含む。別の態様では、付加的治療剤は、別々の組成物で送達される。いくつかの態様では、１つ又は複数の付加的治療剤は、免疫調節剤、抗腫瘍剤、化学療法剤、成長阻害剤、抗血管新生剤、放射線療法、細胞傷害性剤、細胞ベースの治療、又はそれらの組み合わせを含む。
上記の併用療法は、併用投与（同じ又は別々の製剤に２種以上の治療剤が含まれている）及び別々の投与（ここでは、付加的治療剤の投与前、投与と同時、及び／又は投与後にＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストの投与が起こり得る）を包含する。一態様では、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストの投与及び付加的治療剤の投与は、互いに、約１ヶ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５若しくは６日以内に起こる。
ＶＩＩ． ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療方法
Ａ．治療方法
いくつかの態様では、本発明は、ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を含む治療を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法を含む。
いくつかの態様では、本発明は、ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、該個体からの試料中のポドプラニン（ＰＤＰＮ）の発現レベルを決定することを含み、ここで、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療から利益を得る可能性がある個体として該個体を同定する、方法を含む。
いくつかの態様では、本発明は、がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、該個体からの試料中のＰＤＰＮの発現レベルを決定することを含み、ここで、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療から利益を得る可能性がある個体として該個体を同定する、方法を含む。
いくつかの態様では、個体は、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る試料中のＰＤＰＮの発現レベルを有し、方法は、ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与することをさらに含む。
いくつかの態様では、本発明は、がんを有する個体を治療する方法であって、（ａ）個体からの試料中のＰＤＰＮの発現レベルを決定することであって、試料中のＰＤＰＮの発現レベルが参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る、決定すること；及び（ｂ）ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与すること、を含む方法を含む。
いくつかの態様では、本開示は、がんを有する個体を治療する方法であって、ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与することを含み、ここで、個体からの試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回ると決定されている、方法を含む。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性はＰＤＰＮの阻害である。
いくつかの態様では、個体からの試料は、腫瘍組織試料又は腫瘍流体試料、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、アーカイブ試料、新鮮な試料、又は凍結試料である。
いくつかの態様では、試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、ＰＤＰＮのタンパク質発現レベル又はＰＤＰＮのＲＮＡ発現レベルである。いくつかの態様では、試料中のＰＤＰＮの発現レベルはＰＤＰＮのＲＮＡ発現レベルである。いくつかの態様では、ＰＤＰＮのＲＮＡ発現レベルは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ若しくはＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、ＦＩＳＨ、又はそれらの組み合わせによって決定される。
いくつかの態様では、利益は、ＣＤ１７７活性のアゴニストなしの治療と比較して、個体の無再発生存期間（ＲＦＳ）の延長を含む。他の態様では、利益は、例えば、ＣＤ１７７活性のアゴニストなしの治療と比較して、個体の全生存期間（ＯＳ）の延長、再発までの時間の増加、又は治療期間の短縮を含み得る。
Ｂ．参照発現レベル
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、がんを有する個体の集団、例えば、結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する個体の集団におけるＰＤＰＮの発現レベルである。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、がんを有する個体の集団における発現レベルの３３パーセンタイル、３５パーセンタイル、４０パーセンタイル、４５パーセンタイル、５０パーセンタイル、５５パーセンタイル、６０パーセンタイル、６５パーセンタイル、６６パーセンタイル、７０パーセンタイル、７５パーセンタイル、８０パーセンタイル、８５パーセンタイル、９０パーセンタイル、９５パーセンタイル、又は９９パーセンタイルである。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、がんを有する個体の集団における発現レベルの５０パーセンタイルである。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、がんを有する個体の集団における発現レベルの中央値である。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、がんを有する個体の集団における発現レベルの３３パーセンタイルである。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、がんを有する個体の集団における発現レベルの６６パーセンタイルである。
いくつかの態様では、個体の集団のＰＤＰＮ発現レベルは三分位に分けられ、参照ＰＤＰＮ発現レベルは第２の三分位における最低値である。
いくつかの態様では、個体の集団のＰＤＰＮ発現レベルは三分位に分けられ、参照ＰＤＰＮ発現レベルは第３の三分位における最低値である。
いくつかの態様では、参照ＰＤＰＮ発現レベルは、事前に割り当てられたＰＤＰＮ発現レベルである。
Ｃ．がん
いくつかの態様では、がんは、ＣＲＣ、頭頸部の扁平上皮癌、又は神経膠腫である。
いくつかの態様では、個体は結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する。いくつかの態様では、個体は、ＣＲＣの外科的切除を受けている。いくつかの態様では、個体のＣＲＣは、治療開始時のＴＮＭ分類システムによれば、ステージＩ、ステージＩＩ、又はステージＩＩＩ、又はステージＩＶのＣＲＣ、例えば、ステージＩＩのＣＲＣ又はステージＩＶのＣＲＣである。いくつかの態様では、個体のＣＲＣは左側腫瘍、すなわち遠位結腸（例えば、横行結腸の遠位１／３、脾弯曲部、下行結腸、Ｓ状結腸、又は直腸）に発生する腫瘍、又は右側腫瘍、すなわち近位結腸（例えば、横行結腸の近位２／３、上行結腸、及び盲腸）に発生する腫瘍である。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、アゴニストの非存在下での２つのタンパク質の結合と比較して、ＰＤＰＮとＣＤ１７７の結合の増加をもたらす。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、ＣＤ１７７活性のアゴニストの非存在下での下流活性と比較して、ＰＤＰＮの下流活性に変化をもたらす。いくつかの態様では、下流活性の変化は、腫瘍増殖の減少又はがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の収縮性の減少である。
Ｄ．ＣＤ１７７活性のアゴニスト
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、又は模倣物である。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、ペプチド、例えば、ＣＤ１７７ペプチド、例えば、ＣＤ１７７の細胞外ドメインである。ペプチドは、多量体化、例えば、二量体化、三量体化、四量体化、又は五量体化され得る。いくつかの態様では、ペプチドは四量体化され、例えば、ストレプトアビジンを使用して四量体化される。
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＰＮに結合し、例えば、ＰＤＰＮに結合するアンタゴニスト抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ１７７に結合し、例えば、ＣＤ１７７に結合するアゴニスト抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、抗原結合断片は、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
ＣＤ１７７活性のアゴニストは、例えば、相互作用の調節を同定するための方法、又は本明細書のセクションＩＩＩＡ及びＩＩＩＢに記載されるタンパク質の下流活性の変化を同定するための方法を使用して同定され得る。例えば、本明細書に記載されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、ＥＬＩＳＡ、又は細胞外若しくは細胞表面相互作用を含む方法を使用して、ＣＤ１７７とＰＤＰＮとの間の相互作用を増加させるモジュレーター、すなわちＣＤ１７７活性のアゴニストを同定することができる。
ＣＤ１７７活性のアゴニストが抗体（例えば、ＣＤ１７７アゴニスト抗体又はＰＤＰＮアンタゴニスト抗体）である態様では、抗体は、所望の活性又は複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを作成して所望の結合特性を有する抗体の当該ライブラリをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、無作為にファージライブラリ中で再結合され、Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)に述べられているようにして、そのファージライブラリは抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths et al., EMBO J,12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、免疫化なしで、広範囲の非自己及び自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、Hoogenboom and Winter, J. Molによって記載されているように、幹細胞から再配列されていないＶ－遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再編成を達成するために、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いることによって、ナイーブライブラリを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号及び同第２００９／０００２３６０を含む。
Ｅ．送達の方法
本明細書に記載の方法で利用される組成物（例えば、ＣＤ１７７活性のアゴニスト）は、例えば本明細書のセクションＶＢに記載されるような任意の適切な方法によって投与することができる。
Ｆ．付加的治療剤
いくつかの態様では、ＣＤ１７７活性のアゴニストは、例えば、本明細書のセクションＶＩＦに記載されるように、１つ又は複数の付加的治療剤、例えば併用療法と共に使用される。
ＶＩＩＩ．製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。
いくつかの態様では、本発明は、多数の位置を含む固体表面又は固体表面のセット（例えば、マルチウェルプレート又はマルチウェルプレートのセット）であって、前記位置の各々がポリペプチドのコレクションからの一意のポリペプチドを含む、固体表面又は固体表面のセットを含み、ここで、各ポリペプチドは細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含み、ポリペプチドのコレクションは表７のタンパク質の全て又はサブセットの細胞外ドメインを含む。ポリペプチドの例示的なコレクションは、セクションＩＩＢに記載されている。
いくつかの態様では、本発明は、多数の位置を含む固体表面又は固体表面のセット（例えば、マルチウェルプレート又はマルチウェルプレートのセット）であって、前記位置の各々が、上記のように一意のポリペプチドをコードするプラスミドを含む、固体表面又は固体表面のセットを含む。いくつかの態様では、固体表面又は固体表面のセットは、ポリペプチドでスタンプされている。
いくつかの態様では、本発明は、固体表面又は固体表面のセット（例えば、マルチウェルプレート又はマルチウェルプレートのセット）であって、前記位置の各々がポリペプチドのコレクションからの一意のポリペプチドを含む、固体表面又は固体表面のセットを含み、ここで、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質の全て又はサブセットの細胞外ドメインを含み、前記ポリペプチドは、１つ又は複数の固体表面に固定化されており、前記ポリペプチドの１つ又は複数の各々は、前記１つ又は複数の固体表面上の別個の位置（例えば、明確に調査可能な位置、例えば、本明細書に記載の方法によって明確に調査可能な位置）に固定化される。別個の位置は、細胞株がプレーティングされる表面上の領域、例えば、ウェルであり得る。
いくつかの態様では、固体表面又は固体表面のセットは、合わせて少なくとも９６５の位置を含み、位置の各々はポリペプチドのコレクションからの一意のポリペプチドを含み、ここで、各ポリペプチドは細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含み、ここで、ポリペプチドのコレクションは表７のタンパク質の少なくとも８１％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、固体表面又は固体表面のセットは、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１０５０、少なくとも１１００、少なくとも１１５０、又は１１９５個の位置を含み、例えば、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、９５０～１０００、１０００～１０５０、１０５０～１１００、１１００～１１５０、又は１１９５個の位置を含み、それぞれが、ポリペプチドのコレクションからの一意のポリペプチド又はそのようなポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８１％から１００％の細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％を含み（例えば、全てを含む）、例えば、表７のタンパク質のうちの８１％～８５％、８３％～８７％、８５％～８９％、８７％～９１％、８９％～９３％、９１％～９５％、９３％～９７％、９５％～９９％、又は１００％の細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表７のタンパク質のうちの少なくとも８０％から８１％の細胞外ドメインを含み、例えば、表７のタンパク質のうちの少なくとも８０．１％、８０．２％、８０．３％、８０．４％、８０．５％、８０．６％、８０．７％、８０．７５％、８０．８％、又は８０．９％を含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドのコレクションは、表１７のタンパク質のうちの少なくとも１つの細胞外ドメインを含み、例えば、表１７のタンパク質のうちの少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、又は２３１個全ての細胞外ドメインを含み、例えば、表１７のポリペプチドのうちの１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１０１～１０５、１０５～１１０、１１０～１１５、１１５～１２０、１２０～１２５、１２５～１３０、１３０～１３５、１３５～１４０、１４０～１４５、１４５～１５０、１５０～１５５、１５５～１６０、１６０～１６５、１６５～１７０、１７０～１７５、１７５～１８０、１８０～１８５、１８５～１９０、１９０～１９５、１９５～２００、２００～２０５、２０５～２１０、２１０～２１５、２１４～２２０、２２０～２２５、２２５～２３０、又は２３１個全ての細胞外ドメインを含む。
いくつかの態様では、本発明は、一組の容器（例えば、一組のバイアル）を含み、各バイアルは、上記のような一意のポリペプチドをコードするプラスミドを含む。
ＩＸ． 実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供された一般的な記述を考慮すると、様々な他の態様が実施され得ることが理解され、その例は特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。
実施例１ ＩｇＳＦタンパク質とヒトＳＴＭ受容体ライブラリとの相互作用のアッセイ
低親和性相互作用の偏りのない検出のための技術を使用して、ほとんどのヒト単一膜貫通（ＳＴＭ）受容体（１，２２６受容体）を含むライブラリを４４５の免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）タンパク質への結合についてアッセイした。ＩｇＳＦタンパク質は、軸索ガイダンス又はシナプス可塑性の調節、細胞遊走及び接着の制御、並びに自己対非自己認識などの広範な機能性を媒介するホモフィリック及びヘテロフィリック複合体の形成を介して機能することが知られており、このように、これらのタンパク質は、薬物開発の取り組みの主要な焦点を構成する。
Ａ．ＩｇＳＦクエリコレクション
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）コレクション（クエリコレクション）は、タンパク質の特徴の予測のための様々な計算アルゴリズムからの機能注釈づけと計算予測を統合し、その後慎重に手動でキュレーションとレビューを行うことにより定義された。まず、ＩｎｔｅｒＰｒｏ（ＩＰＲ０３６１７９）によれば、「免疫グロブリン様ドメインスーパーファミリー」と予測されるタンパク質のリストがＵｎｉＰｒｏｔからダウンロードされた。このリストは、関連する生物学的機能への関与に基づいて９８の選択されたタンパク質で補完され、受容体シグナル伝達機能に関連する細胞外ドメインとモチーフに関する証拠に照らしてさらにキュレートされ、４４５のタンパク質のサブセットに制限された（Clark et al., Genome Res, 13: 2265-2270, 2003; Daeron et al., Immunol Rev, 224: 11-43, 2008; Yap et al., J Mol Biol, 426: 945-961, 2014）。最終的なクエリセットには、３６５個のヒトＩｇＳＦタンパク質（ＩｎｔｅｒＰｒｏ注釈によると、ＩｇＳＦの８２％程度）と９８個の追加タンパク質が含まれており、そのうちのいくつかはＳｗｉｓｓＰｒｏｔで「Ｉｇ様フォールド」でも注釈付けされている（図１Ａ；表４）。ＩｇＳＦタンパク質は、既述のとおりクローニングされた（Bushell et al., Genome Res, 18: 622-630, 2008; Martinez-Martin et al., Cell, 174(5): 1158-1171, 2018）。簡潔には、各ＩｇＳＦクエリタンパク質のＥＣＤを、ラット軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の五量体ヘリックス領域及びβ－ラクタマーゼに融合させ、結合活性を増加させ、基質ニトロセフィンの添加時に比色読み取りを可能にした（図１Ｂ）。全てのクローンは、哺乳動物細胞の発現のためにコドン最適化された配列を使用して合成された。
マイクロモルのＫＤでの一過性の相互作用を含む広範囲の親和性を特徴とする受容体－リガンド相互作用を検出するこの技術の力は、これまでに示されている（Martinez-Martin et al., Cell, 174(5): 1158-1171, 2018）。ヒト受容体間の相互作用の検出のためのこのプラットフォームの感度及び再現性をさらにベンチマークするために、確立された手順に従い、ＰＤ－１／ＰＤＣＤ１及びＰＤ－Ｌ２／ＰＤＣＤ１ＬＧ２タンパク質をスクリーニングした（図１Ｂ）。特に、予想される全ての相互作用因子は、高い正規化シグナル（＞０．７５）、高い結合特異性及び優れた再現性（ピアソンのｒ＞＝０．８７）で検出され（図１Ｃ及び図７Ｃ－７Ｅ）、受容体相互作用発見プラットフォームの頑健性をさらに実証した。
Ｂ．ヒトＳＴＭ受容体ライブラリ
単一膜貫通（ＳＴＭ）受容体（プレイライブラリ）のリストは、タンパク質の特徴を予測するための様々な計算アルゴリズムからの機能的注釈と計算予測を統合し、続いて注意深く手動でキュレーションし、公開された注釈のレビューを行って編集された（Clark et al., Genome Res, 13: 2265-2270, 2003; Martinez-Martin et al., Cell, 174(5): 1158-1171, 2018）。このライブラリは、１，２６６個の一意のヒトＳＴＭ受容体で構成される（表５）。ＳＴＭ受容体は、ヒトＦｃタグに融合した細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（例えば、可溶性ＥＣＤ）として発現された。これはタンパク質の発現を促進し、界面活性剤の存在下での可溶化の必要性を回避し、プロテインＡでコーティングされたプレート上での強固な捕捉を可能にする（図１Ｂ）。簡潔には、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の境界は、タンパク質の特徴を予測するために公開されているサーバー（Ｐｈｏｂｉｕｓ、ＴＭＨＭＭ、ＳｉｇｎａｌＰ３．０）を使用して、シグナルペプチドと膜貫通ヘリックス又はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合部位を予測することによって決定された。各受容体のＥＣＤを合成し、Ｃ末端ヒトＦｃタグを含むｐＲＫ５ベクター（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）にクローニングした。ＩＩ型ＳＴＭタンパク質については、ＨＳＶシグナル配列がＮ末端Ｆｃタグの上流に挿入された。
Ｃ．細胞培養及び馴化培地の生成
ｉ．細胞培養
ＳＴＭ受容体ライブラリ用の馴化培地は、ＨＥＫ２９３細胞（上皮ヒト細胞、胎児腎臓）から適合された浮遊細胞株であるＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して調製した。細胞を以下の条件下で培養した：３７℃、８％のＣＯ２、８０％湿度、１５０ｒｐｍの撹拌速度。Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をシードトレイン及び生産培地として使用した。分泌された五量体ＩｇＳＦタンパク質の発現には、同じ細胞株及び培養条件を使用した。ＣＯＳ７細胞（サル腎臓組織に由来する線維芽細胞株、ＡＴＣＣから購入）又はＨＥＫ－２９３細胞を、完全長タンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）として発現される関連する結合パートナーの一過性発現のために使用した。トランスフェクションは、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＰＬＵＳ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを使用して実施した。細胞は、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、３７℃の加湿、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
ｉｉ．馴化培地生成
ＳＴＭ受容体のコレクション（プレイライブラリ；ヒトＦｃタグ（ＥＣＤ－Ｆｃ）に融合した細胞外ドメイン（ＥＣＤ）としてクローニング）を、馴化培地中で可溶性タンパク質として発現させるためにヒト細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞トランスフェクション自動化のための細胞培養及び機器が詳細に記載されている（Bos et al., Biotechnol Bioeng, 112: 1832-1842, 2015）。簡潔には、トランスフェクションは、懸濁液に適応したＨＥＫ２９３株であるＥｘｐｉ２９３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施された。Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をシードトレイン及び生産培地として使用した。細胞をフラスコ内でシードトレインとして培養し、一過性トランスフェクションの前に、加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２、１５０ｒｐｍの攪拌速度で増殖させた。Ｔｅｃａｎ ＥＶＯ液体処理システム（Ｔｅｃａｎ）及び統合ＭｕｌｔｉＤｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ試薬ディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、全ての自動細胞培養操作に利用した。プレイライブラリは、最近記載されている自動プラットフォーム（Bos et al., Biotechnol Bioeng, 112: 1832-1842, 2015; Martinez-Martin et al., Cell, 174(5): 1158-1171, 2018）を使用して、マイクロスケール１ｍＬ一過性トランスフェクションを使用して調製した。簡潔には、ハイスループットプラスミド精製システムを使用してミニプレップスケールでＤＮＡを精製し、各ウェルに１μｇのＤＮＡを分注した。オリゴマークエリタンパク質が豊富な調整培地の作製のために、各ウェルに合計３０μｇを使用する３０ｍＬの一過性トランスフェクションを、基本的に記載されているように（Bos et al., Biotechnol Bioeng, 112: 1832-1842, 2015）、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ液体処理ロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、効率化のために９６のバッチで処理された５０ｍｌのチューブスピン中で実施した。２５ＫＤａの線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を一過性トランスフェクション手順のために使用し、トランスフェクション後７日目に馴化培地を回収した。３０００ｒｐｍで３０分間回転させて細胞を除去し、上清を処理するまで４℃で保存した。
ｉｉｉ．タンパク質間相互作用スクリーニングのためのＳＴＭライブラリ－コーティングプレートの調製
利用された受容体－リガンドスクリーニング技術は、結合活性に基づく細胞外相互作用（ＡＶＥＸＩＳ）法（Bushell et al., Genome Res, 18: 622-630, 2008）に基づき、３８４ウェルプレートフォーマットでの自動ハイスループットスクリーニングにさらに適応された（Martinez-Martin et al., Cell, 174(5): 1158-1171, 2018）。簡潔には、ハイスループット細胞外相互作用スクリーニングのための馴化培地を調製するために、関連する翻訳後修飾の付加を最大にするために、ＳＴＭプレイライブラリ及びＩｇＳＦクエリタンパク質を、上記のようにヒト発現系で生産した。細胞トランスフェクションを記載されているように実施し、細胞培養物を７日間増殖させた後、３，０００ｇで３０分間遠心分離して細胞を除去した。プロテインＡでコーティングされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、一晩インキュベートし、続いて４℃で保存することによって、馴化培地からプレイライブラリを捕捉した。同様の手順を使用してＩｇＳＦクエリタンパク質を調製した。これらのタンパク質は、捕捉ステップを一切行わずに馴化培地中で直接アッセイした。スクリーニングの前に、各五量体ＩｇＳＦ受容体の濃度は、読み取り値として馴化培地中のβ－ラクタマーゼ活性を使用して正規化された。簡潔には、上清の希釈系列をニトロセフィン（０．１２５ｍｇ／ｍＬ）に加え、直ちにプレートリーダーに移し、毎分４８５ｎｍでの吸光度を計２０分間記録した。各クエリタンパク質の発現レベルは、記載されているように、≦１０μＭの相互作用を同定するために以前に決定された閾値レベルに正規化された（Bushell et al., Genome Res, 18: 622-630, 2008）。
ｉｖ．馴化培地におけるＥＣＤ－Ｆｃ受容体濃度の分析
アッセイに利用された馴化培地中の各ＳＴＭ受容体（ＥＣＤ－Ｆｃ）の濃度は、ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ時間分解（ＴＲ）－ＦＲＥＴアッセイを使用して測定された。ＡｆｆｉｎｉＰｕｒ Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ Ｃｒｙｐｔａｔｅ（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）とコンジュゲートしたＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７Ｒ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒ Ｆ（ａｂ’）２ロバ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγをそれぞれドナー及びアクセプターとして使用した。標準物質、対照物質及び試料をアッセイ希釈液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０／１５ｐｐｍ Ｐｒｏｃｌｉｎ）で希釈し、１５３６ウェルＭａＫＯ白色プレート（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に加えた。次に、ドナーとアクセプター試薬の混合溶液を各ウェルに加えた。プレートを周囲温度で１時間インキュベートした後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）プレートリーダーを使用して、励起波長３２０ｎｍ、発光波長６６５ｎｍ及び６２０ｎｍで読み取った。ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルは，２つの発光波長（６６５ｎｍ／６２０ｎｍ）の比に１０，０００を乗じた値として報告された。試料定量化は、標準の５パラメータ適合からの結果を補間することによって得られた。データはカスタムソフトウェアを使用して処理された。
Ｄ．自動細胞表面相互作用スクリーニング
ＩｇＳＦメンバーの相互作用レパートリーを系統的に探索するために、各クエリタンパク質をＳＴＭ受容体のライブラリ全体に対して個別にスクリーニングし、２０００を超える個別の３８４ウェルプレートから約６００，０００のバイナリ結合イベントを試験した（図８Ａ）。
ＳＴＭ受容体ライブラリコーティングプレートの調製及びＳＴＭ受容体ライブラリに対するオリゴマーＩｇＳＦタンパク質のスクリーニングは、自動液体処理装置（プレートディスペンサー及びウォッシャー）からなる統合ロボットシステムを使用して実施され、タンパク質間相互作用のハイスループット分析が可能となり、スクリーニングデータの質を向上させるためのマニュアル操作が最小限に抑えられた（Martinez-Martin et al., Cell, 174(5): 1158-1171, 2018）。このシステムは、ロボットアームと統合されたいくつかの装置で構成される全自動マイクロプレートアッセイシステムであった。このシステムは、プレートからプレートへの試料移送用の３８４チャネルピペットヘッドを備えたＢｉｏｍｅｋ ＦＸ液体ハンドラー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、アッセイプレートとチップボックスを保管するためのＴｈｅｒｍｏ Ｃｙｔｏｍａｔ ９ホテルカルーセル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、プレートの洗浄及びプレートへの試薬分注用のＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６コンビネーションウォッシャー／ディスペンサー（ＢｉｏＴｅｋ）、及び追加試薬を分注するためのＢｉｏＴｅｋ ＭｕｌｔｉＦｌｏディスペンサー（ＢｉｏＴｅｋ）で構成されていた。ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、スクリーニングプレートからのシグナルを記録した。この方法は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＡＭＩソフトウェアを使用して開発された。このソフトウェアは、実行中のアッセイプレートの数に応じて方法をスケジュールし、自動プロセス全体の実行を制御する。
本研究で使用した全３８４ウェルスクリーニングプレートは、クエリ構築物の最大酵素吸光度を報告する１６のウェル（自動化手順の陽性対照として使用）、プレートバックグラウンドを報告する１６のブランクウェル（陰性対照）、及びＳＴＭライブラリから無作為にスポットされた３４６のプレイタンパク質で構成された。平均して、このワークフローによって、４つのスクリーニングプレートにわたって分配された１３６４個のプレイからなるライブラリに対して、１日に最大７個のクエリタンパク質のスクリーニングが可能になった（図７Ｃ）。スクリーニング当日、馴化培地ライブラリと共に一晩インキュベートされたプロテインＡコーティングプレートを、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含むＰＢＳで３回洗浄した。続いて、プレートに五量体化ＩｇＳＦクエリタンパク質（５０μＬ／ウェル）を含む馴化培地を播種し、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳで洗浄して、結合していないＩｇＳＦ五量体を全て除去した。ニトロセフィン（５０μＬ／ウェル）を加えた（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。色の変化によって示されるニトロセフィンの加水分解は、β－ラクタマーゼ活性の存在下で観察され、ＩｇＳＦクエリタンパク質がウェルに捕捉された個々のＳＴＭ受容体に結合していることを示した（図１Ｂ）。プレートを室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、ＩｇＳＦ‐ＳＴＭ受容体相互作用を４８５ｎｍでの吸光度測定により評価した。
実施例２ ＩｇＳＦ細胞外相互作用スクリーニング結果の分析とＩｇＳＦインタラクトームの予測
この大きなデータセットの分析を可能にし、非特異的（偽陽性）結合因子を確実に同定し、自動化された方法で結合スコアを計算するために、計算分類ツールを開発した。
まず、プレートの推定バックグラウンド酵素吸光度（１０％－ｉｌｅ）を差し引いた後、それらの値を最大酵素吸光度推定値（９９．５％－ｉｌｅ）にスケーリングして、スクリーニングプレートごとに生の酵素吸光度値を補正し、各測定ウェルの［０，１］範囲内の正規化吸光度値を導出した。全ての吸光度対照と空のウェルの値は除外され、正規化された吸光度の値は、クエリ（行）とプレイ（列）のデータマトリックスにまとめられた。データマトリックスを使用して、クエリ－プレイの各対について４つの予測的特徴を計算した：１）正規化された吸光度値；２）クエリのＺスコア（１つのクエリについて４つのＳＴＭライブラリプレート上の全てのプレイにわたるＺスコア）；３）プレイのＺスコア（ＳＴＭ受容体ライブラリに対してスクリーニングされた全てのクエリにわたるプレイごとのＺスコア）；４）カスタム特異性スコア。以下のように計算される。
Figure 2022527192000001
Ｃａｒｅｔ Ｒパッケージに実装されている教師つきランダムフォレスト分類器は，文献から収集した真の陽性受容体相互作用、直交ライブラリスクリーニングで観察された「非特異的」プレイ（表１４）、及び９９－％－ｉｌｅ（正規化吸光度＜０．０５７）未満のデータポイントから陽性と陰性の比率を１：１０にしてサンプリングした真の陰性相互作用のベンチマークデータセットを使用して、４つの特徴を全て使用してトレーニングされた（図８Ｃ－８Ｅ）。トレーニング及び予測に先立ち、全ての吸光度対照を削除した。Ｃａｒｅｔのトレーニング関数は、以下のパラメータで構成した：トレーニングセットサイズ７５％、試験セットサイズ２５％、反復交差検証（Ｎ＝１０、Ｒ＝１０）、多クラス予測（陽性、陰性、非特異的）、ランダムフォレストのグリッド探索パラメータ最適化（ｍｔｒｙ＝２０、．ｎｔｒｅｅ＝３０）及びパフォーマンスメトリックとしての精度。予測された「高い信頼度」のＩｇＳＦインタラクトームは、以下のクラス確率によってさらにフィルタリングすることによって定義された：（陽性）＞＝０．７５、Ｐ（非特異的）＜＝０．２５及びＰ（陰性）＜＝０．０５（図２Ｂ及び８Ｂ）。最後に、表現とデータ統合の目的で、同一のＳＴＭ受容体の複数のプレイ構築物で同定された全ての相互作用と双方向に同定された相互作用を、一意の結合パートナーの無方向性、非重複リストに要約した。
この分類訓練により、「ＩｇＳＦインタラクトーム」と呼ばれる４４０個の一意のＩｇＳＦタンパク質とＳＴＭタンパク質の間に、５７７個の予測される高信頼性相互作用が得られた（図２Ａ、表６）。データの統合、分析及び可視化を容易にするために、ＩｇＳＦインタラクトームは、「ノード」が細胞外タンパク質を表し、「エッジ」がそれらの間の相互作用を表すサイトスケープ相互作用ネットワークとして表現された（図２Ａ）。ＩｇＳＦインタラクトームネットワークは高度に接続されている（図２Ａ）。生物学的ネットワークの接続性は多くの研究の主題であり、それらのスケールフリーな特性が頑健性に寄与すると仮定している（Barabasi, Science, 325: 412-413, 2009）。実際、ＩｇＳＦインタラクトームのネットワーク分析では、各タンパク質は平均して２～３個の隣接タンパク質に接続されており、トポロジー係数は、スケールフリーネットワークの特徴であるべき乗則分布に従うことが示された（図２Ｃ）。これは、細胞外インタラクトームが切断された受容体－リガンド対で構成されているのではなく、密な内部接続性と疎な、しかし関連する相互接続性を有するモジュラーコンポーネントで構成されていることを示唆している（Albert, J Cell Sci, 118: 4947-4957, 2005)。
ＩｇＳＦインタラクトームは、４７２の新規相互作用の顕著な数を同定し、Ｂｉｏｇｒｉｄ、Ｂｉｏｐｌｅｘ及びＳＴＲＩＮＧデータベースの集合体において以前に実証された１０５の相互作用を再現した（図２Ｄ）。
実施例３ ＩｇＳＦインタラクトームデータと公開データセットとの統合
Ａ．ＩｇＳＦインタラクトーム及びＢｉｏｐｌｅｘ、Ｂｉｏｇｒｉｄ、ＳＴＲＩＮＧデータセット
ＩｇＳＦインタラクトームデータセットを、ヒトタンパク質相互作用のために現在最も系統的に編集されたリソースである、Ｂｉｏｐｌｅｘ、Ｂｉｏｇｒｉｄ、及びＳＴＲＩＮＧデータセット（Chatr-Aryamontri et al., Nucleic Acids Res, 45: D369-D379, 2016; Huttlin et al., Nature, 545: 505-509, 2017; Szklarczyk et al., Nucleic Acids Res., 43: D447-452, 2015）と比較した。Ｂｉｏｐｌｅｘデータセットは、Ｂｉｏｐｌｅｘウェブページ（ｖ２．０）からダウンロードした。Ｂｉｏｇｒｉｄデータセットは、Ｂｉｏｇｒｉｄウェブページ（ｖ３．４．１６０、物理的相互作用）からダウンロードした。全てのＳＴＲＩＮＧ「エビデンスチャネル」を含むＳＴＲＩＮＧデータセットをＳＴＲＩＮＧウェブサイト（ｖ．１０．５）からダウンロードし、前述の加重エビデンスチャネルに基づいて、ＳＴＲＩＮＧ「複合スコア＞０．７」の相互作用のみを保持するようにフィルタリングした（von Mering et al., Nucleic Acids Res, 33:D433-437, 2005）。重複パーセンテージを計算するために、３つのタンパク質相互作用リソースは全て、この研究で試験されたバイナリ相互作用の範囲に限定され、プレイタンパク質による全てのクエリの組み合わせセットとした。全てのネットワーク統計はＣｙｔｏｓｃａｐｅ（ｖ．３．６．１）で計算した（Shannon et al., Genome Res, 13: 2498-2504, 2003）。
相対的に言えば、我々のデータセットは、ＳＴＲＩＮＧデータベースとの重複が最も大きく（８２／１０３７）、ＨＥＫ２９３細胞及びＨＣＴ１１６細胞における複合Ｂｉｏｐｌｅｘとの重複が最も小さく（１１／３５０）、これはＢｉｏｐｌｅｘの取り組みの規模（ほぼ１５，０００種類のタンパク質の間で約１２０，０００の相互作用）を考慮すると重要な観察であり、我々の研究で研究されたほぼ全てのタンパク質がＢｉｏｐｌｅｘ及びＳＴＲＩＮＧデータベースの一部でもあるという事実を示している（図７Ａ）。Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓからのタンパク質局在情報の統合により、Ｂｉｏｐｌｅｘに見られる２つの細胞外タンパク質間の相互作用の数は不釣り合いに少なく、このデータセットの約１％のみが、ヒトゲノムにコードされている細胞外タンパク質のセット間の相互作用を表していることが明らかになった（図２Ｅ）。標準的なＡＰ－ＭＳワークフローで原形質膜発現タンパク質を捕捉するという課題と、Ｂｉｏｐｌｅｘプロジェクトが細胞内タグ付き構築物に焦点を当てていることは、この観察に対する論理的な説明を提供し、さらに、細胞外環境で起こる相互作用に対処するための本研究の関連性を強調する。最後に、ネットワーク上に表示される２３８個のＳＴＭタンパク質がクエリタンパク質としても含まれていることを考えると、我々のスクリーニングではこれらを相互作用として検出することが可能であった。実際、１１４の相互作用（３１６のうち、約３６％）が、クエリ－プレイ及びプレイ－クエリ対として観察された（図２Ｆ）。
Ｂ．健常組織発現相関によるネットワーククラスタリング
原形質膜タンパク質の研究に関連する本質的な課題は、重要なことに、ヒト受容体間の機能的関係の系統的探索を妨げてきた。我々の知る限り、配列及び構造の特徴から共有リガンド相互作用を予測することによって細胞受容体を機能ファミリーに分類しようと試みた研究はわずかしかなく、事実上全ての予測に実験的検証が欠けている。ＩｇＳＦインタラクトームの機能的解釈を容易にするため、遺伝子型－組織発現（ＧＴＥｘ）プロジェクト（Pierson et al., PLoS Comput Biol, 11, e1004220, 2015）からのＩｇＳＦインタラクトームにおける全タンパク質（ネットワークノード）の健常組織ｍＲＮＡ発現プロファイルを統合した。
ＧＴＥｘにおけるノード対間の組織発現相関は、全組織詳細カテゴリにわたってｌｏｇ２変換ＲＰＫＭのスピアマン係数として計算した。全ての検定ｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用した多重仮説検定用に調整された。全てのヒートマップをｐｈｅａｔｍａｐ Ｒパッケージでプロットした。教師なしクラスタリングは、ユークリッド距離とウォードリンケージを使用して実行された。全てのネットワーク統計はＣｙｔｏｓｃａｐｅ（ｖ．３．６．１）（Shannon et al., Genome Res, 13: 2498-2504, 2003）で計算した。また、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ上で、ＣｌｕｓｔｅｒＭａｋｅｒ２プラグインに実装されているマルコフクラスタリングアルゴリズム（ＭＣＬ）を使用して、エッジの重みとしてスピアマン相関係数を用いてネットワーククラスタリングを行った（インフレーションパラメータ＝１．４、残差が増加した場合は停止＝Ｆａｌｓｅ、反復回数＝５００）。ＧＯｓｔａｔｓ Ｒパッケージ（Falcon and Gentleman, Bioinformatics, 23: 257-258, 2007）を使用して、ＭＣＬクラスターごとに遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮統計を算出した。有意に濃縮されたＧＯ生物学的プロセス項は、ｑ値＜０．０５によって決定した。全ての重要な用語は手作業でキュレーションされ、図３Ａに示されている包括的なカテゴリに集約された。
我々は、接続されたＩｇＳＦ及びＳＴＭタンパク質のモジュラーコンポーネントは、機能的な関係を共有する可能性が高く、同じ組織で一般的に発現するであろうという仮説を立てた。この仮説と一致して、相互作用するタンパク質の対に関するグローバル組織相関係数は、我々のスクリーニングにおける非相互作用対のものと比較して、実際に有意に高かった（ｐ＜１．２ １０－２０、片側ウィルコクソン順位和検定）（図３Ｂ及び９Ａ）。物理的関連性と共発現関連性との間に明確な一致が認められたことから、発現相関係数を使用して、ＩｇＳＦインタラクトームのモジュラーコンポーネント又は「コミュニティ」へのクラスタリングを情報提供した（図３Ａ）。予想通り、共発現係数は、これらのコミュニティ間の全ての相互作用と比較して、これらのコミュニティ内で有意に高かった（図９Ｂ）。
クラスター化されたインタラクトームは、ＣＥＡＣＡＭタンパク質（図３Ａ、クラスター１８）、ＰＶＲ／ネクチン受容体（図３Ａ、クラスター１３）、セマフォリン／プレキシンファミリー（図３Ａ、クラスター２１）、又は受容体型チロシンキナーゼのエフリンファミリー（ＲＴＫ）（図３Ａ、クラスター５）などを含む、密接に関連するＩｇＳＦメンバー間で密接に接続された多数のコミュニティを表示した。共発現とクラスタリングの結果は、ＭＤＧＡ１／ニューロリギン又は免疫受容体ＡＸＬとその推定結合パートナーを含む、これまで知られていなかった多くのタンパク質対の強い関連性も明らかにし、これらの組織におけるこれらの相互作用の生理学的役割を示唆している。次に、全てのネットワークコミュニティを、カスタム遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析で調査し、インタラクトームコミュニティ内のタンパク質の機能分類を試みた。この濃縮分析は、全ての大きなコミュニティ（ｎ＞２）は、免疫反応の調節、神経系の発達、シグナル伝達、細胞間コミュニケーションなど、既知のＩｇＳＦ機能に関連する生物学的関連性を捉えていることを示し、比較的よく研究された結合パートナーとの関連に基づいて、タンパク質の特徴づけが不十分なタンパク質の推定機能の割り当てを可能にした（図３Ａ）。
相互作用するタンパク質は、相互作用しない対と比較して有意に相関する組織発現パターンを有していたが、両方の分布間の適度な平均シフトは、この違いが選択された相互作用及び／又は特定の組織の状況における相互作用によって引き起こされたことを示唆した。実際、上位５％の最も相関のある相互作用対内で、多くの既知のタンパク質対が、別個の組織においてより顕著な相関パターンを示し、例えばネクチン１－ネクチン４（図３Ｃ）又はＣＥＡＣＡＭ５－ＣＥＡＣＡＭ７（図３Ｄ及び図９Ｃ）はそれぞれ皮膚及び結腸でそれぞれ高度に相関していた。
興味深いことに、ＩｇＳＦインタラクトームデータセットで認められた新規相互作用の多くも、同様に強い組織依存性の関連性を示した。例えば、ＬＩＬＬＲＡ５及びＬＩＬＬＲＢ１は、血中で（図３Ｅ及び図９Ｄ）；ＰＴＰＲＺ１及びＣＮＴＮ１は、脳内で（図３Ｆ）；ＮＣＲ１及びＳＩＧＬＥＣ７（図９Ｅ）は、複数の組織で高度に関連しており；又はＣＨＬ１及びＬ１ＣＡＭ（図３Ｇ及び図９Ｆ）は、組織全体で強く関連しており、特定の生物学的シナリオにおけるこれらの相互作用の関連性のある役割が示唆された。次に、これらの相互作用が細胞上で「イントランス」で起こり得るかどうかを、細胞表面に発現している推定バインダーの高感度検出のための四量体化に基づくアプローチを使用して調べた（図３Ｈ）。これらの結果から、ＮＣＲ１のＳＩＧＬＥＣファミリーの特異的メンバーへの結合（図３Ｉ）、ＣＨＬ１とＬ１ＣＡＭの間の相互作用（図３Ｊ及び図９Ｇ及び９Ｈ）、並びにＣＮＴＮ１のＰＴＰＲＺ１及び残りの推定結合パートナーへの結合（図３Ｋ及び図９Ｈ及び図９Ｉ）が実証された。共免疫沈降研究は、ＮＣＲ１が原形質膜との関連で新たに同定された全ての結合パートナーと相互作用することを示し、これらの相互作用の役割がさらに裏付けられた（図３Ｌ－３Ｎ）。まとめると、これらの分析により、結合パートナーの共発現によって支配される、これまで報告されていなかったタンパク質ファミリー間の機能的関連の可能性についての記述が可能になった。その結果、この取り組みは、既知であり、十分に特徴づけられていないタンパク質についての推定分子機能の仮説駆動型研究を強化し、これらのタンパク質が機能する可能性のある生物学的に関連のある状況の理論的根拠を提供する。
ＧＴＥｘデータセットはＧＴＥｘポータルウェブページからダウンロードされた（ｖ７、我々の内部パイプラインによって再処理された）。
Ｃ．ＩｇＳＦインタラクトーム及びＴＣＧＡデータセット
細胞外インタラクトームの撹乱は、しばしば特徴づけられていない機構を通して、腫瘍増殖及び免疫回避を含む病理学的過程と密接に関連している。したがって、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）で報告されているように、インタラクトーム内のどのエッジが、隣接する正常組織に対する腫瘍組織での遺伝子発現と比較して有意に調節解除されている（アップレギュレート又はダウンレギュレートされている）ノードを接続しているかを調べることを試みた。
ＴＣＧＡにおける腫瘍対対応する隣接正常の差を、少なくとも３つの対応する正常試料を有する全ての適応症（３３の適応症のうちＮ＝２０）について評価した。差次的発現を、両側ｔ検定を使用して、少なくとも３つの対応した腫瘍及び隣接正常試料を用いて、全てのＴＣＧＡ適応症について試験した。全ての検定ｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用した多重仮説検定用に調整された。全てのヒートマップをｐｈｅａｔｍａｐ Ｒパッケージでプロットした。教師なしクラスタリングは、ユークリッド距離とウォードリンケージを使用して実行された。全てのネットワーク統計はＣｙｔｏｓｃａｐｅ（ｖ．３．６．１）で計算した（Shannon et al., Genome Res, 13: 2498-2504, 2003）。また、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ上で、ＣｌｕｓｔｅｒＭａｋｅｒ２プラグインに実装されているマルコフクラスタリングアルゴリズム（ＭＣＬ）を使用して、エッジの重みとしてスピアマン相関係数を用いてネットワーククラスタリングを行った（インフレーションパラメータ＝１．４、残差が増加した場合は停止＝Ｆａｌｓｅ、反復回数＝５００）。
この分析から、５４３／７０３のエッジ（約７５％）で接続された３９８／４８５のノード（約８２％）が、少なくとも１つのＴＣＧＡ適応症において共同で調節解除されていることが明らかになり（図６Ａ）、ＩｇＳＦとＳＴＭタンパク質が関与する相互作用が腫瘍において一般的に撹乱されていることが示された。また、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、結腸直腸腺癌（ＣＯＡＤ）及び腎臓腎癌（ＫＩＲＣ）の適応症において、調節解除されたノードの数、並びにそれらを接続するエッジの数が最も多く、約１５０のネットワーク遺伝子が有意に過剰発現していることも観察された（図６Ｂ、及び１１Ａ）。この分析により、抑制性受容体ＣＴＬＡ４及びＣＤ８０（５／１９適応症）、ＰＶＲ／ネクチンファミリー（４／１９適応症）、又は特にセマフォリン及びエフリン受容体ファミリーのメンバー数種など、多くの比較的よく特徴づけられた相互作用対が複数の共有ＴＣＧＡ適応症においてアップレギュレートされることが確認され、さらに検証された（図６Ａ）。逆に、これらの結果はまた、ＣＡＤＭ２及びＣＡＤＭ３、ＦＬＲＴ２及びＵＮＣ５Ｃ（各９／１９適応症）又はＰＴＰＲファミリーの一部のメンバー及びそれらの相互作用パートナーなどの機能的に関連する相互作用対が、複数の共有腫瘍タイプにわたって共同でダウンレギュレートされ、腫瘍抑制因子として提案されているそれらの機能と一致していることを明らかにした。興味深いことに、我々の分析はまた、本研究で新たに報告された相互作用の多くについて、このような著しい同義共調節パターンを強調した。注目すべきことに、抑制性受容体対ＣＤ３００ＬＦ－ＣＤ３００ＬＧ及びＬＩＬＲＢ４－ＣＮＴＦＲ、あるいは共刺激分子ＩＣＯＳ－ＩＣＯＳＬＧのような多くの相互作用対が負に同期しており（それぞれアップレギュレーションとダウンレギュレーション）、これらの相互作用の欠如が腫瘍の進行に役割を果たす可能性があることを示唆している。最後に、この分析により、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＳ、ＮＴＲＫ２、ＣＮＴＮ１、又はＣＤ３００ＬＧを含む、ハブ（５つ以上のエッジで接続されたノード）として同定されるほとんどのタンパク質が、複数の適応症にわたって有意にダウンレギュレートされていることが明らかになり（図６Ａ－６Ｄ）、これらのタンパク質によって媒介される相互作用の破壊が、がんの進行において役割を果たす可能性があること、及び免疫受容体のＣＤ３００ファミリーのように十分に特徴づけられていないタンパク質の潜在的な役割を果たしている可能性があることを示唆している。
ＴＣＧＡ ＲＮＡ－Ｓｅｑデータは、ＮＣＩ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄａｔａ Ｃｏｍｍｏｎｓ ＰａｎＣａｎａｔｌａｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓのウェブページからダウンロードした。
実施例４ 結合パートナーの検証の方法
実施例１及び２で同定された選択された相互作用は、１つ又は複数の直交手法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法、及び共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）を使用して検証された。
Ａ．表面プラズモン共鳴
推定上の受容体－リガンド相互作用は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＰｒｏｔｅｏｎ機器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用したＳＰＲによって分析された。示されたタンパク質は、標準的なアミノカップリング法を使用して、ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＧＬＣ（Ｂｉｏｒａｄ）センサーチップ上にそれぞれ固定化された。被分析物は、ＨＢＳ－Ｐバッファー（０．０１ＭのＨｅｐｅｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で、又はＰｒｏｔｅｏｎ機器を使用した場合はＰＢＳ－０．０１ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中で、それぞれの場合に示された濃度で泳動された。速度論的計算では、リガンドを低共鳴単位で固定化し、ＫＤ値を平衡状態で計算した。速度論実験では、ｈｉｓタグ付き組換えタンパク質を被分析物として使用した。全ての場合において、バルク屈折率の変化は、基準流量反応を差し引くことによって除去され、センサーグラムは、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して分析された。
Ｂ．バイオレイヤー干渉法
ＡＸＬと結合パートナーであるＩＬ１ＲＬ１及びＧａｓ６との相互作用は、既述のように（Husain et al., Mol Cell Proteomics, 18: 2310-2323, 2019）、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄシステムを使用したバイオレイヤー干渉法によってアッセイされた。簡潔には、組換えＡＸＬ、ＭＥＲＴＫ又はＴｙｒｏ３エクトドメインを、ＥＺ－ＬＩＮＫＴＭスルホ－ＮＨＳビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでビオチン化し、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサー上で捕捉した。これらの受容体は、ＰＢＳバッファー中でアッセイされた組換えエクトドメインとして発現されるＧａｓ６又はＩＬ１ＲＬ１への結合について試験された。データはＦｏｒｔｅ Ｐａｌｌ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）ソフトウェア９．０を使用して分析した。
Ｃ．組換えタンパク質
以下のタンパク質はＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入した：ＣＮＴＦＲ、ＬＤＬＲ、ＳＬＩＴＲＫ４、及びＢＴＮ３Ａ３。以下のタンパク質はＲ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した：ＣＨＬ１、ＭＣＡＭ、ＳＩＲＰＡ、ＣＮＴＮ１、ＳＬＩＴＲＫ２、ＳＬＩＴＲＫ３、ＬＲＦＮ５、ＥＤＡＲ、ＦＬＴ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＢＴＮＡ２Ａ、ＢＴＮ３Ａ１、ＡＸＬ、ＩＬ１ＲＬ１、ＶＳＩＧ１０Ｌ、ＦＬＲＴ１、ＦＬＲＴ２、ＦＬＲＴ３、ＮＣＲ１、ＭＤＧＡ１、ＴＲＥＭＬ２、ＩＧＳＦ９Ｂ、ＬＩＬＲＡ３、Ｇａｓ６、ＭＥＲＴＫ、及びＴｙｒｏ３。ＥＣＤ－Ｆｃとして発現されるＣＥＡＣＡＭ４は、哺乳動物細胞で発現され、標準的なアフィニティークロマトグラフィー技術を使用して社内で精製された（Ramani et al., 2012）。
Ｄ．新規結合パートナーの共免疫沈降
以下のＳＴＭタンパク質を、Ｃ末端ＨＡタグに融合した完全長タンパク質として発現させた：ＦＡＭ１８７Ｂ、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＶＳＩＧ８、ＣＤＨ９、ＳＴ１４、ＴＧＯＬＮ２、ＩＧＳＦ５、ＩＬ１ＲＬ１、ＶＳＩＧ１０Ｌ、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１、ＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＢ４、ＬＩＬＲＢ５、及びＮＣＲ１。以下のＳＴＭタンパク質を、Ｃ末端Ｆｌａｇタグと融合した完全長タンパク質として発現させた：ＢＴＮ２Ａ１、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＡＸＬ、ＣＤ３００Ａ、ＣＤ３００Ｃ、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＥＰＨＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＥＤＡＲ、ＩＬＤＲ１、ＣＮＴＦＲ、ＬＤＬＲ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ８、及びＣＤ４。ＨＥＫ２９３細胞に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、関連するタンパク質対（それぞれＨＡタグ付き及びＦｌａｇタグ付き融合体として発現）をコトランスフェクトした。タンパク質の高過剰発現を回避するために、比較的低いプラスミド濃度が使用された。典型的には、６ｘ１０５細胞をＭ６ウェルプレートに播種し、１：１のＤＮＡ混合物１μｇで逆トランスフェクトした。細胞溶解物をＰＢＳで洗浄し、トランスフェクションの約１８時間後にＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣＬ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５（ｗ／ｖ）Ｎａ－デオキシコール酸、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０）を使用して溶解した。等量の溶解物を、製造者の指示に従って、４℃で一晩ＥＺＶＩＥＷＴＭ Ｒｅｄ ＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティーゲル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。ビーズを溶解バッファーで広範囲に洗浄し、タンパク質を、変性条件を使用してローディングバッファーＳＤＳ試料バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して溶出した。免疫沈降物は、ＬＩＣＯＲ機器を使用して、抗Ｆｌａｇ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用したウエスタンブロッティングによって分析された。
実施例５ ＥＰＨＡ３及びＣＥＡＣＡＭ４結合パートナーの検証
機能的相互作用マップ（図３Ａ）は、タンパク質ファミリー内の関連する受容体が、タンパク質コミュニティ内の他のメンバーと比較して、異なるバインダー又は差次的組織発現を示すことを示した。このような多様な挙動を示す２つの注目すべき例は、免疫調節クラスター内でＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の結合パートナーとしてそれぞれ同定されたエフリン受容体ＥＰＨＡ３と細胞表面タンパク質ＣＥＡＣＡＭ４であった（図４Ａ）。
興味深いことに、特定のエフリンファミリーメンバー（ＥＰＨＡ３、ＥＦＮＢ１、ＥＰＨＢ４）は、他のファミリーに比べてより乱雑な発現パターンを示した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。同様に、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）のファミリーは、２つの組織クラスターに明確に分けられ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ３及びＣＥＡＣＡＭ８からなるグループは、ＣＥＡＣＡＭ４及びＰＤ－Ｌ２の共有組織共発現を含む、免疫調節クラスターとの組織発現パターンの有意な重複を示した（図１０Ａ及び１０Ｃ）。
これらの推定免疫調節因子をさらに調べるために、両方の相互作用を、精製組換えタンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって研究した。ＥＰＨＡ３のＰＤ－Ｌ１への特異的結合（図４Ｅ）及びＣＥＡＣＡＭ４のＰＤ－Ｌ２への特異的結合（図４Ｂ）が中程度の結合親和性で確認され（ＰＤ－Ｌ１／ＥＰＨＡ３：ＫＤ：２．８ｘ１０－８±２．７；ＰＤ－Ｌ２／ＣＥＡＣＡＭ４、ＫＤ：８．４ｘ１０－８±６９）（図１０Ｄ及び１０Ｅ）、発見パイプラインを介した受容体－リガンド相互作用の頑強かつ高感度な検出能力を示している。ＳＰＲ分析により、ＬＩＬＲファミリーメンバーであるＬＩＬＲＡ３とＥＰＨＡ３との間で新たに同定された相互作用も確認された（図４Ｃ）。ＰＤ－Ｌ１は、細胞に発現する既知の結合パートナーであるＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ２、並びにＥＰＨＡ３と相互作用したが、エフリンファミリーの関連メンバー又は試験したＣＥＡＣＡＭタンパク質との相互作用は観察されず、ＰＤ－Ｌ１／ＥＰＨＡ３相互作用の特異性をさらに実証している（図４Ｆ）。次に、ＰＤ－Ｌ２は、細胞表面に発現するＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１、並びに新たな相互作用因子ＣＥＡＣＡＭ４と結合した。ＣＥＡＣＡＭ４に関連するタンパク質であるＣＥＡＣＡＭ５、又はＰＤ－Ｌ１バインダーＥＰＨＡ３への結合は観察されず、ＰＤ－Ｌ２とＣＥＡＣＡＭ４の間の特異的相互作用が裏付けられた（図４Ｆ）。興味深いことに、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を遮断することが知られており、固形腫瘍治療の免疫療法として現在使用される治療用抗体アテゾリズマブ（Shah et al., Hum Vaccin Immunother, 14: 269-276, 2018）もＥＰＨＡ３との相互作用を競合した（図４Ｄ）。
実施例６ ＰＴＰＲ結合パートナーの検証
ＩｇＳＦインタラクトームネットワークの機能的クラスタリング（実施例２）は、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰＲ）ファミリーのメンバーと、ニューロトロフィン受容体（ＮＴＲＫ）、インターロイキン‐１‐受容体アクセサリータンパク質（ＩＬＲＡＰ）、Ｓｌｉｔ及びＮＴＲＫ様ファミリー（Ｓｌｉｔｒｋ）、並びにロイシンリッチ及びフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＬＲＦＮ）タンパク質を含む神経系関連タンパク質との間の顕著な関連性を明らかにした。興味深いことに、ネトリン－Ｇリガンド－３（ＮＧＬ－３／ＬＲＲＣ４Ｂ）は、ＰＴＰＲタンパク質のほか、ブチロフィリン（ＢＴＮ）ファミリーの特異的メンバーと相互作用することもわかった（図３Ａ）。
Ａ．細胞表面相互作用アッセイ
ＰＴＰＲファミリーは、原形質膜に発現する受容体型チロシンホスファターゼの最大ファミリーである（Du and Grandis, Chin J Cancer, 34: 61-69, 2015）。このコミュニティは、ＰＴＰＲファミリーのメンバーと、ニューロトロフィン受容体（ＮＴＲＫ）、インターロイキン‐１‐受容体アクセサリータンパク質（ＩＬＲＡＰ）、Ｓｌｉｔ及びＮＴＲＫ様ファミリー（ＳＬＩＴＲＫ）、並びにロイシンリッチ及びフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＬＲＦＮ）タンパク質を含む神経系関連タンパク質の４つの異なるファミリーの間の複雑な関連パターンを明らかにした（図３Ａ、クラスター１；図５Ａ）。さらに、ＰＴＰＲタンパク質と相互作用することが知られているネトリン－Ｇリガンド－３（ＮＧＬ－３／ＬＲＲＣ４Ｂ）は、治療に関連する免疫受容体の新たなファミリーであるブチロフィリンファミリーの特異的メンバーと結合することが明らかにされた（Arnett and Viney, Nat Rev Immunol, 14: 559-569, 2014）。これらのタンパク質ファミリー間の複雑な結合を確認し、さらに研究するために、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＳ及びＰＴＰＲＦを細胞表面タンパク質として発現させ、記載された細胞ベースの方法論を使用して、それらの同定された相互作用パートナーへの結合について試験した。これらの結果から、ＳＬＩＴＲＫ２及びＳＬＩＴＲＫ３タンパク質と、ＰＴＰＲＤ及びＰＴＰＲＳのそれぞれとの間の特異的相互作用が確認された（図５Ｂ）。さらに、ＬＦＲＮ５（図５Ｃ）及びＩＬ１ＲＡＰ（図５Ｄ）タンパク質が、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＳ及びＰＴＰＲＦの３つのファミリーメンバー全てに直接結合することが観察された。これらの結果と一致して、ＳＰＲ分析によりさらにＰＴＰＲＤのＳＬＩＴＲＫ１、ＳＬＩＴＲＫ４、ＬＦＲＮ１、ＬＦＲＮ４、ＩＬ１ＲＡＰ及びＩＬ１ＲＡＰＬ１タンパク質への結合が確認された（図５Ｆ）。最後に、ＳＬＩＴＲＫ、ＩＬ１ＲＡＰ及びＬＲＦＮファミリーメンバーが選択的ＰＴＰ受容体を特異的に認識するか、あるいはむしろ乱雑なクロストークの能力を維持するかを調べるために、ＰＴＰＲファミリーの８つのメンバーへの結合を試験した。興味深いことに、これらのアッセイにより、それぞれのファミリーにおけるその同族リガンドの選択的ＰＴＰＲ認識が確認された（図１２Ａ－１２Ｄ）。
さらに、我々は、インタラクトームの結果から予測されるように、細胞表面に発現したＬＲＲＣ４Ｂが、ブチロフィリンタンパク質ＢＴＮ３Ａ１及びＢＴＮ３Ａ３（図５Ｅ、５Ｇ及び５Ｈ）に結合することを確認したが、相同ファミリーメンバーＢＴＮ２Ａ２（図１２Ｅ）には結合しないことを確認した。注目すべきことに、これらの新たな相互作用因子は免疫共沈降試験（図５Ｇ及び５Ｉ）で確認され、ＬＲＲＣ４ＢとＢＴＮ３Ａ２との相互作用も実証された（図５Ｈ）。ＢＴＮ２Ａ１及びＢＴＮ３Ａ１（図５Ｇ、５Ｊ、１２Ｆ）を含む、ブチロフィリンファミリーの他のメンバーのさらなる解析により、新たに同定された相互作用因子への特異的結合が実証され、これらのタンパク質が細胞内で複合体を形成できることが示された。
まとめると、この包括的な検証作業は、ＰＴＰＲファミリーについて前述した相互作用パートナーを裏付け、個々のファミリーメンバー間の新しい相互作用を同定し、我々の知る限り、ファミリー間の選択性を初めて評価した。さらに、多数のブチロフィリンタンパク質に対する受容体特異的相互作用因子が明らかにされており、その他の点ではあまり特徴づけられていないが、関連性の高い免疫受容体ファミリーに光を当てている。
Ｂ．疾患関連ＰＴＰＲＤバリアント
いくつかの遺伝子は徹底的に特徴づけられているが、ほとんどの疾患関連変異は十分に研究されておらず、相互作用ネットワークの理解が非常に限られていることもあり、疾患の根底にあるタンパク質インタラクトームの変化はほとんど未知のままである。新たなデータは、ＰＴＰＲＤが腫瘍抑制因子として機能し、機能喪失表現型を引き起こす遺伝的及び／又はエピジェネティックな調節解除が、シグナル伝達の変化及び腫瘍増殖の増加をもたらす可能性があることを示している。実際、ＰＴＰＲＤは、他の腫瘍の中でも神経膠芽腫、悪性黒色腫及び肺腺癌において高頻度に変異している（Peyser et al., PLoS One, 10: e0135750, 2015; Veeriah et al., Proc Natl Acad Sci USA, 9435-9440, 2009）。そこで、この研究で前述した受容体相互作用発見パイプラインを利用して、がん関連ＰＴＰＲＤバリアントのコレクションを調べた。がんの体細胞変異のカタログ（ＣＯＳＭＩＣ）とＴＣＧＡデータポータル、及び個別に公表された研究を照会して、腫瘍タイプ全体で比較的多くみられる非同義変異を同定した（表９）。
興味深いことに、タンパク質チロシンホスファターゼドメインの変化に加えて、ＥＣＤを構成する免疫グロブリン（ＩＧ）及びフィブロネクチン（ＦＮ）ドメイン全体に高頻度の変異が位置しており、細胞間情報伝達を媒介するＰＴＰＲＤ相互作用の状況への影響が示唆された（図５Ｋ）。これらのがん関連変異がＰＴＰＲＤについて記述された相互作用ネットワークを妨害するかどうかを調べるために、ＥＣＤの全てのドメインを代表する１４の変異体のコレクションを相互作用発見パイプラインでスクリーニングした（図５Ｋ及び５Ｌ及び表９）。全体として、ＦＮドメインの変異はＰＴＰＲＤ相互作用レパートリーを実質的に修飾しなかったが、ＩＧドメインに集中する変異は有意な効果を示し（図５Ｌ）、これまでの報告及び既存の構造と一致して、ほとんどの結合パートナーへの結合が有意に減少した（Mohebiany et al., FEBS J, 280: 388-400, 2012; Veeriah et al., Proc Natl Acad Sci USA, 9435-9440, 2009）。
興味深いことに、研究された変異のほとんどがＬＲＲＣ４Ｂ及びＮＴＲＫ３への相互作用に有意に影響し、ＩＧ１－３及びＦＮドメイン１－３の変異により結合が完全に消失したことから、選択された相互作用は一般に腫瘍との関連で乱されていることが示唆される。逆に、ＩＬＲＡＰファミリーメンバーであるＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、及びＩＬＲＡＰＬ２への結合は、ＩＧ１及びＩＧ２ドメインの変異体を除いて損なわれなかったか、わずかに損なわれただけであった（図５Ｋ及び５Ｌ）。興味深いことに、選択された変異が特定のファミリーメンバーへの結合に選択的に影響を及ぼすことも観察された。ＳＬＩＴＲＫファミリー内では、Ｒ２３２Ｃ／Ｒ２３３Ｃの二重変異によりＳＬＩＴＲＫ１／３タンパク質への結合が損なわれたが、ＳＬＩＴＲＫ６への結合は一般にｗｔＰＴＲＰＤと同等であった。同様に、ＬＲＦＮファミリー内では、Ｇ２０３Ｅ／Ｋ２０４Ｅ二重変異体はＬＲＦＮ４とＬＲＦＮ５の両方への結合の欠如を示したが、Ｒ２３２Ｃ／Ｒ２３３Ｃ二重変異体は、ＬＲＦＮ４ではなくＬＲＦＮ５への結合のより有意な減少を示した（図５Ｌ）。これらの結果は、ＰＴＰＲＤ変異体スクリーニングによって同定された高度に特異的な相互作用ネットワーク再配線イベントが疾患において役割を果たす可能性を示唆し、ＰＴＰＲＤについて特徴づけられていなかった生物学的機能及びシグナル伝達特性のより広い範囲を示唆している。
実施例７ ＣＨＬ１及びＣＮＴＮ１結合パートナーの検証
ＩｇＳＦインタラクトームネットワーク（実施例２）から、神経系の細胞外マトリックス、細胞接着及びシナプス形成に役割を果たす２つの細胞表面タンパク質である、神経細胞接着分子ＣＨＬ１とコンタクチンファミリーメンバーＣＮＴＮ１との関連が明らかになった（図３Ａ）。ＣＨＬ１及びＣＮＴＮ１と他の相互作用タンパク質との間の相互作用は、細胞表面相互作用アッセイを用いて確認し、ＳＰＲを使用してさらにアッセイした。
Ａ．細胞表面相互作用アッセイ
実施例５Ａに記載の細胞表面相互作用アッセイをＣＮＴＮ１及びＣＨＬ１について実施した。細胞表面に発現したＣＨＬ１は、ＣＮＴＮ５及びＬ１ＣＡＭと相互作用し、免疫受容体ＢＴＬＡとより弱く相互作用することが確認された（図１１Ｃ）。
細胞表面に発現したＣＮＴＮ１は可溶性クエリＰＴＰＲＺ１に特異的に結合したが、ＰＴＰＲＤ又はＰＴＰＲＳを含むこの受容体ファミリーに属する他のメンバーとは結合しなかった（図１２Ｄ）。これらのメンバーはＬＦＲＮ、ＳＬＩＴＲＫ、及びＩＬ１ＲＡＰタンパク質と結合することがわかった（図５Ａ及び１２Ａ－１２Ｄ）。この結果は、ＩｇＳＦインタラクトームスクリーニングで同定された結合プロファイルの精度をさらに強調し、これらの受容体が結合パートナーの選択的認識を通じて特定の機能を発揮することを示唆する。
Ｂ．ＳＰＲアッセイ
選択されたＣＮＴＮ１バインダーは、実施例４Ｃ及び４Ｄに記載されているようにＳＰＲによってアッセイされた。ＣＮＴＮ１をヒトＦｃタグに融合した細胞外ドメイン（ＥＣＤ）として発現させ、ＣＭ５センサチップ上に固定化した。被分析物ＮＲＣＡＭ、ＮＦＡＳＣ、ＭＣＡＭ、及びＣＨＬ１と対照は、実施例４Ｂに記載されているように製剤化され、２５０ｎＭの濃度で注入された。これらの実験は、ＣＮＴＮ１と神経系タンパク質ＮＲＣＡＭ、ＮＦＡＳＣ、ＭＣＡＭ、及びＣＨＬ１との間の直接的な相互作用を実証した（図９Ｉ）。
実施例８ ＬＩＬＬＲファミリー結合パートナーの検証
ＬＩＬＲタンパク質は、新規の、今のところ十分に特徴づけられていない免疫受容体のファミリーであり、その一部はＭＨＣクラスＩに結合することが知られている。我々は、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）の存在を特徴とし、したがって推定免疫抑制機能を有する受容体であるＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、及びＬＩＬＲＢ５に焦点を当てた（Brown et al., Tissue Antigens, 64: 215-225, 2004; van der Touw et al., Cancer Immunol Immunother, 66: 1079-1087, 2017）。
興味深いことに、我々の研究は、原形質膜上に発現しているＬＩＬＬＲＢ１へのＥＤＡＲ及びＬＩＬＬＲＡ５の結合を含むＬＩＬＬＲ受容体特異的相互作用；並びにＣＮＴＦＲ及びＬＤＬＲとＬＩＬＬＲＢ４及びＬＩＬＬＲＢ５受容体との特異的相互作用をそれぞれ同定した（図５Ｎ）。さらに、ＥＤＡＲ（図４Ｇ）、ＩＬ６Ｒ（図４Ｈ）及びＣＮＴＦＲ（図４Ｉ）は、それぞれＬＩＬＬＲＢ１及びＬＩＬＬＲＢ４と効率的に共免疫沈降し、これらの新たに同定された結合パートナーが原形質膜との関連で起こり得ることを示している。
Ａ．細胞表面相互作用アッセイ
実施例５Ａに記載されたような細胞表面相互作用アッセイを、ＬＩＬＬＲファミリータンパク質及び関連する結合パートナーについて実施した。ＦＬＴ４、ＥＤＡＲ、ＩＬ６Ｒ、ＣＮＴＦＲ、及びＬＤＬＲは細胞表面に発現し、ＬＩＬＬＲＢ１、ＬＩＬＬＲＢ４、及びＬＩＬＬＲＢ５は可溶性多量体化タンパク質として発現した。これらのアッセイにより、ＬＩＬＬＲＢ１と受容体ＥＤＡＲ、ＩＬ６Ｒ及び血管内皮増殖因子受容体３であるＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４）との相互作用、ＬＩＬＬＲＢ４とＣＮＴＦＲとの相互作用、ＬＩＬＬＲＢ５とＬＤＬＲとの相互作用が確認された（図１１Ｂ）。
Ｂ．ネットワーク統合におけるＬＩＬＬＲＢ１の分析
ＩｇＳＦネットワークとＴＣＧＡの統合により（実施例３Ｃ）、複数の腫瘍の適応症にわたって、ＬＩＬＬＲＢ１とリンパ管新生受容体ＦＬＴ４／ＶＥＧＦＲ３の両方が同期的にアップレギュレートするが、他のＬＩＬＬＲＢ１相互作用パートナーはアップレギュレートしないことが明らかになった。このパターンは腎がんにおいて特に有意であった（図５Ｍ）。これらの観察結果は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｔｌａｓにおける注釈とも一致しており、ＦＬＴ４が特定の腫瘍において負の予後因子であることを示唆する独立した取り組みとも一致している。さらに、証拠の増加は、ＬＩＬＲＢ１が免疫反応において重要な役割を果たしていることを示している。我々と他の研究者は、ＬＩＬＬＲＢ１を顕著なウイルス標的として同定し（Chan et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 111: 2722-2727, 2014; Chapman et al., Immunity, 11: 603-613, 1999; Hirayasu et al., Nat Microbiol, 1: 16054, 2016; Martinez-Martin et al., Nat Commun, 7: 11473, 2016）、最近の研究は、ＭＨＣ－Ｉの認識を介したマクロファージの食作用機能の制御におけるＬＩＬＬＲＢ１の中心的役割を実証しており（Barkal et al., Nat Immunol, 19: 76-84, 2018）、ＬＩＬＲＢ１が有望な治療標的であることを示している。
実施例９ ＩｇＳＦインタラクトームとがん
ＩｇＳＦインタラクトームは、抗ＰＤ－Ｌ１治療用抗体アテゾリズマブで治療された転移性尿路上皮がん患者を対象とした大規模な第２相試験（ＩＭｖｉｇｏｒ２１０）からの転写プロファイル試料との関連で評価された。これらの知見は、ＣＤ８＋ Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞機能及び異なる腫瘍免疫学的表現型に関連する相互作用タンパク質コミュニティを明らかにした。さらなる調査により、治療に対する反応の欠如及び生存率と高度に相関するタンパク質相互作用シグネチャーが明らかになり、臨床転帰の予測力が改善された。
Ａ．腫瘍における差次的遺伝子発現
ホメオスタシス中の組織の完全性は、主に細胞表面タンパク質間の相互作用によって規定され、その結果、細胞外インタラクトームの撹乱は、腫瘍増殖及び免疫回避のような病理学的過程と密接に関連している。本質的に、細胞外インタラクトームのカバレッジが不十分なため、疾患においてタンパク質相互作用ネットワークがどのように乱されたり、再配線されたりするかについての理解は著しく制限されている。したがって、ゲノム情報と機能的重要性を結び付けるために、ＴＣＧＡで報告されているように、腫瘍と隣接する正常組織との間の差次的ｍＲＮＡ発現データがＩｇＳＦインタラクトームに組み込まれた（図６Ａ及び図２９Ａ－２９Ｊ）。注目すべきことに、検討したＩｇＳＦ遺伝子の９０％超が、少なくとも１つの腫瘍適応症において有意に差次的に発現していることが観察された（両側ｔ検定、｜Ｌｏｇ倍率変化｜＞１、ｑ＜０．０５）（図６Ａ）。実際、本研究で報告されたＩｇＳＦインタラクトームにおける無関係な遺伝子の対と相互作用対との間の系統的な比較では、共同調節不全相互作用の数は全てのＴＣＧＡ適応症にわたってＩｇＳＦ内で一貫して高いことが示された（図６Ｂ）。特に、ＩｇＳＦインタラクトームとＴＣＧＡの統合は、ＣＡＤＭ３－ＣＡＤＭ２、ＵＮＣ５Ｃ－ＦＬＲＴ２、及びＰＴＰＲファミリーの一部のメンバーとそれらの相互作用パートナーを含む、ほとんどの腫瘍において共同でダウンレギュレートされた相互作用タンパク質を強調し、これらの遺伝子について記載されている腫瘍抑制機能と一致する観察結果を示した（Bae et al., Sci Rep, 7: 272, 2017; Chang et al., Clin Cancer Res, 16: 5390-5401, 2010）。逆に、この分析はまた、よく特徴づけられた相互作用対が、ＣＴＬＡ４／ＣＤ８０又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などのよく説明されている免疫受容体対を含めて、複数の共有ＴＣＧＡ適応症において通常共同でアップレギュレートされるという観察を確認し、さらに支持した（図６Ｃ及び６Ｄ）。加えて、ＬＩＬＬＲファミリーの特定のメンバーによって示されるように、多数の相互作用タンパク質が複数の腫瘍適応症において相反する方向に差次的に発現すること（それぞれアップレギュレート及びダウンレギュレート）が見出され（図２９Ｂ及び２９Ｃ）、これらの相互作用の破壊が腫瘍微小環境における細胞情報伝達に影響を及ぼす可能性が示唆された。
次に、ＲＮＡレベルでは見逃されていたかもしれない、タンパク質レベルで相関していた相互作用を調べようと試みた。そのために、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）（Nusinow et al., Cell, 180:387-402 e316, 2020）から最近公開された３７５のがん細胞株のプロテオミクスリソースがＩｇＳＦインタラクトームと統合された。ＧＴＥＸを使用して行われた観察と同様に、相互作用対のサブセットに対するピアソン相関は、率直ではないが（片側ウィルコクソン順位和検定、ｐ＜０．０５）、ＧＴＥＸ対応物に対する全体的な相関スコアが低かったが、相互作用対のサブセットに対するピアソン相関は、非相互作用対の補完と比較して有意に高く、ＣＣＬＥにおける細胞株よりもＧＴＥＸにおける患者数が多く、プロテオミクスデータセットにおける欠損値の量が典型的に多かったことが原因である可能性が高い。それにもかかわらず、ＩｇＳＦインタラクトームとタンパク質発現の比較は、大腸系統（図６Ｆ）及び肺がん細胞株（図２９Ｈ）におけるＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡＣＡＭ６；肺細胞株で新たに検証されたタンパク質対ＣＮＴＮ１－ＮＲＣＡＭ（図６Ｇ、９Ｈ、及び９Ｉ）；ＬＲＲＣ４ＢとＢＴＮ３Ａ１（図６Ｈ、５Ｈ、及び５Ｊ）；ＵＮＣファミリーとＦＬＲＴファミリーの間の相互作用（図６Ｉ及び１０Ａ－１０Ｊ）、又は興味深いことに、健常脳組織における強い相関（図３Ａ）並びに造血細胞株とリンパ細胞株における強い関連性（図６Ｊ）を示したＣＮＴＮ１－ＰＴＰＲＺ１対（図３Ａ）など、著しく相関している多くの相互作用も明らかにし、免疫細胞におけるこれらの相互作用のまだ特徴づけられていない役割を示唆している。同様に、ＩＧＳＦ３－ＰＴＧＦＲＮ対は、本研究で相互作用が報告された初めてのものであり、ほとんど機能が不明であるが、がん細胞株系統間で顕著な相関関係を示した（図６Ｋ、６Ｌ、及び２９Ｅ－２９Ｇ）。また、受容体型チロシンキナーゼであり、腫瘍の耐性の決定因子としてますます高く評価されている自然免疫の重要な調節因子であるＴＡＭ受容体ＡＸＬ（図６Ｍ）の強い相関関係も観察された（Zhu et al., Mol Cancer, 18: 153, 2020）。興味深いことに、ＡＸＬタンパク質レベルは、原形質膜のシスで相互作用できる、新しい結合パートナーＶＳＩＧ１０Ｌと有意に相関していた（図６Ｎ）。同定された第２の推定上の相互作用因子であるＩＬ１ＲＬ１について利用可能なタンパク質発現データはなかったが、複数の方法を使用してＡＸＬとＩＬ１ＲＬ１との特異的相互作用を確認することもでき、この重要なＲＴＫの新たなモジュレーターが示唆された（図６Ｏ－６Ｑ）。
最後に、肺におけるＫＩＴ－ＫＩＴＬＧ又はＩＣＯＳＬＧ－ＮＴＭなどのタンパク質対について、密接に負に相関した相互作用が観察され（図２９Ｉ及び２９Ｊ）、これらの相互作用の重要な抑制的役割を示唆している可能性のあるパターンであった（Chung et al., mSystems, 4, 2019）。
まとめると、これらの知見は、ＩｇＳＦとＳＴＭタンパク質の間の細胞外タンパク質相互作用が腫瘍において一般的に撹乱されていることを示しており、おそらく腫瘍における免疫細胞浸潤の違い、又は腫瘍細胞による免疫回避プロセスを反映している。ＴＣＧＡとの関連におけるＩｇＳＦインタラクトームの評価は、特定の腫瘍タイプに影響を及ぼす相互作用するタンパク質ネットワークの解明を可能にし、がんにおいて調節不全にある特定の経路に関する分子的洞察を提供し、したがって治療法開発の機会を示唆する。
Ｂ．Ｔ細胞機能及び臨床転帰に関連する相互作用シグネチャー。
既存の抗腫瘍反応を再活性化するためのがん免疫療法の開発は、がんの治療における比類のない飛躍を意味する。特に、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１などの阻害チェックポイントを遮断する治療用抗体は、複数のがんを患う患者に持続的な反応を誘発することが示されている。チェックポイント療法の測定可能な成功にもかかわらず、これらの反応は患者のサブセットにおいてのみ起こり、腫瘍形成に影響する未知の非重複経路の存在を示唆する（Sharma et al., Cell, 168: 707-723, 2017）。このように、臨床転帰に関連する受容体－リガンドネットワークを包括的に解明し、治療に対する耐性と反応の新たな決定因子を同定するために、ＩｇＳＦインタラクトームは、ＰＤ－Ｌ１遮断抗体アテゾリズマブで治療された転移性尿路上皮がん患者由来の２９８のトランスクリプトーム試料を含む第２相試験（ＩＭｖｉｇｏｒ２１０）からの大規模コホートとの関連において研究された（Mariathasan et al., Nature, 554: 544-548, 2018）。興味深いことに、ＩｇＳＦインタラクトームタンパク質のサブセットは、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞と関連する遺伝子セットによって定義される、免疫コールド（又は非炎症性）又はホット（炎症性）腫瘍と強い相関を示した（Mariathasan et al., 2018）。免疫性ホット腫瘍は、免疫排除表現型と相関する、間質高腫瘍に関連する汎線維芽細胞ＴＧＦｂシグネチャーを使用してさらに層別化された（Mariathasan et al., Nature, 554: 544-548, 2018）。特に、新たに同定された相互作用対、例えばＰＤ－Ｌ２／ＣＥＡＣＡＭ４、ＬＩＬＬＲＢ１／ＩＬ６Ｒ、及びＬＩＬＬＲＢ４／ＣＮＴＦＲは、ＮＣＲ１とＳＩＧＬＥＣ６又はＳＩＧＬＥＣ８タンパク質、又は主に間質に富む腫瘍と関連するＰＴＰＲＤに結合するＳＬＩＴＲＫファミリーのメンバーとの相互作用を含むホット腫瘍と強く相関することが観察された（図２８Ａ）。これらの免疫受容体相互作用は、これらの腫瘍が能動的な免疫反応を欠くという概念（Chen and Mellman, Nature, 541: 321-330, 2017）に沿って、免疫コールド腫瘍にはほとんど認められなかった。逆に、セマフォリン及びプレキシン受容体又はＵＮＣ及びＦＬＴＲタンパク質を含む細胞接着ファミリーは、ＵＮＣ５Ｄ又はグリピカン－３（ＧＰＣ３）などのこれらのファミリーの新たに同定された相互作用因子と並んで、免疫コールド腫瘍と顕著に関連していた（図２８Ａ）。このようなＴｅｆｆ細胞の特徴は、免疫細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現と、治療に対するより良好な反応と相関することが示されている（Mariathasan et al., Nature, 554: 544-548, 2018）。この観察に沿って、我々の分析は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ファミリー、ＣＴＬＡ４／ＣＤ８０、ＣＤ２８／ＣＤ８６及びＣＤ４７／ＳＩＲＰＡなどのよく特徴づけられた免疫受容体対、並びにＰＤ－Ｌ１／ＥＰＨＡ３又はＬＩＬＲＢ１バインダーＥＤＡＲ及びＩＬ６Ｒなどの新たに同定されたタンパク質対を含む、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ遺伝子セットとの明確な関連を示した相互作用タンパク質を強調した（図３０Ａ）。逆に、セマフォリン／プレキシンファミリー内の対や推定上のＦＬＴ１相互作用因子ＴＲＥＭ２及びＥＰＨＢ６を含む、特定のタンパク質コミュニティはＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ遺伝子と負に相関していた（図３０Ａ）。
次に、まず相互作用するタンパク質対と臨床転帰との関連性を評価することにより、Ｔｅｆｆ細胞機能を超えたＩｇＳＦインタラクトームの特徴を調べることを試みた。以前に記載されるように（Mariathasan et al., Nature, 554: 544-548, 2018）、患者はアテゾリズマブに対する応答者と非応答者に分類された。約８０のタンパク質相互作用（インターラクトームネットワークの約１５％）が、このコホートの臨床転帰の改善又は悪化のいずれかと有意に関連していた（図２８Ｂ及び表１５及び表１６）。予想通り、免疫受容体のＣＤ８０ファミリー及びＰＤ－１ファミリー内の相互作用は、アテゾリズマブに対する反応と強く相関していた。さらに、ＮＣＲ１／ＳＩＧＬＥＣ６などの新たな推定タンパク質対、又はＬＲＲＣ４Ｂと特定のブチロフィリンメンバーと間の相互作用は、反応と強く相関していた（図２８Ｂ）。逆に、セマフォリン／プレキシンファミリー内の相互作用、並びにＬＦＲＮ４及びＩＬ１ＲＡＰなどの特異的ＰＴＰＲＤ調節因子は、治療に対する反応の欠如と有意に関連していた（図２８Ｂ）。次に、相互作用する遺伝子対が予測される臨床転帰に相乗効果を示すかどうかを、それらの共同発現から導かれる「タンパク質相互作用」ハザード比（ＨＲ）をそれらの個々の遺伝子発現のハザード比と比較することにより調べた。特に、ＩｇＳＦインタラクトームネットワークの約２５％に相当する１３７のタンパク質対は、単一のタンパク質よりも有意に誇張されたハザード比を示した（図２８Ｃ）。この相乗効果が認められたタンパク質対には、ＳＩＧＬＥＣ６及びＮＣＲ１；ＢＴＮ３Ａ１及びＬＲＲＣ４Ｂ；ＣＤ８０及びＣＴＬＡ４；ＢＴＮ３Ａ３及びＬＲＲＣ４Ｂ；ＥＦＮＢ１及びＴＲＨＤＥ；ＣＴＬＡ４及びＰＣＤＨＧＢ４；ＣＴＬＡ４及びＦＡＭ２００Ａ；ＣＡ１２及びＳＩＧＬＥＣ６；ＩＬＤＲ２及びＣＬＥＣ１２Ｂ；ＥＦＮＢ１及びＩＴＬＮ１；ＣＡＤＭ１及びＣＲＴＡＭ；ＣＤ７９Ｂ及びＣＤ２４４；及びＤＡＧ１及びＥＦＮＢ１（これらはアテゾリズマブ療法に対する反応性と関連する）、並びにＥＦＮＢ１及びＥＶＣ２；ＧＰＣ４及びＦＧＦＲＬ１；ＥＦＮＢ３及びＥＰＨＢ４；ＰＴＰＲＤ及びＬＲＦＮ４；ＥＦＮＢ１及びＡＱＰＥＰ；ＥＦＮＢ１及びＤＳＧ４；ＬＤＬＲ及びＬＩＬＲＢ５；ＥＦＮＢ３及びＥＰＨＢ３；ＰＬＸＮＢ３及びＳＥＭＡ４Ｇ；ＥＦＮＢ１及びＥＰＨＢ６；ＦＬＴ４及びＦＬＲＴ２；ＡＸＬ１及びＩＬ１ＲＬ１；ＣＤ３２０及びＩＧＳＦ５；ＣＤ５９及びＳＴＡＢ１；ＣＮＴＮ３及びＰＴＰＲＧ；ＥＦＮＢ１及びＥＰＨＡ３；ＥＦＮＢ３及びＥＰＨＢ２；ＥＧＦ及びＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ；ＥＮＰＥＰ及びＳＬＩＴＲＫ１；ＦＣＧＲ３Ｂ及びＥＤＡ２Ｒ；ＩＬ２０ＲＡ及びＣＬＥＣ１４Ａ；ＩＬ６Ｒ及びＢＴＮＬ９；ＩＺＵＭＯ１及びＬＩＬＲＡ５；ＮＧＦＲ及びＬＲＲＴＭ３；ＮＴＭ及びＡＭＩＧＯ２；ＰＣＤＨＢ３及びＩＧＳＦ１１；ＰＴＧＦＲＮ及びＴＭＥＭ５９Ｌ；及びＴＲＥＭ１及びＶＳＩＧ８（これらはアテゾリズマブ療法に対する反応性の欠如と関連する）が含まれる。
その中で、血管内皮増殖因子受容体ＦＬＴ１及びＦＬＴ４、又は細胞死及び免疫反応の調節因子ＥＤＡＲ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ及びＣＤ４７など、腫瘍において十分に特徴づけられた役割を有するタンパク質に対する新たな相互作用を観察した。予想通り、ＰＤ－Ｌ１ファミリー内の相互作用は、アテゾリズマブに対する反応及び全生存期間と関連していた（図３０Ｂ及び３０Ｅ）。さらに、ＬＲＲＣ４Ｂ／ＢＴＮ３Ａ１／ＢＴＮ３Ａ３又はＮＣＲ１／ＳＩＧＬＥＣ６タンパク質対によって示されるように、いくつかの新規受容体相互作用も治療に対する反応と強く相関していた（図３０Ｃ及び３０Ｆ並びに表１５及び１６）。
逆に、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）チロシンキナーゼ又はＬＩＬＲファミリーのメンバーなどのタンパク質ファミリー内の相互作用は、反応の欠如に有意に関連する相互作用として同定された（図２８Ｃ及び表１５及び１６）。このような相乗的相互作用の顕著な例は、エフリンＢ１（ＥＦＮＢ１）であり、エフリンファミリー内の結合メンバーと、以前は無関係であった新たに同定された相互作用因子を確認した（図３０Ｄ）。ＥＶＣ２、ＡＱＰＥＰ及びＥＰＨＢ６を含む複数のＥＦＮＢ１相互作用は、対内の両遺伝子が単離された各遺伝子と比較して発現した場合、非応答者と有意に高い関連性を示した（図２８Ｄ）。一貫して、相互作用するタンパク質対の発現は、ＥＦＮＢ１とヘッジホッグシグナル伝達機構タンパク質ＥＶＣ２との間の相乗的な予測効果によって示されるように、治療に対する反応の欠如及び予後不良と有意に関連していた（図２８Ｅ及び２８Ｆ）。
まとめると、患者の大規模コホートとの関連におけるＩｇＳＦインタラクトームの研究は、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ機能並びに特異的な腫瘍免疫表現型に関連する遺伝子シグネチャーマップを定義し、受容体機能、クロストーク、及びがん進行との関連に関する独特の洞察を提供している。さらに、これらの結果は、ＰＤ－Ｌ１遮断への反応に関連するタンパク質コミュニティを強調し、臨床転帰の予測力が向上した相互作用する遺伝子シグネチャーを同定する。
実施例１０ ＣＲＣ患者におけるＣＡＦ発現ＰＤＰＮと転帰不良との相関
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、血液内皮細胞（ＢＥＣ）、リンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）、及びがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）のような非造血間質細胞型、並びに造血免疫細胞を含む、腫瘍及び非悪性細胞の混合物からなる。腫瘍細胞と間質は、腫瘍の増殖と進行の調節に重要な役割を果たす動的なクロストークを確立する（Turley et al., Nat Rev Immunol, 15: 669-682, 2015; Peranzoni et al., Cell Mol Life Sci, 70: 4431-4448, 2013）。間質と腫瘍浸潤免疫細胞との関係は依然としてあまり解明されていないが、間質が抗腫瘍免疫反応や免疫療法に対する反応性に重要な影響を及ぼすことを示す有力な証拠が示されている（Turley et al., Nat Rev Immunol, 15: 669-682, 2015）。ＴＭＥ内の間質細胞の大部分を構成する線維芽細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングと多量の炎症性因子の分泌を介して組織の構造と機能を調節する。さらに、ＣＡＦが抗腫瘍免疫を損ない、腫瘍細胞の増殖及び播種をサポートすることを示唆する証拠が増加している（Turley et al., Nat Rev Immunol, 15: 669-682, 2015; Chen et al., Nat Rev Drug Discov, 18: 99-115）。この考えに沿って、最近の報告では、ＣＡＦがＴＧＦ－ｂに反応して転移を増加させ、結腸直腸がん（ＣＲＣ）の転帰不良の主な要因であることが実証された（Calon et al., Nat Genet, 47: 320-329, 2015）。
免疫抑制及び免疫療法に対する耐性におけるＣＡＦ及び他の間質細胞の新たな役割にもかかわらず、ＣＡＦと腫瘍浸潤免疫細胞との間のクロストークを担う下流分子回路は、まだ十分に理解されていない。多数の報告が、ＣＡＦ及びＬＥＣによって主に発現される単一膜貫通（ＳＴＭ）含有受容体であるポドプラニン（ＰＤＰＮ、ｇｐ３８、Ａｇｇｒｕｓ、又はＴ１α）が、腫瘍において過剰発現し、予後不良と関連していることを示している（Astarita et al., Nat Immunol, 16: 75-84, 2015）。しかしながら、腫瘍におけるＰＤＰＮの機能は不明であり、ＰＤＰＮ生物学の基本的側面はほとんど特徴づけられていないままである。我々は、マウスリンパ節線維芽細胞において、ＰＤＰＮはアクトミオシン収縮性のマスター制御因子であり、主に血小板や樹状細胞において発現されるＣ型レクチン受容体ＣＬＥＣ－２（Ｃｌｅｃ１ｂ）によって阻害されることを示した（Astarita et al., Nat Immunol, 16: 75-84, 2015; Acton et al., Nature, 514: 498-502, 2014）。炎症に際して、ＣＬＥＣ－２はＰＤＰＮを介した収縮性を減弱させ、その結果、リンパ節の硬さが低下し、免疫を増強する（Astarita et al., Nat Immunol, 16: 75-84, 2015）。ＰＤＰＮがヒト線維芽細胞において同様に機能して収縮性を付与し、免疫細胞との相互作用を媒介するかどうかは、特に固形腫瘍を取り巻く独特の環境において不明である。
ここでは、ＰＤＰＮ＋ ＣＡＦの存在を表す遺伝子シグネチャーが患者生存率の有意な低下と相関することがわかり、これは、ヒト線維芽細胞におけるＰＤＰＮの発現が腫瘍の進行に重要な影響を及ぼす可能性があることを示している。
Ａ．ＣＡＦによって発現されるＰＤＰＮは、ヒトＣＲＣの転帰不良と相関する
ＰＤＰＮの発現は、頭頸部の扁平上皮がん、神経膠腫、及び結腸がんを含むいくつかのがんで高度に上昇し、生存転帰の不良と関連している。これらの研究は主に免疫組織化学分析に基づいており、必ずしもＰＤＰＮの細胞源を明らかにしているわけではない。このタンパク質は、腫瘍細胞、ＬＥＣ、ＣＡＦ、さらには一部の免疫細胞によって発現され、これらの細胞はＴＭＥにおいて異なる効果を発揮するため、このタンパク質の機能を検討する上で、この区別は重要である（Astarita et al., Front Immunol, 3: 283, 2012; Turley et al., Nat Rev Immunol, 15: 669-682, 2015）。最近の報告では、ＰＤＰＮ＋ＦＡＰ＋ ＣＡＦにおけるＴＧＦｂシグナル伝達がＣＲＣ患者の転移の主な要因であることが確認されている（Calon et al., Nat Genet, 47: 320-329, 2015）。
したがって、ＲＮＡレベルでのＰＤＰＮ発現がＣＲＣにおける有意な予後因子であるかどうかを決定するために、以前に発表された２つのヒトＣＲＣ研究からのバルク腫瘍遺伝子発現及び無再発生存率（ＲＦＳ）データを照会した。ステージＩＩの患者からなるコホートにおいて（de Sousa et al., Cell Stem Cell, 9: 476-485, 2011）（ＧＳＥ３３１１３、ｎ＝８５）、ＰＤＰＮの発現が生存率の低下と有意に関連していることを見出した（図１３Ａ）。同様に、全ステージの患者を含む大規模なＣＲＣコホートにおいて（Marisa et al。、PLoS Med、10:e1001453、2013）（ＧＳＥ３９５８２、ｎ＝５１１）、ＰＤＰＮの発現は、コホート全体とステージＩＩの患者の両方で、ＲＦＳの低下と再び有意に関連していた（図１３Ｂ及び１９Ａ）。後期疾患では、ＰＤＰＮの発現はステージＩＶの極めて有意な危険因子であったが（図１９Ｂ）、ステージＩＩＩのＣＲＣ患者では有意な危険因子ではなかった（表１０）。
Ｂ．ＰＤＰＮは初代ヒト線維芽細胞における細胞張力／収縮の調節因子として機能する
ＣＲＣにおけるＰＤＰＮ発現と生存率低下との有意な関連性に照らして、次にＣＲＣ病変から単離した原発性線維芽細胞におけるＰＤＰＮの機能を決定することを試みた。Ｐｄｐｎ－／－細胞は、Ｃａｓ９－ＲＮＰ－ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、高内因性レベルのＰＤＰＮを発現するがん性結腸直腸組織から増殖した初代ヒトＣＡＦにおいて生成された（図２６Ａ）。これらの細胞を３Ｄコラーゲンマトリックスに播種すると、Ｐｄｐｎ－／－ＣＡＦはＷＴ ＣＡＦと比較して著しく偏った形態を示し、約７０％も伸長した表現型を示すことが観察された（図２６Ｂ－２６Ｃ）。さらに、ＰＤＰＮ欠失が他の機能的結果をもたらすかどうかを試験するために、増殖速度、張力を生成する細胞の能力、及び表面に付着する細胞の能力を測定するための様々なアッセイを実施した。収縮を試験するために、ＣＡＦを３Ｄマトリックスに播種し、３日間にわたってゲルを収縮させた。ＰＤＰＮが線維芽細胞収縮性のマスター調節因子であるという我々の仮説と一致して、ＰＤＰＮ欠損細胞はゲルを収縮させる能力が有意に損なわれていた（図２６Ｄ）。最後に、線維芽細胞の収縮性が細胞の増殖と生存を制御できることを考慮して、ＰＤＰＮの欠如がこれらの細胞の増殖に影響するかどうかを調べた。特に、Ｐｄｐｎ－／－線維芽細胞は、ＷＴ細胞と比較して著しくゆっくりと増殖した（図２６Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ＰＤＰＮがヒト細胞におけるアクトミオシン収縮性において主要な役割を果たし、細胞自律的に線維芽細胞の増殖を促進することを示している。
Ｃ．活性化線維芽細胞シグネチャー
次に、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＰＤＰＮ発現が、主に線維芽細胞と関連しているか、又は腫瘍細胞と関連しているかを尋ねた。我々はまず、文献及び我々自身のデータから活性化線維芽細胞遺伝子（活性化線維芽細胞シグネチャー）のリストをキュレートし（表１１）、それを使用してバルク腫瘍ＲＮＡ‐ｓｅｑデータにおける線維芽細胞レベルを推測した。次に公表されているＤＮＡコピー数に基づく腫瘍含有量データ（Taylor et al., Cancer Cell, 33: 676-689, 2018）を利用し、ＰＤＰＮ発現、推定線維芽細胞レベル、及び腫瘍含有量の間の関連を調べた。我々は、ＰＤＰＮ ｍＲＮＡレベルが推定活性化線維芽細胞レベルと強い正の相関を有するが（図１３Ｄ）、腫瘍含有量とは負の相関を有することを見出し（図１３Ｃ）、ＴＭＥにおけるＰＤＰＮ発現は大部分が線維芽細胞に由来することを示している。
Ｄ．ＦＡＰ＋線維芽細胞シグネチャー
次に、ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにおいて、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の存在をより細かいレベルで捕捉することを試みた。ＣＲＣの促進におけるＦＡＰ＋間質細胞の役割を明らかにした最近の研究のデータを利用した（Calon et al., Nat Genet, 47: 320-329, 2015）。我々は、本研究の４種類の選別細胞集団（ＦＡＰ＋線維芽細胞、ＣＤ３１＋内皮細胞、免疫細胞（ＣＤ４５＋細胞）、腫瘍細胞（ＥｐＣＡＭ＋細胞））間で差次的発現試験を実施し、線維芽細胞のみが発現し、他の細胞が発現しない上位３５遺伝子からＦＡＰ線維芽細胞シグネチャーを定義した（表１２）。
Ｅ．活性化線維芽細胞シグネチャー及びＦＡＰ＋線維芽細胞シグネチャーと生存との関連
次に、活性化線維芽細胞シグネチャーとＦＡＰ＋線維芽細胞シグネチャーがヒトＣＲＣにおける予後的重要性を有するかどうかを調べた。両方のシグネチャーは、ＧＳＥ３３１１３及びＧＳＥ３９５８２の両方で無再発生存率（ＲＦＳ）不良と有意に関連していた（図１３Ｅ－１３Ｆ、１９Ｃ－１９Ｄ）。ＧＳＥ３３１１３にはステージＩＩの患者のみが含まれていたため、次にＧＳＥ３９５８２のステージＩＩのコホートが、負の予後因子としてのシグネチャーを裏付けたかどうかを尋ねた。我々は、ＧＳＥ３９５８２ステージＩＩコホートにおいて、両方のシグネチャーがＲＦＳ不良とも関連していることを見出した（図１９Ｅ－１９Ｆ）。いずれの線維芽細胞のシグネチャーも、ステージを制御しながら全ての患者に適合する多変量モデルに含めると、ＲＦＳの有意な予測因子であり続けた（表１０）。これらのデータは、ＰＤＰＮがＣＲＣにおける転帰不良の指標であり、ＴＭＥにおけるＰＤＰＮ発現線維芽細胞が腫瘍増殖に寄与することを示している。
実施例１１ 細胞外インタラクトームの特徴づけ
ＣＡＦにおけるＰＤＰＮ機能をよりよく理解し、最も一般的に使用される受容体‐リガンドスクリーニングアプローチの限界を克服するために、細胞表面上での制御された提示のために操作されたほとんどのＳＴＭヒト受容体を代表するライブラリを構築した。さらに、一過性の低親和性相互作用を検出するための四量体ベースのスクリーニング法を開発した。ここでは、我々は、ヒトにおけるＰＤＰＮのＳＴＭインタラクトームを研究するためにこの新しいプラットフォームを利用し、好中球マーカーＣＤ１７７を新規結合パートナーとして同定した。
Ａ．原形質膜上の制御されたタンパク質提示及び一過性受容体－リガンド相互作用の検出増強のための新しいプラットフォーム
細胞外環境におけるタンパク質相互作用は、一過性の低親和性結合（マイクロモルからミリモル範囲のＫＤ）よって特徴づけられることが多く、最も一般的に使用されるアプローチによる同定を困難にする（Martinez-Martin, 2017）。このような相互作用の検出を容易にするために、タンパク質の多量体化と結合の結合活性の増強のための四量体ベースの方法を開発した。まず、このアプローチを使用して、免疫受容体ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４とポリオウイルス受容体ＰＶＲ及びそれぞれのリガンドとの間の相互作用を試験した。要約すると、クエリタンパク質であるＰＤ－Ｌ１又はＰＶＲを、組換えビオチン化エクトドメインとして発現させ、次いで蛍光ストレプトアビジンを使用して四量体化し、受容体－リガンド相互作用の定量化を可能にした。次に、単量体又は四量体のＰＤ－Ｌ１又はＰＶＲを、関連する結合パートナーを一過性に発現している細胞への結合について試験した。クエリタンパク質の四量体化は、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１などのマイクロモル親和性相互作用を含む、単量体エクトドメインを上回る受容体－リガンド相互作用の検出を有意に増強した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。
まず、半自動トランスフェクション手順を使用して、このタンパク質ライブラリの一過性トランスフェクト細胞上での発現について試験した。特に、細胞表面発現について分析した３５００を超えるＳＴＭタンパク質から、中から高の細胞表面発現レベルがＳＴＭタンパク質の７５％以上で達成されたが、原形質膜上で検出可能な発現を示さなかったタンパク質はわずか約１０％であり、このことは、ライブラリ中の受容体の大部分が細胞表面上に提示され、関連する結合パートナーとの相互作用に利用できることを示している（図１４Ｄ）。
次に、新たに開発されたエクトドメイン－ｇＤ－ＧＰＩ ＳＴＭタンパク質コレクション（図１４Ｃ）を四量体ベースのスクリーニングと組み合わせて利用し、受容体－リガンド相互作用の発見をハイスループットで強化しようとした。そのために、自動細胞トランスフェクション及びスクリーニングの方法を実施し、続いて、細胞表面への蛍光四量体結合の検出のためのハイコンテントイメージングを実施した（図１４Ｅ）。まず、このプラットフォームを使用して、細胞表面相互作用因子に対する免疫受容体Ｂ７－Ｈ３／ＣＤ２７６を研究した（図１４Ｆ）。インターロイキン－２０受容体サブユニットα（ＩＬ２０－ＲＡ）は、最近の知見と一致して、相互作用因子として検出された（Husain et al., Mol Cell Proteomics, 18: 2310-2323, 2019）。ｇＤタグ及びＧＰＩアンカーが、細胞表面でのタンパク質相互作用の検出に影響しないことを実証するために、Ｂ７－Ｈ３は、いずれのタグも存在しない状態で完全長タンパク質として発現されたＳＴＭタンパク質のライブラリに対してもスクリーニングされた（図１４Ｇ）。以前の結果と一致して、このアッセイは、ＩＬ２０－ＲＡを高スコアヒットとして同定し、これは、エクトドメイン－ｇＤ－ＧＰＩライブラリが、細胞表面上のタンパク質相互作用の検出に適していることを実証する。
Ｂ．ｇＤ－ＧＰＩタグ付きヒトＳＴＭ受容体ライブラリ
ＳＴＭ受容体のリストは、タンパク質ドメインや細胞内局在などのタンパク質の特徴を予測するための様々なアルゴリズムを使用したバイオインフォマティクス分析を使用して編集され、その後手動でキュレーションされ、公開された注釈のレビューを行った。このリストを使用して、ほとんどのヒトＳＴＭ受容体タンパク質からなるライブラリを作成した（表７）。ＳＴＭ受容体をグリコシルホスファチジル－イノシトール（ＧＰＩ）－糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ（ｇＤ－ＧＰＩ）に融合した細胞外ドメイン（ＥＣＤ）として発現させ、細胞表面での発現を増強した（図１４Ｅ）。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の境界は、実施例１Ｂのように注釈が付けられた。天然シグナル配列を含む各受容体のＥＣＤを合成し、ｇＤ－ＧＰＩタグとインフレームでｐＲＫ５ベクター（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）にクローニングした。
Ｃ．四量体化クエリタンパク質
クエリタンパク質ＰＤＰＮは、部位特異的ビオチン化を可能にするａｖｉタグに融合したＰＤＰＮ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）として発現され、ビオチン化され、蛍光ストレプトアビジンを使用して結合の結合力を増加させるために四量体化された（図１４Ｅ）。ＥＣＤを四量体化するために、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートストレプトアビジンを、典型的には２ｍｇ／ｍＬの濃度で、特注バイアルとしてＰｒｏｚｙｍｅから購入した。Ａｖｉタグ付きのビオチン化ＰＤＰＮ ＥＣＤは、ＮＩＨ Ｔｅｔｒａｍｅｒ ＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙによって提供されたプロトコルに従って４量体化された。簡潔には、ＡＰＣ結合ストレプトアビジンを１０回の時間間隔で添加して、二量体又は三量体種に対して四量体形成を最大化した。ストレプトアビジンの添加量は、ＰＤＰＮとストレプトアビジン試薬の分子量に基づき、ビオチン化を１００％と仮定して算出した。ストレプトアビジンを、試料を光から保護した状態で室温で添加し、四量体はその後アッセイが行われるまで氷上で保存した。四量体は、アッセイの日に新たに調製された。
Ｄ．自動化されたシングルクローン、細胞ベースの受容体発見プラットフォーム
本明細書のセクション２Ａ（ｉｉ）に記載されているように、細胞表面受容体相互作用スクリーニング（図１４Ｅ）を使用して、ヒトＳＴＭ受容体のライブラリをＰＤＰＮとの相互作用についてスクリーニングした。実施例８Ｂの四量体化ＰＤＰＮ構築物を、クエリタンパク質として使用した。実施例８ＡのｇＤ－ＧＰＩタグ付きヒトＳＴＭ受容体ライブラリをプレイライブラリとして使用した。
ｉ．細胞のトランスフェクション
ＳＴＭヒト受容体のライブラリをＣＯＳ‐７細胞上に発現させた。半自動化手順を用いた逆トランスフェクションプロトコルに従い、細胞に個々の受容体クローンを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ－Ｐｌｕｓ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造業者の指示に若干の修正を加えて使用した。簡潔には、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）中のリポフェクタミンＬＴＸ－Ｐｌｕｓ混合物２５μＬを、ウェルあたり６ｎｇのＤＮＡを含む３８４ウェルマイクロタイタープレートに分注した。ＤＮＡ‐リポフェクタミン複合体を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで自動細胞ディスペンサーを使用して、細胞（１２５０００細胞／ｍＬでＤＭＥＭ培地に再懸濁）をアッセイプレートに分注した。
ｉｉ．細胞表面相互作用スクリーニング
ＰＤＰＮ結合パートナーの細胞表面相互作用スクリーニングをトランスフェクション４８時間後に実施した。細胞トランスフェクション効率を制御するために、多数のＧＦＰタグ付きクローンが含まれていた。細胞表面へのＰＤＰＮ ＥＣＤ結合の分析は、自動液体処理装置（プレートディスペンサー及びウォッシャー）で構成される統合ロボットシステムを使用して実施され、データ品質を向上させるための手動操作を最小限に抑えつつ、ＰＰＩのハイスループット分析を可能にした。増殖培地を細胞培養物から除去し、細胞を洗浄して、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＰＤＰＮ ＥＣＤ四量体と共に４℃で４５分間インキュベートした。細胞表面結合は、カルシウムとマグネシウムを補充した０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中でアッセイした。ＰＤＰＮとのインキュベーション後、細胞を洗浄し、４％ＰＦＡで固定し、光から保護して４℃で保存した。ロボットアームの支援を受けたハイコンテント顕微鏡（Ｉｎ Ｃｅｌｌ ６０００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して個々のウェルから画像を取得した。細胞表面の四量体染色は、蛍光シグナル強度として表された（図１４Ｅ）。
ｉｉｉ．画像処理
画像データはｔｉｆｆファイルとしてエクスポートされ、Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ＴｏｏｌｂｏｘバージョンＸソフトウェアを使用して処理された。画像は、カスタム分析モジュールを使用して分析し、セグメンテーションは、陽性細胞表面染色に基づいて行った。典型的には、１０～５００シグナル／ノイズ比の範囲内のイベントは、分析モジュールにおいて「ヒット」とみなされ得る。所望のオブジェクトの最適な輪郭を得て、スクリーニングアーチファクトによるバックグランド信号を最小限に抑えるために、最小限の後処理分析及び除外パラメータを設定した。細胞表面へのＰＤＰＮ結合は、シグナル／ノイズ比として表された（図１４Ｅ）。
単一の新規結合ＰＤＰＮ結合パートナー、ＣＤ１７７（ＮＢ１、ＰＲＶ１）が同定された（図１４Ｈ）。ＣＤ１７７は、好中球及び腫瘍内制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のごく一部で発現するＧＰＩ結合細胞表面糖タンパク質である（Plitas et al., Immunity, 45: 1122-1134, 2016）。
完全長タンパク質として発現されるほとんどのＳＴＭ様受容体からなるライブラリに対して実施された同様のスクリーニングにより、ＰＤＰＮとヒトＣＬＥＣ－２の間の相互作用が確認された（図２０Ａ）；ＣＬＥＣ－２は、マウスモデルにおける既知のＰＤＰＮ結合パートナーである（Astarita et al., Nat Immunol, 16: 75-84, 2015）。
ｉｖ．ＰＤＰＮとＣＤ１７７及びＣＬＥＣ－２との間の相互作用の検証
ＰＤＰＮとＣＤ１７７及びＣＬＥＣ‐２との間の相互作用をさらに検証するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して結合をアッセイした。ＳＰＲはＰｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉｏｒａｄ）又はＢｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定した。精製タンパク質（組換えＥＣＤとして発現させたＣＤ１７７又はＣＬＥＣ－２）を、アミンカップリング法を使用して、それぞれＧＬＣ又はＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ＡｖｉｄｉｔｙＡＶＩＴＡＧＴＭ（Ａｖｉ）タグ付きＰＤＰＮを、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイのために、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用した場合）、又はＨＢＳ－Ｐバッファー（０．０１ＭのＨｅｐｅｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中に示された濃度の可溶性被分析物として泳動した。バルク屈折率変化は、基準流量反応を差し引くことにより除去した。ＫＤ計算のために、３００～４００の共鳴単位を固定化し、速度論データを平衡又はラングミュアモデルに適合させて、ＣＤ１７７及びＣＬＥＣ‐２結合の速度論パラメータをそれぞれ計算した。速度論の計算では、Ａｖｉタグ付き単量体ＰＤＰＮエクトドメインを被分析物として使用した。全てのセンサーグラムを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ）又はＰｒｏｔｅｏｎ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１．０．６（Ｐｒｏｔｅｏｎ）ソフトウェアを使用して分析した。
これらの研究により、ＰＤＰＮとＣＤ１７７の間の相互作用（図１４Ｉ－１４Ｊ）及びＰＤＰＮとＣＬＥＣ－２の間の相互作用（図２０Ｂ）が裏付けられた。興味深いことに、ＰＤＰＮはマイクロモルの結合親和性（ＫＤ＝３．３±０．７μＭ）でＣＤ１７７と相互作用し、ＣＬＥＣ－２で検出された親和性（ＫＤ＝２１０±０．３ｎＭ）よりも１桁低く（図１４Ｉ）、様々な親和性のタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）を検出するための我々のアプローチの感度を示している。
ｖ．マウスＰＤＰＮ、ＣＤ１７７及びＣＬＥＣ－２間の相互作用の評価
また、ＳＰＲを使用して、マウスＣＤ１７７とＰＤＰＮが相互作用するかどうかを試験した。我々は、マウスＣＬＥＣ－２のＰＤＰＮへの結合を再現することができたが、マウスＣＤ１７７のマウスＰＤＰＮへの結合を様々なフォーマットで検出することはできなかった（示さず）。これは、おそらくマウス及びヒトＣＤ１７７における配列保存性が低いためであり、この相互作用がヒトの免疫系に特異的な関連機能を果たしていることを示唆している。
実施例１２ 腫瘍微小環境におけるＰＤＰＮ、ＣＬＥＣ－２、及びＣＤ１７７発現細胞
ＰＤＰＮ及びＣＤ１７７を発現する細胞型を決定するために、初代ヒト血液及び結腸組織を分析した。
Ａ．血液試料
血液試料は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社の献血プログラムの下で、健常ドナーから採取した。ＭＡＣＳＥｘｐｒｅｓｓ好中球分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、血液から好中球を分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、フィコール（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）勾配遠心分離によってヘパリン添加血液から精製され、続いてＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＴ細胞が分離された。
Ｂ．ＣＡＦ
初代ヒト結腸直腸がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）をＶｉｔｒｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａから購入し、ＭＳＣ－Ｇｒｏ低血清増殖培地（Ｖｉｔｒｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）で最大５～６継代増殖させた。ＨＴ－２９細胞をＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙの５ａ培地で増殖させた。全ての細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養された。
Ｃ．血液及び結腸細胞中のＣＤ１７７
ｉ．血中好中球におけるＣＤ１７７発現
我々は最初に、血中の好中球において報告されているＣＤ１７７の発現を確認した。これまでに報告されているように（Bai et al., Blood, 130: 2092-2100, 2017）、ＣＤ１７７を発現する好中球の割合は個体間で大きく異なり、好中球の平均約６０％がＣＤ１７７＋であることがわかった（図１５Ａ）。
ｉｉ．マイクロアレイデータにおけるＰＤＰＮ及びＣＤ１７７の発現
次に、ＧＳＥ３３１１３及びＧＳＥ３９５８２マイクロアレイデータセットにおけるＰＤＰＮ及びＣＤ１７７のＲＮＡ発現を調べた。ＰＤＰＮの発現は正常組織と比較して腫瘍組織で有意に高く、ＣＤ１７７の発現は腫瘍におけるＰＤＰＮの発現よりもはるかに低かった（図２２Ａ－２２Ｂ）。
ｉｉｉ．細胞コンパートメントにおけるＰＤＰＮ及びＣＤ１７７の発現
次に、健常個体及び結腸直腸がん（ＣＲＣ）患者からのヒト血液及び結腸組織におけるＰＤＰＮ及びＣＤ１７７の発現パターンを調べた。ＰＤＰＮ及びＣＤ１７７のＲＮＡ発現は、ＴＣＧＡデータセットにおいて正常組織と比較して腫瘍において有意に高かった（図２２Ａ及び２２Ｂ）。図１３Ａ～１３Ｆで調べた２つのデータセットでは、ＣＤ１７７及びＰＤＰＮが発現していたが、バルク腫瘍ＲＮＡデータではＲＮＡの細胞源を識別することは不可能である（図２２Ｃ及び２２Ｄ）。したがって、タンパク質レベルでの発現及び細胞分布を研究するために、新鮮なヒト組織を、間質細胞及び免疫細胞を含む全ての細胞型を良好な生存率で良好に回収できる消化プロトコルを使用して、単一細胞懸濁液に消化した。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を行い、試料を図１５Ｂのようにゲートした。
正常隣接結腸組織には比較的少数の好中球が含まれていたが、腫瘍には好中球の大量の流入があることがわかった（図１５Ｂ－１５Ｃ）。血液中と同様に、腫瘍好中球は様々な量のＣＤ１７７を発現したが、ＣＤ１７７＋好中球の比率は、個体の血液と腫瘍の間で類似していた（図１５Ｄ－１５Ｅ）。興味深いことに、ＣＤ１７７＋好中球は隣接する正常組織に比べて腫瘍にわずかに濃縮されていた（図１５Ｄ－１５Ｅ）。
以前に報告されたように（Plitas et al., Immunity, 45: 1122-1134, 2016）、我々はまた、腫瘍Ｔｒｅｇのごく一部がＣＤ１７７を発現しているのに対して、非腫瘍組織、血液、又は扁桃腺におけるＴｒｅｇ上ではＣＤ１７７はほとんど観察されないことも観察した（データは非表示）。これらのＣＤ１７７＋ ＴｒｅｇはＣＤ１７７＋好中球よりもはるかに少ない量であった。
次に、非造血間質コンパートメントを調べた。ゲートは、生きている（７－ＡＡＤ染色の欠如によって示される）、一重項である、ＣＤ４５－である（すなわち、免疫細胞ではなく、ＥｐＣＡＭ－である）（すなわち、腫瘍細胞ではない）イベントを含むように選択された（図１５Ｆ）。我々は、全ＣＤ３１－間質と定義されるがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の約４０％がＰＤＰＮ＋であることを見出した（図１５Ｇ）。ＰＤＰＮはいくつかのリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）及びごく一部のマクロファージによっても発現されたが、細胞あたりのＰＤＰＮレベルはＣＡＦ上で有意に高く（図１５Ｈ）、これらが腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＰＤＰＮの主要源であることを示している。この知見は、我々のバイオインフォマティクス分析から導かれた結論を確認するものである（図１３Ｄ）。さらに、ＣＡＦ上のＰＤＰＮ染色は隣接する正常組織の線維芽細胞上の染色よりも６倍高く、より高い割合の細胞がＰＤＰＮ＋であった（図１５Ｉ－１５Ｊ）。
また、炎症状態である憩室炎患者の結腸試料中の線維芽細胞を、上記の方法を使用して調べた。興味深いことに、これらの組織の線維芽細胞も正常な腫瘍隣接組織に比べてＰＤＰＮをアップレギュレートした（図１５Ｉ－１５Ｊ）。この知見は、ＰＤＰＮがＴＧＦ－βやＩＬ－６などの様々な炎症性刺激によってアップレギュレートされ得るというこれまでの観察結果と一致している（Astarita et al., Front Immunol, 3: 283, 2012）。
全体として、これらのデータは、ＣＡＦが腫瘍組織におけるＰＤＰＮの主要源であることを確認し、ＰＤＰＮ＋ ＣＡＦとＣＤ１７７＋好中球の両方が結腸腫瘍組織に濃縮されていることを示している。
Ｄ．ＰＤＰＮ及びＣＤ１７７のＩＨＣ及び免疫蛍光局在
ＴＭＥ内のＰＤＰＮ＋及びＣＤ１７７＋細胞の局在を調べるために、ＣＲＣ腫瘍（ＣＲＣ結腸）及び正常隣接組織（ａｄｊ結腸）由来のヒト結腸組織におけるＰＤＰＮ及びＣＤ１７７の二重免疫組織化学（ＩＨＣ）及び免疫蛍光染色を行った。正常組織では、ＰＤＰＮ染色は主にリンパ管に限定されており、好中球はほとんど観察されなかった（図１６Ａ、２３Ａ、及び２３Ｃ）。対照的に、腫瘍試料では、ＰＤＰＮは周囲の腫瘍間質のＣＡＦで強くアップレギュレートされていたが（図１６Ｂ－１６Ｃ及び２３Ｂ）、腫瘍細胞ではほとんど観察されなかった。ＰＤＰＮ＋線維芽細胞は一般的に整列しており、腫瘍床間を走る間質の大きな帯を作っていた（図１６Ｂ－１６Ｃ）。これらの繊維は腫瘍床に平行に走る傾向があった。全体として、正常な結腸細胞の約２０％のみが何らかのＰＤＰＮ染色を示したが、腫瘍試料の６０％以上がＰＤＰＮ染色を示した（図１６Ｅ）。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）との共染色により、ＣＤ１７７＋細胞の大部分が好中球であることが確認され（図１６Ｄ及び２３Ｄ）；このデータは、ＦＡＣＳ分析と組み合わせて、ほとんどのＣＤ１７７シグナルが好中球から来るであろうことを明らかにした。ＰＤＰＮ＋細胞と同様に、我々の組織分析と一致して（図１５Ｄ）、ＣＤ１７７＋好中球の量も腫瘍試料中で大幅に増加し、腫瘍試料の６０％以上がＣＤ１７７＋染色を示した（図１６Ｅ）。一部のＣＤ１７７＋細胞は、腫瘍周囲間質において同定され、そこではＰＤＰＮ＋細胞と密接に相互作用した（図１６Ｂ－１６Ｃ）。しかし、ほとんどのＰＤＰＮ＋細胞は、それらが腫瘍微小環境全体にわたってまばらに位置していたため、ＣＤ１７７＋細胞と接触していなかった。全体として、これらの結果は、ＣＤ１７７発現好中球がＣＲＣ組織においてＰＤＰＮを発現するＣＡＦと相互作用できることを示しており、この新たに発見された分子相互作用がＣＡＦ機能に影響を及ぼす可能性を示唆している。
実施例１３ ＰＤＰＮ、ＣＬＥＣ－２、及びＣＤ１７７間の相互作用の機能的効果
次に、ＰＤＰＮとＣＤ１７７の間、及びＰＤＰＮとＣＬＥＣ－２の間の相互作用が、ＣＡＦにおけるアクトミオシン収縮性に及ぼす機能的効果を調査した。実施例１０Ｂに記載されているように、３Ｄ伸長実験を実施した。１００ｎＭの組換えＣＬＥＣ－２又はＣＤ１７７を培地に添加した。これらの実験は、ＣＬＥＣ－２及びＣＤ１７７の両方がＣＡＦの伸長を引き起こすことを示した（図１７Ａ－１７Ｂ）。
観察された効果が、ＣＤ１７７及びＣＬＥＣ－２が細胞上で内因的に発現されたときに発生したかどうかを試験するために、ＣＡＦを初代好中球（ＣＤ１７７＋ ＣＬＥＣ－２＋）又はＴ細胞（ＣＤ１７７－ ＣＬＥＣ２－）と共培養する同様のアッセイを行った。ＣＡＦには、血液から単離した好中球（ｎｅｕｔ）又はＴ細胞を５：１の比率で播種した。我々は、好中球は組換えタンパク質と同程度にＣＡＦの伸長を引き起こすが、Ｔ細胞は引き起こさないことを観察した（図１７Ｃ）。
この表現型が複数の種類の線維芽細胞に当てはまるかどうかを確認するために、健常結腸、膀胱、及び卵巣組織からの初代ヒト線維芽細胞でこの実験を繰り返した。ＰＤＰＮを発現した２つの線維芽細胞、結腸及び膀胱線維芽細胞においてのみ伸長の増加が観察された（図１７Ｄ－１７Ｅ）。これらの結果は、ＣＬＥＣ‐２とＣＤ１７７が原形質膜上のＰＤＰＮを介して作用し、線維芽細胞の伸長を調節していることを示している。
次に、ＣＬＥＣ－２とＣＤ１７７がＣＡＦ収縮性も阻害するかどうかを試験した。両方のタンパク質が収縮性を約５０％阻害した（図１７Ｆ）。
実施例１４ ホスホプロテオミクス分析
次に、我々は、高内因性レベルのＰＤＰＮを発現するＣＲＣ組織から単離された初代ヒトＣＡＦにおいて、ＰＤＰＮ機能のＣＤ１７７調節の基礎となる機構を研究することを試みた。まず、ＣＬＥＣ‐２及びＣＤ１７７による刺激時のＣＡＦの転写プロファイルの変化を分析した。ＣＡＦトランスクリプトームの有意な変化は観察されず（データは非表示）、ＰＤＰＮターゲティングがＣＡＦプロテオームに対してより迅速で一時的な影響を及ぼす可能性が示唆された。このように、ＣＤ１７７及びＣＬＥＣ－２によって調節されるシグナル伝達経路及びエフェクタータンパク質を包括的に調査するために、深い多重プロテオミクスアプローチを使用してプロテオーム及びホスホプロテオームのグローバル定量化を行った。
簡潔には、ＣＡＦを組換えＣＤ１７７又はＣＬＥＣ－２タンパク質で２分間及び３０分間刺激し、得られた全細胞抽出物を、タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用したグローバルリン酸化分析に供した（図１８Ａ）。我々は、プロテオーム画分の１０プレックスタンデムマスタグ（ＴＭＴ）標識化を組み合わせたプロテオミクスプロファイリング法を利用して、全ての条件にわたるホスホペプチドの相対的定量を行い、深いホスホプロテオミクスプロファイリングを可能にするために強陽イオン交換分画とＴｉＯ２ホスホペプチド濃縮を行った。また、タンパク質の存在量を評価するためにグローバルプロテオームプロファイリングが実施され、その後、総タンパク質及びリン酸化部位の定量化のためのコンピュータによるデータ処理が行われ、最後に治療群間の相対的な差の統計的検定が行われた（Beausoleil et al., Nat Biotechnol, 24: 1285-1292, 2006）。重要なことに、この方法は、ＣＤ１７７又はＣＬＥＣ－２刺激が、２分間又は３０分間で総タンパク質のレベルを有意に変化させないことを実証し、したがって、観察された差次的リン酸化イベントが、シグナル伝達の変化に特異的に起因する可能性があり、定量化されたリン酸化部位のほぼ３０００個（約７０％）について、グローバルなタンパク質レベルの評価が可能であると結論することができた（図１８Ｇ及び２４Ａ）。グローバルホスホプロテオームの変化は、２分間と比較して３０分間の刺激後の方が顕著であった（図１８Ｂ及び２４Ｆ）。２分後には、ＣＤ１７７又はＣＬＥＣ－２のいずれかによって３０個のタンパク質が有意に修飾されたが（図１８Ｃ）、２２６個のタンパク質に相当する約３００個のリン酸化部位が、ＰＤＰＮバインダーによる３０分間の刺激後に有意に調節された（図１８Ｄ）。
ＰＤＰＮ結合により調節される経路を機能的に分類するために、ＣＤ１７７又はＣＬＥＣ‐２により有意に調節されるリン酸化タンパク質を、遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語の濃縮について分析した。これらの結果は、我々の研究室及び他の研究室からの以前のデータ（Astarita et al., Nat Immunol, 16: 75-84, 2015; Acton et al., Nature, 514: 498-502, 2014; Martinez et al., Cell Rep, 29: 2810-2822 e2815,2019）と一致して、細胞骨格の再配列、細胞の運動性、細胞外マトリックスの沈着、及び分泌経路におけるＰＤＰＮの主要な役割を強調した（図１８Ｅ及び２４Ａ）。プレクチン（ＰＬＥＣ）、微小管関連タンパク質ＭＡＰ１Ｓ又はＭＡＰ４、グアニンヌクレオチド交換因子ＧＢＦ１及びＲＧＨ１０、又はプレクストリン相同性様ドメインファミリーＢメンバー１及び２（ＰＨＬＢ１及びＰＨＬＢ２）など、微小管機能、細胞骨格構成、及び輸送過程の重要なモジュレーターは、特にＰＤＰＮターゲティング時に実質的に調節された（図１８Ｆ）。さらに、興味深いことに、これらのデータは、細胞の増殖と分化、並びに細胞ストレスと外因性刺激への応答に関連する代謝過程、これまでＰＤＰＮとは関連していなかったＣＡＦ生物学に関連する生物学的過程における顕著な変化も示唆した（図１８Ｅ）。これらの過程のいくつかの重要なモジュレーターは、ＣＬＥＣ－２及びＣＤ１７７刺激により有意に翻訳後修飾され、これらには、ＭＥＤ１、ＷＷＴＲ１／ＴＡＺ、ＬＡＲＰ１、ＮＣＢＰ１などの多数の転写制御因子及びＲＮＡ結合分子が含まれる（図１８Ｆ）。
ホスホプロテオームのこのグローバルな評価は、ＣＡＦ細胞の形態及び細胞骨格の再配列、並びに細胞増殖などのこれまで認識されていなかった過程の変化におけるＰＤＰＮシグナル伝達の重要な役割を裏付けるものである。さらに、これらのデータは、ＣＬＥＣ－２又はＣＤ１７７のいずれかの結合が、ＣＡＦへのＰＤＰＮシグナル伝達を大きく変化させることができることを示し、免疫細胞とＣＡＦとの相互作用が、これまで認識されていなかった方法でＴＭＥを変化させる可能性あることを示している。
Ａ．ホスホプロテオミクス法
ｉ．プロテオミクス試料の調製
ＣＡＦを１５ｃｍ皿上で約７０％の培養密度まで増殖させた。アッセイの日に、細胞を２時間飢餓状態にした後、組換えＣＬＥＣ－２又はＣＤ１７７で２分間又は３０分間刺激した（表１３）。刺激は無血清培地中で３７℃で行った。刺激後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、続いて収集し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、９Ｍ尿素（１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、及び１ｍＭのβ－グリセロリン酸を含む）で溶解した。５つの条件からの溶解物を分析した。これらは、未処理、ＣＬＥＣ‐２で２分間＆３０分間処理、及びＣＤ１７７で２分間＆３０分間処理である。各５プレックス実験の２回のバイオレプリケートを行い、組み合わせて１０プレックス実験を行った。Ｍｉｓｏｎｉｘ Ｍｉｃｒｏｓｏｎ ＸＬソニケーターを使用して試料を超音波処理し、続いて１５℃で２０分間２０，０００ｇで遠心分離した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して測定した。タンパク質（１ｍｇ／条件）を５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）で３７℃で１時間還元し、続いて１５ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で室温で２０分間暗所でアルキル化した。試料を最終濃度２Ｍ尿素に希釈した後、Ｌｙｓ－Ｃ（和光、日本）で酵素：基質比（Ｅ：Ｓ）１：５０、３７℃で４時間消化し、続いてトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＥ：Ｓ比１：５０、３７℃で一晩消化した。ペプチド溶液を２０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化した後、ＷａｔｅｒｓのＣ１８カートリッジ（吸収剤５０ｍｇ）を使用して固相抽出した。ペプチドを、２ｘ０．５ｍＬの４０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／０．１％のＴＦＡで溶出した後、定量的比色ペプチドアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してペプチド濃度測定を行った。条件ごとに等量を一晩凍結乾燥に供した。
ｉｉ．ＴＭＴ標識化
ペプチド混合物を１０００μＬのＨＥＰＥＳ（２００ｍＭ、ｐＨ８．５）＋３００μＬのＡＣＮ中で再構成し、１００μＬのＴＭＴ試薬を１０個の試料の各々に添加した（ＴＭＴ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）の各バイアルを４０μＬのＡＣＮに溶解した））。標識化は室温（ＲＴ）で１．５時間行った。各条件の少量（２μＬ）を混合し、脱塩し、分析して、標識効率並びに各試料中の相対タンパク質量を測定した。標識効率が少なくとも９５％であると決定され時点で、１００μＬの５％ヒドロキシルアミンで反応を停止させた。試料を等量混合した後、２０％のＴＦＡを用いて酸性化し、一晩凍結乾燥した。１０プレックスＴＭＴ標識ペプチド混合物を、ＷａｔｅｒｓのＣ１８カートリッジ（２００ｍｇ吸収剤）を使用して脱塩した。試料を、３ｘ１ｍＬの６０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡで溶出した。少量（約０．５ｍｇ）を総タンパク質プロファイリングのために保存し、約６．５ｍｇをグローバルリン酸化分析に供した。
ｉｉｉ．グローバルリン酸化及びグローバルタンパク質分析
ＨＰ１１００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、ＰｏｌｙＳｕｌｆｏｅｔｈｙｌ ４．６ｍｍ ＩＤｘ２００ｍｍ、５μｍ、２００Åカラム（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ）を使用し、流速１ｍＬ／分で強陽イオン交換（ＳＣＸ）分画を行った。１６画分を収集し、脱塩後、ＴｉＯ２濃縮Ｐｈｏｓ－ＴｉＯキット（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してホスホペプチド濃縮を行った。タンパク質プロファイリングのために、試料を高ｐＨ逆相分画に供し、９６画分を収集し、２４画分にプールした。試料は質量分析の前にＣ１８ステージチップで脱塩した。
ｉｖ．質量分析
脱塩したペプチドを２％ＡＣＮ／０．１％ギ酸（ＦＡ）／水で再構成し、ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して０．７μＬ／分の流速でＣ１８カラム（１．７μｍＢＥＨ、１３０Å、０．１ｘ２５０ｍｍ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）にロードした。２％から３０％の溶媒Ｂ（０．１％ＦＡ／２％水／ＡＣＮ）の勾配を０．５μＬ／分で１５５分間かけて適用し、総分析時間は１８０分でペプチドを分離した。ペプチドはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ装置（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して分析した。前駆体イオン（ＭＳ１）は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ＡＧＣターゲット１Ｅ６、１２０，０００質量分解能、最大注入時間５０ｍｓ）で分析され、最も豊富な１０種が断片化（ＭＳ２）のために選択された（ＭＳ２）。イオンは、電荷状態≧２（ｚ＝２，３＆４‐６）とモノアイソトピックピークの割り当てに基づいてフィルタリングされ、ダイナミックエクスクルージョン（４５ｓ±１０ｐｐｍ）が有効となった。各前駆体を０．５Ｔｈの質量幅で分離した後、衝突誘起解離（３５ＮＣＥでのＣＩＤ）を使用して断片化を行い、ＭＳ２ ＡＧＣターゲットを２．０Ｅ４に設定し、最大注入時間は２００ｍｓとした。ＨＣＤ（５５ＮＣＥ、ＳＰＳノッチ＝８、ＡＧＣターゲット＝２．０Ｅ５、最大注入時間１５０ｍｓ）ＭＳ３断片化及び５０，０００分解能でのＯｒｂｉｔｒａｐ分析の前に、同期前駆体選択（ＳＰＳ）を使用して複数の断片イオンを分離した。グローバルリン酸化分析のために、７９．９７Ｄａの中性損失が指定され、多段階活性化を活性化し、リン酸化種のより良好な識別を可能にした。また、ＭＳ３の最大注入時間は３５０ｍｓに設定した。
ｖ．質量分析データ分析
ＭＳ／ＭＳデータは、Ｍａｓｃｏｔ検索アルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ホモサピエンスタンパク質と一般的な汚染物質配列で構成される連結されたフォワードリバースターゲットデコイデータベース（２０１６年６月にＵｎｉＰｒｏｔからダウンロード）に対して検索された。スペクトルは、５０ｐｐｍの前駆体物質質量許容範囲と０．８Ｄａの断片イオン許容範囲を使用して割り当てた。静的修飾には、ペプチドのＮ末端とリジン残基の両方にカルバミドメチルシステイン（＋５７．０２１５Ｄａ）、ＴＭＴ（２２９．１６２９Ｄａ）が含まれていた。可変修飾には、酸化メチオニン（＋１５．９９４Ｄａ）と、リン酸化分析のためのセリン、スレオニン、及びチロシン残基のリン酸化（＋７９．９６６３Ｄａ）が含まれていた。最大３つの切断の失敗を伴うトリプシン特異性が特定された。ペプチドスペクトルの一致は、５％の偽発見率（ＦＤＲ）でフィルタリングされ、続いて２％のＦＤＲでタンパク質がフィルタリングされた。リン酸化された種については、ＡＳｃｏｒｅアルゴリズムを適用して、正確なリン酸化部位の局在１６を決定した。ＭＳ３ ＴＭＴ定量化をＭｏｊａｖｅモジュールを使用して行い、全１０チャンネルにわたって合計３０，０００未満のＭＳ３スキャンのＴＭＴピークを除外した。各ペプチドは、全てのＰＳＭからの各試料のＴＭＴシグナルを合計することにより定量化された。最後に、７残基より短いペプチドを除外した。
ｖｉ．質量分析統計分析
グローバルホスホプロテオミクスアッセイのために、同一のリン酸化部位をカバーする全てのトリプシンホスホペプチドが、複数のリン酸化部位をカバーするグループを含む、単一のリン酸化部位グループ識別子の下にグループ化された。次に、各リン酸化部位グループ（又はグローバルプロテオームアッセイのタンパク質）について、ＭＳｓｔａｔｓ ｖ３．７．１３７でＴｕｋｅｙ Ｍｅｄｉａｎ Ｐｏｌｉｓｈ ｓｕｍｍａｒｙを使用して、複製全体の全ての定量化されたペプチドについて、打ち切り閾値２８未満の欠測値を補完して、モデルを適合させた。ＭＳｓｔａｔ内では、比較した全処理群についてモデルの推定倍率変化及び統計的有意性を算出した。有意に変化したリン酸化部位グループは、｜Ｌｏｇ２（倍率変化）｜＞１及びｐ値＜０．０５の閾値を設定することによって決定された。次いで、有意に変化したリン酸化部位グループの全てのサブセットに注釈を付け、ＧｏＳｔａｔｓパッケージ（（Ｆａｌｃｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ，２００７））を使用して各グループの比較内で大きな比率を占める生物学的注釈（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ、ＰＦＡＭ、及びＫＥＧＧ）について試験した。有意な注釈は、ｑ値＜０．０５、グループサイズ＞２及びゲノム発生＜１０００閾値によって定義された。次いで、有意な用語をさらに手動で、生物学的プロセス用語のための単純化、非重複カテゴリにグループ化し、フィッシャーの正確確率検定で過剰出現について試験した。
実施例１５ ＰＤＰＮ＋ ＣＡＦによる腫瘍増殖の増強はＣＤ１７７によって抑制される
ＰＤＰＮがＣＡＦ増殖とアクトミオシン収縮性を制御することを示す我々の結果、及びＣＲＣ患者におけるＰＤＰＮの予後的意義に照らして、次にＣＲＣ ＣＡＦが腫瘍増殖を直接サポートできるかどうかを評価することにした。腫瘍オルガノイド増殖の定量化を可能にするために、赤色蛍光タンパク質を発現するＳＷ４８０腫瘍細胞株を作製した。腫瘍細胞を単独で、又はＷＴ若しくはＰＤＰＮ欠損ＣＡＦとの共培養で増殖させ、ＣＡＦを腫瘍オルガノイド増殖を促進する能力について評価した。ＷＴ ＣＡＦは単独で増殖した腫瘍細胞と比較して腫瘍増殖を有意に増強した。特に、Ｐｄｐｎ－／－ＣＡＦは、オルガノイドの増殖をサポートするのに有意に悪く、これは、ＣＡＦの腫瘍サポート機能を維持する上でのＰＤＰＮシグナル伝達の中心的な役割を示している（図２７Ａ及び２７Ｂ）。次に、ＣＬＥＣ－２及びＣＤ１７７がＣＡＦの形態及び収縮性に有意に影響することを考慮して、ＣＤ１７７又はＣＬＥＣ－２がＣＡＦの腫瘍オルガノイドの増殖をサポートする能力に影響するかどうかを評価することを試みた。この目的のために、腫瘍細胞及びＣＡＦ共培養物をＣＤ１７７及びＣＬＥＣ－２で刺激し、ＣＡＦと免疫細胞との間の相互作用を模倣した。１７日間の培養で腫瘍オルガノイド増殖を評価した。注目すべきことに、ＰＤＰＮ＋ ＣＡＦによって引き起こされた増殖の増加は、ＣＤ１７７又はＣＬＥＣ－２刺激時に有意に減少し、このことは、これらの分子がＰＤＰＮ機能を阻害し、それによってＣＡＦの腫瘍形成促進能を制限することを示している（図２７Ｃ及び２７Ｄ）。
Ａ．腫瘍オルガノイド培養法
３Ｄオルガノイド培養物を生成するために、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を安定に発現する２０００個のＳＷ‐４８０腫瘍細胞を、１００μＬのＭＡＴＲＩＧＥＬＬ（登録商標）マトリックス（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）、３５６２３１）に、１００，０００個のＷＴ又はＰｄｐｎ－／－ＣＡＦｓの有り又は無しで播種した。腫瘍オルガノイドは、既述のとおり調製した（Dominguez et al., Cancer Discov, 10: 232-253, 2019）。簡潔には、細胞がカバーガラスに付着するのを防ぐために、１００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングされた２４ウェルガラス底プレートに混合物をプレーティングした。次に、ゲル重合後の培養物の上に２ｍＬの腫瘍細胞増殖用培地を加え、培養物を１２～１７日間モニターした。ＣＬＥＣ－２及びＣＤ１７７処理のために、ストレプトアビジンにコンジュゲートしたＣＤ１７７又はＣＬＥＣ－２のビオチン化細胞外ドメインを含む四量体として提供される１５０ｎＭの四量体化ＣＬＥＣ－２又はＣＤ１７７を、プレーティング前にＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）－細胞混合物に直接添加した。さらに、オルガノイドをプレーティングした後、１５０ｎＭの各四量体を培地に補充し、１５日目まで７２時間ごとに四量体の添加を繰り返した。プレートは、ＮＩＫＯＮ（登録商標）４ＸＰｌａｎ Ｆｌｕｏｒ対物レンズ（ＮＡ：０．１３）を使用して、自動ステージ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を備えたＮＩＫＯＮ（登録商標）Ｔｉ－Ｅ倒立顕微鏡で４日ごとに画像化された。画像は、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）と明視野チャネルで記録され、腫瘍オルガノイドを表す球体がステッチされ、焦点深度拡張モジュール（ＥＤＦ、Ｎｉｋｏｎ（登録商標））を用いて単一最大画像投影に焦点を合わせた。各画像の腫瘍オルガノイドの総面積をＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（ｖＲ２０１８ａ、ＭＡＴＨＷＯＲＫＳ（登録商標））で分析した。
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上述の発明は、理解を明確にする目的のために、例示の方法及び実施例によってある程度詳細に記載されているが、記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。

Claims (261)

  1. ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療から利益を得る可能性のある個体として前記個体を同定する、方法。
  2. がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを含む治療から利益を得る可能性のある個体として前記個体を同定する、方法。
  3. 個体が、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルを有し、方法は、有効量のＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを個体に投与することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. がんを有する個体を治療する方法であって、
    （ａ）個体からの試料において表１５の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することであって、ここで、遺伝子対の第１のメンバーの発現レベルは、第１の参照発現レベルを上回り、且つ遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、第２の参照発現レベルを上回る、決定すること；及び
    （ｂ）有効量のＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを個体に投与すること
    を含む方法。
  5. がんを有する個体を治療する方法であって、第１の参照発現レベルを上回る表１５の遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る前記遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルを有すると決定された個体に、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストを投与することを含む、方法。
  6. ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、個体からの試料において表１６の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のある個体として前記個体を同定する、方法。
  7. がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、個体からの試料において表１６の少なくとも１つの遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルを決定することを含み、ここで、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルは、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える治療から利益を得る可能性のある個体として前記個体を同定する、方法。
  8. 個体が、第１の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第１のメンバーの発現レベル及び第２の参照発現レベルを上回る遺伝子対の第２のメンバーの発現レベルを有し、方法は、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト以外の、又はそれに加える、有効量の治療を個体に投与することを含む、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 第１の参照発現レベルが、事前に割り当てられた発現レベルであり、且つ第２の参照発現レベルが、事前に割り当てられた参照発現レベルである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 個体からの試料が、抗がん療法の投与前に個体から得られる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 個体からの試料が、抗がん療法の投与後に個体から得られる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 個体からの試料が、腫瘍組織試料又は腫瘍流体試料である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、アーカイブ試料、新鮮な試料、又は凍結試料である、請求項１２に記載の方法。
  14. 腫瘍組織試料がＦＦＰＥ試料である、請求項１３に記載の方法。
  15. （ａ）試料中の遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルは、タンパク質発現レベルである；又は
    （ｂ）試料中の遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルは、ｍＲＮＡ発現レベルである
    請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 試料中の遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルが、それぞれ、遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーのｍＲＮＡ発現レベルである、請求項１５に記載の方法。
  17. 遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーのｍＲＮＡ発現レベルが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ若しくはＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、ＦＩＳＨ、又はそれらの組み合わせによって決定される、請求項１６に記載の方法。
  18. 第１の参照発現レベルが、約０．２５から約０．５カウント／ミリオン（ＣＰＭ）の間であり、第２の参照発現レベルが、約０．２５から約０．５ＣＰＭの間である、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 第１の参照発現レベルが０．２５ＣＰＭであり、第２の参照発現レベルが０．２５ＣＰＭである、請求項１８に記載の方法。
  20. 第１の参照発現レベル及び第２の参照発現レベルが、それぞれ、がんを有する個体の参照集団における遺伝子対の第１のメンバー及び第２のメンバーの発現レベルである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. がんが尿路がんである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 尿路がんが尿路癌である、請求項２１に記載の方法。
  23. 尿路癌が局所進行性尿路上皮癌である、請求項２２に記載の方法。
  24. 尿路癌が転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）である、請求項２２に記載の方法。
  25. 利益が、ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストなしの治療と比較して、個体の全生存期間（ＯＳ）の延長を含む、請求項１～３及び６～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 遺伝子対の第１のメンバーがＳＩＧＬＥＣ６であり、遺伝子対の第２のメンバーがＮＣＲ１である、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 遺伝子対の第１のメンバーがＢＴＮ３Ａ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＬＲＲＣ４Ｂである、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. 遺伝子対の第１のメンバーがＣＤ８０であり、遺伝子対の第２のメンバーがＣＴＬＡ４である、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  29. 遺伝子対の第１のメンバーがＢＴＮ３Ａ３であり、遺伝子対の第２のメンバーがＬＲＲＣ４Ｂである、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  30. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＴＲＨＤＥである、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  31. 遺伝子対の第１のメンバーがＣＴＬＡ４であり、遺伝子対の第２のメンバーがＰＣＤＨＧＢ４である、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  32. 遺伝子対の第１のメンバーがＣＴＬＡ４であり、遺伝子対の第２のメンバーがＦＡＭ２００Ａである、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  33. 遺伝子対の第１のメンバーがＣＡ１２であり、遺伝子対の第２のメンバーがＳＩＧＬＥＣ６である、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  34. 遺伝子対の第１のメンバーがＩＬＤＲ２であり、遺伝子対の第２のメンバーがＣＬＥＣ１２Ｂである、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  35. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＩＴＬＮ１である、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  36. 遺伝子対の第１のメンバーがＣＡＤＭ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＣＲＴＡＭである、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 遺伝子対の第１のメンバーがＣＤ７９Ｂであり、遺伝子対の第２のメンバーがＣＤ２４４である、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  38. 遺伝子対の第１のメンバーがＤＡＧ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＥＦＮＢ１である、請求項１～５及び９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  39. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＥＶＣ２である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  40. 遺伝子対の第１のメンバーがＧＰＣ４であり、遺伝子対の第２のメンバーがＦＧＦＲＬ１である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  41. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーがＥＰＨＢ４である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  42. 遺伝子対の第１のメンバーがＰＴＰＲＤであり、遺伝子対の第２のメンバーがＬＲＦＮ４である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  43. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＡＱＰＥＰである、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  44. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＤＳＧ４である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  45. 遺伝子対の第１のメンバーがＬＤＬＲであり、遺伝子対の第２のメンバーがＬＩＬＲＢ５である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  46. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーがＥＰＨＢ３である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 遺伝子対の第１のメンバーがＰＬＸＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーがＳＥＭＡ４Ｇである、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  48. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＥＰＨＢ６である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  49. 遺伝子対の第１のメンバーがＦＬＴ４であり、遺伝子対の第２のメンバーがＦＬＲＴ２である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  50. 遺伝子対の第１のメンバーがＡＸＬ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＩＬ１ＲＬ１である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  51. 遺伝子対の第１のメンバーがＣＤ３２０であり、遺伝子対の第２のメンバーがＩＧＳＦ５である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  52. 遺伝子対の第１のメンバーがＣＤ５９であり、遺伝子対の第２のメンバーがＳＴＡＢ１である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  53. 遺伝子対の第１のメンバーがＣＮＴＮ３であり、遺伝子対の第２のメンバーがＰＴＰＲＧである、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  54. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＥＰＨＡ３である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  55. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＦＮＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーがＥＰＨＢ２である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  56. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＧＦであり、遺伝子対の第２のメンバーがＴＮＦＲＳＦ１１Ｂである、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 遺伝子対の第１のメンバーがＥＮＰＥＰであり、遺伝子対の第２のメンバーがＳＬＩＴＲＫ１である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  58. 遺伝子対の第１のメンバーがＦＣＧＲ３Ｂであり、遺伝子対の第２のメンバーがＥＤＡ２Ｒである、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  59. 遺伝子対の第１のメンバーがＩＬ２０ＲＡであり、遺伝子対の第２のメンバーがＣＬＥＣ１４Ａである、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  60. 遺伝子対の第１のメンバーがＩＬ６Ｒであり、遺伝子対の第２のメンバーがＢＴＮＬ９である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  61. 遺伝子対の第１のメンバーがＩＺＵＭＯ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＬＩＬＲＡ５である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  62. 遺伝子対の第１のメンバーがＮＧＦＲであり、遺伝子対の第２のメンバーがＬＲＲＴＭ３である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  63. 遺伝子対の第１のメンバーがＮＴＭであり、遺伝子対の第２のメンバーがＡＭＩＧＯ２である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  64. 遺伝子対の第１のメンバーがＰＣＤＨＢ３であり、遺伝子対の第２のメンバーがＩＧＳＦ１１である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  65. 遺伝子対の第１のメンバーがＰＴＧＦＲＮであり、遺伝子対の第２のメンバーがＴＭＥＭ５９Ｌである、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  66. 遺伝子対の第１のメンバーがＴＲＥＭ１であり、遺伝子対の第２のメンバーがＶＳＩＧ８である、請求項６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  67. ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストが、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、ＰＤ－１結合アンタゴニスト及びＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストからなる群から選択される、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストがＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストである、請求項６７に記載の方法。
  69. ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストが、ＰＤ－Ｌ１の、そのリガンド結合パートナーのうちの１つ又は複数への結合を阻害する、請求項６８に記載の方法。
  70. ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストが、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害する、請求項６８に記載の方法。
  71. ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストが、ＰＤ－Ｌ１のＢ７－１への結合を阻害する、請求項６８に記載の方法。
  72. ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストが、ＰＤ－Ｌ１の、ＰＤ－１及びＢ７－１の両方への結合を阻害する、請求項６８に記載の方法。
  73. ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストが、抗体又はその抗原結合断片である、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 抗体が、アテゾリズマブ、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
  75. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、以下の超可変領域：
    （ａ）ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨのＨＶＲ－Ｈ１配列（配列番号１９）；
    （ｂ）ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧのＨＶＲ－Ｈ２配列（配列番号２０）；
    （ｃ）ＲＨＷＰＧＧＦＤＹのＨＶＲ－Ｈ３配列（配列番号２１）；
    （ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡのＨＶＲ－Ｌ１配列（配列番号２２）；
    （ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳのＨＶＲ－Ｌ２配列（配列番号２３）；及び
    （ｆ）ＱＱＹＬＹＨＰＡＴのＨＶＲ－Ｌ３配列（配列番号２４）
    を含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は
    （ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメイン
    を含む、請求項７４又は７５に記載の方法。
  77. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は
    （ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメイン
    を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は
    （ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメイン
    を含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は
    （ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメイン
    を含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は
    （ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメイン
    を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン；又は
    （ｃ）（ａ）に記載のＶＨドメインと（ｂ）に記載のＶＬドメイン
    を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
    を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体がアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である、請求項８２に記載の方法。
  84. ＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニストがＰＤ－１結合アンタゴニストである、請求項６７に記載の方法。
  85. ＰＤ－１結合アンタゴニストが、ＰＤ－１の、そのリガンド結合パートナーのうちの１つ又は複数への結合を阻害する、請求項８４に記載の方法。
  86. ＰＤ－１結合アンタゴニストが、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する、請求項８５に記載の方法。
  87. ＰＤ－１結合アンタゴニストが、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ２への結合を阻害する、請求項８５に記載の方法。
  88. ＰＤ－１結合アンタゴニストが、ＰＤ－１の、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方への結合を阻害する、請求項８５に記載の方法。
  89. ＰＤ－１結合アンタゴニストが、抗体又はその抗原結合断片である、請求項８５～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 抗体が、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペムブロリズマブ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ－１０８からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
  91. ＰＤ－１結合アンタゴニストがＦｃ融合タンパク質である、請求項８５～８８のいずれか一項に記載の方法。
  92. ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
  93. ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療から利益を得る可能性のあるがんを有する個体を同定する方法であって、前記個体からの試料中のポドプラニン（ＰＤＰＮ）の発現レベルを決定することを含み、ここで、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療から利益を得る可能性がある個体として前記個体を同定する、方法。
  94. がんを有する個体に対する治療法を選択する方法であって、前記個体からの試料中のＰＤＰＮの発現レベルを決定することを含み、ここで、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、ＣＤ１７７活性のアゴニストを含む治療から利益を得る可能性がある個体として前記個体を同定する、方法。
  95. 個体は、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る試料中のＰＤＰＮの発現レベルを有し、方法は、ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与することをさらに含む、請求項９３又は９４に記載の方法。
  96. がんを有する個体を治療する方法であって、
    （ａ）個体からの試料中のＰＤＰＮの発現レベルを決定することであって、試料中のＰＤＰＮの発現レベルが参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回る、決定すること；及び
    （ｂ）ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与すること
    を含む、方法。
  97. がんを有する個体を治療する方法であって、ＣＤ１７７活性のアゴニストの有効量を個体に投与することを含み、ここで、個体からの試料中のＰＤＰＮの発現レベルは、参照ＰＤＰＮ発現レベルを上回ると決定されている、方法。
  98. ＣＤ１７７活性がＰＤＰＮの阻害である、請求項９２～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 個体からの試料が、腫瘍組織試料又は腫瘍流体試料である、請求項９３～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 腫瘍組織試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、アーカイブ試料、新鮮な試料、又は凍結試料である、請求項９９に記載の方法。
  101. 試料中のＰＤＰＮの発現レベルが、ＰＤＰＮのタンパク質発現レベル又はＰＤＰＮのＲＮＡ発現レベルである、請求項９３～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 試料中のＰＤＰＮの発現レベルがＰＤＰＮのＲＮＡ発現レベルである、請求項１０１に記載の方法。
  103. ＰＤＰＮのＲＮＡ発現レベルが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲ若しくはＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、ＦＩＳＨ、又はそれらの組み合わせによって決定される、請求項１０２に記載の方法。
  104. 参照ＰＤＰＮ発現レベルが、がんを有する個体の集団におけるＰＤＰＮの発現レベルである、請求項９３～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. がんが、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、頭頸部の扁平上皮癌、又は神経膠腫である、請求項１０４に記載の方法。
  106. 参照ＰＤＰＮ発現レベルが、集団における発現レベルの５０パーセンタイルである、請求項１０４又は１０５に記載の方法。
  107. 参照ＰＤＰＮ発現レベルが、集団における発現レベルの６６パーセンタイルである、請求項１０４又は１０５に記載の方法。
  108. 参照ＰＤＰＮ発現レベルが、事前に割り当てられたＰＤＰＮ発現レベルである、請求項９３～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. がんが、ＣＲＣ、頭頸部の扁平上皮癌、又は神経膠腫である、請求項９２～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. がんがＣＲＣである、請求項１０９に記載の方法。
  111. ＣＲＣがステージＩＩのＣＲＣである、請求項１１０に記載の方法。
  112. ＣＲＣがステージＩＶのＣＲＣである、請求項１１０に記載の方法。
  113. 利益が、ＣＤ１７７活性のアゴニストなしの治療と比較して、個体の無再発生存期間（ＲＦＳ）の延長を含む、請求項９３～９５及び９８～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. ＣＤ１７７活性のアゴニストが、アゴニストの非存在下での２つのタンパク質の結合と比較して、ＰＤＰＮとＣＤ１７７の結合の増加をもたらす、請求項９２～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. ＣＤ１７７活性のアゴニストが、ＣＤ１７７活性のアゴニストの非存在下での下流活性と比較して、ＰＤＰＮの下流活性に変化をもたらす、請求項９２～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 下流活性の変化が、腫瘍増殖の減少である、請求項１１５に記載の方法。
  117. 下流活性の変化が、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）収縮性の減少である、請求項１１５に記載の方法。
  118. ＣＤ１７７活性のアゴニストが、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、又は模倣物である、請求項９２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. ＣＤ１７７活性のアゴニストがペプチドである、請求項１１８に記載の方法。
  120. ペプチドがＣＤ１７７ペプチドである、請求項１１９に記載の方法。
  121. ＣＤ１７７ペプチドがＣＤ１７７の細胞外ドメインである、請求項１２０に記載の方法。
  122. ペプチドが多量化されている、請求項１２１に記載の方法。
  123. ペプチドが四量体化されている、請求項１２２に記載の方法。
  124. ペプチドがストレプトアビジンを使用して四量体化されている、請求項１２３に記載の方法。
  125. ＣＤ１７７活性のアゴニストが、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１１８に記載の方法。
  126. 抗体又はその抗原結合断片がＰＤＰＮに結合する、請求項１２５に記載の方法。
  127. 抗体又はその抗原結合断片が、アンタゴニスト抗体又はその抗原結合断片である、請求項１２６に記載の方法。
  128. 抗体又はその抗原結合断片がＣＤ１７７に結合する、請求項１２５に記載の方法。
  129. 抗体又はその抗原結合断片が、アゴニスト抗体又はその抗原結合断片である、請求項１２８に記載の方法。
  130. 抗原結合断片が、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項１１８及び１２５～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 個体がヒトである、請求項１～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. ポリペプチドのコレクションであって、各ポリペプチドが、細胞外ドメイン、タグ、及びアンカーを含み、ポリペプチドのコレクションが、表７のタンパク質のうちの少なくとも８１％の細胞外ドメインを含む、ポリペプチドのコレクション。
  133. ポリペプチドのコレクションが、表７のタンパク質のうちの少なくとも８５％の細胞外ドメインを含む、請求項１３２に記載の方法。
  134. ポリペプチドのコレクションが、表７のタンパク質のうちの少なくとも９０％の細胞外ドメインを含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. ポリペプチドのコレクションが、表７のタンパク質のうちの少なくとも９５％の細胞外ドメインを含む、請求項１３４に記載の方法。
  136. ポリペプチドのコレクションが、表７の全てのタンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項１３５に記載の方法。
  137. アンカーが、細胞外ドメインを細胞の原形質膜の表面に係留することができる、請求項１３２～１３６のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクション。
  138. アンカーがグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ポリペプチドである、請求項１３２～１３７のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクション。
  139. タグを直接的又は間接的に視覚化することができる、請求項１３２～１３８のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクション。
  140. タグが、抗体又は抗体断片を使用して検出することができる部分を含む、請求項１３９に記載のポリペプチドのコレクション。
  141. タグが糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）ポリペプチドである、請求項１３９又は１４０に記載のポリペプチドのコレクション。
  142. タグが蛍光タンパク質を含む、請求項１３９に記載のポリペプチドのコレクション。
  143. 細胞外ドメインが天然のコンホメーションを有する、請求項１３２～１４２のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクション。
  144. 細胞外ドメインが天然の翻訳後修飾を含む、請求項１３２～１４３のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクション。
  145. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３７～１４４のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクション。
  146. 細胞がＣＯＳ７細胞である、請求項１４５に記載のポリペプチドのコレクション。
  147. 細胞がポリペプチドをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトされている、請求項１３７～１４６のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクション。
  148. 請求項１３２～１４７のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクションをコードするベクターのコレクション。
  149. 請求項１４８に記載のベクターのコレクションを含む細胞のコレクション。
  150. 複数の細胞が、請求項１３２～１４７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを発現することができ、任意選択で、異なる細胞が異なるポリペプチドを発現する、請求項１４９に記載の細胞のコレクション。
  151. 前記ポリペプチドの１つ又は複数のそれぞれが、１つ又は複数の固体表面上の別個の位置に固定化されている、請求項１３２～１４７のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクション。
  152. タンパク質間相互作用を同定するための方法であって、
    （ａ）請求項１３２～１４７のいずれか一項に記載のポリペプチドのコレクションを提供し、任意選択で、前記ポリペプチドが１つ又は複数の固体表面に固定化される、提供すること；
    （ｂ）多量体化されたクエリタンパク質とポリペプチドの細胞外ドメインの少なくとも１つとの結合を可能にする条件下で、工程（ａ）のコレクションを多量体化されたクエリタンパク質と接触させること；及び
    （ｃ）多量体化されたクエリタンパク質と少なくとも１つの細胞外ドメインとの間の相互作用を検出し、それによってタンパク質間相互作用を同定すること
    を含む方法。
  153. 前記ポリペプチドのうちの１つ又は複数がそれぞれ、前記１つ又は複数の固体表面上の別個の位置に固定化されている、請求項１５２に記載の方法。
  154. 別個の位置が、ポリペプチドを提示する細胞を含む、請求項１５２又は１５３に記載の方法。
  155. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１５４に記載の方法。
  156. 接触工程が半自動化されている、請求項１５２～１５５のいずれか一項に記載の方法。
  157. 相互作用を検出することが、固体表面上の位置で、閾値レベルを上回るシグナル、任意選択で蛍光シグナルを検出することを含む、請求項１５２～１５６のいずれか一項に記載の方法。
  158. 検出が自動化されている、請求項１５７に記載の方法。
  159. 相互作用が一過性の相互作用である、請求項１５２～１５８のいずれか一項に記載の方法。
  160. 相互作用が低親和性相互作用である、請求項１５２～１５９のいずれか一項に記載の方法。
  161. 低親和性相互作用がマイクロモル親和性相互作用である、請求項１６０に記載の方法。
  162. 多量体化されたクエリタンパク質が、二量体化、三量体化、四量体化、又は五量体化されたクエリタンパク質である、請求項１５２～１６１のいずれか一項に記載の方法。
  163. 多量体化されたクエリタンパク質が、四量体化されたクエリタンパク質である、請求項１６２に記載の方法。
  164. 多量体化されたクエリタンパク質が、クエリタンパク質の単離された細胞外ドメインを含む、請求項１５２～１６３のいずれか一項に記載の方法。
  165. クエリタンパク質の単離された細胞外ドメインが、ビオチン化され、蛍光ストレプトアビジンにコンジュゲートされて、クエリタンパク質を四量体化する、請求項１６４に記載の方法。
  166. 表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、
    （ａ）候補モジュレーターを提供すること；
    （ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、接触させること；及び
    （ｃ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少は、候補モジュレーターを表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターとして同定する、測定すること
    を含む方法。
  167. 表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
    （ａ）候補モジュレーターを提供すること；
    （ｂ）表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表１のタンパク質を表２のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、接触させること；及び
    （ｃ）表１のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化は、候補モジュレーターを表１のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、測定すること
    を含む方法。
  168. 表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
    （ａ）候補モジュレーターを提供すること；
    （ｂ）表２のタンパク質の表１のタンパク質への結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下で表２のタンパク質を表１のタンパク質と接触させることであって、表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用することが報告されている、接触させること；及び
    （ｃ）表２のタンパク質の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化は、候補モジュレーターを表２のタンパク質の下流活性のモジュレーターとして同定する、測定すること
    を含む方法。
  169. 結合の増加又は減少が、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも７０％である、請求項１６６に記載の方法。
  170. モジュレーターが、表１又は表２のタンパク質の下流活性の阻害剤である、請求項１６７又は１６８に記載の方法。
  171. モジュレーターが、表１又は表２のタンパク質の下流活性の活性化因子である、請求項１６７又は１６８に記載の方法。
  172. 下流活性の変化が、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である、請求項１６７又は１６８に記載の方法。
  173. 下流活性の変化が、下流活性の量、強度、又は持続時間の増加である、請求項１６７又は１６８に記載の方法。
  174. モジュレーターが、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  175. 抗原結合断片が、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項１７４に記載の方法。
  176. 抗体又はその抗原結合断片が、表１のタンパク質に結合する、請求項１７４に記載の方法。
  177. 抗体又はその抗原結合断片が、表２のタンパク質に結合する、請求項１７４に記載の方法。
  178. 表１のタンパク質がポドプラニン（ＰＤＰＮ）である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  179. 表２のタンパク質がＣＤ１７７である、請求項１７８に記載の方法。
  180. 下流活性が、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）収縮性である、請求項１７８又は１７９に記載の方法。
  181. ＣＡＦ収縮性が、モジュレーターの存在下で減少する、請求項１８０に記載の方法。
  182. ＣＡＦ収縮性が、ゲル収縮アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する、請求項１８１に記載の方法。
  183. ＣＡＦ収縮性が、３Ｄゲル伸長アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する、請求項１８２に記載の方法。
  184. 下流活性が腫瘍増殖である、請求項１７８又は１７９に記載の方法。
  185. 腫瘍増殖が、モジュレーターの存在下で減少する、請求項１８４に記載の方法。
  186. 腫瘍増殖が、腫瘍増殖アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する、請求項１８５に記載の方法。
  187. モジュレーターが、ＰＤＰＮを標的とする抗体又はその抗原結合断片である、請求項１７８～１８６のいずれか一項に記載の方法。
  188. モジュレーターが、ＣＤ１７７を標的とする抗体又はその抗原結合断片である、請求項１７８～１８６のいずれか一項に記載の方法。
  189. 表１のタンパク質がＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  190. 表２のタンパク質がＥＰＨＡ３である、請求項１８９に記載の方法。
  191. 表１のタンパク質がＰＤ－Ｌ２（ＰＤＣＤ１ＬＧ２）である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  192. 表２のタンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ４、ＩＣＡＭ５、ＮＥＣＴＩＮ３、ＰＳＧ９、又はＴＮＦＲＳＦ１１Ａである、請求項１９１に記載の方法。
  193. 表２のタンパク質がＣＥＡＣＡＭ４である、請求項１９２に記載の方法。
  194. 下流活性が免疫チェックポイント阻害である、請求項１８９～１９３のいずれか一項に記載の方法。
  195. 免疫チェックポイント阻害が、モジュレーターの存在下で減少する、請求項１９４に記載の方法。
  196. 免疫チェックポイント阻害が、細胞ベースのアッセイで測定して、少なくとも３０％減少する、請求項１９５に記載の方法。
  197. 表１のタンパク質がＰＴＰＲＤである、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  198. ＰＴＰＲＤが、Ｇ２０３Ｅ及びＫ２０４Ｅ；Ｒ２３２Ｃ及びＲ２３３Ｃ；Ｐ２４９Ｌ；Ｇ２８５Ｅ；Ｅ４０６Ｋ；Ｓ４３１Ｌ；Ｒ５６１Ｑ；Ｐ６６６Ｓ；Ｅ７５５Ｋ；Ｖ８９２Ｉ；Ｓ９１２Ｆ；Ｒ９９５Ｃ；又はＲ１０８８Ｃアミノ酸置換変異又はΔＧ６１ΔＥ１０６アミノ酸欠失変異を含む、請求項１９７に記載の方法。
  199. 表２のタンパク質が、ＢＭＰ５、ＣＥＡＣＡＭ３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＥＣＴ１、ＬＲＦＮ５、ＳＩＲＰＧ、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、ＳＬＩＴＲＫ６、又はＴＧＦＡである、請求項１９７又は１９８に記載の方法。
  200. 下流活性が細胞増殖の抑制である、請求項１９７～１９９のいずれか一項に記載の方法。
  201. 細胞増殖の抑制が、モジュレーターの存在下で増加する、請求項２００に記載の方法。
  202. 細胞増殖の抑制が、コロニー形成アッセイで測定して、少なくとも３０％増加する、請求項２０１に記載の方法。
  203. 下流活性がＳＴＡＴ３リン酸化の抑制である、請求項１９７～１９９のいずれか一項に記載の方法。
  204. ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制が、モジュレーターの存在下で増加する、請求項２０３に記載の方法。
  205. ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制が、リン酸化ＳＴＡＴ３のウエスタンブロットで測定して、少なくとも３０％増加する、請求項２０４に記載の方法。
  206. 表１のタンパク質がＰＴＰＲＳである、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  207. 表２のタンパク質が、Ｃ６ｏｒｆ２５、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＬＲＦＮ１、ＬＲＦＮ５、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＮＣＡＭ１、ＳＬＩＴＲＫ１、ＳＬＩＴＲＫ２、ＳＬＩＴＲＫ３、ＳＬＩＴＲＫ４、又はＳＬＩＴＲＫ６である、請求項２０６に記載の方法。
  208. 表１のタンパク質がＰＴＰＲＦである、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  209. 表２のタンパク質が、ＣＤ１７７、ＩＬ１ＲＡＰ、又はＬＲＦＮ５である、請求項２０８に記載の方法。
  210. 下流活性が細胞遊走の阻害である、請求項２０６～２０９のいずれか一項に記載の方法。
  211. 細胞遊走の阻害が、モジュレーターの存在下で増加する、請求項２１０に記載の方法。
  212. 細胞遊走の阻害が、少なくとも２０％増加する、請求項２１１に記載の方法。
  213. 下流活性がＥＧＦＲのリン酸化である、請求項２０６～２０９のいずれか一項に記載の方法。
  214. ＥＧＦＲのリン酸化がジュレーターの存在下で減少する、請求項２１３に記載の方法。
  215. ＥＧＦＲのリン酸化が、ＥＧＦＲのリン酸化のアッセイで測定して、少なくとも３０％減少する、請求項２１４に記載の方法。
  216. 表１のタンパク質がＣＨＬ１である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  217. 表２のタンパク質が、ＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ５、ＳＩＲＰＡ、Ｌ１ＣＡＭ、又はＴＭＥＭ１３２Ａである、請求項２１６に記載の方法。
  218. 下流活性が腫瘍形成の抑制である、請求項２１６又は２１７に記載の方法。
  219. 腫瘍形成の抑制が、モジュレーターの存在下で増加する、請求項２１８に記載の方法。
  220. 腫瘍形成の抑制が、少なくとも２０％増加する、請求項２１９に記載の方法。
  221. 表１のタンパク質がＣＮＴＮ１である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  222. 表２のタンパク質が、ＣＤＨ６、ＣＨＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＰＣＤＨＢ７、又はＳＧＣＧである、請求項２２１に記載の方法。
  223. 下流活性が、細胞増殖又は細胞浸潤である、請求項２２１又は２２２に記載の方法。
  224. 細胞増殖又は細胞浸潤が、モジュレーターの存在下で減少する、請求項２２３に記載の方法。
  225. 細胞増殖が、コロニー形成アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する、請求項２２４に記載の方法。
  226. 細胞浸潤が、ゲル浸潤アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する、請求項２２４に記載の方法。
  227. 表１のタンパク質がＬＩＬＲＢ１である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  228. 表２のタンパク質が、ＣＬＥＣ６Ａ、ＣＸＡＤＲ、ＥＤＡＲ、ＦＬＴ４、ＩＬ６Ｒ、ＩＬＤＲ１、又はＬＩＬＲＡ５である、請求項２２７に記載の方法。
  229. 下流活性が食作用の抑制である、請求項２２７又は２２８に記載の方法。
  230. 食作用の抑制が、モジュレーターの存在下で減少する、請求項２２９に記載の方法。
  231. 食作用の抑制が、少なくとも２０％減少する、請求項２３０に記載の方法。
  232. 表１のタンパク質がＬＩＬＲＢ２である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  233. 表２のタンパク質がＩＧＳＦ８又はＭＯＧである、請求項２３２に記載の方法。
  234. 表１のタンパク質がＬＩＬＲＢ３である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  235. 表２のタンパク質がＬＲＲＣ１５又はＬＹ６Ｇ６Ｆである、請求項２３４に記載の方法。
  236. 表１のタンパク質がＬＩＬＲＢ４である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  237. 表２のタンパク質がＣＮＴＦＲである、請求項２３６に記載の方法。
  238. 表１のタンパク質がＬＩＬＲＢ５である、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  239. 表２のタンパク質が、ＡＰＬＰ２、ＣＤ１７７、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＣＬＥＣＳＦ１３、ＬＤＬＲ、ＰＩＬＲＡ、又はＵＮＣ５Ｃである、請求項２３８に記載の方法。
  240. 表２のタンパク質がＬＤＬＲである、請求項２３９に記載の方法。
  241. 下流活性が破骨細胞分化である、請求項２２７、２２８、及び２３４～２４０のいずれか一項に記載の方法。
  242. 破骨細胞分化が、モジュレーターの存在下で少なくとも２０％減少する、請求項２４１に記載の方法。
  243. 破骨細胞分化が、ＴＲＡＰ＋多核細胞のアッセイで測定される、請求項２４２に記載の方法。
  244. 表１のタンパク質がＡＸＬである、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  245. 表２のタンパク質がＩＬ１ＲＬ１又はＶＳＩＧ１０Ｌである、請求項２４４に記載の方法。
  246. 下流活性が、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２経路の活性化、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の活性化、細胞遊走、糸状仮足の形成、又はＡＸＬのリン酸化である、請求項２４４又は２４５に記載の方法。
  247. 細胞遊走が、ゲル浸潤アッセイで測定して、少なくとも２０％減少する、請求項２４６に記載の方法。
  248. 表１のタンパク質がＬＲＲＣ４Ｂである、請求項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  249. 表２のタンパク質がＢＴＮ３Ａ１又はＢＴＮ３Ａ３である、請求項２４８に記載の方法。
  250. 表１のタンパク質又は表２のタンパク質の発現が、健常組織と比較して腫瘍組織においてアップレギュレート又はダウンレギュレートされる、請求項１６６～２４９のいずれか一項に記載の方法。
  251. 表１のタンパク質と表２のタンパク質との間の相互作用の単離されたモジュレーターであって、
    ｉ．表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用すると報告され；且つ
    ｉｉ．モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での結合と比較して、表１のタンパク質の表２のタンパク質への結合の増加又は減少を引き起こす
    単離されたモジュレーター。
  252. 表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の単離されたモジュレーターであって、
    ｉ．表１のタンパク質及び表２のタンパク質は、表３において相互作用すると報告され；且つ
    ｉｉ．モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での下流活性と比較して、表１のタンパク質又は表２のタンパク質の下流活性の変化を引き起こす
    単離されたモジュレーター。
  253. 結合の増加又は減少が、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、少なくとも７０％である、請求項２５１に記載のモジュレーター。
  254. モジュレーターが、表１又は表２のタンパク質の下流活性の阻害剤である、請求項２５１又は２５２に記載のモジュレーター。
  255. モジュレーターが、表１又は表２のタンパク質の下流活性の活性化因子である、請求項２５１又は２５２に記載のモジュレーター。
  256. 下流活性の変化が、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である、請求項２５２に記載のモジュレーター。
  257. 下流活性の変化が、下流活性の量、強度、又は持続時間の増加である、請求項２５２に記載のモジュレーター。
  258. モジュレーターが、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、又は模倣物である、請求項２５１～２５７のいずれか一項に記載のモジュレーター。
  259. 抗原結合断片が、ｂｉｓ－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項２５８に記載のモジュレーター。
  260. 抗体又はその抗原結合断片が、表１のタンパク質に結合する、請求項２５９に記載のモジュレーター。
  261. 抗体又はその抗原結合断片が、表２のタンパク質に結合する、請求項２５９に記載のモジュレーター。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CA3201626A1 (en) * 2020-12-01 2022-06-09 Genentech, Inc. Biological vesicles displaying cell surface proteins and methods related to same
TW202306979A (zh) 2021-05-26 2023-02-16 美商建南德克公司 調節人類巨細胞病毒與宿主細胞表面交互作用之方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
EP1141708A1 (en) 1998-12-28 2001-10-10 Sunesis Pharmaceuticals Inc. Identifying small organic molecule ligands for binding
IL149809A0 (en) 1999-12-15 2002-11-10 Genentech Inc Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP1896582A4 (en) 2005-05-09 2009-04-08 Ono Pharmaceutical Co HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES FOR PROGRAMMED DEATH 1 (MP-1) AND METHODS FOR TREATING CANCER USING ANTI-MP-1 ANTIBODIES ALONE OR ASSOCIATED WITH OTHER IMMUNOTHERAPIES
CA2612241C (en) 2005-07-01 2018-11-06 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
US8679490B2 (en) 2005-11-07 2014-03-25 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP2262837A4 (en) 2008-03-12 2011-04-06 Merck Sharp & Dohme PD-1 BINDING PROTEINS
KR20110074850A (ko) 2008-08-25 2011-07-04 앰플리뮨, 인크. Ｐｄ-１ 길항제 및 그의 사용 방법
HRP20240240T1 (hr) 2008-12-09 2024-04-26 F. Hoffmann - La Roche Ag Protutijela anti-pd-l1 i njihova uporaba za poboljšanje funkcije t-stanice
LT3279215T (lt) 2009-11-24 2020-04-10 Medimmune Limited Tiksliniai surišantys agentai prieš b7-h1
JP2013512251A (ja) 2009-11-24 2013-04-11 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−ｌ１／ｐｄ−ｌ２の同時阻害
US10017572B2 (en) 2015-09-25 2018-07-10 Genentech, Inc. Anti-tigit antibodies and methods of use
US20190209652A1 (en) * 2016-09-23 2019-07-11 Oncosec Medical Incorporated Modulating responses to checkpoint inhibitor therapy
ES2953595T3 (es) * 2017-03-01 2023-11-14 Hoffmann La Roche Procedimientos diagnósticos y terapéuticos para el cáncer

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