JP2024521783A - ヒトサイトメガロウイルスとの宿主細胞表面相互作用を調節するための方法 - Google Patents
ヒトサイトメガロウイルスとの宿主細胞表面相互作用を調節するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024521783A JP2024521783A JP2023572765A JP2023572765A JP2024521783A JP 2024521783 A JP2024521783 A JP 2024521783A JP 2023572765 A JP2023572765 A JP 2023572765A JP 2023572765 A JP2023572765 A JP 2023572765A JP 2024521783 A JP2024521783 A JP 2024521783A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pentamer
- hcmv
- modulator
- binding
- infection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 title claims abstract description 313
- 230000003993 interaction Effects 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 87
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title description 115
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 61
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 198
- 108090000770 Neuropilin-2 Proteins 0.000 claims description 160
- 102000004213 Neuropilin-2 Human genes 0.000 claims description 159
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 claims description 134
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 claims description 134
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 claims description 115
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 claims description 115
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 claims description 63
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 59
- 101150082158 UL128 gene Proteins 0.000 claims description 48
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 48
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 43
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 43
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 43
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 43
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 38
- 101150088904 UL130 gene Proteins 0.000 claims description 35
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 31
- 101100315698 Human cytomegalovirus (strain Merlin) UL131A gene Proteins 0.000 claims description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 26
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 26
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 22
- 150000003384 small molecules Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 claims description 15
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 12
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 12
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 claims description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 11
- 239000004109 brown FK Substances 0.000 claims description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims description 9
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 8
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 45
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 46
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 28
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 23
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 12
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 12
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 12
- 102100039384 Huntingtin-associated protein 1 Human genes 0.000 description 11
- 101710140977 Huntingtin-associated protein 1 Proteins 0.000 description 11
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 11
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 11
- 102000004207 Neuropilin-1 Human genes 0.000 description 11
- 108090000772 Neuropilin-1 Proteins 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- -1 N-substituted hydrazine Chemical class 0.000 description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 5
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 101000961414 Homo sapiens Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 4
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 4
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 4
- 238000011374 additional therapy Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000000503 lectinlike effect Effects 0.000 description 4
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 102000012547 Olfactory receptors Human genes 0.000 description 3
- 108050002069 Olfactory receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 3
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 3
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000005101 cell tropism Effects 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 108010041898 cytomegalovirus receptor Proteins 0.000 description 3
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000002094 self assembled monolayer Substances 0.000 description 3
- 239000013545 self-assembled monolayer Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 2
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002005 protein protein interaction detection Methods 0.000 description 2
- 238000002762 protein-protein interaction assay Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine Chemical compound C1CSCN1 OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ANABEPYNUPWXTC-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]-13-sulfanyltridecan-2-ol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCC(O)CCCCCCCCCCCS ANABEPYNUPWXTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxychromen-4-one Chemical compound C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMSODMZESSGVBE-UHFFFAOYSA-N 2-Oxazoline Chemical compound C1CN=CO1 IMSODMZESSGVBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701021 Betaherpesvirinae Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037373 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 241000630627 Diodella Species 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000272186 Falco columbarius Species 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710088570 Flagellar hook-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001124191 Homo sapiens Neuropilin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000763314 Homo sapiens Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 101000800821 Homo sapiens Transforming growth factor beta receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 101900039244 Human cytomegalovirus Envelope glycoprotein UL130 Proteins 0.000 description 1
- 101900003124 Human cytomegalovirus Envelope protein UL128 Proteins 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 101150106321 Nrp2 gene Proteins 0.000 description 1
- WYNCHZVNFNFDNH-UHFFFAOYSA-N Oxazolidine Chemical compound C1COCN1 WYNCHZVNFNFDNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 229940099471 Phosphodiesterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 102000001393 Platelet-Derived Growth Factor alpha Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010068588 Platelet-Derived Growth Factor alpha Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010007100 Pulmonary Surfactant-Associated Protein A Proteins 0.000 description 1
- 102100027773 Pulmonary surfactant-associated protein A2 Human genes 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012952 Resampling Methods 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102100033663 Transforming growth factor beta receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 108010022164 acetyl-LDL Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 150000008052 alkyl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000001502 aryl halides Chemical class 0.000 description 1
- 125000005228 aryl sulfonate group Chemical group 0.000 description 1
- 229940090047 auto-injector Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- RICLFGYGYQXUFH-UHFFFAOYSA-N buspirone hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].C1C(=O)N(CCCCN2CCN(CC2)C=2N=CC=CN=2)C(=O)CC21CCCC2 RICLFGYGYQXUFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N carbonyl dihydrazine Chemical compound NNC(=O)NN XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 150000008049 diazo compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 150000002081 enamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000286 energy filtered transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000026502 entry into host cell Effects 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 101150055782 gH gene Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000051206 human THBD Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000015227 human neuropilin-2 Human genes 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 201000003723 learning disability Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007474 nonparametric Mann- Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002571 phosphodiesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000004879 pulmonary tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 102200048773 rs2224391 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 150000007659 semicarbazones Chemical class 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- CBDKQYKMCICBOF-UHFFFAOYSA-N thiazoline Chemical compound C1CN=CS1 CBDKQYKMCICBOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003555 thioacetals Chemical class 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000008478 viral entry into host cell Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
- G01N2333/04—Varicella-zoster virus
- G01N2333/045—Cytomegalovirus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染を治療又は予防する方法であって、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体と原形質膜発現宿主細胞タンパク質との間の相互作用を調節することを含む方法、並びにそのような相互作用のモジュレーターを同定する方法が本明細書で提供される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２６日に出願された米国特許出願第６３／１９３，５２９号及び２０２２年５月２５日に出願された米国特許出願第６３／３４５，８１１号の優先権を主張し、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年５月２６日に出願された米国特許出願第６３／１９３，５２９号及び２０２２年５月２５日に出願された米国特許出願第６３／３４５，８１１号の優先権を主張し、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２２年５月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は５０４７４－２７０ＷＯ３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿５＿２５＿２２＿ＳＴ２５であり、サイズは２４，２２３バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２２年５月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は５０４７４－２７０ＷＯ３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿５＿２５＿２２＿ＳＴ２５であり、サイズは２４，２２３バイトである。
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染を治療又は予防する方法であって、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体と原形質膜発現宿主細胞タンパク質との間の相互作用を調節することを含む方法、並びにそのような相互作用のモジュレーターを同定する方法が本明細書で提供される。
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のベータヘルペスウイルス（Ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）亜科のメンバーであり、ヒト集団の７０％超において生涯感染を確立する。一次感染後、ＨＣＭＶは潜在性になり、その再活性化は、免疫抑制されているか、又は臓器若しくは造血幹細胞（ＨＳＣ）移植を受けている個体において重篤な罹患率及び死亡率を引き起こす。ＨＣＭＶは、胎盤関門を通過して胎児に感染する能力のために、妊娠中に特に脅威となる。ＨＣＭＶ感染は、新生児の０．３％～２．３％が罹患し、脳損傷、難聴、学習障害、心疾患及び精神遅滞を含む先天性出生時欠損の主要なウイルス原因となる。これらの理由から、ＨＣＭＶは、医学研究所によって最優先の疾患標的として特定されている。有効な抗ウイルス治療薬又はワクチンは、宿主細胞へのウイルス侵入を含むＨＣＭＶ感染サイクルの初期段階を標的とすべきである。ＨＣＭＶは、２つのｇＨｇＬエンベロープ糖タンパク質複合体、ｇＨｇＬｇＯ（三量体）及びｇＨｇＬｐＵＬ１２８－１３１Ａ（五量体）、並びに糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）を含むいくつかのエンベロープ糖タンパク質複合体を使用して、異なる細胞株に入る。細胞宿主受容体へのＨＣＭＶ三量体又は五量体結合は、まだ同定されていない機構を介して、ＨＣＭＶ糖タンパク質ｇＢがウイルスと感染細胞との間の膜融合を触媒するためのトリガーシグナルを提供する。この融合は、ＨＣＭＶが細胞に侵入し、複製し、その潜伏期間を確立することを可能にする。
過去数十年の間に、ＨＣＭＶ感染に対するワクチン候補を開発するための重要な努力が確立されてきた。しかしながら、最近の臨床試験からの結果は、ＨＣＭＶワクチンがウイルス感染の予防において中程度の有効性しか示さなかったことを示した。したがって、ＨＣＭＶに対する有効な治療薬の開発は、重要な満たされていない医学的必要性を表す。
一態様では、本開示は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供すること；（ｂ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体をＢ２Ｍと接触させること；及び（ｃ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少が、候補モジュレーターをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとの間の相互作用のモジュレーターとして同定する、Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を測定することを含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供すること；（ｂ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体をＢ２Ｍと接触させること；及び（ｃ）ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化が、候補モジュレーターをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性を測定することを含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、Ｂ２Ｍの下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供すること；（ｂ）ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＢ２Ｍの結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＢ２ＭをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体と接触させること；及び（ｃ）Ｂ２Ｍの下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化が、候補モジュレーターをＢ２Ｍの下流活性のモジュレーターとして同定する、Ｂ２Ｍの下流活性を測定することを含む方法を特徴とする。
いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される場合、少なくとも５０％である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体又はＢ２Ｍの下流活性の阻害剤である。
いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子，抗体若しくはその抗原結合断片，ペプチド，模倣物，又は抑制性核酸である。いくつかの態様では、抑制性核酸は、ＡＳＯ又はｓｉＲＮＡである。いくつかの態様では、抗原結合断片は、ビス－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ２Ｍに結合する。
いくつかの態様では、下流活性は、ＨＣＭＶによる細胞の感染である。いくつかの態様では、感染は、モジュレーターの存在下で減少する。いくつかの態様では、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染は少なくとも４０％減少する。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、モジュレーターは、Ｂ２Ｍに結合する抗体又はその抗原結合断片である。
別の態様では、本開示は、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のニューロピリン２（ＮＲＰ２）への結合の減少を引き起こす、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＮＲＰ２との間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ＮＲＰ２の残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９のうちの１つ若しくは複数；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｋ４７及びＲ５７の一方若しくは両方；（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｒ１９３；並びに／又は（ｄ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３１Ａサブユニットの残基Ａ１１４及びＡ１１７の一方若しくは両方に結合する、モジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ＮＲＰ２の残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９の６つすべて；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｋ４７及びＲ５７の両方；（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｒ１９３；並びに／又は（ｄ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３１Ａサブユニットの残基Ａ１１４及びＡ１１７の両方に結合する。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＮＲＰ２へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＮＲＰ２へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも９０％減少させる。
別の態様では、本開示は、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＴＨＢＤとの間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ＴＨＢＤの残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３のうちの１つ若しくは複数；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８のうちの１つ若しくは複数；並びに／又は（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１のうちの１つ若しくは複数に結合する、モジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ＴＨＢＤの残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３の１１個すべて；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８の８つすべて；並びに／又は（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１の３つすべてに結合する。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＴＨＢＤへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＴＨＢＤへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも９０％減少させる。
別の態様では、本開示は、Ｂ２ＭへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間の相互作用のモジュレーターを特徴とする。いくつかの態様では、モジュレーターは、Ｂ２ＭへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＴＨＢＤへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも９０％減少させる。
いくつかの態様では、結合の減少は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される。
いくつかの態様では、モジュレーターは、前記モジュレーターの非存在下での感染と比較して、ＨＣＭＶによる細胞の感染の減少を引き起こす。いくつかの態様では、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染は少なくとも４０％減少する。
いくつかの態様では、モジュレーターは、小分子，抗体若しくはその抗原結合断片，ペプチド，模倣物，又は抑制性核酸である。いくつかの態様では、抑制性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）又はｓｉＲＮＡである。いくつかの態様では、抗原結合断片は、ビス－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
いくつかの態様では、抗体は二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、薬学的に許容される担体をさらに含む。
別の態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を治療するための方法であって、有効量の本明細書で提供されるモジュレーターのいずれか１つを個体に投与し、それにより個体を治療することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ感染の持続期間又は重症度は、モジュレーターを投与されていない個体と比較して少なくとも４０％減少する。
別の態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防するための方法であって、有効量の本明細書で提供されるモジュレーターのいずれか１つを個体に投与し、それにより個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、個体における二次ＨＣＭＶ感染に対する予防のための方法であって、有効量の本明細書で提供されるモジュレーターのいずれか１つを個体に投与し、それにより個体における二次ＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、二次感染は、非感染組織のＨＣＭＶ感染である。
いくつかの態様では、個体は、免疫減弱状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である。
別の態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を治療するための医薬の製造における、本明細書で提供されるモジュレーターのいずれか１つの使用を特徴とする。
別の態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防するための医薬の製造における、本明細書で提供されるモジュレーターのいずれか１つの使用を特徴とする。
別の態様では、本開示は、個体における二次ＨＣＭＶ感染に対する予防のための医薬の製造における、本明細書で提供されるモジュレーターのいずれか１つの使用を特徴とする。いくつかの態様では、二次感染は、非感染組織のＨＣＭＶ感染である。
いくつかの態様では、個体は、免疫減弱状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である。
別の態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を治療する方法における使用のための本明細書で提供されるモジュレーターのいずれか１つを特徴とし、この方法は、有効量のモジュレーターを個体に投与し、それにより個体を治療することを含む。
別の態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防する方法における使用のための本明細書で提供されるモジュレーターのいずれか１つを特徴とし、この方法は、有効量のモジュレーターを個体に投与し、それにより個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む。
別の態様では、本開示は、個体における二次ＨＣＭＶ感染に対する予防の方法における使用のための本明細書で提供されるモジュレーターのいずれか１つを特徴とし、この方法は、有効量のモジュレーターを個体に投与し、それにより個体における二次ＨＣＭＶ感染を予防することを含む。いくつかの態様では、二次感染は、非感染組織のＨＣＭＶ感染である。
いくつかの態様では、個体は、免疫減弱状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である。
Ｉ．定義
別途定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記、及び他の科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図する。場合によっては、一般的に理解されている意味を有する用語が、明確にするため及び／又は参照しやすいようにするために本明細書において定義されており、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野で一般的に理解されているものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。
別途定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記、及び他の科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図する。場合によっては、一般的に理解されている意味を有する用語が、明確にするため及び／又は参照しやすいようにするために本明細書において定義されており、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野で一般的に理解されているものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。
本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者であれば容易に理解する、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書中の値又はパラメータに関する「約」の言及は、その値又はパラメータそれ自体に向けられる態様を含む（及び記述する）。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「単離されたペプチド」は、１つ又は複数の単離されたペプチドを意味する。
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記載された整数又は整数のグループの包含を意味するが、いかなる他の整数又は整数のグループの除外も意味しないことが理解されるであろう。
本明細書で互換的に使用される、「患者」、「対象」又は「個体」という用語は、ヒト患者を指す。
薬物の「静脈内」すなわち「ｉｖ」用量、投与又は製剤は、静脈を介して、例えば点滴によって投与される。
薬物の「皮下」すなわち「ｓｃ」用量、投与又は製剤は、例えば、プレフィルドシリンジ、自動注射器、又は他の装置を介して、皮膚の下に投与される。
本明細書の目的のために、「臨床状態」は、患者の健康状態を指す。例としては、患者が改善している又は悪化していることが挙げられる。一実施形態では、臨床状態は、臨床状態の順序尺度に基づく。一実施形態では、臨床状態は、患者が熱を有するか否かに基づいていない。
「有効量」は、望まれない／望ましくない副作用を上回る治療的／予防的恩恵（例えば、本明細書に記載される）をもたらすために有効な薬剤（例えば、治療剤）の量を指す。
「薬学的製剤」という用語は、１つ以上の活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象に許容できないほどに有毒である追加の成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は無菌である。一実施形態では、製剤は、静脈内（ｉｖ）投与のためのものである。別の実施形態では、製剤は、皮下（ｓｃ）投与のためのものである。
本明細書における「天然配列」タンパク質は、天然に存在するタンパク質のバリアントを含む、天然に見られるタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。本明細書で使用される用語は、その天然源から単離されるタンパク質、又は組み換え生成されるタンパク質を含む。
別途指示がない限り、本明細書で使用される用語「タンパク質」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然タンパク質を指す。この用語は、「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内での処理から生じるあらゆる形態のタンパク質を包含する。この用語はまた、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアント、例えば、アミノ酸置換変異又はアミノ酸欠失変異を包含する。この用語はまた、タンパク質の単離された領域又はドメイン、例えば、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
「単離された」タンパク質又はペプチドは、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様では、タンパク質又はペプチドは、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
本明細書で使用される場合、「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）五量体」、「ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体」、及び「ＨＣＭＶ五量体」という用語は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のウイルスエンベロープの外面に位置し、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１Ａ糖タンパク質サブユニットから構成される糖タンパク質複合体を指す。
本明細書で使用される「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＨサブユニット」、「ｇＨサブユニット」、及び「ｇＨ」という用語は、別途指示がない限り、任意のウイルス源由来の任意の天然ｇＨを広く指す。この用語は、完全長ｇＨ及びｇＨの単離された領域又はドメインを包含する。この用語は、ｇＨの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なＨＣＭＶ ｇＨのアミノ酸配列は、配列番号１として提供される。軽微な配列バリエーション、特にｇＨの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないｇＨの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＬサブユニット」、「ｇＬサブユニット」、及び「ｇＬ」という用語は、別途指示がない限り、任意のウイルス源由来の任意の天然ｇＬを広く指す。この用語は、完全長ｇＬ及びｇＬの単離された領域又はドメインを包含する。この用語は、ｇＬの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なＨＣＭＶ ｇＬのアミノ酸配列は、配列番号２として提供される。軽微な配列バリエーション、特にｇＬの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないｇＬの保存的アミノ酸置換もまた、本発明により意図される。
本明細書で使用される「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ１２８サブユニット」、「ＵＬ１２８サブユニット」、及び「ＵＬ１２８」という用語は、別途指示がない限り、任意のウイルス源由来の任意の天然ＵＬ１２８を広く指す。この用語は、完全長ＵＬ１２８及びＵＬ１２８の単離された領域又はドメインを包含する。この用語は、ＵＬ１２８の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なＨＣＭＶ ＵＬ１２８のアミノ酸配列は、配列番号３として提供される。軽微な配列差異、特にＵＬ１２８の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＵＬ１２８の保存的アミノ酸置換も、本発明により意図される。
本明細書で使用される「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ１３０サブユニット」、「ＵＬ１３０サブユニット」、及び「ＵＬ１３０」という用語は、別途指示がない限り、任意のウイルス源由来の任意の天然ＵＬ１３０を広く指す。この用語は、完全長ＵＬ１３０及びＵＬ１３０の単離された領域又はドメインを包含する。この用語は、ＵＬ１３０の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なＨＣＭＶ ＵＬ１３０のアミノ酸配列は、配列番号４として提供される。軽微な配列差異、特にＵＬ１３０の機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＵＬ１３０の保存的アミノ酸置換も、本発明により意図される。
本明細書で使用される「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ１３１Ａサブユニット」、「ＵＬ１３１Ａサブユニット」、及び「ＵＬ１３１Ａ」という用語は、別途指示がない限り、任意のウイルス源由来の任意の天然ＵＬ１３１Ａを広く指す。この用語は、完全長ＵＬ１３１Ａ及びＵＬ１３１Ａの単離された領域又はドメインを包含する。この用語は、ＵＬ１３１Ａの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なＨＣＭＶ ＵＬ１３１Ａのアミノ酸配列は、配列番号５として提供される。軽微な配列差異、特にＵＬ１３１Ａの機能及び／又は活性に影響を及ぼさないＵＬ１３１Ａの保存的アミノ酸置換も、本発明により意図される。
本明細書で使用される場合、「モジュレーター」は、所与の生物活性、例えば、相互作用又は相互作用から生じる下流活性を調節する（例えば、増加させる、減少させる、活性化する、又は阻害する）薬剤である。モジュレーター又は候補モジュレーターは、例えば、小分子、抗体（例えば、二重特異性又は多重特異性抗体）、抗原結合断片（例えば、ビス－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ、ＶＨドメイン若しくはＶＨＨドメイン）、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は抑制性核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）若しくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））であり得る。
「増加させる」又は「活性化する」とは、例えば、２０％以上、５０％以上、又は７５％、８５％、９０％、又は９５％以上の全体的な増加を引き起こす能力を意味する。一部の態様では、増加させる又は活性化するは、タンパク質間相互作用の下流活性に言及することができる。
「減少させる」又は「阻害する」とは、例えば、２０％以上、５０％以上、又は７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。一部の態様では、低減する又は阻害するは、タンパク質間相互作用の下流活性に言及することができる。
「親和性」は、分子（例えば、受容体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用される「結合親和性」は、別途指示がない限り、結合対（例えば、受容体とリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。
本明細書で使用される場合、「複合体」又は「複合体化」は、ペプチド結合ではない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス力、疎水性力、親水性力）を介して互いに相互作用する２つ以上の分子の会合を指す。一態様では、複合体は、ヘテロ多量体である。本明細書で使用される用語「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」は、タンパク質複合体中のタンパク質にコンジュゲートした非タンパク質実体（例えば、限定しないが、毒素又は検出剤等の化学分子を含む）を有する複合体を含むことを理解するべきである。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「トランスフェクトされた細胞」、「形質転換細胞」、及び「形質転換体」が含まれ、これには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。いくつかの態様では、宿主細胞は、外因性核酸で安定して形質転換される。他の態様では、宿主細胞は、外因性核酸で一過性に形質転換される。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を増殖させることのできる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定はしないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片（例えば、ビス－Ｆａｂ）を含む、種々の抗体構造を包含する。
「抗原結合断片」又は「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗原結合断片の例には、限定されないが、ビス－Ｆａｂ；Ｆｖ；Ｆａｂ；Ｆａｂ，Ｆａｂ’－ＳＨ；Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む抗体断片を指す。一部の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。単一ドメイン抗体の例には、限定されないが、ＶＨＨが含まれる。
「Ｆａｂ」断片は、抗体のパパイン消化によって生成される抗原結合断片であり、Ｌ鎖全体と、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のパパイン消化により、２つの同一のＦａｂ断片が生成される。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が生じ、これは、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基をさらに有している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインの１つ又は複数のシステイン残基が、遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
本明細書において用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域及び異変Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基から又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の生成若しくは精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することによって、取り除かれうる。したがって、インタクトな抗体の組成物は、すべてのＬｙｓ４４７残基が除かれた抗体集団、Ｌｙｓ４４７残基が除かれていない抗体集団、及びＬｙｓ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合物を有する抗体集団を含みうる。
「Ｆｖ」は、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの、密に非共有結合した二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗原結合特異性を抗体に付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であることが多いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で交換可能に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖中に接続するＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）；Ｍａｌｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：７－１３，１９９５を参照。
用語「小分子」とは、分子量約２０００ダルトン以下、例えば約１０００ダルトン以下の任意の分子を指す。いくつかの態様では、小分子は、小さな有機分子である。
本明細書で使用される用語「模倣物」又は「分子模倣物」は、コンホメーション及び／又は結合能力において、所定のポリペプチドに対して又は前記ポリペプチドの結合パートナーに結合するための部分に対して十分な類似性（例えば、二次構造、三次構造）を有するポリペプチドを指す。模倣物は、それが模倣するポリペプチドと等しい、それより小さい、又はそれより大きい親和性で結合パートナーに結合しうる。分子模倣物は、それが模倣するポリペプチドと明らかなアミノ酸配列類似性を有していても、有していなくてもよい。模倣物は、天然に存在するものでもよく、操作されてもよい。いくつかの態様では、模倣物は、結合対のメンバーの模倣物である。他の態様では、模倣物は、結合対のメンバーに結合する別のタンパク質の模倣物である。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドのすべての機能を実行しうる。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドのすべての機能を実行するわけではない。
本明細書で使用される、２つ以上のタンパク質の相互の「結合を可能にする条件」という用語は、２つ以上のタンパク質がモジュレーター又は候補モジュレーターの非存在下で相互作用するであろう条件（例えば、タンパク質濃度、温度、ｐＨ、塩濃度）を指す。結合を可能にする条件は、個々のタンパク質によって異なり、タンパク質間相互作用アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴アッセイ、バイオレイヤー干渉法アッセイ、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、細胞外相互作用アッセイ、及び細胞表面相互作用アッセイ）の間で異なる可能性がある。
基準となるポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性最大パーセントが得られるように、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、基準となるポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の技術範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって書かれたものであり、ソースコードは、米国著作権局（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）にユーザー文書と共に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルする必要がある。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変化しない。
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較のために使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに、所与のアミノ酸配列Ｂと、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対して特定のアミノ酸配列同一性％を有するか又はそれを含む所与のアミノ酸配列Ａと言い表すことができる）は、以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％に等しくないことが理解されよう。別途特に明記されない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータープログラムを使用して直前の段落に記載されたように得られる。
分数Ｘ／Ｙの１００倍
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％に等しくないことが理解されよう。別途特に明記されない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータープログラムを使用して直前の段落に記載されたように得られる。
本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」などのその文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理学の経過中に行うことができる。処置の望ましい効果には、限定するものではないが、疾患の発生又は再発の予防（例えば、ＨＣＭＶ感染又はその症状の予防）、感染症を有する患者における二次感染の低減又は予防（例えば、神経組織、免疫細胞、リンパ組織、及び／又は肺組織の二次感染の低減又は予防）、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、並びに寛解又は予後の改善が含まれる。
疾患又は状態の「病理」は、患者の幸福を損なうすべての現象を含む。
「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」、「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」、「緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）」、「緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」、又はそれらの同等物は、治療的処置及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指し、ここでその目的は、疾患又は病態、ＨＣＭＶ感染を改善する、予防する、減速させる（和らげる）、減少させる又は阻害することである。治療を必要とする者には、疾患若しくは状態を既に有する者、並びに疾患若しくは状態を有する傾向にある者、又は疾患若しくは状態を予防する必要がある者が含まれる。
ＩＩ．タンパク質間相互作用のモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、ニューロピリン２（ＮＲＰ２）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、又はベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用の単離されたモジュレーターであって、モジュレーターの非存在下での結合と比較して、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、又はＢ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、単離されたモジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、ニューロピリン２（ＮＲＰ２）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、又はベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用の単離されたモジュレーターであって、モジュレーターの非存在下での結合と比較して、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、又はＢ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、単離されたモジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、モジュレーターは、薬学的に許容される担体を含む。
Ａ．ＮＲＰ２とＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、ニューロピリン２（ＮＲＰ２）へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＮＲＰ２との間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ＮＲＰ２の残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９のうちの１つ若しくは複数（例えば、残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つすべて）；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｋ４７及びＲ５７の一方若しくは両方（例えば、残基Ｋ４７及びＲ５７の一方若しくは両方）；（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｒ１９３；並びに／又は（ｄ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３１Ａサブユニットの残基Ａ１１４及びＡ１１７の一方若しくは両方に結合する、モジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、ニューロピリン２（ＮＲＰ２）へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＮＲＰ２との間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ＮＲＰ２の残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９のうちの１つ若しくは複数（例えば、残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つすべて）；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｋ４７及びＲ５７の一方若しくは両方（例えば、残基Ｋ４７及びＲ５７の一方若しくは両方）；（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｒ１９３；並びに／又は（ｄ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３１Ａサブユニットの残基Ａ１１４及びＡ１１７の一方若しくは両方に結合する、モジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ＮＲＰ２の残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９の６つすべて；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｋ４７及びＲ５７の両方；（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｒ１９３；並びに／又は（ｄ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３１Ａサブユニットの残基Ａ１１４及びＡ１１７の両方に結合する。
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ＮＲＰ２の残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９の６つすべて；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｋ４７及びＲ５７の両方；（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｒ１９３；並びに（ｄ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３１Ａサブユニットの残基Ａ１１４及びＡ１１７の両方に結合する。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＮＲＰ２へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、モジュレーターの非存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％、又は１００％（すなわち、結合が消失する）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％－１００％である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＮＲＰ２へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％）減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される場合、少なくとも５０％である（例えば、５０％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％である）。
いくつかの態様では、モジュレーターは、前記モジュレーターの非存在下での感染と比較して、ＨＣＭＶによる細胞の感染の減少を引き起こす。いくつかの態様では、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染は少なくとも４０％減少する。いくつかの態様では、減少は、少なくとも ５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％であるか、又は１００％（すなわち、感染は起こらない）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％）である。
Ｂ．ＴＨＢＤとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＴＨＢＤとの間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ＴＨＢＤの残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３の１つ若しくは複数（例えば、残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは１１個すべて）（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８の１つ若しくは複数（例えば、残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８のうちの１、２、３、４、５、６、７若しくは８個すべて）；並びに／又は（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１の１つ若しくは複数（例えば、残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１のうちの１、２又は３個すべて）に結合する、モジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＴＨＢＤとの間の相互作用のモジュレーターであって、（ａ）ＴＨＢＤの残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３の１つ若しくは複数（例えば、残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは１１個すべて）（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８の１つ若しくは複数（例えば、残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８のうちの１、２、３、４、５、６、７若しくは８個すべて）；並びに／又は（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１の１つ若しくは複数（例えば、残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１のうちの１、２又は３個すべて）に結合する、モジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ＴＨＢＤの残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３の１１個すべて；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８の８つすべて；並びに／又は（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１の３つすべてに結合する。
いくつかの態様では、モジュレーターは、（ａ）ＴＨＢＤの残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３の１１個すべて；（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８の８つすべて；並びに（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１の３つすべてに結合する。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＴＨＢＤへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のｇＯサブユニットの結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、モジュレーターの非存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％、又は１００％（すなわち、結合が消失する）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％－１００％である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＴＨＢＤへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％）減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される場合、少なくとも５０％である（例えば、５０％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％である）。
いくつかの態様では、モジュレーターは、前記モジュレーターの非存在下での感染と比較して、ＨＣＭＶによる細胞の感染の減少を引き起こす。いくつかの態様では、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染は少なくとも４０％減少する。いくつかの態様では、減少は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％であるか、又は１００％（すなわち、感染は起こらない）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％）である。
Ｃ．Ｂ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター
いくつかの態様では、本開示は、Ｂ２ＭへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間の相互作用のモジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、Ｂ２ＭへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間の相互作用のモジュレーターを特徴とする。
いくつかの態様では、モジュレーターは、Ｂ２ＭへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも５０％減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、モジュレーターの非存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％、又は１００％（すなわち、結合が消失する）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％－１００％である。いくつかの態様では、モジュレーターは、Ｂ２ＭへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも９０％（例えば、９０％～１００％）減少させる。いくつかの態様では、結合の減少は、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される場合、少なくとも５０％である（例えば、５０％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％である）。
いくつかの態様では、モジュレーターは、前記モジュレーターの非存在下での感染と比較して、ＨＣＭＶによる細胞の感染の減少を引き起こす。いくつかの態様では、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染は少なくとも４０％減少する。いくつかの態様では、減少は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％であるか、又は１００％（すなわち、感染は起こらない）であり、例えば、減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％）である。
Ｄ．小分子
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、小分子である。小分子は、本明細書で定義される結合ポリペプチド又は抗体以外の分子である。結合する小分子は、既知の方法論を使用して同定され、化学的に合成されうる（例えば、国際公開第００／００８２３号及び同００／３９５８５号を参照のこと）。結合する小分子は、サイズが通常約２０００ダルトン未満（例えば、サイズが約２０００、１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満）であり、本明細書に記載のポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、既知の技術を使用して、過度の実験をすることなく同定されうる。この点に関して、ポリペプチド標的に結合することができる分子について小分子ライブラリーをスクリーニングするための技術が当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、国際公開第００／００８２３号及び同第００／３９５８５号を参照）。結合する小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ－置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、又は酸塩化物等でありうる。
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、小分子である。小分子は、本明細書で定義される結合ポリペプチド又は抗体以外の分子である。結合する小分子は、既知の方法論を使用して同定され、化学的に合成されうる（例えば、国際公開第００／００８２３号及び同００／３９５８５号を参照のこと）。結合する小分子は、サイズが通常約２０００ダルトン未満（例えば、サイズが約２０００、１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満）であり、本明細書に記載のポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、既知の技術を使用して、過度の実験をすることなく同定されうる。この点に関して、ポリペプチド標的に結合することができる分子について小分子ライブラリーをスクリーニングするための技術が当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、国際公開第００／００８２３号及び同第００／３９５８５号を参照）。結合する小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ－置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、又は酸塩化物等でありうる。
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、又はＢ２Ｍの結合は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％減少する）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、又はＢ２Ｍの結合は、小分子の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％を超えて増加する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％又は１００％を超えて増加する）。いくつかの態様では、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性（例えば、ＨＣＭＶによる細胞の感染）は、小分子の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％減少する）。
Ｅ．抗体及び抗原結合断片
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗原結合断片は、ビス－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗原結合断片は、ビス－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである。
いくつかの態様では、モジュレーターは、多重特異性抗体，例えば、二重特異性抗体である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の複数のエピトープに結合する二重特異性又は多重特異性抗体である。いくつかの態様では、モジュレーターは、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及びＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の２つ以上に結合する二重特異性又は多重特異性抗体である。
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、又はＢ２Ｍの結合は、抗体又は抗原結合断片の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％減少する）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、又はＢ２Ｍの結合は、抗体又は抗原結合断片の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％を超えて増加する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％又は１００％を超えて増加する）。いくつかの態様では、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性（例えば、ＨＣＭＶによる細胞の感染）は、抗体又は抗原結合断片の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％減少する）。
Ｆ．ペプチド
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合するペプチドである。ペプチドは、天然に存在するペプチド、又は操作されるペプチドでありうる。ペプチドは、完全長タンパク質と等しい、完全長タンパク質より小さい、又は完全長タンパク質より大きい親和性で結合パートナーに結合しうる。いくつかの態様では、ペプチドは、完全長タンパク質のすべての機能を実行する。他の態様では、ペプチドは、完全長タンパク質のすべての機能を実行するわけではない。
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合するペプチドである。ペプチドは、天然に存在するペプチド、又は操作されるペプチドでありうる。ペプチドは、完全長タンパク質と等しい、完全長タンパク質より小さい、又は完全長タンパク質より大きい親和性で結合パートナーに結合しうる。いくつかの態様では、ペプチドは、完全長タンパク質のすべての機能を実行する。他の態様では、ペプチドは、完全長タンパク質のすべての機能を実行するわけではない。
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、又はＢ２Ｍの結合は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％減少する）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、又はＢ２Ｍの結合は、ペプチドの存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％を超えて増加する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％又は１００％を超えて増加する）。いくつかの態様では、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性（例えば、ＨＣＭＶによる細胞の感染）は、ペプチドの存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％減少する）。
Ｇ．模倣物
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する模倣物、例えば分子模倣物である。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドのすべての機能を実行しうる。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドのすべての機能を実行するわけではない。
いくつかの態様では、モジュレーター又は候補モジュレーターは、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する模倣物、例えば分子模倣物である。いくつかの態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドのすべての機能を実行しうる。他の態様では、模倣物は、模倣されたポリペプチドのすべての機能を実行するわけではない。
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、又はＢ２Ｍの結合は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％減少する）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ又はＢ２Ｍの結合は、模倣物の存在下で増加する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％を超えて増加する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％又は１００％を超えて増加する）。いくつかの態様では、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性（例えば、ＨＣＭＶによる細胞の感染）は、模倣物の存在下で減少する（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少する、例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％減少する）。
Ｈ．タンパク質間相互作用の調節についてのアッセイ
いくつかの態様では、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ又はＢ２Ｍの結合を、タンパク質間相互作用についてのアッセイで評価する。相互作用の調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用の増加、例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％超）の増加として同定され得る。あるいは、調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質間相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質間相互作用の減少、例えば、タンパク質間相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％）の減少として同定され得る。タンパク質間相互作用のアッセイは、例えば、ＳＰＲアッセイ，バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ，酸素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ），細胞外相互作用アッセイ，又は細胞表面相互作用アッセイでありうる。
いくつかの態様では、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＮＲＰ２、ＴＨＢＤ又はＢ２Ｍの結合を、タンパク質間相互作用についてのアッセイで評価する。相互作用の調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質－タンパク質相互作用の増加、例えば、タンパク質－タンパク質相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％超）の増加として同定され得る。あるいは、調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質間相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質間相互作用の減少、例えば、タンパク質間相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％）の減少として同定され得る。タンパク質間相互作用のアッセイは、例えば、ＳＰＲアッセイ，バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ，酸素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ），細胞外相互作用アッセイ，又は細胞表面相互作用アッセイでありうる。
タンパク質間相互作用のモジュレーター、並びにそのような相互作用を調節し得る薬剤を同定するための例示的な方法は、参照によりその全体が本明細書に援用される、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２５４７１号に記載されている。
ＩＩＩ．ＨＣＭＶ感染を治療する又は予防する方法
Ａ．ＨＣＭＶ感染を有する個体を治療する方法
いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を治療するための方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体を治療することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を治療するための医薬の製造における本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）の使用を特徴とする。いくつかの態様では、個体は、免疫減弱状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である。
Ａ．ＨＣＭＶ感染を有する個体を治療する方法
いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を治療するための方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体を治療することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を治療するための医薬の製造における本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）の使用を特徴とする。いくつかの態様では、個体は、免疫減弱状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である。
いくつかの態様では、ＨＣＭＶ感染の持続期間又は重症度は、モジュレーターを投与されていない個体と比較して少なくとも４０％減少する（例えば、４０％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％又は９５％～１００％減少する）。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ感染の持続期間又は重症度は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％）減少する。
Ｂ．ＨＣＭＶ感染又は二次感染を予防する方法
いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防するための方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防するための医薬の製造における本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）の使用を特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防するための方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、本開示は、個体におけるＨＣＭＶ感染を予防するための医薬の製造における本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）の使用を特徴とする。
いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での感染と比較して、個体におけるＨＣＭＶ感染の可能性を低下させる。いくつかの態様では、ＨＣＭＶ感染の可能性、程度、又は重症度は、未治療患者と比較して、又は対照方法（例えば、ＳＯＣ）を使用して治療された患者と比較して、上述の方法に従って治療された患者では減少する、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％減少する（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％減少する）。
いくつかの態様では、本開示は、個体（例えば、ＨＣＭＶ感染を有する個体）における二次ＨＣＭＶ感染に対する予防の方法であって、有効量の本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）を個体に投与し、それにより個体における二次ＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、本開示は、個体における二次ＨＣＭＶ感染に対する予防のための医薬の製造における本明細書に記載のモジュレーター（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター）の使用を特徴とする。いくつかの態様では、二次感染は、非感染組織のＨＣＭＶによる感染である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下での二次感染と比較して、個体における二次ＨＣＭＶ感染の可能性を低下させる。いくつかの態様では、二次ＨＣＭＶ感染の可能性、程度、又は重症度は、未治療患者と比較して、又は対照方法（例えば、ＳＯＣ）を使用して治療された患者と比較して、上述の方法に従って治療された患者では減少する、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％減少する（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％減少する）。
Ｃ．併用療法
上述の治療及び予防方法のいくつかの態様では、方法は、個体に対して少なくとも１つの追加的療法（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上の追加的療法）を適用することを含む。ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーターは、少なくとも１つの追加の療法の前に、追加の療法と同時に、又は追加の療法の後に個体に投与され得る。
上述の治療及び予防方法のいくつかの態様では、方法は、個体に対して少なくとも１つの追加的療法（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上の追加的療法）を適用することを含む。ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーターは、少なくとも１つの追加の療法の前に、追加の療法と同時に、又は追加の療法の後に個体に投与され得る。
いくつかの態様では、追加の療法は、宿主細胞タンパク質（例えば、原形質膜発現宿主細胞タンパク質）とＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体との間の相互作用のモジュレーター、例えば、宿主細胞タンパク質へのＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の結合を減少させるモジュレーターである。そのような相互作用の例示的なモジュレーターは、参照によりその全体が本明細書に援用される、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０６０８８７号に提供されている。
Ｄ．送達の方法
本明細書に記載の方法において利用される組成物（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター、例えば、小分子、抗体、抗原結合断片、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ）は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、腹腔内、結膜下、膀胱内、粘膜内、心膜内、臍下、眼内、眼窩内、経口、経皮、硝子体内（例えば、硝子体内注射によって）、点眼薬、吸入、注射、移植、点滴、連続的注入、局所灌流浴、標的細胞に直接、カテーテル、洗浄、クリーム中、又は脂質組成物中を含む任意の適切な方法によって投与することができる。本明細書に記載される方法において利用される組成物はまた、全身的に又は局所的に投与することができる。投与方法は、種々の因子（例えば、投与される化合物又は組成物、及び治療される状態、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化しうる。いくつかの態様では、タンパク質間相互作用のモジュレーターは、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植により、吸入により、髄腔内に、脳室内に、又は鼻腔内に投与される。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない種々の投薬スケジュールが企図される。
本明細書に記載の方法において利用される組成物（例えば、ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ及び／又はＢ２ＭとＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体との間の相互作用のモジュレーター、例えば、小分子、抗体、抗原結合断片、ペプチド、模倣物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ）は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、腹腔内、結膜下、膀胱内、粘膜内、心膜内、臍下、眼内、眼窩内、経口、経皮、硝子体内（例えば、硝子体内注射によって）、点眼薬、吸入、注射、移植、点滴、連続的注入、局所灌流浴、標的細胞に直接、カテーテル、洗浄、クリーム中、又は脂質組成物中を含む任意の適切な方法によって投与することができる。本明細書に記載される方法において利用される組成物はまた、全身的に又は局所的に投与することができる。投与方法は、種々の因子（例えば、投与される化合物又は組成物、及び治療される状態、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化しうる。いくつかの態様では、タンパク質間相互作用のモジュレーターは、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植により、吸入により、髄腔内に、脳室内に、又は鼻腔内に投与される。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない種々の投薬スケジュールが企図される。
本明細書に記載されるタンパク質間相互作用のモジュレーター（及び任意の付加的治療剤）は、医学行動規範と一致した様式で製剤化、投薬、及び投与されうる。これに関連して考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療施術者に知られている他の因子が含まれる。モジュレーターは、必要ではないが、任意選択的に、問題の障害を防止又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と共に製剤化及び／又は共投与される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するモジュレーターの量、障害又は治療の種類、及び上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投薬量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
ＩＩＩ．ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとの間の相互作用のモジュレーターを同定する方法
Ａ．相互作用の調節に関するアッセイ
いくつかの態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間の相互作用のモジュレーターを同定することを特徴とし、その方法は、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＩに記載の候補モジュレーター）を提供すること；（ｂ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体をＢ２Ｍと接触させること；及び（ｃ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を測定し、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少が、候補モジュレーターをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとの間の相互作用のモジュレーターとして同定することを含む。
Ａ．相互作用の調節に関するアッセイ
いくつかの態様では、本発明は、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間の相互作用のモジュレーターを同定することを特徴とし、その方法は、（ａ）候補モジュレーター（例えば、本明細書のセクションＩＩに記載の候補モジュレーター）を提供すること；（ｂ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体をＢ２Ｍと接触させること；及び（ｃ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を測定し、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少が、候補モジュレーターをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとの間の相互作用のモジュレーターとして同定することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供すること；（ｂ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体をＢ２Ｍと接触させること；及び（ｃ）ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化が、候補モジュレーターをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性を測定することを含む方法を特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、Ｂ２Ｍの下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）候補モジュレーターを提供すること；（ｂ）ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＢ２Ｍの結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＢ２ＭをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体と接触させること；及び（ｃ）Ｂ２Ｍの下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化が、候補モジュレーターをＢ２Ｍの下流活性のモジュレーターとして同定する、Ｂ２Ｍの下流活性を測定することを含む方法を特徴とする。
いくつかの態様では、結合の増加又は減少は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される場合、少なくとも５０％（例えば、５０％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％）である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体又はＢ２Ｍの下流活性の阻害剤である。
いくつかの態様では、モジュレーターは、本明細書のセクションＩＩに記載のモジュレーターであり、例えば、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片（例えば、ビス－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、若しくはＶＨＨドメイン）、ペプチド、模倣物、又は抑制性核酸（例えば、ＡＳＯ若しくはｓｉＲＮＡ）である。
モジュレーターが抗体又はその抗原結合断片であるいくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ２Ｍに結合する。例えば、いくつかの態様では、モジュレーターは、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する抗体若しくはその抗原結合断片、Ｂ２Ｍに結合する抗体若しくはその抗原結合断片、又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとに結合する抗体若しくはその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、下流活性の変化は、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である。
いくつかの態様では、下流活性はＨＣＭＶによる細胞の感染であり、感染はモジュレーターの存在下で減少する。感染の減少は、例えば、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定した場合、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の減少であり得る（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％の減少であり得る）。いくつかの態様では、偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染は少なくとも４０％減少する。
いくつかの態様では、候補モジュレーターは、細胞（例えば、哺乳動物細胞）、細胞培養培地、馴化培地、並びに／又はＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体及び／若しくはＢ２Ｍの精製形態に提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、少なくとも０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、又は１０μＭの濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、０．１ｎＭと１０μＭとの間の濃度で提供される。いくつかの態様では、候補モジュレーターは、溶液中に、例えば、可溶型形態で提供される。
いくつかの態様では、結合の増加が少なくとも７０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、結合の増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は１００％超である（例えば、増加は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％超である）。いくつかの態様では、結合の増加は少なくとも７０％である。
いくつかの態様では、結合の減少が少なくとも７０％である場合、候補モジュレーターはモジュレーターとして同定される。いくつかの態様では、結合の減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％である（例えば、結合の減少は、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％である。）。いくつかの態様では、結合の減少は少なくとも７０％である。
ｉ．タンパク質間相互作用の調節に関するアッセイ
いくつかの態様では、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとの結合を、タンパク質間相互作用についてのアッセイで評価する。ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとの間の相互作用の調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質間相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質間相互作用の増加、例えば、タンパク質間相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超の増加（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％超の増加）として同定され得る。あるいは、調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質間相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質間相互作用の減少、例えば、タンパク質間相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の減少（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％の減少）として同定され得る。タンパク質間相互作用についてのアッセイは、例えば、ＳＰＲアッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、酸素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、国際公開第２０２０／２０５６２６号に記載されているような細胞外相互作用アッセイ、又は国際公開第２０２０／２０５６２６号に記載されているような細胞表面相互作用アッセイであり得る。
いくつかの態様では、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとの結合を、タンパク質間相互作用についてのアッセイで評価する。ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとの間の相互作用の調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質間相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質間相互作用の増加、例えば、タンパク質間相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又は１００％超の増加（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、９５％～１００％、又は１００％超の増加）として同定され得る。あるいは、調節は、モジュレーターの非存在下でのタンパク質間相互作用と比較した、モジュレーターの存在下でのタンパク質間相互作用の減少、例えば、タンパク質間相互作用の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の減少（例えば、５％～１５％、１５％～２５％、２５％～３５％、３５％～４５％、４５％～５５％、５５％～６５％、６５％～７５％、７５％～８５％、８５％～９５％、又は９５％～１００％の減少）として同定され得る。タンパク質間相互作用についてのアッセイは、例えば、ＳＰＲアッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、酸素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、国際公開第２０２０／２０５６２６号に記載されているような細胞外相互作用アッセイ、又は国際公開第２０２０／２０５６２６号に記載されているような細胞表面相互作用アッセイであり得る。
本明細書において引用されるすべての特許、特許公報及び文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
実施例１．ＨＣＭＶ五量体受容体認識及び抗体中和の構造的基礎
Ａ．序論
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ベータヘルペスウイルス科のメンバーであり、免疫減弱状態の個体における重度の罹患率及び死亡率の原因である（Ｋｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，６：７１１－７２１，２０１０）。ＨＣＭＶ感染は、妊娠中に特に脅威となり、先天性出生時異常の主要なウイルス原因である（Ｈｙｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０（５）：３１１－３２６，２０１０）。
Ａ．序論
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ベータヘルペスウイルス科のメンバーであり、免疫減弱状態の個体における重度の罹患率及び死亡率の原因である（Ｋｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，６：７１１－７２１，２０１０）。ＨＣＭＶ感染は、妊娠中に特に脅威となり、先天性出生時異常の主要なウイルス原因である（Ｈｙｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０（５）：３１１－３２６，２０１０）。
ＨＣＭＶは、広範な細胞指向性を示し、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３０－１３１Ａ五量体複合体（「五量体」）を利用して、異なる受容体タンパク質に結合し、上皮細胞、内皮細胞及び骨髄細胞を含む多様な細胞型に感染する（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９（２），１１０－１２１，２０２１；Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１６（１４）：７０４３－７０５２，２０１９；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８；Ｎｇｕｙｅｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｌ，Ｖｉｒｕｓｅｓ，１０（１２）：７０４，２０１８）。ＨＣＭＶ受容体結合は、ｇＢ糖タンパク質がウイルスと宿主細胞との間の膜融合を触媒するためのトリガーシグナルを提供し、ＨＣＭＶが細胞に侵入し、複製し、その潜伏を確立することを可能にすると考えられている（Ｍａｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３１：４３－５１，２０１８）。ニューロピリン２（ＮＲＰ２）欠損は、選択された内皮細胞及び上皮細胞をＨＣＭＶ感染に対して耐性にすることが実証されており、ＨＣＭＶ受容体としてのＮＲＰ２の重要な役割を示している（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）が、この相互作用の構造的基礎は不明のままである。ＨＣＭＶ五量体はまた、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）にナノモル親和性で結合するが、ＨＣＭＶの侵入におけるＴＨＢＤの役割は依然として不可解である（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）。
感染すると、ＨＣＭＶは五量体に対する極めて強力な中和抗体を誘発し、ＨＣＭＶに対する治療薬及びワクチン候補としてのこの複合体の重要性を強調している（Ｍａｃａｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８４（２）：１００５－１０１３，２０１０）。多大の努力にもかかわらず、ＨＣＭＶに対するワクチンは依然として満たされていない医学的必要性であり、先天性ＨＣＭＶ感染を治療するために現在利用可能な承認された治療法はない（Ｂｉｒｏｎ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７１（２－３）：１５４－１６３，２００６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，１２（１）：２１，２０１９）。このギャップは、主に五量体と宿主細胞受容体との間の相互作用の構造的理解が欠如していること、及び五量体中和に関連するエピトープの知識が限られていることに起因する。
本実施例では、細胞受容体ＮＲＰ２及びＴＨＢＤと複合体を形成した五量体の高分解能構造を決定する。これらの構造は、ＨＣＭＶ五量体－受容体認識に必要な特異的相互作用を強調し、五量体－受容体複合体の予期せぬ二量体化を明らかにする。重要なことに、五量体とＮＲＰ２又はＴＨＢＤとの間の相互作用は相互に排他的であり、両方とも共受容体ではなく、異なる細胞型への侵入を媒介する機能的受容体であることが見出された。本実施例はまた、ＨＣＭＶに対する重要な中和部位を同定する一連の強力な中和抗体に結合した五量体の構造を報告する。これらの研究は、ＨＣＭＶ受容体認識及び抗体に基づく中和を理解するための枠組みを提供する。
Ｂ．結果の要約
本明細書で提供される実施例は、ＨＣＭＶ五量体の包括的な構造的、生物物理学的、及び機能的分析を提示して、その構造、受容体認識、細胞侵入、及び中和に対する重要な洞察を提供する。これらの研究は、五量体のサブユニットＵＬ１２８－１３１Ａの大部分が２つの完全に異なる機能的受容体タンパク質ＮＲＰ２及びＴＨＢＤにどのように結合するかを明らかにし、これは、ＨＣＭＶが広範な細胞指向性及び異なる細胞型の受容体特異性をどのように達成するかに光を当てる。ニューロピリン１及び２は、それらのｂ１ドメインを使用して、ＶＥＧＦ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を含む結合パートナーのＣｅｎｄＲモチーフと相互作用することが示されている（Ｄａｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３７０（６５１８）：８６１－８６５，２０２０；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７（１４）：１１０８２－１１０８９，２０１２）；しかしながら、構造試験は、ＮＲＰ２がこの標準的な結合部位を利用せず、代わりに、ａ２ドメインとｂ２ドメインとの間の重要な相互作用を介して五量体をＵＬ１２８及びＵＬ１３１Ａサブユニットに係合することを実証している（図１Ｅ、１Ｆ、１Ｈ及び８Ａ；Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｐ．２０２１．０３．２５．４３６８０４，２０２１）。五量体が結合すると、ＮＲＰ２ ａ１ドメインはａ２ｂ１ｂ２コアから移動し、ＵＬ１２８とｇＬとの間の結合部位に再配置される（図１Ｄ）。特に、ＮＲＰ２ ａ１ドメインは、ＴＨＢＤ受容体によって認識される五量体の同じ領域に結合し（図１Ａ～１Ｈ及び２Ａ～２Ｄ）、ＨＣＭＶ五量体が、異なる細胞型に侵入するために高い親和性で複数の異なる相互作用パートナーを認識することができる日和見結合部位を進化させたことを示している。
本明細書で提供される実施例は、ＨＣＭＶ五量体の包括的な構造的、生物物理学的、及び機能的分析を提示して、その構造、受容体認識、細胞侵入、及び中和に対する重要な洞察を提供する。これらの研究は、五量体のサブユニットＵＬ１２８－１３１Ａの大部分が２つの完全に異なる機能的受容体タンパク質ＮＲＰ２及びＴＨＢＤにどのように結合するかを明らかにし、これは、ＨＣＭＶが広範な細胞指向性及び異なる細胞型の受容体特異性をどのように達成するかに光を当てる。ニューロピリン１及び２は、それらのｂ１ドメインを使用して、ＶＥＧＦ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を含む結合パートナーのＣｅｎｄＲモチーフと相互作用することが示されている（Ｄａｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３７０（６５１８）：８６１－８６５，２０２０；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７（１４）：１１０８２－１１０８９，２０１２）；しかしながら、構造試験は、ＮＲＰ２がこの標準的な結合部位を利用せず、代わりに、ａ２ドメインとｂ２ドメインとの間の重要な相互作用を介して五量体をＵＬ１２８及びＵＬ１３１Ａサブユニットに係合することを実証している（図１Ｅ、１Ｆ、１Ｈ及び８Ａ；Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｐ．２０２１．０３．２５．４３６８０４，２０２１）。五量体が結合すると、ＮＲＰ２ ａ１ドメインはａ２ｂ１ｂ２コアから移動し、ＵＬ１２８とｇＬとの間の結合部位に再配置される（図１Ｄ）。特に、ＮＲＰ２ ａ１ドメインは、ＴＨＢＤ受容体によって認識される五量体の同じ領域に結合し（図１Ａ～１Ｈ及び２Ａ～２Ｄ）、ＨＣＭＶ五量体が、異なる細胞型に侵入するために高い親和性で複数の異なる相互作用パートナーを認識することができる日和見結合部位を進化させたことを示している。
これらの実施例では、ＴＨＢＤがＨＣＭＶの関連する機能的受容体であることが初めて示される（図３Ａ及び３Ｂ）。これらの構造的及び生物物理学的試験によって明らかにされた五量体へのＮＲＰ２及びＴＨＢＤの相互に排他的な結合（図３Ｄ～３Ｆ）は、ＨＣＭＶがこれらのタンパク質を共受容体として使用するのではなく、五量体を使用して２つの代替経路を介して上皮細胞及び内皮細胞に入る可能性が高いことをさらに示唆している。ＮＲＰ２及びＴＨＢＤの発現プロファイルに基づいて、ＮＲＰ２受容体は主に上皮細胞感染に使用され、一方、ＴＨＢＤは内皮細胞及び骨髄細胞感染の主な受容体である可能性がある（Ｓａｒｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９６（２）：８３２－８４５，２０１６；Ｂａｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０７（６）：１２７３－１２８１，２０１０）。五量体は、受容体結合時に大きなコンホメーション変化を受けて、ｇＢ媒介膜融合及びＨＣＭＶ侵入を引き起こすことが以前に提案された（Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（３０）：２０１７）。しかしながら、本構造試験は、ＮＲＰ２又はＴＨＢＤ相互作用が五量体のコンホメーションを有意に変化させないことを示唆している（図９Ｃ及び９Ｄ）。したがって、五量体は、おそらくＨＣＭＶ三量体について最近提案されたものと同様に、大きな五量体コンホメーション変化を伴わない異なる機構を介してｇＢ活性化を引き起こし得る（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４．ｅ１６，２０２１）。
本構造は、ＨＣＭＶ五量体が、ＮＲＰ２ ａ１及びＴＨＢＤレクチン様ドメインが２つの五量体の間に挟まれる二量体化を受け得ることを明らかにする。五量体のこの見かけの受容体媒介二量体化は、それぞれＵＬ１２８サブユニット及びＮＲＰ２又はＴＨＢＤ受容体を介してヘッド・トゥ・ヘッド様式で起こる（図２Ｂ及び３Ｇ）。五量体によるこの受容体係合方法は、各宿主受容体が三量体のただ１つのコピーに係合することが見られた、ＨＣＭＶ三量体について観察されたものとは明らかに異なる（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４．ｅ１６，２０２１）。これらの構造的観察が、三量体認識又は五量体認識に関与するヒト受容体の同定に必要な実験計画と一致するようであることは注目に値する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）。実際に、ＰＤＧＦＲαは、古典的なアフィニティー精製及び質量分析手法を使用して三量体受容体として同定されたが（Ｋａｂａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１（８）：１６０８２，２０１６）、生理的に関連する五量体－受容体相互作用の同定は、おそらく受容体の結合活性の増加及び潜在的に２つの対向する膜（すなわち、ウイルスエンべロープと宿主細胞）の分子配置を模倣することを介して、五量体のオリゴマー化を通してのみ可能になり得る（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）。五量体の受容体媒介二量体化の明らかな要件及び受容体結合時の構造再配列の欠如は、図５に示す宿主細胞への五量体特異的ＨＣＭＶ侵入のモデルを支持する。このモデルでは、受容体結合は五量体の二量体化と相関しており、次に受容体クラスター化を媒介して、最終的にウイルス膜と宿主細胞膜との高親和性かつ安定なテザリングを促進する。まだ知られていない機構を介して、受容体媒介五量体二量体化及び膜テザリングは、ｇＢのその融合前コンホメーションから融合後コンホメーションへの移行を引き起こし、おそらく五量体クラスター化時のｇＢの局所的捕捉及び／又はウイルス膜二重層内の変動を介して膜融合を開始する。その融合前コンホメーションにおけるＨＣＭＶ ｇＢの最近の高分解能構造（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ａｄｖ．，７（１０），２０２１）は、これら及び他の仮説を試験するための新しい道を開くはずである。ＨＣＭＶ五量体（又は三量体）と融合前ｇＢとの相互作用の構造的基礎及び膜融合を引き起こすために必要な機構に対処するには、将来の高分解能構造試験が必要とされるであろう。
ＨＣＭＶ五量体は、ＨＣＭＶに対する最も強力な中和抗体応答を誘発するが、この中和の構造的基礎はほとんど理解されないままである。これらの結果は、Ｆａｂ ２Ｃ１２がＮＲＰ２ドメイン結合に直接干渉し、五量体とＮＲＰ２との間の結合をブロックすることを示す（図４Ａ～４Ｍ）。より重要なことには、Ｆａｂ ７Ｉ１３は、ＮＲＰ２及びＴＨＢＤの両方をブロックする五量体の表面に結合し、五量体の受容体相互作用及び潜在的に五量体の二量体化をブロックする優れた中和抗体である（図４Ａ～４Ｍ）。全体として、本実施例は、ＨＣＭＶの広範な細胞指向性及び細胞侵入機構への洞察を明らかにする、五量体受容体係合及び中和の構造的基礎を提示する。これらの所見は、ＨＣＭＶに対する有効なワクチン及び治療薬の将来の開発のための枠組みを提供する。
Ｃ．方法
ｉ．ＨＣＭＶ糖タンパク質及びＦａｂコンストラクトの作製
コドン最適化された（ヒト細胞での発現のための）ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ及びＮＲＰ２遺伝子を合成し、プラスミド発現ベクターｐＲＫ５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。ｇＨ遺伝子は細胞外領域（最初の７１６アミノ酸）のみを含み、これをＣ末端Ｍｙｃ－Ａｖｉ－８ｘＨＩＳタグに融合した。タンパク質精製の目的のために、ＵＬ１３０をＣ末端二重Ｓｔｒｅｐタグに融合した。
ｉ．ＨＣＭＶ糖タンパク質及びＦａｂコンストラクトの作製
コドン最適化された（ヒト細胞での発現のための）ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ及びＮＲＰ２遺伝子を合成し、プラスミド発現ベクターｐＲＫ５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。ｇＨ遺伝子は細胞外領域（最初の７１６アミノ酸）のみを含み、これをＣ末端Ｍｙｃ－Ａｖｉ－８ｘＨＩＳタグに融合した。タンパク質精製の目的のために、ＵＬ１３０をＣ末端二重Ｓｔｒｅｐタグに融合した。
ｉｉ．タンパク質の発現及び精製
ＨＣＭＶ五量体を、ＨＣＭＶ三量体について以前に記載されたように（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４．ｅ１６，２０２１）、３工程で精製した。ＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞を、個々のサブユニットをコードするプラスミドでトランスフェクトした。５０Ｌの発現に対応する発現上清をタンジェント流濾過（ＴＦＦ）によって１～２Ｌの容積に濃縮し、２０ｍＬのＮｉ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｅｘｃｅｌ樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）に負荷し、１３カラム容積（ＣＶ）の洗浄バッファー（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール）で洗浄し、５ＣＶ溶出バッファー（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、４００ｍＭイミダゾール）中で溶出した。溶出剤を３ｍＬのＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）ＸＴ高親和性樹脂（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、２時間結合させた。樹脂を１０ＣＶのＳｔｒｅｐ洗浄バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で洗浄し、５０ｍＭビオチンを添加したＳｔｒｅｐ洗浄バッファー中でビーズから溶出した。溶出液をＡＭＩＣＯＮ（登録商標）超遠心フィルター装置（３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、五量体－ＳＥＣバッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で平衡化したＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００ １０／３００又は１６／６０カラムに負荷した。
ＨＣＭＶ五量体を、ＨＣＭＶ三量体について以前に記載されたように（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４．ｅ１６，２０２１）、３工程で精製した。ＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞を、個々のサブユニットをコードするプラスミドでトランスフェクトした。５０Ｌの発現に対応する発現上清をタンジェント流濾過（ＴＦＦ）によって１～２Ｌの容積に濃縮し、２０ｍＬのＮｉ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｅｘｃｅｌ樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）に負荷し、１３カラム容積（ＣＶ）の洗浄バッファー（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール）で洗浄し、５ＣＶ溶出バッファー（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、４００ｍＭイミダゾール）中で溶出した。溶出剤を３ｍＬのＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）ＸＴ高親和性樹脂（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、２時間結合させた。樹脂を１０ＣＶのＳｔｒｅｐ洗浄バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で洗浄し、５０ｍＭビオチンを添加したＳｔｒｅｐ洗浄バッファー中でビーズから溶出した。溶出液をＡＭＩＣＯＮ（登録商標）超遠心フィルター装置（３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、五量体－ＳＥＣバッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で平衡化したＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００ １０／３００又は１６／６０カラムに負荷した。
ヒトＦｃタグ付きＮＲＰ２タンパク質を、ＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞の３０ｍＬ培養物中で発現させ、３０μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、７日間増殖させた。発現培地培養上清を回収した後、Ｆｃ融合タンパク質を０．１５ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ－ｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＣ－６５０Ｆ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｒｏｖｅ Ｃｉｔｙ，ＯＨ）で精製した。１０ＣＶのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄することによって、結合していないタンパク質及び培地成分を除去した。ＮＲＰ２－ｈｕＦｃ融合物を、溶出バッファー（５０ｍＭリン酸、ｐＨ２．９）を使用して樹脂から溶出し、０．０５ｍＬの２０×ＰＢＳ ｐＨ１１．０を添加することによって～６．０のｐＨに直ちに中和した。タンパク質を、ＵＬＴＩＭＡＴＥ（商標）３０００ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に接続したＺＥＮＩＸ（登録商標）－Ｃ ＳＥＣ ３００カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）で実施したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製によってさらに洗練した。カラムを１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で平衡化し、試料を１．５ｍＬ／分の流速でイソクラティック溶出によって分離した。
ヒトＴＨＢＤ－Ｆｌａｇ及びＮＲＰ２－Ｆｌａｇを１０Ｌの発現上清から精製した。上清を１０ｍＬのＭ２アガロースＦｌａｇ樹脂（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートし、４℃で２０時間インキュベートした。樹脂を１０ＣＶ ＦＬＡＧ洗浄バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）で洗浄し、０．２ｍｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチドを添加したＦＬＡＧ洗浄バッファーで溶出した。溶出液をＡＭＩＣＯＮ（登録商標）超遠心フィルター装置（３０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、ＳＥＣバッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ）中で平衡化したＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００ １０／６０カラムに負荷した。
断片抗原結合領域（Ｆａｂ）ＭＳＬ－１０９の重鎖及び軽鎖を、ホスフェート制限培地（Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．）中、３０℃で２０時間、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３４Ｂ８細胞（インハウス株）においてｐｈｏＡプロモーター下で共発現させた。１Ｌ発現からのペレットを、Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤錠剤を添加した７０ｍＬの溶解バッファー（１×ＰＢＳ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。溶解物を２５，０００×ｇで１時間の遠心分離によって清澄化し、続いて０．４５μｍフィルターに通した。清澄化した溶解物を、溶解バッファー中で平衡化した５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ（Ｃｙｔｉｖａ）カラムに負荷した。カラムを１０－２０ ＣＶ溶解緩衝液で洗浄し、０．５８％（ｖ／ｖ）酢酸で溶出した。ＳＰ－Ａバッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５）の添加によって溶出液のｐＨを直ちに調整し、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に負荷した。ＳＰ－Ｂバッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ）に対する直線２０ＣＶ勾配でＦａｂを溶出した。溶出液を、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）超遠心フィルター装置（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）を使用して濃縮し、Ｆａｂ－Ｓ２００バッファー（２５ｍＭトリスｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中で平衡化したＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００ １０／３００カラムでさらに精製した。精製したＦａｂをＡＭＩＣＯＮ（登録商標）超遠心フィルター装置（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）で濃縮し、液体Ｎ２中で凍結し、－８０℃で保存した。Ｆａｂ ２Ｃ１２、７Ｉ１３、８Ｉ２１及び１３Ｈ１１の重鎖及び軽鎖を、ホスフェート制限培地（Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．）中、３０℃で２０時間、大腸菌３４Ｂ８細胞（インハウス株）においてｐｈｏＡプロモーター下で共発現させた。４Ｌ発現からのペレットを、Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤錠剤を添加した２５０ｍＬの溶解バッファー（２５ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＮａＮ３）に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。その後の精製は、ＭＳＬ－１０９について記載されたプロトコールと同様のプロトコールに従った。
五量体、Ｆａｂ及びＴＨＢＤの間の複合体を、少なくとも１．２過剰モルのＦａｂ及び受容体と共に氷上で少なくとも１時間インキュベートすることによって生成し、ＳＥＣによって精製して過剰のＦａｂ／受容体を除去した。五量体－ＮＲＰ２－Ｆａｂ複合体を２工程で形成した。最初に、五量体とＮＲＰ２を混合し、ＳＥＣによって精製した後、過剰のＦａｂ ８Ｉ２１及び１３Ｈ１１を添加し、２回目のＳＥＣ精製を行った。
ｉｉｉ．クライオＥＭ試料の調製及びデータ取得
この試験で示されるＨＣＭＶ五量体複合体は、ＨＣＭＶ三量体について以前に記載されたように調製した（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４．ｅ１６，２０２１）。ＨＣＭＶ五量体ｇＨｇＬ－ＵＬ１２８－ＵＬ１３０－ＵＬ１３１Ａ＋ＮＲＰ２＋８Ｉ２１＋１３Ｈ１１複合体について、Ｓｏｌａｒｕｓプラズマクリーナー（Ｇａｔａｎ）を使用して、ホーリーカーボングリッド（ＵＬＴＲＡＵＦＯＩＬ（登録商標）２５ｎＭ Ａｕ Ｒ ０．６／１ ３００メッシュ；ＱＵＡＮＴＩＦＯＩＬ（登録商標））を２０秒間グロー放電した。他のすべての五量体複合体について、ホーリーカーボングリッド（ＵＬＴＲＡＵＦＯＩＬ（登録商標）２５ｎＭ Ａｕ Ｒ ０．６／１ ３００メッシュ；ＱＵＡＮＴＩＦＯＩＬ（登録商標））を、４ｍＭモノチオアルカン（Ｃ１１）ＰＥＧ６－ＯＨ（１１メルカプトウンデシル）ヘキサエチレングリコール（ＳＰＴ－００１１Ｐ６、ＳｅｎｓｏＰａｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｚｅｍａｎ，ＭＴ）のチオール反応性自己組織性反応混合物と共にインキュベートした（Ｍｅｙｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，４：７０８４，２０１４）。グリッドをこの自己組織化単層（ＳＡＭ）溶液と共に２４時間インキュベートした。グリッド凍結の前に、グリッドをＳＡＭ溶液から取り出し、ＥｔＯＨですすいだ。０．６６～１．８ｍｇ／ｍＬの濃度の３μＬの試料をグリッドに適用し、１００％湿度で３．５秒のブロッティング時間を使用してＬｅｉｃａ ＥＭ ＧＰ（Ｌｅｉｃａ）で片面をブロッティングし、液体窒素で冷却した液体エタン中でプランジ凍結した。五量体－ＮＲＰ２－８Ｉ２１－１３Ｈ１１試料を０．０２５％ＥＭグレードグルタルアルデヒドで室温にて１０分間穏やかに架橋し、グリッド適用の前に９ｍＭトリスｐＨ７．５でクエンチした。
この試験で示されるＨＣＭＶ五量体複合体は、ＨＣＭＶ三量体について以前に記載されたように調製した（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４．ｅ１６，２０２１）。ＨＣＭＶ五量体ｇＨｇＬ－ＵＬ１２８－ＵＬ１３０－ＵＬ１３１Ａ＋ＮＲＰ２＋８Ｉ２１＋１３Ｈ１１複合体について、Ｓｏｌａｒｕｓプラズマクリーナー（Ｇａｔａｎ）を使用して、ホーリーカーボングリッド（ＵＬＴＲＡＵＦＯＩＬ（登録商標）２５ｎＭ Ａｕ Ｒ ０．６／１ ３００メッシュ；ＱＵＡＮＴＩＦＯＩＬ（登録商標））を２０秒間グロー放電した。他のすべての五量体複合体について、ホーリーカーボングリッド（ＵＬＴＲＡＵＦＯＩＬ（登録商標）２５ｎＭ Ａｕ Ｒ ０．６／１ ３００メッシュ；ＱＵＡＮＴＩＦＯＩＬ（登録商標））を、４ｍＭモノチオアルカン（Ｃ１１）ＰＥＧ６－ＯＨ（１１メルカプトウンデシル）ヘキサエチレングリコール（ＳＰＴ－００１１Ｐ６、ＳｅｎｓｏＰａｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｚｅｍａｎ，ＭＴ）のチオール反応性自己組織性反応混合物と共にインキュベートした（Ｍｅｙｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，４：７０８４，２０１４）。グリッドをこの自己組織化単層（ＳＡＭ）溶液と共に２４時間インキュベートした。グリッド凍結の前に、グリッドをＳＡＭ溶液から取り出し、ＥｔＯＨですすいだ。０．６６～１．８ｍｇ／ｍＬの濃度の３μＬの試料をグリッドに適用し、１００％湿度で３．５秒のブロッティング時間を使用してＬｅｉｃａ ＥＭ ＧＰ（Ｌｅｉｃａ）で片面をブロッティングし、液体窒素で冷却した液体エタン中でプランジ凍結した。五量体－ＮＲＰ２－８Ｉ２１－１３Ｈ１１試料を０．０２５％ＥＭグレードグルタルアルデヒドで室温にて１０分間穏やかに架橋し、グリッド適用の前に９ｍＭトリスｐＨ７．５でクエンチした。
ＨＣＭＶ五量体ｇＨｇＬ－ＵＬ１２８－ＵＬ１３０－ＵＬ１３１Ａ＋２Ｃ１２＋７Ｉ１３＋１３Ｈ１１及びＨＣＭＶ五量体ｇＨｇＬ－ＵＬ１２８－ＵＬ１３０－ＵＬ１３１Ａ＋ＮＲＰ２＋８Ｉ２１＋１３Ｈ１１の動画スタックを、Ｋ２ Ｓｕｍｍｉｔ直接電子検出器カメラ（Ｇａｔａｎ Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を備えた生物量子エネルギーフィルターを有する３００ｋｅＶで動作するＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ Ｇ３ｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上でＳｅｒｉａｌＥＭ（Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１５２（１）：３６－５１，２００５）を使用して収集した。画像は、２０ｅＶのエネルギースリットを使用して、０．８２４Å／ピクセルに相当する１６５，０００倍の倍率で記録した。各画像スタックは、～５０ｅÅ－２の蓄積線量及び１０秒の総露光時間について０．２秒ごとに記録された５０のフレームを含む。０．５～１．５μｍの設定された焦点ずれ範囲で画像を記録した。
ＨＣＭＶ五量体ｇＨｇＬ－ＵＬ１２８－ＵＬ１３０－ＵＬ１３１Ａ＋ＴＨＢＤ＋ＭＳＬ－１０９＋１３Ｈ１１の動画スタックを、Ｋ３ Ｓｕｍｍｉｔ直接電子検出器カメラ（Ｇａｔａｎ Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を備えた生物量子エネルギーフィルターを有する３００ｋｅＶで動作するＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ Ｇ３ｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上でＳｅｒｉａｌＥＭ（Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１５２（１）：３６－５１，２００５）を使用して収集した。画像は、２０ｅＶのエネルギースリットを使用して、０．８３８Å／ピクセルに相当する１０５，０００倍の倍率で、ＥＦＴＥＭモードで記録した。各画像スタックは、～６０ｅÅ－２の蓄積線量及び３秒の総露光時間について０．０５秒ごとに記録された６０個のフレームを含む。０．５～１．５μｍの設定された焦点ずれ範囲で画像を記録した。
ｉｖ．クライオＥＭデータ処理
クライオＥＭデータを、ＨＣＭＶ三量体に関する以前の研究（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４．ｅ１６，２０２１）と同様に、ＲＥＬＩＯＮ（Ｓｃｈｅｒｅｓ，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１８０（３）：５１９－５３０，２０１２）、ｃｉｓＴＥＭ（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，７：ｅ３５３８３，２０１８）、及びｃｒｙｏＳｐａｒｃ（Ｐｕｎｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（３）：２９０－２９６，２０１７）ソフトウェアパッケージの組み合わせを使用して処理した。
クライオＥＭデータを、ＨＣＭＶ三量体に関する以前の研究（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４．ｅ１６，２０２１）と同様に、ＲＥＬＩＯＮ（Ｓｃｈｅｒｅｓ，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１８０（３）：５１９－５３０，２０１２）、ｃｉｓＴＥＭ（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，７：ｅ３５３８３，２０１８）、及びｃｒｙｏＳｐａｒｃ（Ｐｕｎｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（３）：２９０－２９６，２０１７）ソフトウェアパッケージの組み合わせを使用して処理した。
ＨＣＭＶ五量体－２Ｃ１２－７Ｉ１３－１３Ｈ１１のクライオＥＭデータを、図１３Ａ～１３Ｈに記載されているように処理した。最初のａｂ－ｉｎｉｔｉｏ再構成の生成のために、１８，３２６の動画を動き補正し、コントラスト伝達関数パラメータをｃｉｓＴＥＭ内で適合させた。ｃｉｓＴＥＭ内の円形ブロブピッキングツールを使用して、合計１，５２７，８０２，７６６個の潜在的な粒子をピッキングした。２ラウンドのｃｉｓＴＥＭ ２Ｄ分類で粒子を選別して、最良に整列する粒子を選択し、１８４，８３３個の粒子を得た。これらの粒子を、３つの標的体積を有するｃｉｓＴＥＭ内でａｂ－ｉｎｉｔｉｏ ３Ｄ生成に供した。Ｆａｂ ２Ｃ１２、７Ｉ１３及び１３Ｈ１１に結合したＨＣＭＶ五量体に対応する体積を、高分解能３Ｄ精密化のための３Ｄ参照として使用した。五量体－２Ｃ１２－７Ｉ１３－１３Ｈ１１複合体の高分解能３Ｄ再構成の生成のために、ＲＥＬＩＯＮにおけるＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４：３３１－３３２，２０１７）実装を使用してフレーム動きについて１８，３２６の動画すべてを補正し、ＣＴＦＦＩＮＤ－４（Ｒｏｈｏｕ ａｎｄ Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９２（２）：２１６－２２１，２０１５）を用いて、スペクトルの３０～４．５Å帯域を使用してコントラスト伝達関数パラメータを適合させた。ＣＴＦ適合画像を、８Åより良好な検出されたフィット分解能に基づいてフィルタリングした。３０Åのローパスフィルターをかけた五量体－２Ｃ１２－７Ｉ１３－１３Ｈ１１複合体参照構造を用いて、ｇａｕｔｏｍａｔｃｈ（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）によるテンプレートマッチングによって合計５，１２８，２６４個の粒子をピッキングした。ＲＥＬＩＯＮ ２Ｄ分類中に粒子を選別し、選択した４，７９２，９８４個の粒子を３ＤリファインメントのためにｃｉｓＴＥＭにインポートした。最初の五量体－２Ｃ１２－７Ｉ１３－１３Ｈ１１再構成は、五量体－２Ｃ１２－７Ｉ１３－１３Ｈ１１複合体の周りのマスクを用いて、マスクの外側にローパスフィルター（フィルター分解能２０Å）及び０．３０のスコア閾値を適用することによって自動精密化及び手動精密化した後に得られたので、各サイクルで粒子画像の最高スコアの３０％のみが３Ｄ再構成に含まれる。マスクの外側の重量は、反復ラウンドの手動精密化で０．５から０．１５に徐々に減少した（精密化では３．８Åを超えるデータは使用しなかった）。マップの品質を改善するために、マスクを使用してマップを３つの異なる領域に分割し、マスクの外側にローパスフィルター（フィルター分解能２０Å）及び０．２０のスコア閾値を適用した後、集中的精密化を行った。フォーカスマップは、以下のパラメータを用いてｃｉｓＴＥＭで鮮明にした：８Åの分解能からの平坦化、逆空間の原点から８Åへの－９０Å２の事前カットオフＢ因子の適用、及び偏極効率フィルター（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３３（４）：７２１－７４５，２００３）の適用。モデル構築及び図面作成のために、ｐｈｅｎｉｘ ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｆｏｃｕｓｅｄ＿ｍａｐｓ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７４（６）：５３１－５４４，２０１８）を使用して３つの個々のフォーカス３Ｄマップから合成マップを生成した。
ＨＣＭＶ五量体－ＴＨＢＤ－１３Ｈ１１－ＭＳＬ１０９のクライオＥＭデータを図１０Ａ～１０Ｆに記載されているように処理した。Ｒｅｌｉｏｎの動き補正の実装を使用して１０，９２６の動画を動き補正し、整列した顕微鏡写真をＣＴＦＦＩＮＤ４を介してＣＴＦ推定のためにｃｉｓＴＥＭにインポートした。３０Åの排除及びテンプレート半径を使用して、少なくとも５ÅのＣＴＦフィット分解能を有する合計９，１６７個の画像をａｂ－ｉｎｉｔｉｏ粒子ピッキングのために選択した。得られた１０，６８０，１６３個の粒子座標を、４００ピクセルのボックスサイズ及び１．０７Å／ピクセルを使用して抽出した。複数ラウンドの階層的２Ｄ分類及びクラス選択は、最終的に３つの粒子スタックをもたらした：二量体全体が明確に分解された２Ｄクラスからなる７８，５７７個の粒子スタック、二量体がほぼ完全に分解されたいくつかのさらなるクラスを含む１７２，３９８個の粒子スタック、及び少なくともいくつかの良好に分解された領域を有するすべての２Ｄクラスを含む５０４，４９２個の粒子スタック。７８，５７７個の粒子スタックからａｂ ｉｎｉｔｉｏ Ｃ２対称３Ｄマップを生成し、Ｃ２対称性を使用した自動３Ｄ精密化により、初期中間分解能初期マップが得られた。１７２，３９８個の粒子スタックをＲｅｌｉｏｎにエクスポートし、Ｃ２対称初期マップを、最初にＣ２で、最終的にＣ２対称性緩和を伴うＣ１対称性を用いて、３Ｄ自動精密化のテンプレートとして使用した。これにより、単一の非対称に結合したＴＨＢＤが二量体接触面で分解された中間分解能のＨＣＭＶ五量体二量体マップが得られた。ｃｉｓＴＥＭに戻って、次いで、完全分子マスク及び３つの異なるフォーカスマスクを使用して、この非対称マップに対して最も包括的な５０４，４９２個の粒子スタックをＣ１で精密化した：両方のプロトマーのＴＨＢＤ及びＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１のみを含むもの、偽二量体の単一プロトマーのｇＬ、ｇＨ、１３Ｈ１１及びＭＳＬ１０９のみを含むもの、並びに他方のプロトマーのｇＬ、ｇＨ、１３Ｈ１１及びＭＳＬ１０９のみを含むもの。Ｐｈｅｎｉｘ ＲｅｓｏｌｖｅクライオＥＭ密度修正をこれらの各々に適用し、モデル構築に使用される最終マップを、相関によって完全分子マップにフォーカスマップを適合させ、共通のグリッドに再サンプリングし、各ボクセルについて３つのフォーカスマップの間で最も高い値（ｖｏｐ ｍａｘｉｍｕｍ）をとることによって、ＵＣＳＦキメラの密度修正マップを組み合わせて生成した。局所分解能を、Ｒｅｌｉｏｎ後処理を使用して、鮮明化されておらず、フィルター処理されていないハーフマップから計算した。
ＨＣＭＶ五量体－ＮＲＰ２－１３Ｈ１１－８Ｉ２１クライオＥＭデータを図６Ａ～６Ｉに記載されているように処理した。２１，３５７の動画をＲｅｌｉｏｎを使用して動き補正し、ＣＴＦパラメータをＣＴＦＦＩＮＤ４で推定し、少なくとも５ÅのＣＴＦフィット分解能を有する画像をさらなる処理のために選択した。Ｒｅｌｉｏｎ ａｂ－ｉｎｉｔｏ Ｌａｐｌａｃｅ－ｏｆ－Ｇａｕｓｓｉａｎ粒子ピッキングは９８２，３１３個の粒子座標をもたらし、これを１４２ピクセルのボックスサイズ及び３Åのピクセルサイズを使用して抽出した。２Ｄ分類後、見かけのＨＣＭＶ五量体の２Ｄクラス（６９，７６７粒子）を４００ピクセル及び１．０７Å／ピクセルのボックスサイズに再抽出し、Ｒｅｌｉｏｎ ａｂ ｉｎｉｔｏ ３Ｄ精密化、続いて３Ｄ自動精密化に供し、初期五量体マップを得た。二量体五量体－ＮＲＰ２－８Ｉ２１－１３Ｈ１１については、２Ｄクラス選択をＲｅｌｉｏｎテンプレートベースの粒子ピッキングのテンプレートとして使用し、１，３００，８４４個の座標を得た。これらの座標を４００ピクセル及び１．０７Å／ピクセルのボックスサイズに抽出し、階層的２Ｄ分類及び選択に供し、最終的に７２，７４５個の粒子を得た。これらの粒子を直接ｃｉｓＴＥＭにインポートし、完全分子マスクを使用して初期二量体五量体マップに対して精密化した（６．７Åを超えるデータは精密化に使用しなかった）。単量体五量体－ＮＲＰ２－８Ｉ２１－１３Ｈ１１複合体については、少なくとも６ÅのＣＴＦフィット分解能を有する２１，３５７の画像をさらなる処理のために選択した。合計２，５３２，２０６個の粒子を、ｇａｕｔｏｍａｔｃｈ（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を用いた３０Åローパスフィルターをかけた単一の五量体－ＮＲＰ２－８Ｉ２１－１３Ｈ１１再構成からの投影とのテンプレートマッチングによってピッキングした。粒子を、６６ｐｘのボックスサイズ及び５．４Åのピクセルサイズを使用して抽出し、Ｒｅｌｉｏｎ ２Ｄ分類を使用して選別し、２，２５２，９２４個の粒子を２８０ｐｘのボックスサイズ及び１．３５Åのｐｘサイズで抽出した。これらの粒子をｃｉｓＴＥＭに直接インポートし、完全分子マスクを使用して初期単量体五量体マップに対して精密化した（４Åを超えるデータは精密化に使用しなかった）。マップの品質を改善するために、マスクを使用してマップを３つの異なる領域に分割し、マスクの外側にローパスフィルター（フィルター分解能２０Å）及び０．２０のスコア閾値を適用した後、集中的精密化を行った。Ｐｈｅｎｉｘ ＲｅｓｏｌｖｅクライオＥＭ密度修正をこれらのマップの各々に適用し、次いで、ＵＣＳＦキメラの密度修正マップを組み合わせることによって、モデル構築に使用される最終マップを生成した。局所分解能を、二量体五量体ＮＲＰ２－８Ｉ２１－１３Ｈ１１についてのＲｅｌｉｏｎ後処理を使用して、鮮明化されておらず、フィルター処理されていないハーフマップから計算した。単量体五量体－ＮＲＰ２－８Ｉ２１－１３Ｈ１１複合体については、ｂｌｏｃｒｅｓアルゴリズムの再実装を使用してｃｉｓＴＥＭで局所分解能を決定した。
ｖ．モデル構築及び構造解析
ＨＣＭＶ五量体構造のｇＨ及びｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１Ａサブユニット（Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（３０）：２０１７）を剛体としてクライオＥＭマップに当てはめた。ＴＨＢＤレクチンドメインを、ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４６（Ｗ１）：Ｗ２９６－Ｗ３０３，２０１８）を使用してヒトＲｅｇＩＩａｌｐｈａ（ＰＤＢ：４ＭＴＨ、（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５０５（７４８１）：１０３－１０７，２０１４））の相同性モデルに基づいて構築した。ＮＲＰ２の構造（ＰＤＢ：２ＱＱＯ）を、ＮＲＰ２ ａ１－ａ２－ｂ１ｂ２ドメインのモデル化のためのテンプレートとして使用した。得られたモデルを剛体としてクライオＥＭマップに当てはめた。広範な再構築及び手動調整の後、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７４（６）：５３１－５４４，２０１８）ツールを用いた複数ラウンドの実空間精密化を使用して、初期モデルとマップとの間のグローバルな構造差を補正した。Ｉｓｏｌｄｅ（Ｃｒｏｌｌ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，Ｄ７４：５１９－５３０，２０１８）及びＰｈｅｎｉｘ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７４（６）：５３１－５４４，２０１８）におけるモデル構築及び実空間精密化の反復ラウンドを通して、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６（４）：４８６－５０１，２０１０）においてモデルをさらに手動で調整した。モデルを、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙスコアリング（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２７（１）：２９３－３１５，２０１８）が内蔵されたｐｈｅｎｉｘ．ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ｃｒｙｏｅｍ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７４（６）：５３１－５４４，２０１８）を使用して検証した。ＰｙＭＯＬ（ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，ｖ．２．０７ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）及びＵＣＳＦ ＣｈｉｍｅｒａＸ（Ｇｏｄｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２７（１）：１４－２５，２０１８）を使用して図を作成した。ＪａｌＶｉｅｗ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５（９）：１１８９－１１９１，２００９）内のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．，７（１），２０１１）を使用して配列を整列させ、ＥＳＰｒｉｐｔ ３．０（Ｒｏｂｅｒｔ ａｎｄ Ｇｏｕｅｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２（Ｗ１）：Ｗ３２０－Ｗ３２４，２０１４）で示した。
ＨＣＭＶ五量体構造のｇＨ及びｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１Ａサブユニット（Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（３０）：２０１７）を剛体としてクライオＥＭマップに当てはめた。ＴＨＢＤレクチンドメインを、ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４６（Ｗ１）：Ｗ２９６－Ｗ３０３，２０１８）を使用してヒトＲｅｇＩＩａｌｐｈａ（ＰＤＢ：４ＭＴＨ、（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５０５（７４８１）：１０３－１０７，２０１４））の相同性モデルに基づいて構築した。ＮＲＰ２の構造（ＰＤＢ：２ＱＱＯ）を、ＮＲＰ２ ａ１－ａ２－ｂ１ｂ２ドメインのモデル化のためのテンプレートとして使用した。得られたモデルを剛体としてクライオＥＭマップに当てはめた。広範な再構築及び手動調整の後、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅａｌ＿ｓｐａｃｅ＿ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７４（６）：５３１－５４４，２０１８）ツールを用いた複数ラウンドの実空間精密化を使用して、初期モデルとマップとの間のグローバルな構造差を補正した。Ｉｓｏｌｄｅ（Ｃｒｏｌｌ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，Ｄ７４：５１９－５３０，２０１８）及びＰｈｅｎｉｘ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７４（６）：５３１－５４４，２０１８）におけるモデル構築及び実空間精密化の反復ラウンドを通して、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６（４）：４８６－５０１，２０１０）においてモデルをさらに手動で調整した。モデルを、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙスコアリング（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２７（１）：２９３－３１５，２０１８）が内蔵されたｐｈｅｎｉｘ．ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ｃｒｙｏｅｍ（Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７４（６）：５３１－５４４，２０１８）を使用して検証した。ＰｙＭＯＬ（ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，ｖ．２．０７ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）及びＵＣＳＦ ＣｈｉｍｅｒａＸ（Ｇｏｄｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２７（１）：１４－２５，２０１８）を使用して図を作成した。ＪａｌＶｉｅｗ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５（９）：１１８９－１１９１，２００９）内のＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．，７（１），２０１１）を使用して配列を整列させ、ＥＳＰｒｉｐｔ ３．０（Ｒｏｂｅｒｔ ａｎｄ Ｇｏｕｅｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２（Ｗ１）：Ｗ３２０－Ｗ３２４，２０１４）で示した。
ｖｉ．細胞及びウイルス
これらの試験に使用した細胞は、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８に記載されているものと同じであった。ＡＲＰＥ－１９は、自然発生する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２３０２）に由来する雄性細胞株であり、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤ－ＭＥＭ／Ｆ－１２＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。ＨＡＰ－１細胞は、ＫＢＭ－７細胞株に由来する雄性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株であり、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨから入手し、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンの存在下でイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、男性及び女性ドナーからのプール）をＬｏｎｚａから入手し、Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ ＩＲＣＣＳ Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ Ｓａｎ Ｍａｔｔｅｏ，Ｐａｖｉａ，Ｉｔａｌｙによって提供され、ＥＮＤＯＧＲＯ（商標）－ＶＥＧＦ完全培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で培養した。ＨＥＫ２９３ＦＴは、ＳＶ４０ラージＴ抗原（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で形質転換されたヒト胎児性腎細胞に由来する雌性ヒト胎児性腎細胞株分離株である。ＨＥＫ ２９３ＦＴ細胞株を、Ｄ－ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、１ｍＭ ＭＥＭピルビン酸ナトリウム及び５００ｍｇ／ｍＬ ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。すべての細胞株がマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）を含まないことが確認された。ＨＣＭＶ臨床分離株ＶＲ１８１４は、Ｖｉｒｏｌｏｇｉａ ｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ ＩＲＣＣＳ Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ Ｓａｎ Ｍａｔｔｅｏ，Ｐａｖｉａ，Ｉｔａｌｙによって提供された。ＨＣＭＶ ＶＲ１８１４をＨＵＶＥＣ中で増殖させた。ＡＲＰＥ－１９及びＨＡＰ－１細胞を、それぞれＡＴＣＣ及びＨｏｒｉｚｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨでのショートタンデムリピート（ＳＴＲ）遺伝子座の分析によって認証した。ＨＵＶＥＣは、ＣＤ３１／１０５、フォン・ヴィレブランド因子ＶＩＩＩの発現によって認証され、アセチル化低密度リポタンパク質取り込みについて陽性である。ＨＥＫ２９３ＦＴをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、高力価の感染性レンチウイルス粒子を産生する能力によって認証した。
これらの試験に使用した細胞は、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８に記載されているものと同じであった。ＡＲＰＥ－１９は、自然発生する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２３０２）に由来する雄性細胞株であり、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤ－ＭＥＭ／Ｆ－１２＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。ＨＡＰ－１細胞は、ＫＢＭ－７細胞株に由来する雄性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株であり、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨから入手し、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンの存在下でイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、男性及び女性ドナーからのプール）をＬｏｎｚａから入手し、Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ ＩＲＣＣＳ Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ Ｓａｎ Ｍａｔｔｅｏ，Ｐａｖｉａ，Ｉｔａｌｙによって提供され、ＥＮＤＯＧＲＯ（商標）－ＶＥＧＦ完全培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で培養した。ＨＥＫ２９３ＦＴは、ＳＶ４０ラージＴ抗原（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で形質転換されたヒト胎児性腎細胞に由来する雌性ヒト胎児性腎細胞株分離株である。ＨＥＫ ２９３ＦＴ細胞株を、Ｄ－ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、１ｍＭ ＭＥＭピルビン酸ナトリウム及び５００ｍｇ／ｍＬ ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。すべての細胞株がマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）を含まないことが確認された。ＨＣＭＶ臨床分離株ＶＲ１８１４は、Ｖｉｒｏｌｏｇｉａ ｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ ＩＲＣＣＳ Ｐｏｌｉｃｌｉｎｉｃｏ Ｓａｎ Ｍａｔｔｅｏ，Ｐａｖｉａ，Ｉｔａｌｙによって提供された。ＨＣＭＶ ＶＲ１８１４をＨＵＶＥＣ中で増殖させた。ＡＲＰＥ－１９及びＨＡＰ－１細胞を、それぞれＡＴＣＣ及びＨｏｒｉｚｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨでのショートタンデムリピート（ＳＴＲ）遺伝子座の分析によって認証した。ＨＵＶＥＣは、ＣＤ３１／１０５、フォン・ヴィレブランド因子ＶＩＩＩの発現によって認証され、アセチル化低密度リポタンパク質取り込みについて陽性である。ＨＥＫ２９３ＦＴをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、高力価の感染性レンチウイルス粒子を産生する能力によって認証した。
ｖｉｉ．フローサイトメトリー染色
フローサイトメトリー染色を、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８に記載されているように実施した。細胞表面染色のために、接着細胞（ＡＲＰＥ－１９、ＨＵＶＥＣ及びＨＡＰ－１）をセルスクレーパーで静かに剥離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ中で、２μｇ／ｍｌの特異的抗ニューロピリン２抗体及び抗ＣＤ４６抗体（ＡＦ２２１５及びＡＦ２００５、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗トロンボモジュリン抗体（クローン１４１Ｃ０１、Ａｂｃａｍ）、又はアイソタイプ対照として正常ヒツジＩｇＧ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞を、２ｍｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４コンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体と共に氷上で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターで取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析を行った。
フローサイトメトリー染色を、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８に記載されているように実施した。細胞表面染色のために、接着細胞（ＡＲＰＥ－１９、ＨＵＶＥＣ及びＨＡＰ－１）をセルスクレーパーで静かに剥離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ中で、２μｇ／ｍｌの特異的抗ニューロピリン２抗体及び抗ＣＤ４６抗体（ＡＦ２２１５及びＡＦ２００５、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗トロンボモジュリン抗体（クローン１４１Ｃ０１、Ａｂｃａｍ）、又はアイソタイプ対照として正常ヒツジＩｇＧ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞を、２ｍｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４コンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体と共に氷上で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターで取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析を行った。
ｖｉｉｉ．ウイルスの微量中和
抗体及び可溶型組換えタンパク質の段階希釈物をＨＣＭＶ臨床分離株（ＶＲ１８１４株）と共に３７℃で１時間プレインキュベートし、９６ウェル平底プレート（感染多重度（ＭＯＩ）１）で培養したＡＲＰＥ－１９、ＨＵＶＥＣ又はＨＡＰ－１細胞のコンフルエントな単層に添加した。段階希釈（１：３）を微量中和アッセイに使用し、最初の希釈は２０μｇ／ｍＬであった。感染細胞を３日後に回収し、ＢＤ ＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で固定し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ中で、２μｇ／ｍＬの特異的マウス抗ｐｐ７２抗体（クローン６Ｅ１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳＣ－６９８３４）又はアイソタイプ対照と共に氷上で３０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞を２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。死細胞を、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色することによって計数から除外した。ＦＡＣＳ ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを用いて試料を取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析を行った。感染細胞のパーセンテージをＦＡＣＳによって計算した。相対的感染細胞をＭＦＩシグナルに対してプロットすることによって用量反応曲線を作成した。感染の５０％の阻害を引き起こす濃度（ＩＣ５０）を、Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた非線形回帰によって計算した。
抗体及び可溶型組換えタンパク質の段階希釈物をＨＣＭＶ臨床分離株（ＶＲ１８１４株）と共に３７℃で１時間プレインキュベートし、９６ウェル平底プレート（感染多重度（ＭＯＩ）１）で培養したＡＲＰＥ－１９、ＨＵＶＥＣ又はＨＡＰ－１細胞のコンフルエントな単層に添加した。段階希釈（１：３）を微量中和アッセイに使用し、最初の希釈は２０μｇ／ｍＬであった。感染細胞を３日後に回収し、ＢＤ ＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で固定し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ中で、２μｇ／ｍＬの特異的マウス抗ｐｐ７２抗体（クローン６Ｅ１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳＣ－６９８３４）又はアイソタイプ対照と共に氷上で３０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞を２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。死細胞を、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色することによって計数から除外した。ＦＡＣＳ ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを用いて試料を取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析を行った。感染細胞のパーセンテージをＦＡＣＳによって計算した。相対的感染細胞をＭＦＩシグナルに対してプロットすることによって用量反応曲線を作成した。感染の５０％の阻害を引き起こす濃度（ＩＣ５０）を、Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた非線形回帰によって計算した。
ｉｘ．遺伝子過剰発現及び遺伝子ＫＯ
これらの試験のための遺伝子過剰発現及びノックアウト（ＫＯ）を、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８に記載されているように実施した。ヒトＮｒｐ２（アクセッション番号ＡＦ０２２８６０）、ＣＤ４６（アクセッション番号ＮＭ＿００２３８９）及びＴＨＢＤ（アクセッション番号ＡＦ４９５４７１）をＧｅｎＥＺ ＯＲＦデータベース（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）から発注し、ｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。レンチウイルス粒子を、ｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）及びｐｓＰＡＸ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いたＨＥＫ２９３ＦＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＰＥＩトランスフェクションによって作製し、スクロースクッションで精製した。ＮＲＰ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＨＡＰ－１ ＫＯは、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨによって生成された。レンチウイルスで形質導入されたＨＡＰ－１細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３日間選択した。単一クローンを増殖させ、標的遺伝子の有効なＫＯをフローサイトメトリーによって分析し、サンガー配列決定によって確認した。ＮＲＰ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に使用したガイドＲＮＡは５’＿ＧＧＧＴＡＧＴＣＣＴＧＧＧＧＧＴＡＡＣＣ＿３’（配列番号８）であった。
これらの試験のための遺伝子過剰発現及びノックアウト（ＫＯ）を、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８に記載されているように実施した。ヒトＮｒｐ２（アクセッション番号ＡＦ０２２８６０）、ＣＤ４６（アクセッション番号ＮＭ＿００２３８９）及びＴＨＢＤ（アクセッション番号ＡＦ４９５４７１）をＧｅｎＥＺ ＯＲＦデータベース（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）から発注し、ｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。レンチウイルス粒子を、ｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）及びｐｓＰＡＸ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いたＨＥＫ２９３ＦＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＰＥＩトランスフェクションによって作製し、スクロースクッションで精製した。ＮＲＰ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＨＡＰ－１ ＫＯは、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨによって生成された。レンチウイルスで形質導入されたＨＡＰ－１細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３日間選択した。単一クローンを増殖させ、標的遺伝子の有効なＫＯをフローサイトメトリーによって分析し、サンガー配列決定によって確認した。ＮＲＰ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に使用したガイドＲＮＡは５’＿ＧＧＧＴＡＧＴＣＣＴＧＧＧＧＧＴＡＡＣＣ＿３’（配列番号８）であった。
ｘ．拡散アッセイ
細胞拡散を調べるために、ＨＡＰ １細胞単層に、０．１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＨＣＭＶ ＶＲ１８１４を接種した（ウイルスをＡＲＰＥ－１９細胞で滴定した）。次いで、感染細胞培養物を２日目又は８日目に、２μｇ／ｍＬのマウス抗ｐｐ７２抗体（クローン６Ｅ１．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳＣ－６９８３４）又はアイソタイプ対照で、氷上で３０分間染色した。感染したＨＡＰ１－Ｎｒｐ２ ＫＯを対照として使用し、いかなる感染の存在も示さなかった。
細胞拡散を調べるために、ＨＡＰ １細胞単層に、０．１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＨＣＭＶ ＶＲ１８１４を接種した（ウイルスをＡＲＰＥ－１９細胞で滴定した）。次いで、感染細胞培養物を２日目又は８日目に、２μｇ／ｍＬのマウス抗ｐｐ７２抗体（クローン６Ｅ１．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳＣ－６９８３４）又はアイソタイプ対照で、氷上で３０分間染色した。感染したＨＡＰ１－Ｎｒｐ２ ＫＯを対照として使用し、いかなる感染の存在も示さなかった。
ｘｉ．バイオレイヤー干渉法
ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｆａｂ、及びＨＣＭＶ五量体の間の相互作用を、以前に記載されているように（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４，２０２１）、ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｒｅｄ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用するバイオレイヤー干渉法によって分析した。すべてのデータは、９６ウェル黒色平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）を使用して２５℃で収集した。組換えＮＲＰ２－Ｆｃ又はＴＨＢＤ－Ｆｃタンパク質を抗ヒトＦｃ被覆（ＡＨＣ）センサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上に捕捉し、可溶型被分析物としてＣＭＶ五量体への結合について試験した。センサーを、ＰＢＳにおけるアッセイの前に、製造者の指示に従って１０分間平衡化した。負荷、ベースライン、会合及び解離を含むすべての工程をＰＢＳ中で実施した。ＨＣＭＶ五量体とＮＲＰ２ ＷＴ及び変異タンパク質との間の相対的結合を比較するために、ＮＲＰ２－Ｆｃタンパク質をＡＨＣセンサー上に捕捉し、５０ｎＭ濃度の可溶型被分析物として五量体への結合について試験した。ＮＲＰ２変異タンパク質への結合を、ＮＲＰ２ ＷＴタンパク質への結合と比較して表した。会合工程の終了時の結合単位を使用して、プロットに示される相対的結合を計算した。ＮＲＰ２－ＴＨＢＤ競合実験のために、ＴＨＢＤ－Ｆｌａｇを、予備平衡化した五量体－ＮＲＰ２－Ｆｃ複合体と比較して異なる濃度（１：１；１：１０；１：５０；１：１００モル過剰）で添加した。Ｆａｂ競合実験のために、Ｆａｂ ２Ｃ１２、７Ｉ１３、８Ｉ２１、１３Ｈ１１又はＭＳＬ－１０９を、予備平衡化した五量体－ＮＲＰ２－Ｆｃ複合体に１００μｇ／ｍｌの濃度で過剰に添加した。すべての場合に、データは、ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｒｅｄ９６装置（Ｆｏｒｔｅ Ｐａｌｌソフトウェアバージョン９．０）を使用して取得した。その後、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を動態パラメータの計算に利用した。データを１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。
ＮＲＰ２、ＴＨＢＤ、Ｆａｂ、及びＨＣＭＶ五量体の間の相互作用を、以前に記載されているように（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４，２０２１）、ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｒｅｄ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用するバイオレイヤー干渉法によって分析した。すべてのデータは、９６ウェル黒色平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）を使用して２５℃で収集した。組換えＮＲＰ２－Ｆｃ又はＴＨＢＤ－Ｆｃタンパク質を抗ヒトＦｃ被覆（ＡＨＣ）センサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上に捕捉し、可溶型被分析物としてＣＭＶ五量体への結合について試験した。センサーを、ＰＢＳにおけるアッセイの前に、製造者の指示に従って１０分間平衡化した。負荷、ベースライン、会合及び解離を含むすべての工程をＰＢＳ中で実施した。ＨＣＭＶ五量体とＮＲＰ２ ＷＴ及び変異タンパク質との間の相対的結合を比較するために、ＮＲＰ２－Ｆｃタンパク質をＡＨＣセンサー上に捕捉し、５０ｎＭ濃度の可溶型被分析物として五量体への結合について試験した。ＮＲＰ２変異タンパク質への結合を、ＮＲＰ２ ＷＴタンパク質への結合と比較して表した。会合工程の終了時の結合単位を使用して、プロットに示される相対的結合を計算した。ＮＲＰ２－ＴＨＢＤ競合実験のために、ＴＨＢＤ－Ｆｌａｇを、予備平衡化した五量体－ＮＲＰ２－Ｆｃ複合体と比較して異なる濃度（１：１；１：１０；１：５０；１：１００モル過剰）で添加した。Ｆａｂ競合実験のために、Ｆａｂ ２Ｃ１２、７Ｉ１３、８Ｉ２１、１３Ｈ１１又はＭＳＬ－１０９を、予備平衡化した五量体－ＮＲＰ２－Ｆｃ複合体に１００μｇ／ｍｌの濃度で過剰に添加した。すべての場合に、データは、ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｒｅｄ９６装置（Ｆｏｒｔｅ Ｐａｌｌソフトウェアバージョン９．０）を使用して取得した。その後、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を動態パラメータの計算に利用した。データを１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。
ｘｉｉ．定量化及び統計分析
図６Ａ～６Ｉ、９Ａ～９Ｄ、１１Ａ、及び１１Ｂにおいて、クライオＥＭ密度マップの分解能推定値は、０．１４３フーリエシェル相関（ＦＳＣ）基準（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３３（４）：７２１－７４５，２００３）に基づいている。
図６Ａ～６Ｉ、９Ａ～９Ｄ、１１Ａ、及び１１Ｂにおいて、クライオＥＭ密度マップの分解能推定値は、０．１４３フーリエシェル相関（ＦＳＣ）基準（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３３（４）：７２１－７４５，２００３）に基づいている。
図３Ａ及び３Ｂにおいて、ｎの正確な値、精度尺度（幾何平均±ＳＥＭ）、及び統計学的有意性を含む統計学的パラメータが、図面及び「図面の簡単な説明」に報告されている。データは、ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であると判定した。サンプルサイズを事前決定するために統計的方法を使用せず、試験者の盲検化は必要なく、データポイントは除外しなかった。２つの群の比較のための両側ノンパラメトリックマンホイットニーＵ検定、又は３つ以上の群を比較する場合のクラスカル・ウォリスの検定（及びＤｕｎｎの事後検定）を使用して、Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）でデータを分析した（アスタリスクは統計学的有意性を示す ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。細胞表面相互作用のスクリーンデータを分析し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４．７）を使用して表した。
実施例２．五量体－ＮＲＰ２受容体結合の構造的基礎
ＨＣＭＶ糖タンパク質複合体の以前の構造試験は、これらの分子がそれらの固有の柔軟性、細長い性質、及び多数のグリコシル化部位のために高分解能構造決定に不応性であることを示している（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１２（６）：１７６７－１７７２，２０１５）。したがって、ＨＣＭＶ五量体を、ニューロピリン２（ＮＲＰ２）の可溶型エクトドメイン並びに中和Ｆａｂ １３Ｈ１１及び８Ｉ２１との複合体で再構成し、単粒子クライオ電子顕微鏡法（クライオＥＭ）を使用してそれらの構造を決定した（図１Ａ～１Ｈ及び６Ａ～６Ｉ）。二次元クラス平均により、２つの粒子集団が同定された。１つの集団は単量体であり、１つの五量体が１コピーのＮＲＰ２に結合した粒子の大部分を表していた。予想外に、２つの五量体複合体が単一のＮＲＰ２分子の周りに巻き付けられ、ヘッド・トゥ・ヘッド様式で配置された第２の二量体集団が同定された（図６Ｄ～６Ｆ）。
ＨＣＭＶ糖タンパク質複合体の以前の構造試験は、これらの分子がそれらの固有の柔軟性、細長い性質、及び多数のグリコシル化部位のために高分解能構造決定に不応性であることを示している（Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１２（６）：１７６７－１７７２，２０１５）。したがって、ＨＣＭＶ五量体を、ニューロピリン２（ＮＲＰ２）の可溶型エクトドメイン並びに中和Ｆａｂ １３Ｈ１１及び８Ｉ２１との複合体で再構成し、単粒子クライオ電子顕微鏡法（クライオＥＭ）を使用してそれらの構造を決定した（図１Ａ～１Ｈ及び６Ａ～６Ｉ）。二次元クラス平均により、２つの粒子集団が同定された。１つの集団は単量体であり、１つの五量体が１コピーのＮＲＰ２に結合した粒子の大部分を表していた。予想外に、２つの五量体複合体が単一のＮＲＰ２分子の周りに巻き付けられ、ヘッド・トゥ・ヘッド様式で配置された第２の二量体集団が同定された（図６Ｄ～６Ｆ）。
１３Ｈ１１及び８Ｉ２１に結合した単量体五量体－ＮＲＰ２複合体の構造を、～３．１Å（図６Ｇ～６Ｉ）の分解能まで決定した。フォーカス３Ｄ再構成により、五量体－１３Ｈ１１－８Ｉ２１複合体の大部分並びにＮＲＰ２ ａ２、ｂ１及びｂ２ドメインの構造モデルを構築することができた。（図１Ｃ、１Ｄ及び７Ａ並びに表１）。ＮＲＰ２のａ１ドメインの密度は、おそらく柔軟性又はａ１ドメインが異なる配向で五量体と緩く相互作用する能力に起因して、複合体の残りの部分よりも弱かった（図１Ｄ及び６Ｇ）。タンパク質コンストラクト及び試料中に存在するにもかかわらず、ＮＲＰ２のＣ末端ＭＡＭドメインについて密度は観察されなかった。
以前の観察結果（Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｐ．２０２１．０３．２５．４３６８０４，２０２１）と一致して、ＮＲＰ２と五量体との間の相互作用の３つの主要な部位が同定された（図１Ｅ～１Ｇ）。部位１では、ＮＲＰ２のａ２ドメイン中のカルシウム配位領域が、五量体のＵＬ１２８のＮ末端ドメインに局在する残基との電荷相互作用を確立する（図１Ｅ～１Ｇ）。具体的には、ＮＲＰ２－Ｄ１９７及びＮＲＰ２－Ｄ２５２はＵＬ１２８－Ｋ４７と相互作用し、ＮＲＰ２－Ｎ１７２はＵＬ１２８－Ｒ５７と接触する（図１Ｅ）。部位２は、ＮＲＰ２のｂ２ドメインと、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１ＡのＣ末端鎖との間に確立される（図１Ｆ及び１Ｇ）。特に、部位１又は部位２のいずれかにおける五量体上の電荷反転変異がＮＲＰ２結合を破壊することが見出された（図１Ｈ）。結合していないＮＲＰ２構造と比較して、ａ１ドメインは、五量体結合時にａ２ｂ１ｂ２コアから移動し、ＵＬ１２８とｇＬとの間の結合部位でＵＬ成分の凹面に沿って収容された第３の相互作用部位、部位３に再配置される（図１Ｄ）。この領域はクライオＥＭマップにおいて十分に分解されず、ＮＲＰ２が、より低い程度ではあるが、ａ１ドメインの非存在下で依然として五量体と相互作用することができるという所見（Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｐ．２０２１．０３．２５．４３６８０４，２０２１）と一致して、単量体五量体へのａ１ドメイン結合が動的であることを示唆している。
ＮＲＰ１及びＮＲＰ２の折り畳みは保存されているが、ＨＣＭＶ五量体とのＮＲＰ２相互作用の部位はＮＲＰ１において異なっており、これは、ＮＲＰ２受容体の特異性についての構造的根拠を提供する（図８Ａ～８Ｃ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２６：４９０２－４９１２，２００７）。興味深いことに、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２タンパク質は、それらのそれぞれのｂ１ドメインが結合パートナー中の［Ｒ／Ｋ］ＸＸ［Ｒ／Ｋ］（ＣｅｎｄＲ）モチーフと相互作用する方法を介して、ＶＥＧＦ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を含むいくつかの共通パートナーと相互作用することが公知である（Ｄａｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３７０（６５１８）：８６１－８６５，２０２０；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７（１４）：１１０８２－１１０８９，２０１２）。しかしながら、本明細書に提示される構造及びＭｃＬｅｌｌａｎグループからの研究（Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｐ．２０２１．０３．２５．４３６８０４，２０２１）は、五量体とＮＲＰ２との間の相互作用がｂ１ドメイン上のこの共通の結合表面を含まず、むしろＮＲＰ２のａ２及びｂ２ドメインと五量体のＵＬ成分、特にＵＬ１２８及びＵＬ１３１Ａとの間の特異的相互作用を必要とすることを明確に実証している（図１Ｅ～１Ｇ及び８Ｄ；Ｄａｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３７０：８６１－８６５，２０２０；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７：１１０８２－１１０８９，２０１２）。これらの特徴は、五量体が相互作用することができる多種多様な細胞タンパク質の根底にある構造的経済性を強調する。
五量体とのＮＲＰ２受容体相互作用は、コンホメーション変化を伝播して、融合前ｇＢなどの他のＨＣＭＶ糖タンパク質結合を可能にするか又は不可能にし得る。ＮＲＰ２に結合した五量体のクライオＥＭ構造を、受容体の非存在下での五量体の以前に決定された結晶構造（ＰＤＢ：５ＶＯＢ（Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（３０）：２０１７））並びにＨＣＭＶ ｇＨｇＬｇＯ三量体の構造（ｇＨ及びｇＬサブユニットのみ（Ｋｓｃｈｏｎｓａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（５）：１２３２－１２４４，２０２１）と比較した。特に、以前の所見（Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｐ．２０２１．０３．２５．４３６８０４，２０２１）と一致して、ｇＨ／ｇＬの非常に類似したコンホメーションがすべての比較にわたって観察され（図９Ａ及び９Ｂ）、以下に論じるように、異なる機構がＨＣＭＶ融合機構の活性化の根底にあるに違いないことを暗示している。
実施例３．五量体－ＴＨＢＤ受容体結合の構造的基礎
次に、可溶型ＴＨＢＤエクトドメインと、ＨＣＭＶ五量体並びにＦａｂ １３Ｈ１１及びＭＳＬ－１０９との化学量論的複合体を再構成し、構造を～３．３Åの全体分解能まで決定した（図２Ａ～２Ｄ、７Ｂ及び１０Ａ～１０Ｆ並びに表１）。ＮＲＰ２ヘッド・トゥ・ヘッド五量体の二量体集団を連想させるが、二次元分類は、ＵＬ１２８サブユニットを介して相互作用するヘッド・トゥ・ヘッド様式で１つのＴＨＢＤ受容体の周りに巻き付けられた２つの五量体分子を明らかにした（図２Ｂ）。この二量体複合体構造において、ＴＨＢＤのＮ末端レクチン様ドメインは、２つの五量体分子の間に挟まれており、具体的には、ＵＬ１２８とｇＬとの相互作用部位でＵＬ成分によって形成される２つの凹面の間に挟み込まれている（図２Ｂ）。さらなる低分解能密度が宿主細胞膜上の受容体のアンカーポイントの方向に観察され、これはおそらくＴＨＢＤ ＴＭＥ１並びにそれをＵＬ１３０及びＵＬ１３１Ａサブユニットによって形成される五量体の凸面上のＴＨＢＤレクチン様ドメインに接続するリンカー領域に対応していた（図１１Ａ）。ＴＨＢＤの結合は、ＮＲＰ２－五量体複合体について観察されるように（図９Ｃ）、五量体のいかなる重要な構造再配列も誘導しなかった（補足図Ｓ４Ｄ）。
次に、可溶型ＴＨＢＤエクトドメインと、ＨＣＭＶ五量体並びにＦａｂ １３Ｈ１１及びＭＳＬ－１０９との化学量論的複合体を再構成し、構造を～３．３Åの全体分解能まで決定した（図２Ａ～２Ｄ、７Ｂ及び１０Ａ～１０Ｆ並びに表１）。ＮＲＰ２ヘッド・トゥ・ヘッド五量体の二量体集団を連想させるが、二次元分類は、ＵＬ１２８サブユニットを介して相互作用するヘッド・トゥ・ヘッド様式で１つのＴＨＢＤ受容体の周りに巻き付けられた２つの五量体分子を明らかにした（図２Ｂ）。この二量体複合体構造において、ＴＨＢＤのＮ末端レクチン様ドメインは、２つの五量体分子の間に挟まれており、具体的には、ＵＬ１２８とｇＬとの相互作用部位でＵＬ成分によって形成される２つの凹面の間に挟み込まれている（図２Ｂ）。さらなる低分解能密度が宿主細胞膜上の受容体のアンカーポイントの方向に観察され、これはおそらくＴＨＢＤ ＴＭＥ１並びにそれをＵＬ１３０及びＵＬ１３１Ａサブユニットによって形成される五量体の凸面上のＴＨＢＤレクチン様ドメインに接続するリンカー領域に対応していた（図１１Ａ）。ＴＨＢＤの結合は、ＮＲＰ２－五量体複合体について観察されるように（図９Ｃ）、五量体のいかなる重要な構造再配列も誘導しなかった（補足図Ｓ４Ｄ）。
ＴＨＢＤレクチン様ドメインは、６本のβ鎖（ｂ１～ｂ６）及びｂ２とｂ３との間に挿入された２つのαヘリックス（ａ１及びａ２）から構成される球状ドメインである（図１１Ｂ）。ＴＨＢＤの２つの対向する表面は、２つの係合五量体分子の同じ領域によって認識され、この接触面の顕著な構造的可塑性を明らかにする（図２Ｂ）。具体的には、ＵＬ１２８のＮ末端領域（ＵＬ１２８－Ｒ４２又はＵＬ１２８－Ｙ４４）は、それぞれＴＨＢＤ－Ｒ８３及びＴＨＢＤ－Ｅ１５４又はＴＨＢＤ－ａ１２３及びＴＨＢＤ－Ｌ１２５のいずれかと相互作用する（図２Ｂ）。同様に、残基ＵＬ１３０－Ｙ１６９を中心とするＵＬ１３０のヘアピンは、一方の側でＴＨＢＤ－Ｓ１４９と相互作用し、他方の側でＴＨＢＤ－Ｃ１３３と相互作用する（図２Ｂ）。さらに、五量体１のＣ末端領域ＵＬ１２８（ＵＬ１２８－Ｒ１３１、ＵＬ１２８－Ｎ１３４、ＵＬ１２８－Ｙ１３７）はＴＨＢＤ－Ｖ６６及びＴＨＢＤ－Ｄ６９と相互作用し、五量体２上の別個の領域ＵＬ１２８（ＵＬ１２８－Ｒ１５８、ＵＬ１２８－Ｒ１６３、ＵＬ１２８－Ｙ１６８）はＴＨＢＤ－Ｓ４９及びＴＨＢＤ－Ｄ５３と接触する（図２Ｂ）。全体として、この構造は、ＵＬ１２８サブユニット及びＵＬ１３０サブユニット上の重複領域におけるＴＨＢＤと五量体二量体との間の驚くほど大きくかつ多特異的な相互作用フットプリントを明らかにする（図２Ｃ及び２Ｄ）。
実施例４．ＴＨＢＤはＨＣＭＶの機能的受容体であり、五量体結合についてＮＲＰ２と競合する
ＴＨＢＤがＨＣＭＶの機能的受容体であるかどうかを決定するために、可溶型タンパク質及び抗体が上皮細胞及び内皮細胞におけるウイルス侵入を阻害する能力を試験した。予想されたように、組換えＮＲＰ２及びパンＮＲＰ抗体（Ａｐｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２６（２３）：４９０２－４９１２，２００７）は、上皮細胞及び内皮細胞におけるＨＣＭＶ感染を用量依存的に阻害した（図３Ａ；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）。組換えＴＨＢＤはウイルス感染をはるかに低い程度に減少させたが、組換えＴＨＢＤとＮＲＰ２との組み合わせは、ＮＲＰ２単独よりも高いレベルでＨＣＭＶ侵入を阻害し、ＨＣＭＶ感染におけるＴＨＢＤの潜在的な機能的役割を示唆しており（図３Ａ）、公表された結果と一致する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）。この仮説をさらに試験するために、ＮＲＰ２を欠く細胞におけるＨＣＭＶ侵入を媒介するＴＨＢＤの能力を調べた（図３Ｂ及び１２Ａ）。ＴＨＢＤの過剰発現は、ＨＡＰ－１野生型（ＷＴ）のＨＣＭＶ感染に最小限の影響しか及ぼさなかったが、ＮＲＰ２ノックアウト（ＫＯ）細胞におけるその過剰発現は、ウイルス侵入を劇的に増加させた（図３Ｂ、１２Ａ及び１２Ｂ）。対照として、０．１μｇ／ｍＬの８Ｉ２１ｍＡｂの存在下で実験を繰り返した。五量体特異的ｍＡｂの添加は感染を完全に消失させ、五量体特異的感染を確認した（図３Ｂ）。さらに、ＴＨＢＤ発現細胞はウイルスを拡散させることができることが観察された（図１２Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＮＲＰ２及びＴＨＢＤの両方が、独立した受容体又は共受容体として機能し得るＨＣＭＶの関連受容体であることを示している。
ＴＨＢＤがＨＣＭＶの機能的受容体であるかどうかを決定するために、可溶型タンパク質及び抗体が上皮細胞及び内皮細胞におけるウイルス侵入を阻害する能力を試験した。予想されたように、組換えＮＲＰ２及びパンＮＲＰ抗体（Ａｐｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２６（２３）：４９０２－４９１２，２００７）は、上皮細胞及び内皮細胞におけるＨＣＭＶ感染を用量依存的に阻害した（図３Ａ；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）。組換えＴＨＢＤはウイルス感染をはるかに低い程度に減少させたが、組換えＴＨＢＤとＮＲＰ２との組み合わせは、ＮＲＰ２単独よりも高いレベルでＨＣＭＶ侵入を阻害し、ＨＣＭＶ感染におけるＴＨＢＤの潜在的な機能的役割を示唆しており（図３Ａ）、公表された結果と一致する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（５）：１１５８－１１７１，２０１８）。この仮説をさらに試験するために、ＮＲＰ２を欠く細胞におけるＨＣＭＶ侵入を媒介するＴＨＢＤの能力を調べた（図３Ｂ及び１２Ａ）。ＴＨＢＤの過剰発現は、ＨＡＰ－１野生型（ＷＴ）のＨＣＭＶ感染に最小限の影響しか及ぼさなかったが、ＮＲＰ２ノックアウト（ＫＯ）細胞におけるその過剰発現は、ウイルス侵入を劇的に増加させた（図３Ｂ、１２Ａ及び１２Ｂ）。対照として、０．１μｇ／ｍＬの８Ｉ２１ｍＡｂの存在下で実験を繰り返した。五量体特異的ｍＡｂの添加は感染を完全に消失させ、五量体特異的感染を確認した（図３Ｂ）。さらに、ＴＨＢＤ発現細胞はウイルスを拡散させることができることが観察された（図１２Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＮＲＰ２及びＴＨＢＤの両方が、独立した受容体又は共受容体として機能し得るＨＣＭＶの関連受容体であることを示している。
これらの構造分析は、異なる細胞の表面に局在する構造的に異なる受容体に係合するために五量体がどのように進化したかを示唆する。特に、ＮＲＰ２及びＴＨＢＤは、固有の相互作用表面を介して五量体に結合し、五量体－ＮＲＰ２複合体と五量体－ＴＨＢＤ複合体との重ね合わせは、これらの受容体が五量体上に重複する結合部位を共有することを実証している（図３Ｃ）。具体的には、共通の相互作用部位は、ＵＬ１２８がｇＬと係合する接触面に局在し、ＮＲＰ２ ａ１ドメイン及びＴＨＢＤ Ｎ末端レクチンドメインの結合を担い、これらの相互作用パートナーが同時に五量体に結合することができないことを示す（図３Ｃ）。観察結果を試験するために、ＮＲＰ２に結合したＨＣＭＶ五量体を漸増量のＴＨＢＤと共にインキュベートすることによって競合実験を実施し、ＴＨＢＤが高濃度でＮＲＰ２結合について競合することができることが観察された（図３Ｄ）。全体として、これらの構造的及び生物物理学的データは、ＮＲＰ２及びＴＨＢＤが共受容体として機能せず、むしろ独立した受容体として作用することによってＨＣＭＶ指向性を媒介することを示している。
実施例５．ＨＣＭＶ五量体二量体は、同様の構造でＮＲＰ２及びＴＨＢＤと係合する
ＮＲＰ２に結合した五量体の予想外の二量体構造は、ＴＨＢＤ結合時に観察された二量体集団と非常に類似している（図３Ｅ）。ＮＲＰ２のａ１ドメインは、ＴＨＢＤのＮ末端レクチンドメインに類似して、２つの五量体分子の間に包まれているが、ＮＲＰ２のａ２ｂ１ｂ２ドメインは、五量体のうちの１つのみと係合して、著しく非対称なアセンブリを形成する（図３Ｅ）。特に、これらの２つの受容体スーパーアセンブリはまた、五量体の最も遠位の領域に局在するＵＬ１２８サブユニットのＮ末端領域の残基のネットワークによって媒介される保存された二量体化接触面を共有し（図３Ｆ及び３Ｇ）、二量体アセンブリの潜在的な生理的関連性を示唆する。
ＮＲＰ２に結合した五量体の予想外の二量体構造は、ＴＨＢＤ結合時に観察された二量体集団と非常に類似している（図３Ｅ）。ＮＲＰ２のａ１ドメインは、ＴＨＢＤのＮ末端レクチンドメインに類似して、２つの五量体分子の間に包まれているが、ＮＲＰ２のａ２ｂ１ｂ２ドメインは、五量体のうちの１つのみと係合して、著しく非対称なアセンブリを形成する（図３Ｅ）。特に、これらの２つの受容体スーパーアセンブリはまた、五量体の最も遠位の領域に局在するＵＬ１２８サブユニットのＮ末端領域の残基のネットワークによって媒介される保存された二量体化接触面を共有し（図３Ｆ及び３Ｇ）、二量体アセンブリの潜在的な生理的関連性を示唆する。
実施例６．モノクローナル抗体による五量体中和の構造的基礎
ＨＣＭＶに対する非常に強力な中和抗体は、ＨＣＭＶ免疫ドナーの不死化メモリーＢ細胞から単離され、五量体の立体構造エピトープを標的化することが示されている（Ｍａｃａｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８４（２）：１００５－１０１３，２０１０；Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．，１１（１０），２０１５）。これらの中和相互作用の図を提供するために、非常に強力な中和Ｆａｂ ２Ｃ１２及び７Ｉ１３に結合し、並びにｇＨ結合Ｆａｂ １３Ｈ１１に結合した五量体の構造を、～２．９Åの全体分解能まで決定した（図１３Ａ～１３Ｈ）。注目すべきことに、２Ｃ１２は、ＮＲＰ２ ａ２ｂ１ｂ２ドメインによって認識される同じ領域において五量体のＵＬ１３１Ａ及びＵＬ１２８サブユニットに結合する（図４Ａ～４Ｅ及び４Ｊ）。具体的には、２Ｃ１２の軽鎖由来のＹ５５、Ｙ１１６、Ｇ１１９及びＮ１２０は、残基Ｔ２４－Ｎ２８の間のＵＬ１３１ＡのＮ末端領域に結合し、２Ｃ１２の重鎖（Ｎ８１、Ｑ１２５及びＶ１３０）は、ＵＬ１３１Ａ－Ｋ２７並びにＵＬ１２８－Ｒ５１、Ｒ１０８及びＩ１０９を認識する（図４Ｂ～４Ｅ）。Ｆａｂ ７Ｉ１３は大きなフットプリント（～１，２００Å２）を覆い、ＴＨＢＤ及びＮＲＰ２ ａ１ドメインを認識する五量体上の同じ表面に結合する（図４Ｅ～４Ｉ及び４Ｋ）。７Ｉ１３の軽鎖及び重鎖の両方由来の残基は、残基Ｙ４４、Ｐ５９、Ｒ１３１、Ｎ１３４及びＬ１３５上でＵＬ１２８と接触し、疎水性、極性及び電荷相互作用の組み合わせを介してＲ１６８、Ｙ１６９、Ｍ１７１及びＮ２００でＵＬ１３０に結合する（図４Ｆ～４Ｉ）。五量体－ＮＲＰ２複合体の構造（図６Ａ～６Ｉ）に示されるＦａｂ ８Ｉ２１は、ＴＨＢＤ又はＮＲＰ２結合部位と重複しない領域において五量体を認識する（図４Ａ及び１４Ａ～１４Ｃ）。２Ｃ１２－７Ｉ１３－五量体構造とＮＲＰ２－五量体又はＴＨＢＤ－五量体構造との重ね合わせは、２Ｃ１２がＮＲＰ２結合をブロックするがＴＨＢＤ結合をブロックしないことを示し（図４Ｊ及び１４Ｂ）、これらの構造の比較は、７Ｉ１３が両方の受容体、ＮＲＰ２及びＴＨＢＤの結合をブロックできることを示唆する（図４Ｋ及び１４Ｃ）。実際に、五量体に対する競合相互作用実験は、ＮＲＰ２結合が２Ｃ１２及び７Ｉ１３によってブロックされるが、８Ｉ２１又はｇＨ特異的中和抗体によってはブロックされない（図４Ｌ）のに対して、ＴＨＢＤ結合は７Ｉ１３によってブロックされるが、２Ｃ１２、８Ｉ２１又はｇＨ特異的中和抗体によってはブロックされない（図４Ｍ）ことを示す。
ＨＣＭＶに対する非常に強力な中和抗体は、ＨＣＭＶ免疫ドナーの不死化メモリーＢ細胞から単離され、五量体の立体構造エピトープを標的化することが示されている（Ｍａｃａｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８４（２）：１００５－１０１３，２０１０；Ｃｉｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．，１１（１０），２０１５）。これらの中和相互作用の図を提供するために、非常に強力な中和Ｆａｂ ２Ｃ１２及び７Ｉ１３に結合し、並びにｇＨ結合Ｆａｂ １３Ｈ１１に結合した五量体の構造を、～２．９Åの全体分解能まで決定した（図１３Ａ～１３Ｈ）。注目すべきことに、２Ｃ１２は、ＮＲＰ２ ａ２ｂ１ｂ２ドメインによって認識される同じ領域において五量体のＵＬ１３１Ａ及びＵＬ１２８サブユニットに結合する（図４Ａ～４Ｅ及び４Ｊ）。具体的には、２Ｃ１２の軽鎖由来のＹ５５、Ｙ１１６、Ｇ１１９及びＮ１２０は、残基Ｔ２４－Ｎ２８の間のＵＬ１３１ＡのＮ末端領域に結合し、２Ｃ１２の重鎖（Ｎ８１、Ｑ１２５及びＶ１３０）は、ＵＬ１３１Ａ－Ｋ２７並びにＵＬ１２８－Ｒ５１、Ｒ１０８及びＩ１０９を認識する（図４Ｂ～４Ｅ）。Ｆａｂ ７Ｉ１３は大きなフットプリント（～１，２００Å２）を覆い、ＴＨＢＤ及びＮＲＰ２ ａ１ドメインを認識する五量体上の同じ表面に結合する（図４Ｅ～４Ｉ及び４Ｋ）。７Ｉ１３の軽鎖及び重鎖の両方由来の残基は、残基Ｙ４４、Ｐ５９、Ｒ１３１、Ｎ１３４及びＬ１３５上でＵＬ１２８と接触し、疎水性、極性及び電荷相互作用の組み合わせを介してＲ１６８、Ｙ１６９、Ｍ１７１及びＮ２００でＵＬ１３０に結合する（図４Ｆ～４Ｉ）。五量体－ＮＲＰ２複合体の構造（図６Ａ～６Ｉ）に示されるＦａｂ ８Ｉ２１は、ＴＨＢＤ又はＮＲＰ２結合部位と重複しない領域において五量体を認識する（図４Ａ及び１４Ａ～１４Ｃ）。２Ｃ１２－７Ｉ１３－五量体構造とＮＲＰ２－五量体又はＴＨＢＤ－五量体構造との重ね合わせは、２Ｃ１２がＮＲＰ２結合をブロックするがＴＨＢＤ結合をブロックしないことを示し（図４Ｊ及び１４Ｂ）、これらの構造の比較は、７Ｉ１３が両方の受容体、ＮＲＰ２及びＴＨＢＤの結合をブロックできることを示唆する（図４Ｋ及び１４Ｃ）。実際に、五量体に対する競合相互作用実験は、ＮＲＰ２結合が２Ｃ１２及び７Ｉ１３によってブロックされるが、８Ｉ２１又はｇＨ特異的中和抗体によってはブロックされない（図４Ｌ）のに対して、ＴＨＢＤ結合は７Ｉ１３によってブロックされるが、２Ｃ１２、８Ｉ２１又はｇＨ特異的中和抗体によってはブロックされない（図４Ｍ）ことを示す。
実施例７．新規ＨＣＭＶ五量体相互作用因子としてのベータ２ミクログロブリンの同定
ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）もさらなる相互作用パートナーとして発見され、ＨＣＭＶ五量体と複合体を形成しているその構造が決定された。
ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）もさらなる相互作用パートナーとして発見され、ＨＣＭＶ五量体と複合体を形成しているその構造が決定された。
以前の全ゲノムＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングにより、嗅覚受容体（ＯＲ１４Ｌ１）がＨＣＭＶ五量体の推定受容体として同定され、ＯＲ１４Ｌ１のＮ末端の２６残基を含む合成ペプチドが、相互作用に必要な最小領域として示唆された（Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１６：７０４３－７０５２，２０１９）。ＯＲＬ４Ｌ１は嗅覚受容体サブファミリーに属する多重膜貫通Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であるので、ＧＦＰに融合した報告されたＯＲ１４Ｌ１最小ペプチドによるＨＣＭＶ五量体の再構成を試み、非化学量論的結合が観察された（図１６Ａ及び１６Ｂ）。ＯＲ１４Ｌ１ペプチドに結合した粒子を単離してその構造を決定するために、クライオＥＭ及び複数ラウンドの３Ｄ分類を使用した（図１６Ｃ～１６Ｇ）。ＯＲ１４Ｌ１ペプチド－ＧＦＰ融合を説明するさらなる密度は観察されなかったが（データは示していない）、ＵＬサブユニットの凹状接触面におけるベータサンドイッチ折り畳みに対応するさらなる密度（～３．５Å分解能）を示す粒子のサブセット（～１０％）が同定された（図１６Ｅ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び質量分析は、試料が、体液及び組織培養培地中に存在する１１．８ｋＤａの細胞タンパク質である豊富なさらなる共精製タンパク質、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を含むことを示した（図１６Ｂ）。クライオＥＭマップにおけるその存在は予想外であったが、Ｂ２ＭはＨＣＭＶウイルス粒子に結合し、細胞に感染するＨＣＭＶ能力を増加させることが以前に示された（Ｇｒｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６８（３）：７９３－８０３，１９８７）。剛体精密化を使用して、Ｂ２Ｍの以前の結晶構造から決定されたベータサンドイッチ折り畳みをこの密度に確実に配置した（図１５Ａ及び１５Ｂ、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４：２１５－２２８，１９９６）。この構造は、Ｂ２ＭがＴＨＢＤによって認識されるＵＬ１２８及びＵＬ１３０上の同じ領域に接触することを明らかにし、五量体上のこの領域の構造的可塑性をさらに実証する（図１５Ｃ及び１５Ｄ）。
Ｂ２Ｍは通常、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩのα３ドメインと非共有結合的に結合して、ウイルス感染及び悪性形質転換に対する細胞媒介性免疫応答に寄与する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．（Ｅｎｇｌ．），１２９：４４８－４５５，２０１６）が、本構造分析は、Ｂ２Ｍと五量体との間の結合がＭＨＣクラスＩへの同時結合と適合しないことを示す（図１５Ｅ）。
前述の発明は、理解を明確にするために例示及び例としてある程度詳細に説明されているが、説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
Claims (51)
- ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間の相互作用のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供すること；
（ｂ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体をＢ２Ｍと接触させること；及び
（ｃ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、候補モジュレーターの存在下での結合の増加又は減少が、候補モジュレーターをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＢ２Ｍとの間の相互作用のモジュレーターとして同定する、Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を測定すること
を含む方法。 - ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供すること；
（ｂ）Ｂ２ＭへのＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体をＢ２Ｍと接触させること；及び
（ｃ）ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化が、候補モジュレーターをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性のモジュレーターとして同定する、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の下流活性を測定すること
を含む方法。 - Ｂ２Ｍの下流活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）候補モジュレーターを提供すること；
（ｂ）ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体へのＢ２Ｍの結合を可能にする条件下で、候補モジュレーターの存在下又は非存在下でＢ２ＭをＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体と接触させること；及び
（ｃ）Ｂ２Ｍの下流活性を測定することであって、候補モジュレーターの非存在下での下流活性と比較した、候補モジュレーターの存在下での下流活性の変化が、候補モジュレーターをＢ２Ｍの下流活性のモジュレーターとして同定する、Ｂ２Ｍの下流活性を測定すること
を含む方法。 - 結合の増加又は減少が、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される場合、少なくとも５０％である、請求項１に記載の方法。
- モジュレーターが、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体又はＢ２Ｍの下流活性の阻害剤である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
- 下流活性の変化が、下流活性の量、強度、又は持続時間の減少である、請求項２又は３に記載の方法。
- モジュレーターが、小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は抑制性核酸である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
- 抑制性核酸が、ＡＳＯ又はｓｉＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
- 抗原結合断片が、ビス－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項７に記載の方法。
- 抗体又はその抗原結合断片がＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する、請求項７又は９に記載の方法。
- 抗体又はその抗原結合断片がＢ２Ｍに結合する、請求項７又は９に記載の方法。
- 下流活性がＨＣＭＶによる細胞の感染である、請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。
- 感染が、モジュレーターの存在下で減少する、請求項１２に記載の方法。
- 偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染が少なくとも４０％減少する、請求項１３に記載の方法。
- モジュレーターが、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体に結合する抗体又はその抗原結合断片である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
- モジュレーターが、Ｂ２Ｍに結合する抗体又はその抗原結合断片である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
- ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のニューロピリン２（ＮＲＰ２）への結合の減少を引き起こす、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＮＲＰ２との間の相互作用のモジュレーターであって、
（ａ）ＮＲＰ２の残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９のうちの１つ若しくは複数；
（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｋ４７及びＲ５７の一方若しくは両方；
（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｒ１９３；並びに／又は
（ｄ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３１Ａサブユニットの残基Ａ１１４及びＡ１１７の一方若しくは両方
に結合する、モジュレーター。 - （ａ）ＮＲＰ２の残基Ｄ１９７、Ｄ２５２、Ｎ１７２、Ｍ２５３、Ｙ４５８及びＬ４５９の６つすべて；
（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｋ４７及びＲ５７の両方；
（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｒ１９３；並びに／又は
（ｄ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３１Ａサブユニットの残基Ａ１１４及びＡ１１７の両方
に結合する、請求項１７に記載のモジュレーター。 - ＮＲＰ２へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも５０％減少させる、請求項１７又は１８に記載のモジュレーター。
- ＮＲＰ２へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも９０％減少させる、請求項１９に記載のモジュレーター。
- トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）へのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とＴＨＢＤとの間の相互作用のモジュレーターであって、
（ａ）ＴＨＢＤの残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３のうちの１つ若しくは複数；
（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８のうちの１つ若しくは複数；並びに／又は
（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１のうちの１つ若しくは複数
に結合する、モジュレーター。 - （ａ）ＴＨＢＤの残基Ｓ４９、Ｄ５３、Ｖ６６、Ｄ６９、Ｒ８３、Ｃ９６、Ｅ１５４、Ａ１２３、Ｌ１２５、Ｓ１４９及びＣ１３３の１１個すべて；
（ｂ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１２８サブユニットの残基Ｒ４２、Ｙ４４、Ｒ１３１、Ｎ１３４、Ｙ１３７、Ｒ１５８、Ｒ１６３及びＹ１６８の８つすべて；並びに／又は
（ｃ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体のＵＬ１３０サブユニットの残基Ｎ１６４、Ｙ１６９及びＭ１７１の３つすべて
に結合する、請求項２１に記載のモジュレーター。 - ＴＨＢＤへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも５０％減少させる、請求項２１又は２２に記載のモジュレーター。
- ＴＨＢＤへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも９０％減少させる、請求項２３に記載のモジュレーター。
- Ｂ２ＭへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合の減少を引き起こす、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体とベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）との間の相互作用のモジュレーター。
- Ｂ２ＭへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも５０％減少させる、請求項２５に記載のモジュレーター。
- ＴＨＢＤへのｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ五量体の結合を少なくとも９０％減少させる、請求項２６に記載のモジュレーター。
- 結合の減少が、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される、請求項１９、２０、２３、２４、２６及び２７のいずれか一項に記載のモジュレーター。
- モジュレーターの非存在下での感染と比較して、ＨＣＭＶによる細胞の感染の減少を引き起こす、請求項１７から２８のいずれか一項に記載のモジュレーター。
- 偽型粒子を使用するウイルス感染アッセイ又はウイルス侵入アッセイで測定される場合、感染が少なくとも４０％減少する、請求項２９に記載のモジュレーター。
- 小分子、抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、模倣物、又は抑制性核酸である、請求項１７から３０のいずれか一項に記載のモジュレーター。
- 抑制性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）又はｓｉＲＮＡである、請求項３１に記載のモジュレーター。
- 抗原結合断片が、ビス－Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項３１に記載のモジュレーター。
- 抗体が、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、請求項３１に記載のモジュレーター。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１７から３４のいずれか一項に記載のモジュレーター。
- 個体におけるＨＣＭＶ感染を治療するための方法であって、有効量の請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターを個体に投与し、それにより個体を治療することを含む方法。
- ＨＣＭＶ感染の持続期間又は重症度が、モジュレーターを投与されていない個体と比較して少なくとも４０％減少する、請求項３６に記載の方法。
- 個体におけるＨＣＭＶ感染を予防するための方法であって、有効量の請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターを個体に投与し、それにより個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法。
- 個体における二次ＨＣＭＶ感染に対する予防の方法であって、有効量の請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターを個体に投与し、それにより個体における二次ＨＣＭＶ感染を予防することを含む方法。
- 二次感染が、非感染組織のＨＣＭＶ感染である、請求項３９に記載の方法。
- 個体が、免疫減弱状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である、請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
- 個体におけるＨＣＭＶ感染を治療するための医薬の製造における、請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターの使用。
- 個体におけるＨＣＭＶ感染を予防するための医薬の製造における、請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターの使用。
- 個体における二次ＨＣＭＶ感染に対する予防のための医薬の製造における、請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターの使用。
- 二次感染が、非感染組織のＨＣＭＶ感染である、請求項４４に記載の使用。
- 個体が、免疫減弱状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の使用。
- 個体におけるＨＣＭＶ感染を治療する方法における使用のための、請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターであって、方法が、有効量の請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターを個体に投与し、それにより個体を治療することを含む、モジュレーター。
- 個体におけるＨＣＭＶ感染を予防する方法における使用のための、請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターであって、方法が、有効量の請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターを個体に投与し、それにより個体におけるＨＣＭＶ感染を予防することを含む、モジュレーター。
- 個体における二次ＨＣＭＶ感染に対する予防の方法における使用のための、請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターであって、方法が、有効量の請求項１７から３５のいずれか一項に記載のモジュレーターを個体に投与し、それにより個体における二次ＨＣＭＶ感染を予防することを含む、モジュレーター。
- 二次感染が、非感染組織のＨＣＭＶ感染である、請求項４９に記載の使用のためのモジュレーター。
- 個体が、免疫減弱状態であるか、妊娠しているか、又は乳児である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の使用のためのモジュレーター。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163193529P | 2021-05-26 | 2021-05-26 | |
| US63/193,529 | 2021-05-26 | ||
| US202263345811P | 2022-05-25 | 2022-05-25 | |
| US63/345,811 | 2022-05-25 | ||
| PCT/US2022/031085 WO2022251461A1 (en) | 2021-05-26 | 2022-05-26 | Methods for modulating host cell surface interactions with human cytomegalovirus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024521783A true JP2024521783A (ja) | 2024-06-04 |
Family
ID=82780940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023572765A Pending JP2024521783A (ja) | 2021-05-26 | 2022-05-26 | ヒトサイトメガロウイルスとの宿主細胞表面相互作用を調節するための方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240094194A1 (ja) |
| EP (1) | EP4348257A1 (ja) |
| JP (1) | JP2024521783A (ja) |
| TW (1) | TW202306979A (ja) |
| WO (1) | WO2022251461A1 (ja) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2919890B2 (ja) | 1988-11-11 | 1999-07-19 | メディカル リサーチ カウンスル | 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用 |
| US6335155B1 (en) | 1998-06-26 | 2002-01-01 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules |
| WO2015110593A1 (en) * | 2014-01-24 | 2015-07-30 | Cecilia Naucler | Use of endothelial receptor b inhibitors in prevention and treatment of human cytomegalovirus infection and cmv-related pathologies such as cardiovascular diseases and cancer |
| KR20210150623A (ko) | 2019-03-29 | 2021-12-10 | 제넨테크, 인크. | 세포 표면 단백질 상호작용의 조절 인자 및 이와 관련된 방법 및 조성물 |
-
2022
- 2022-05-26 TW TW111119765A patent/TW202306979A/zh unknown
- 2022-05-26 JP JP2023572765A patent/JP2024521783A/ja active Pending
- 2022-05-26 EP EP22750745.6A patent/EP4348257A1/en active Pending
- 2022-05-26 WO PCT/US2022/031085 patent/WO2022251461A1/en active Application Filing
-
2023
- 2023-11-24 US US18/518,715 patent/US20240094194A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4348257A1 (en) | 2024-04-10 |
| US20240094194A1 (en) | 2024-03-21 |
| WO2022251461A1 (en) | 2022-12-01 |
| TW202306979A (zh) | 2023-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3365366B1 (en) | Trispecific and/or trivalent binding proteins for prevention or treatment of hiv infection | |
| Cohen et al. | Construction, characterization, and immunization of nanoparticles that display a diverse array of influenza HA trimers | |
| US11834494B2 (en) | Antibodies to zika virus and methods of use thereof | |
| Miersch et al. | Tetravalent SARS-CoV-2 neutralizing antibodies show enhanced potency and resistance to escape mutations | |
| JP7181193B6 (ja) | 抗ｃｈｉｋｖ抗体およびその使用 | |
| JP2024509054A (ja) | 抗体 | |
| JP2023534923A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的にする抗原結合分子 | |
| JP2023534922A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする抗原結合分子 | |
| Kschonsak et al. | Structural basis for HCMV Pentamer receptor recognition and antibody neutralization | |
| US20240218052A1 (en) | Methods of screening and expression of disulfide-bonded binding polypeptides | |
| EP4337689A1 (en) | Binding polypeptides against sars cov-2 and uses thereof | |
| WO2021236998A9 (en) | Potent neutralizing antibodies against sars-cov-2, generation and uses thereof | |
| US20240094194A1 (en) | Methods for modulating host cell surface interactions with human cytomegalovirus | |
| CN117355749A (zh) | 用于调节宿主细胞表面与人巨细胞病毒相互作用的方法 | |
| JP2017501723A (ja) | 新規な抗ａｄａｍ１７抗体および癌の治療におけるその使用 | |
| JP2024517021A (ja) | 汎特異的（ｐａｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）コロナウイルス結合剤 | |
| TWI838663B (zh) | 調節人類巨細胞病毒與宿主細胞表面交互作用之方法 | |
| Du et al. | Avidity engineering of human heavy-chain-only antibodies mitigates neutralization resistance of SARS-CoV-2 variants | |
| US20230287090A1 (en) | USE OF SARS-CoV-2 RECEPTOR BINDING MOTIF (RBM)-REACTIVE MONOCLONAL ANTIBODIES TO TREAT COVID-19 | |
| WO2024050354A1 (en) | Alphavirus antigen binding antibodies and uses thereof | |
| KR20230051416A (ko) | 신규한 항-seb 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도 | |
| WO2023111796A1 (en) | Pan-specific sars-cov-2 antibodies and uses thereof | |
| WO2019020480A1 (en) | ANTIBODIES AND PEPTIDES FOR TREATING HCMV RELATED DISEASES | |
| Demers et al. | Cryo-EM Structures of the N501Y SARS-CoV-2 Spike Protein in Complex with ACE2 and Two Potent Neutralizing Antibodies |