CN117355749A

CN117355749A - 用于调节宿主细胞表面与人巨细胞病毒相互作用的方法

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Publication number: CN117355749A
Application number: CN202280037406.XA
Authority: CN
Inventors: C·西费里; E·M·格林; M·克尚萨克
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2022-05-26
Publication date: 2024-01-05

Abstract

本文提供治疗或防止人巨细胞病毒(HCMV)感染的方法，所述方法包括调节HCMV gH/gL/UL128‑131A五聚体与质膜表达的宿主细胞蛋白之间的相互作用，以及鉴定此类相互作用的调节剂的方法。

Description

用于调节宿主细胞表面与人巨细胞病毒相互作用的方法

相关申请的交叉引用

本申请案主张2021年5月26日申请的美国专利申请案第63/193,529号及2022年5月25日申请的美国专利申请案第63/345,811号的优先权，该等专利申请案的整体内容以全文引用方式整体并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并以引用方式以其全部内容并入本文。该ASCII复本创建于2022年5月25日，命名为50474-270WO3_Sequence_Listing_5_25_22_ST25，且大小为24,223字节。

技术领域

本文提供治疗或防止人巨细胞病毒(HCMV)感染的方法，该方法包括调节HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与质膜表达的宿主细胞蛋白之间的相互作用，以及鉴定此类相互作用的调节剂的方法。

背景技术

人巨细胞病毒(HCMV)是疱疹病毒科β疱疹病毒亚科的成员，其在超过70％的人群中引起终生感染。初次感染后，HCMV潜伏，且其再活化会导致免疫抑制或者接受器官或造血干细胞(HSC)移植的个体的严重发病率和死亡率。HCMV在怀孕期间尤其具有威胁性，因为它能够穿过胎盘屏障并感染胎儿。HCMV感染影响0.3％至2.3％的新生儿，是导致先天性出生缺陷的主要原因，包括脑损伤、听力损失、学习障碍、心脏病和智能不足。由于这些原因，HCMV已被医学研究所鉴定为首要疾病靶标。有效的抗病毒疗法或疫苗应靶向HCMV感染周期的早期步骤，包括病毒进入宿主细胞。HCMV使用几种包膜糖蛋白复合物进入不同的细胞系，包括两种gHgL包膜糖蛋白复合物、gHgLgO(三聚体)和gHgLpUL128-131A(五聚体)，以及糖蛋白B(gB)。HCMV三聚体或五聚体结合至细胞宿主受体通过尚未鉴定的机制为HCMV糖蛋白gB提供触发讯号，以催化病毒与受感染细胞之间的膜融合。此种融合允许HCMV进入细胞、复制并建立其潜伏期。

在过去的几十年中，已经做出了重大努力来开发针对HCMV感染的候选疫苗。然而，最近的临床试验结果表明，HCMV疫苗在防止病毒感染方面仅显示出适度的功效。因此，开发针对HCMV的有效疗法代表了重要的未满足的医疗需求。

发明内容

一方面，本公开特征为一种鉴定人巨细胞病毒(HCMV)gH/gL/UL128-131A五聚体与β-2-微球蛋白(B2M)之间相互作用的调节剂的方法，该方法包括：(a)提供候选调节剂；(b)使HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M在该候选调节剂存在或不存在下在允许HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合的条件下接触；以及(c)测量HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合，其中在该候选调节剂存在下的结合相对于在候选调节剂不存在下的结合的增加或降低将该候选调节剂鉴定为HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M之间相互作用的调节剂。

在另一方面，本公开特征为一种鉴定HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性的调节剂的方法，该方法包括：(a)提供候选调节剂；(b)使HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M在该候选调节剂存在或不存在下在允许HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合的条件下接触；以及(c)测量HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性，其中在该候选调节剂存在下的下游活性相对于在该候选调节剂不存在下的下游活性的改变将该候选调节剂鉴定为HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性的调节剂。

在另一方面，本公开特征为一种鉴定B2M的下游活性的调节剂的方法，该方法包括：(a)提供候选调节剂；(b)使B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体在该候选调节剂存在或不存在下在允许B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合的条件下接触；以及(c)测量B2M的下游活性，其中在候选调节剂存在下的该下游活性相对于在该候选调节剂不存在下的下游活性的改变将该候选调节剂鉴定为B2M的下游活性的调节剂。

在一些方面，结合的增加或降低为至少50％，如通过表面等离子体共振、生物层干涉、或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的。

在一些方面，调节剂为HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体或B2M的下游活性的抑制剂。

在一些方面，下游活性的改变为该下游活性的量、强度或持续时间的减少。

在一些方面，调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物、或抑制性核酸。在一些方面，抑制性核酸为ASO或siRNA。在一些方面，抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')₂、双体抗体(diabody)、线性抗体、scFv、scFab、VH结构域或VHH结构域。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体。在一些方面，抗体或其抗原结合片段与B2M结合。

在一些方面，下游活性为HCMV对细胞的感染。在一些方面，感染在存在该调节剂时降低。在一些方面，感染降低至少40％，如使用假型颗粒在病毒进入测定或病毒感染测定中所测量的。

在一些方面，调节剂为抗体或其抗原结合片段，其结合HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体。在一些方面，调节剂为抗体或其抗原结合片段，其结合B2M。

在另一方面，本公开特征为一种人巨细胞病毒(HCMV)gH/gL/UL128-131A五聚体与神经纤毛蛋白(neuropilin)2(NRP2)之间相互作用的调节剂，其使gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2的结合降低，其中该调节剂结合至：(a)NRP2的残基D197、D252、N172、M253、Y458和L459中的一者或多者；(b)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基K47和R57中的一者或两者；(c)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基R193；及/或(d)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL131A亚基的残基A114和A117中的一者或两者。

在一些方面，该调节剂结合至：(a)NRP2的残基D197、D252、N172、M253、Y458和L459中的全部六者；(b)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基K47和R57中的两者；(c)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基R193；及/或(d)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL131A亚基的残基A114和A117中的两者。

在一些方面，该调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2的结合降低至少50％。在一些方面，该调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2的结合降低至少90％。

在另一方面，本公开特征为一种HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与血栓调节素(THBD)之间相互作用的调节剂，其使gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低，其中调节剂结合至：(a)THBD的残基S49、D53、V66、D69、R83、C96、E154、A123、L125、S149和C133中的一者或多者；(b)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基R42、Y44、R131、N134、Y137、R158、R163和Y168中的一者或多者；及/或(c)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基N164、Y169和M171中的一者或多者。

在一些方面，该调节剂结合至：(a)THBD的残基S49、D53、V66、D69、R83、C96、E154、A123、L125、S149和C133中的全部十一者；(b)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基R42、Y44、R131、N134、Y137、R158、R163和Y168中的全部八者；和/或(c)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基N164、Y169和M171中的全部三者。

在一些方面，调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低至少50％。在一些方面，调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低至少90％。

在另一方面，本公开特征为一种人巨细胞病毒(HCMV)gH/gL/UL128-131A五聚体与β-2-微球蛋白(B2M)之间相互作用的调节剂，其导致gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合降低。在一些方面，该调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合降低至少50％。在一些方面，调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低至少90％。

在一些方面，通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)测量结合的降低。

在一些方面，相对于无调节剂的存在下的感染，调节剂使得经HCMV的细胞感染降低。在一些方面，感染降低至少40％，如使用假型颗粒在病毒进入测定或病毒感染测定中所测量的。

在一些方面，调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物、或抑制性核酸。在一些方面，抑制性核酸为反义寡核苷酸(ASO)或siRNA。在一些方面，抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')₂、双体抗体(diabody)、线性抗体、scFv、scFab、VH结构域或VHH结构域。

在一些方面，抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些方面，调节剂进一步包括药用载体。

在另一方面，本公开特征为一种治疗个体的HCMV感染的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文提供的调节剂中的任一者，从而治疗个体。在一些方面，相对于尚未施用调节剂的个体，HCMV感染的持续时间或严重程度减少至少40％。

在另一方面，本公开特征为一种防止个体的HCMV感染的方法，该方法包含向个体施用有效量的本文提供的调节剂中的任一者，由此防止个体的HCMV感染。

在另一方面，本公开特征为一种防止个体的继发性HCMV感染的方法，该方法包括向该个体施用有效量的本文提供的调节剂中的任一者，从而防止个体的继发性HCMV感染。在一些方面，继发性感染为未经感染组织的HCMV感染。

在一些方面，个体为免疫功能不全的、怀孕的或者为婴儿。

在另一方面，本公开特征为本文提供的调节剂中的任一者的用途，其用于制造用于治疗个体的HCMV感染的药物。

在另一方面，本公开特征为本文提供的调节剂中的任一者的用途，其用于制造用于防止个体的HCMV感染的药物。

在另一方面，本公开特征为本文提供的调节剂中的任一者的用途，其用于制造用于防止个体的继发性HCMV感染的药物。在一些方面，继发性感染为未经感染组织的HCMV感染。

在一些方面，个体为免疫功能不全的、怀孕的或者为婴儿。

在另一方面，本公开特征为本文提供的调节剂中的任一者，其用于在治疗个体的HCMV感染的方法中使用，该方法包括向个体施用有效量的调节剂，由此治疗个体。

在另一方面，本公开特征为本文提供的调节剂中的任一者，其用于在防止个体的HCMV感染的方法中使用，该方法包括向个体施用有效量的调节剂，由此防止个体的HCMV感染。

在另一方面，本公开特征为本文提供的调节剂中的任一者，其用于在防止个体的继发性HCMV感染的方法中使用，该方法包括向个体施用有效量的调节剂，由此防止个体的继发性HCMV感染。在一些方面，继发性感染为未经感染组织的HCMV感染。

在一些方面，个体为免疫功能不全的、怀孕的或者为婴儿。

附图说明

图1A为图，其显示由Merlin和VR1814株编码的HCMV五聚体复合体与神经纤毛蛋白1(NRP1)和神经纤毛蛋白2(NRP2)的标准化结合信号(最大值百分比)，如使用Martinez-Martin等人,Cell.174(5):1158-1171.e19,2018中所述的细胞表面发现平台所检测的。

图1B为示意图，其显示人类NRP2的结构域组织。

图1C为图解，其显示结合至NRP2 a2b1b2结构域(表面表示)的HCMV五聚体复合体(带状表示)的正视图。为清楚起见，没有呈现出Fab。

图1D为HCMV五聚体远端区的图解，其显示NRP2 a1a2b1b2结构域、UL128-131A、gL和gH N末端。

图1E为图1D中所述HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示HCMV五聚体与NRP2 a2结构域之间的相互作用位点(位点1)，包括NRP2的残基N172、M253和D197以及UL128的残基R57和K47。粗体残基代表反向电荷突变。

图1F为图1D中所述HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示HCMV五聚体与NRP2 b2结构域之间的相互作用位点(位点2)，包括NRP2的残基Y458以及L459、UL130的残基R193以及UL131A的残基A114和A1117。粗体残基代表反向电荷突变。

图1G为图1D中所述HCMV五聚体远端区的特写视图(表面表示)，其显示与NRP1的表面相互作用区域(位点1和2)。

图1H为条形图，其显示相对于与野生型(WT)NRP2的结合，HCMV五聚体与包含单点突变的NRP2变体的结合亲和力(位点1：N172R、M253E、A254E；位点2：Y458R、L459R)。动力学参数代表两个独立的测定。

图2A为示意图，其显示人类血栓调节素(THBD)的结构域组织。

图2B为一组图解，其显示结合至THBD凝集素结构域的HCMV五聚体复合体(包含五聚体1和五聚体2的二聚体)(带状表示)的前视图和俯视图(表面表示)，包括(a)HCMV五聚体1远端区的图解，其显示THBD凝集素结构域、UL128-131A和gL，其中突出显示了五聚体1与THBD凝集素结构域之间的相互作用位点(插图)，包括UL128的Y44、R42、R131、N134和Y137；THBD的R83、E154、S149、D69和V66；以及UL130的N164和Y169，以及(b)HCMV五聚体2远端区的图解，其显示THBD凝集素结构域、UL128-131A和gL，中突出显示了五聚体2与THBD凝集素结构域之间的相互作用位点(插图)，包括UL128的Y44、R42、R131、Y168和R163；THBD的L125、A123、C133、C96、S49和D53；以及UL130的Y169和M171。

图2C为图3C中所述HCMV五聚体1远端区的特写视图(表面表示)，其显示与THBD的表面相互作用区域。

图2D为图3D中所述HCMV五聚体2远端区的特写视图(表面表示)，其显示与THBD的表面相互作用区域。

图3A为一对曲线图，其显示人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)或ARPE-19细胞中被感染细胞的百分比，该等细胞是经HCMV系VR1814病毒处理48小时并已与所指示浓度的可溶性重组CD46(蓝色实心圆)、NRP2(红色实心圆)、抗NRP2抗体(红色空心圆)、THBD(橙色实心圆)、重组NRP2与THBD蛋白的混合物(紫色实心圆)或抗NRP2与重组THBD蛋白的混合物(紫色实心圆)预孵育。显示的数据为三个独立实验的平均值±SD。

图3B为条形图，其显示在用空慢病毒载体、编码CD46的慢病毒载体或编码THBD的慢病毒载体转导细胞的测定中，被感染的野生型(WT)或NRP2敲除(KO)HAP-1细胞的百分比。也显示用编码THBD的慢病毒载体转导并用Fab 8I21处理的NRP2 KO细胞。显示了最大感染百分比(四个独立实验的几何平均值±SD)。nn.s.：不显著。

图3C为图解，其显示与NRP2复合的HCMV五聚体及与THBD复合的HCMV五聚体的叠加。NRP2-a1结构域以表面表示形式显示。

图3D为条形图，其显示在递增浓度的THBD存在下HCMV五聚体与野生型(WT)NRP2-Fc的结合(以等摩尔比开始)。100倍过量的转化生长因子β受体3(TGFβR3)的添加显示为对照。

图3E为图解，其显示HCMV五聚体-NRP2二聚体cryo-EM图及HCMV五聚体-THBD的二聚体结构的叠加。

图3F为图解，其显示由UL128介导的HCMV五聚体二聚化界面。

图3G为图解，其显示由UL128介导的二聚体相互作用界面的特写俯视图(如图3F所示)。

图4A为图解，其显示结合至五聚体特异性中和抗体2C12、7I13和8I21(以表面表示形式显示)以及gH特异性中和抗体13H11和MSL-109(以表面表示形式显示)的HCMV五聚体复合体(带状表示)的复合结构的前视图。

图4B为HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示五聚体特异性中和抗体2C12、UL128-131A和gL，其中突出显示了五聚体与2C12之间的相互作用位点。

图4C为HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示五聚体特异性中和抗体2C12、UL128-131A和gL，其中突出显示了五聚体与2C12之间的相互作用位点。

图4D为HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示五聚体与2C12(左)或7I13(右)之间突出显示的相互作用界面。

图4E为HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示2C12、UL128-131A和gL 2C12和7I13。

图4F为HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示7I13、UL128-131A和gL，其中突出显示了五聚体与7I13之间的相互作用位点。

图4G为HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示7I13、UL128-131A和gL，其中突出显示了五聚体与7I13之间的相互作用位点。

图4H为HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示7I13、UL128-131A和gL，其中突出显示了五聚体与7I13之间的相互作用位点。

图4I为HCMV五聚体远端区的特写视图，其显示7I13、UL128-131A和gL，其中突出显示了五聚体与7I13之间的相互作用位点。

图4J为图解，其显示结合至NRP2的HCMV五聚体和结合至2C12的HCMV五聚体的叠加。

图4K为图解，其显示结合至THBD的HCMV五聚体和结合至7I13的HCMV五聚体的叠加。

图4L为条形图，其显示在所指示的中和Fab(2C12、7I13、8I21、MSL-109和13H11)存在下HCMV五聚体与WT NRP2-Fc的结合。

图4M为条形图，其显示在所指示的中和Fab(2C12、7I13、8I21、MSL-109和13H11)存在下HCMV五聚体与WT THBD-Fc的结合。

图5为图解，其显示HCMV五聚体介导的HCMV入侵上皮和内皮宿主细胞的模型。受体结合和可能的五聚体二聚化可以介导受体聚集并促进病毒膜与宿主细胞膜的高亲和力且稳定的连系(tethering)。膜连系将触发gB从其融合前构形到融合后构形的转变并启动膜融合。

图6A为图解，其显示结合至NRP2和Fab 13H11和8I21的HCMV五聚体的纯化及重构的工作流程。

图6B为曲线图及凝胶影像，其显示结合至NRP2和Fab 13H11和8I21的HCMV五聚体的粒径筛析层析(SEC)测定的结果。

图6C为代表性的cryoEM显微照片，其显示结合至NRP2和13H11和8I21的HCMV五聚体。

图6D为一组影像，其显示结合至13H11和8I21的单体和二聚体HCMV五聚体-NRP2的代表性2D类平均。

图6E为图解，其显示获得结合至13H11和8I21的单体和二聚体HCMV五聚体-NRP2的从头开始3D重构的处理工作流程。

图6F为图解，其显示获得结合至13H11和8I21的二聚体HCMV五聚体-NRP2的3D重构的数据收集及处理工作流程。

图6G为图解，其显示获得结合至13H11和8I21的二聚体HCMV五聚体-NRP2的高分辨率3D重构的数据收集及处理工作流程。重构显示于图6H中。

图6H为热图，其显示在图6G的工作流程中测定的指定粒子方向的分布，以及结合至13H11和8I21的二聚体HCMV五聚体-NRP2的高分辨率3D重构。

图6I为曲线图，其显示关于结合至Fab 13H11和8I21的HCMV五聚体-NRP2的总体3D重构的半数据集与关于聚焦细化重构(如图6G所示)的半数据集之间的傅立叶壳相关性(FSC)。

图7A为结合至HCMV五聚体的NRP2的示例性3D图叠加。

图7B为结合至HCMV五聚体的THBD的示例性3D图叠加。

图7C为结合至HCMV五聚体的fab 2C12的示例性3D图叠加。

图7D为结合至HCMV五聚体的fab 7I13的示例性3D图叠加。

图8A为一组图解，其显示cryoEM HCMV五聚体-NRP2的a2b1b2结构域与NRP2晶体结构(PDB：2QQO RMSD/328Cα)及NRP1晶体结构(2QQN，RMSD/>/316Cα)的重迭。

图8B为一组图解，其显示cryoEM HCMV五聚体-NRP2的NRP2 a2和b2结构域与NRP1晶体结构(2QQN，a2：RMSD/98Cα；b2：RMSD/>/122Cα)的重迭。

图8C为图解，其显示NRP1(SEQ ID NO:6)与NRP2(SEQ ID NO:7)的a1a2b1b2结构域的序列比对。

图8D为一组图解，其显示涉及a2和b2结构域与NRP2 b1-VEGFC肽(PDB：6TJT)和NRP1 b1-SARS-CoV-2(PDB：7JJC)的HCMV五聚体-NRP2相互作用之间的比较。

图9A为图解，其显示HCMV五聚体复合体(蓝色/粉色)的gHgL亚基重迭在HCMV三聚体复合体的gHgL亚基(橙色，PDB：7LBE(Kschonsak等人,Cell,184:1232-1244.e16,2021))上；均方根偏差(RMSD)/765Cα)。

图9B为图解，其显示cryoEM HCMV五聚体-13H11-2C12-7I13复合体(蓝色/粉色)重迭在X射线HCMV五聚体复合体(绿色，PDB：5VOB；Chandramouli等人,Sci.Immunol.,2:2017；RMSD/980Cα)上。

图9C为图解，其显示HCMV五聚体-13H11-2C12-7I13复合体重迭在HCMV五聚体-NRP2-13H11-8I21复合体(黄色，RMSD/937Cα)上。

图9D为一对图解，其显示HCMV五聚体-13H11-2C12-7I13复合体重迭在两个HCMV五聚体-THBD-13H11分子(紫色/品红色，(1)RMSD /846Cα(2)RMSD/>/622α)上。

图10A为曲线图及凝胶影像，其显示结合至Fab 13H11和MSL-109的HCMV五聚体-THBD复合体的SEC测定的结果。

图10B为代表性的cryoEM显微照片，其显示结合至THBD和Fab13H11和MSL-109的HCMV五聚体。

图10C为一组影像，其显示结合至13H11和MSL-109的单体和二聚体HCMV五聚体-THBD的代表性2D类平均。

图10D为图解，其显示获得结合至Fab 13H11和MSL-109的单体和二聚体HCMV五聚体-THBD的从头开始及高分辨率3D重构的处理工作流程。重构显示于图10E中。

图10E为热图，其显示在图10D的工作流程中测定的指定粒子方向的分布，以及结合至Fab 13H11和MSL-109的HCMV五聚体-THBD的高分辨率3D重构。

图10F为曲线图，其显示关于结合至Fab 13H11及MSL-109的总体单体性五聚体-THBD 3D重构的半数据集与关于聚焦细化重构(如图10D所示)的半数据集之间的FSC。

图11A为图解，其显示结合至THBD的HCMV五聚体复合体。显示了THBD TME-1结构域以及位于N末端凝集素结构域与TME-1结构域之间的连接符区。

图11B为图解，其显示THBD凝集素结构域的结构。显示了二级结构组织。

图12A为一组曲线图，其显示NRP2、CD46和THBD在WT或NRP2 KO HAP-1细胞上的细胞表面染色(作为相对于最大值的百分比)。蓝色线：同型对照抗体染色；绿色线：用靶标特异性抗体染色。流式细胞分析技术染色重复三次(n＝10,000个细胞)。

图12B为条形图，其显示在用VR1814处理细胞以获得少量感染细胞(MOI为0.1)并且在第8天通过HCMV pp72蛋白染色监测病毒扩散的试验中，感染的WT、NRP2 KO或NRP2 KO+THBD HAP-1细胞的百分比。

图12C为一组显微照片，其显示用抗pp72染色的图12A的感染的细胞的代表性影像。比例尺为10微米。

图13A为图解，其显示结合至Fab 13H11、2C12和7I13的HCMV五聚体的纯化及重构的工作流程。

图13B为曲线图及凝胶影像，其显示结合至13H11、2C12和7I13的HCMV五聚体的SEC测定的结果。

图13C为代表性的cryoEM显微照片，其显示结合至13H11、2C12和7I13的HCMV五聚体。

图13D为一组影像，其显示结合至13H11、2C12和7I13的HCMV五聚体的代表性2D类平均。

图13E为图解，其显示获得结合至13H11、2C12和7I13的HCMV五聚体的从头开始3D重构的处理工作流程。

图13F为图解，其显示获得结合至13H11、2C12和7I13的HCMV五聚体的高分辨率3D重构的数据收集及处理工作流程。重构显示于图8G中。

图13G为热图，其显示在图8F的工作流程中测定的指定粒子方向的分布，以及结合至13H11、2C12和7I13的HCMV五聚体的高分辨率3D重构。

图13H为关于结合至13H11、2C12和7I13的HCMV五聚体的总体3D重构的半数据集与关于聚焦细化重构(如图8F所示)的半数据集之间的FSC。

图14A为图解，其显示cryoEM HCMV五聚体-8I21复合体(蓝色/橙色/粉色)重迭在X射线HCMV五聚体-8I21复合体(绿色，PDB：5VOB RMSD 1.3A/477Cα)上。

图14B为图解，其显示HCMV五聚体-NRP2复合体与结合至2C12、7I13和8I21的HCMV五聚体复合结构的叠加。

图14C为图解，其显示HCMV五聚体-THBD复合体与结合至2C12、7I13和8I21的HCMV五聚体复合结构的叠加。

图15A为图解，其显示结合至β-2-微球蛋白(B2M)的HCMV五聚体复合体(带状表示)的前视图(表面表示)。

图15B为HCMV五聚体远端区的图解，其显示B2M、UL128-131A、gL和gH的N末端区。

图15C为HCMV五聚体远端区的特写视图(表面表示)，其显示与B2M的表面相互作用区域。

图15D为图解，其显示在HCMV五聚体的UL亚基的凹区上相互作用的THBD凝集素结构域及B2M的叠加。

图15E为图解，其显示B2M结合的HCMV五聚体和B2M 1类MHC复合体(蛋白质数据库(PDB)：1A1M)的叠加。

图16A为图解，其显示与嗅觉受体(OR14L1)(1-26)-EGFP混合的HCMV五聚体的SEC测定的结果。

图16B为SDS-PAGE印渍图及质谱(MS)分析的输出，其显示B2M鉴定为HCMV五聚体结合配偶体。

图16C为结合至Fab 13H11和MSL-109的五聚体-B2M的代表性cryoEM显微照片。

图16D为一组影像，其显示结合至Fab 13H11和MSL-109的五聚体-B2M的代表性2D类平均。

图16E为示意图，其显示获得结合至Fab 13H11和MSL-109的五聚体-B2M的从头开始及高分辨率3D重构的处理工作流程。

图16F为在图16E的工作流程中测定的指定粒子方向的分布的热图表示。

图16G为曲线图，其显示关于结合至Fab 13H11和MSL-109的总体五聚体-B2M 3D重构的半数据集之间的FSC

具体实施方式

I.界定

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不应解释为表示与本领域通常理解的定义具有实质性区别。

如本文所用，术语“约”是指本技术领域技术人员易于知晓的各个值的通常误差范围。在本文中，涉及“约”的值或参数包括(并描述)指向该值或参数本身的方面。

如本文所用，单数形式的“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示内容，除非上下文另明确指出。例如，提及“分离的肽”是指一种或多种分离的肽。

在整个说明书和权利要求书中，单词“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变形将被理解为表示包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

本文可互换使用的术语“患者”、“个体”或“受试者”是指人类患者。

药物的“静脉内”或“iv”剂量、施用或制剂是经由静脉，例如通过输注施用的药物。

药物的“皮下”或“sc”剂量、施用或制剂是在皮肤下例如经由预填充注射器、自动注射器或其他装置施用的药物。

出于本文的目的，“临床状态”是指患者的健康状况。实例包括患者正在改善或恶化。在一个实施例中，临床状态基于临床状态的次序量表。在一个实施例中，临床状态不基于患者是否发烧。

“有效量”是指有效产生治疗/预防获益(例如，如本文所述)的药剂(例如，治疗剂)的量，该获益不会被不想要的/不期望的副作用所抵消。

术语“医药制剂”是指一种制剂，其呈允许一种或多种活性成分的生物活性有效的形式，且其不含对制剂所施用的个体具有不可接受的毒性的其他组分。此类制剂为无菌的。在一个实施例中，该制剂用于静脉内(iv)施用。在另一实施例中，该制剂用于皮下(sc)施用。

本文中的“天然序列”蛋白质是指包含自然界中发现的蛋白质的氨基酸序列的蛋白质，包括蛋白质的天然存在的变体。本文使用的术语包括从其天然来源分离的或重组产生的蛋白质。

除非另有说明，否则如本文所使用的术语“蛋白质”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然蛋白质，该脊椎动物包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人类)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”未经加工的蛋白质以及在细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。该术语也涵盖天然生成的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体，例如，氨基酸取代突变或氨基酸缺失突变。该术语也包括蛋白质的分离区或分离结构域，例如细胞外结构域(ECD)。

“单离的”蛋白质或多肽是从其自然环境的组分中分离出来的蛋白质或多肽。在一些方面，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，通过“例如”电泳(例如SDS-PAGE、等电位聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)来测定。

“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或与自然染色体位置不同的染色体位置。

如本文所用，术语“人巨细胞病毒(HCMV)五聚体”、“HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体”及“HCMV五聚体”指代位于人巨细胞病毒(HCMV)病毒包膜外表面上并且由gH、gL、UL128、UL130及UL131A糖蛋白亚基构成的糖蛋白复合体。

如本文所用，术语“人巨细胞病毒(HCMV)的gH亚基”、“gH亚基”和“gH”泛指来自任何病毒来源的任何天然gH，除非另有指示。该术语涵盖全长gH和gH的分离区域或结构域。该术语也涵盖天然gH变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性HCMV gH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所提供。本发明也考虑了极小序列变异，特别是不影响gH功能及/或活性的gH的保守氨基酸取代。

如本文所用，术语“人巨细胞病毒(HCMV)的gL亚基”、“gL亚基”和“gL”泛指来自任何病毒来源的任何天然gL，除非另有指示。该术语涵盖全长gL和gL的分离区域或结构域。该术语也涵盖天然gL变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性HCMV gL的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所提供。本发明也考虑了极小序列变异，特别是不影响gL功能及/或活性的gL的保守氨基酸取代。

如本文所用，术语“人巨细胞病毒(HCMV)的UL128亚基”、“UL128亚基”和“UL128”泛指来自任何病毒来源的任何天然UL128，除非另有指示。该术语涵盖全长UL128和UL128的分离区域或结构域。该术语也涵盖天然UL128变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性HCMV UL128的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所提供。本发明也考虑极小序列变异，特别是不影响UL128的功能及/或活性的UL128的保守氨基酸取代。

如本文所用，术语“人巨细胞病毒(HCMV)的UL130亚基”、“UL130亚基”和“UL130”泛指来自任何病毒来源的任何天然UL130，除非另有指示。该术语涵盖全长UL130和UL130的分离区域或结构域。该术语也涵盖天然UL130变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性HCMV UL130的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所提供。本发明也考虑极小序列变异，特别是不影响UL130的功能及/或活性的UL130的保守氨基酸取代。

如本文所用，术语“人巨细胞病毒(HCMV)的UL131A亚基”、“UL131A亚基”和“UL131A”泛指来自任何病毒来源的任何天然UL131A，除非另有指示。该术语涵盖全长UL131A和UL131A的分离区域或结构域。该术语也涵盖天然UL131A变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性HCMV UL131A的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所提供。本发明也考虑极小序列变异，特别是不影响UL131A的功能及/或活性的UL131A的保守氨基酸取代。

如本文所用，“调节剂”为调节(例如，增加、减少、活化或抑制)给定生物活性(例如，相互作用或由相互作用得到的下游活性)的试剂。调节剂或候选调节剂可以是例如小分子、抗体(例如双特异性或多特异性抗体)、抗原结合片段(例如双-Fab、Fv、Fab、Fab’-SH、F(ab’)₂、双体抗体(diabody)、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域)、肽、模拟物、反义寡核苷酸或抑制性核酸(例如，反义寡核苷酸(ASO)或小干扰RNA(siRNA))。

“增加”或“活化”意指引起总体增加例如20％或更大、50％或更大或75％、85％、90％或95％或更大的能力。在某些方面，增加或活化可指蛋白质-蛋白质相互作用的下游活性。

“减少”或“抑制”意指引起总体降低例如20％或更大、50％或更大或75％、85％、90％或95％或更大的能力。在某些方面，减少或抑制可指蛋白质-蛋白质相互作用的下游活性。

“亲和力”指分子(例如受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所使用的“结合亲和力”，是指反映结合对成员(例如受体和配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对于其搭配物Y的亲和力通常可通过解离常数(K_D)来表示。可以通过本领域已知的习知方法测量亲和力，包括那些本文所述的方法。

如本文所使用，“复合物”或“错合的”涉及两个或更多个分子经由非肽键的键及/或力(例如，凡得瓦力、疏水力、亲水力)相互作用的缔合。一方面，复合物是异源多聚体。应理解，如本文所使用，术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包括具有与蛋白质复合物中的蛋白质结合的非蛋白质实体的复合物(例如，包括但不限于例如毒素或检测剂的化学分子)。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已向其中引入外源性核酸的细胞，包括此类细胞的子代细胞。宿主细胞包括“转染细胞”、“转化细胞”和“转化体”，其包括原代转化细胞和由其衍生的子代细胞，而与传代次数无关。子代细胞的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括与自原始转变细胞中所筛选或选择具有相同功能或生物活性的突变子代细胞。在某方面中，宿主细胞稳定转化有外源核酸。在其他方面中，宿主细胞瞬时转化有外源核酸。

如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入该宿主细胞的基因体中的载体。某些载体能够引导与其操作性连接的核酸的表现。此类载体在本文称为“表现载体”。

本文中的术语“抗体”以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单株抗体、多株抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其等展示出预期抗原结合活性即可。

“抗原结合片段”或“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗原结合片段的实例包括但不限于双-Fab、Fv、Fab、Fab、Fab’-SH、F(ab’)₂、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv、scFab)抗原片段形成的多特异性抗体。

单结构域抗体为包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或抗体的轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体为人单域抗体(参见例如美国第6,248,516B1号专利)。单结构域(single-domain)抗体的实例包括但不限于VHH。

“Fab”片段是通过木瓜蛋白酶消化抗体产生的抗原结合片段，并完整的L链以及H链的可变区域(VH)和一个重链的第一恒定域(CH1)组成。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的Fab片段。胃蛋白酶对抗体的处理产生单一大的F(ab')₂片段，该片段大致对应于两个具有二价抗原结合活性并且仍能够交联抗原的双硫键连接的Fab片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，在CH1结构域的羧基末端具有额外的少数残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱胺酸。Fab'-SH是指恒定域的半胱胺酸残基带有一个游离硫醇基的Fab'。F(ab')₂抗体片段最初作为成对Fab'片段产生，其具有铰链半胱胺酸。抗体片段的其他化学耦联也是已知的。

本文中术语“Fc区域”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区域和变异Fc区域。尽管免疫球蛋白重链的Fc区域的边界可能略有变化，但通常将人IgG重链的Fc区域定义为从Cys226或Pro230位置的氨基酸残基延伸至其羧基端。例如，在抗体生产或纯化过程中，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸，可去除Fc区域的C端离胺酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组成物可包含去除所有Lys447残基的抗体群体、未去除Lys447残基的抗体群体和具有含和不包含Lys447残基的抗体混合物的抗体群体。

“Fv”由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区域的二聚体组成。由这两个结构域的折迭产生六个高度变异环(H和L链各3个环)，这些环形成用于抗原结合的氨基酸残基，并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单一可变域(或仅包含三个针对抗原的CDR的半个Fv)也具有辨识和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构实质上类似的结构的抗体或具有含有本文定义的Fc区的重链的抗体。

“单链Fv”也简称为“sFv”或“scFv”，是包含连接到单一多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。较佳地，scFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽连接符，其使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv片段的综述，参见Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；Malmborg等人，J.Immunol.Methods 183:7-13，1995。

术语“小分子”是指具有约2000道尔顿或更少，例如约1000道尔顿或更少的分子量的任何分子。在一些方面，小分子为有机小分子。

如本文所用，术语“模拟物”或“分子模拟物”是指与给定多肽或该多肽的一部分在构形及/或结合能力(例如二级结构、三级结构)方面具有足够相似性的多肽以结合至该多肽的结合配偶体。模拟物可以等于、小于或大于其模拟的多肽的亲和力结合结合配偶体。分子模拟物与其模拟的多肽可具有或不具有明显的氨基酸序列相似性。模拟物可天然产生，或者可经工程改造。在一些方面，模拟物是结合对成员的模拟物。在另外其他方面，模拟物是结合至结合对的成员的另一种蛋白质的模拟物。在一些方面，模拟物可执行所模拟的多肽的所有功能。在其他方面，模拟物不执行所模拟的多肽的所有功能。

如本文所用，术语“允许两种或更多种蛋白质彼此结合的条件”是指在不存在调节剂或候选调节剂的情况下两种或更多种蛋白质将相互作用的条件(例如蛋白质浓度、温度、pH、盐浓度)。允许结合的条件可能因个别蛋白质而异，并可能在蛋白质-蛋白质相互作用测定(例如，表面等离子体共振测定、生物层干涉测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、细胞外相互作用测定和细胞表面相互作用测定)之间有所不同。

相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”，是指候选序列中氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比，在比对序列并引入差异后(如有必要)，可实现最大的序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守性替换作为序列同一性的一部分。为确定氨基酸序列同一性百分比的目的而进行的比对可通过本领域中技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可取得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由建南德克公司(Genentech，Inc.)编写，源代码已与用户文件一起存盘于美国版权局，华盛顿特区，20559，并以美国版权注册号TXU510087进行注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚南旧金山的建南德克公司(Genentech，Inc.)公众可取得，亦可以从源代码进行编译。ALIGN-2程序应编译为在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，并且没有变化。

在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，既定氨基酸序列A对、与、或相对于既定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可替代性地表述为既定氨基酸序列A，其对、与、或相对于既定氨基酸序列B具有或包含一定％的氨基酸序列同一性)计算如下：

100乘以分数X/Y

其中X是序列比对程序ALIGN-2在A与B程序比对中评分为同一匹配的氨基酸残基数，Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，否则如前一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得本文使用的所有％氨基酸序列同一值。

如本文中所使用的“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)，是指试图改变受治疗个体的疾病自然病程的临床干预，并且可进行预防或在临床病理过程中执行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病的发生或复发(例如防止HCMV感染或其症状)、减少或防止患有感染的患者的继发性感染(例如减少或防止神经组织、免疫细胞、淋巴组织及/或肺组织的继发性感染)，减轻症状，减轻疾病的任何直接或间接病理后果，降低疾病进展速率，改善或缓解疾病状态，缓解或改善预后。

疾病或病状的“病理”包括损害患者健康的全部现象。

“改善(amelioration)”、“改善(ameliorating)”、“减轻(alleviation)”、“减轻(alleviating)”或其等同形式是指治疗和预防或预防措施，其中目的是改善、预防、减慢(减轻)、减少或抑制疾病或病状，例如HCMV感染。需要治疗的人包括已患有疾病或病状的人，以及易于患疾病或病状的人或待预防疾病或病状的人。

II.蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂

在一些方面，本公开特征为一种神经纤毛蛋白2(NRP2)、血栓调节素(THBD)或β-2-微球蛋白(B2M)与人巨细胞病毒(HCMV)gH/gL/UL128-131A五聚体之间相互作用的经分离的调节剂，其中相对于在不存在调节剂下的结合，调节剂使HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2、THBD或B2M的结合降低。

在一些方面，调节剂包括药用载体。

A.NRP2与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂

在一些方面，本公开特征为一种HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与神经纤毛蛋白2(NRP2)之间相互作用的调节剂，其使gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2的结合降低，其中调节剂结合至：(a)NRP2的残基D197、D252、N172、M253、Y458和L459中的一者或多者(例如，D197、D252、N172、M253、Y458和L459中的一者、两者、三者、四者、五者或全部六者)；(b)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基K47和R57中的一者或两者(例如，K47和R57中的一者或两者)；(c)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基R193；及/或(d)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL131A亚基的残基A114和A117中的一者或两者。

在一些方面，调节剂结合至：(a)NRP2的残基D197、D252、N172、M253、Y458和L459中的全部六者；(b)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基K47和R57中的两者；(c)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基R193；及(d)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL131A亚基的残基A114和A117中的两者。

在一些方面，该调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2的结合降低至少50％。在一些方面，相对于无调节剂的存在下的结合，结合的降低为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，结合被废除)，例如降低为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％。在一些方面，调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2的结合降低至少90％(例如，90％至100％)。在一些方面，结合的降低为至少50％(例如，为50％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)，例如，如通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量。

在一些方面，相对于无调节剂的存在下的感染，调节剂使得经HCMV的细胞感染降低。在一些方面，感染降低至少40％，如使用假型颗粒在病毒进入测定或病毒感染测定中所测量的。在一些方面，降低为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，不发生感染)，例如降低为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。

B.THBD与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂

在一些方面，本公开特征为一种HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与血栓调节素(THBD)之间相互作用的调节剂，其使gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低，其中调节剂结合至：(a)THBD的残基S49、D53、V66、D69、R83、C96、E154、A123、L125、S149和C133中的一者或多者(例如，残基S49、D53、V66、D69、R83、C96、E154、A123、L125、S149和C133中的一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者、十者或全部十一者)；(b)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基s R42、Y44、R131、N134、Y137、R158、R163和Y168中的一者或多者(例如，残基R42、Y44、R131、N134、Y137、R158、R163和Y168中的一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)；及/或(c)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基N164、Y169和M171中的一者或多者(例如，残基N164、Y169和M171中的一者、两者或全部三者)。

在一些方面，调节剂结合至(a)THBD的残基S49、D53、V66、D69、R83、C96、E154、A123、L125、S149和C133中的全部十一者；(b)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基R42、Y44、R131、N134、Y137、R158、R163和Y168中的全部八者；及/或(c)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基N164、Y169和M171中的全部三者。

在一些方面，调节剂结合至(a)THBD的残基S49、D53、V66、D69、R83、C96、E154、A123、L125、S149和C133中的全部十一者；(b)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基R42、Y44、R131、N134、Y137、R158、R163和Y168中的全部八者；以及(c)gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基N164、Y169和M171中的全部三者。

在一些方面，调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体的gO亚基与THBD的结合降低至少50％。在一些方面，相对于无调节剂的存在下的结合，结合的降低为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，结合被废除)，例如降低为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％。在一些方面，调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低至少90％(例如，90％至100％)。在一些方面，结合的降低为至少50％(例如，为50％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)，例如，如通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量。

C.B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂

在一些方面，本公开特征为一种人巨细胞病毒(HCMV)gH/gL/UL128-131A五聚体与β-2-微球蛋白(B2M)之间相互作用的调节剂，其导致gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合降低。

在一些方面，该调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合降低至少50％。在一些方面，相对于无调节剂的存在下的结合，结合的降低为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或者为100％(即，结合被废除)，例如降低为5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％。在一些方面，调节剂使gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合降低至少90％(例如，90％至100％)。在一些方面，结合的降低为至少50％(例如，为50％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)，例如，如通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量。

D.小分子

在一些方面，调节剂或候选调节剂为小分子。小分子为如本文定义的结合多肽或抗体以外的分子。结合小分子可使用已知方法进行鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。结合小分子的大小通常小于约2000道尔顿(例如，小于约2000、1500、750、500、250或200道尔顿)，其中能够结合、较佳的是特异性地结合至如本文所述的多肽的此类有机小分子可使用众所周知的技术来鉴定，而无需过度实验。就此而言，注意到筛选小分子文库中能够结合至多肽靶标的分子的技术是此项技术中众所习知的(参见，例如，PCT出版物第WO00/00823和WO00/39585号)。结合小分子可为例如醛、酮、肟、腙、半卡腙、卡肼、一级胺、二级胺、三级胺、N-取代肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、胺基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫缩酮、缩醛、硫缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸盐、烷基卤化物、烷基磺酸盐、芳族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、胺基醇、唑啶、/>唑啉、四氢噻唑、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、吖、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、酰氯等。

在一些方面，在小分子存在下，NRP2、THBD或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合降低(例如，降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，降低5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。在一些方面，在小分子存在下，NRP2、THBD或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％，例如，增加5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％、95％至100％、或超过100％)。在一些方面，在小分子存在下，NRP2、THBD、B2M及/或HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性(例如，细胞被HCMV感染)减少(例如，减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，减少5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。

E.抗体和抗原结合片段

在一些方面，调节剂或候选调节剂为结合NRP2、THBD、B2M及/或HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')₂、双体抗体(diabody)、线性抗体、scFv、ScFab、VH结构域或VHH结构域。

在一些方面，调节剂为多特异性抗体，例如双特异性抗体。在一些方面，调节剂为结合NRP2、THBD、B2M和/或HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的多个表位的双特异性或多特异性抗体。在一些方面，调节剂为结合NRP2、THBD、B2M和HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体中的两者或更多者的双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些方面，在抗体或抗原结合片段存在下，NRP2、THBD或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合降低(例如，降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，降低5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。在一些方面，在抗体或抗原结合片段存在下，NRP2、THBD或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％，例如，增加5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％、95％至100％、或超过100％)。在一些方面，在抗体或抗原结合片段存在下，NRP2、THBD、B2M和/或HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性(例如，细胞被HCMV感染)减少(例如，减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，减少5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。

F.肽

在一些方面，调节剂或候选调节剂为结合至NRP2、THBD、B2M和/或HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的肽。肽可天然产生，或者可经工程改造。肽可以等于、小于或大于全长蛋白的亲和力结合结合配偶体。在一些方面，肽执行全长蛋白的所有功能。在其他方面，肽不执行全长蛋白的所有功能。

在一些方面，在肽存在下，NRP2、THBD或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合降低(例如，降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，降低5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。在一些方面，在肽存在下，NRP2、THBD或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％，例如，增加5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％、95％至100％、或超过100％)。在一些方面，在肽存在下，NRP2、THBD、B2M和/或HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体下游活性(例如，细胞被HCMV感染)减少(例如，减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，减少5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。

G.模拟物

在一些方面，调节剂或候选调节剂为结合至NRP2、THBD、B2M和/或HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的模拟物，例如，分子模拟物。在一些方面，模拟物可执行所模拟的多肽的所有功能。在其他方面，模拟物不执行所模拟的多肽的所有功能。

在一些方面，在模拟物存在下，NRP2、THBD或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合降低(例如，降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，降低5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。在一些方面，在模拟物存在下，NRP2、THBD或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％，例如，增加5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％、95％至100％、或超过100％)。在一些方面，在模拟物存在下，NRP2、THBD、B2M和/或HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性(例如，细胞被HCMV感染)减少(例如，减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如，减少5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。

H.用于调节蛋白质-蛋白质相互作用的测定

在一些方面，在候选调节剂存在或不存在下，NRP2、THBD或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合在用于蛋白质-蛋白质相互作用的测定中进行评估。在蛋白质-蛋白质相互作用中，相互作用的调节可被鉴定为相较于在无调节剂的存在下的蛋白质-蛋白质相互作用，在调节剂的存在下的蛋白质-蛋白质相互作用增加，例如增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、100％或超过100％(例如5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％、95％-100％或超过100％)。替代性地，在蛋白质-蛋白质相互作用中，调节可鉴定为相较于在调节剂不存在下的蛋白质-蛋白质相互作用，在调节剂存在下的蛋白质-蛋白质相互作用减少，例如减少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或100％(例如，5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。用于蛋白质-蛋白质相互作用的测定可以是例如SPR测定、生物层干涉(BLI)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、细胞外相互作用测定或细胞表面相互作用测定。

PCT/US2020/025471中描述了用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂的示例性方法，以及可以调节此类相互作用的药剂，该专利据此以引用方式全文并入。

III.治疗或防止HCMV感染的方法

A.治疗患有HCMV感染的个体的方法

在一些方面，本公开特征为一种用于治疗个体的HCMV感染的方法，该方法包含向个体施用有效量的本文所述的调节剂(例如，NRP2、THBD和/或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂)，从而治疗个体。在一些方面，本公开特征为本文描述的调节剂(例如，NRP2、THBD和/或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂)的用途，其用于制造用于治疗个体的HCMV感染的药物。在一些方面，个体为免疫功能不全的、怀孕的或者为婴儿。

在一些方面，相对于尚未施用调节剂的个体，HCMV感染的持续时间或严重程度减少至少40％(例如，减少40％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。在一些方面，HCMV感染的持续时间或严重程度减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或100％(例如，5％-15％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或95％-100％)。

B.防止HCMV感染或继发性感染的方法

在一些方面，本公开特征为一种用于防止个体的HCMV感染的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述的调节剂(例如，NRP2、THBD和/或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂)，由此防止个体的HCMV感染。在一些方面，本公开特征为本文描述的调节剂(例如，NRP2、THBD和/或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂)的用途，其用于制造用于防止个体的HCMV感染的药物。

在一些方面，相对于无调节剂的存在下的感染，调节剂降低个体的HCMV感染的可能性。在某些方面，相对于未治疗的患者或相对于使用对照方法(例如，SOC)治疗的患者，根据上述方法治疗的患者的HCMV感染的可能性、程度或严重程度减少，例如，减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％(例如，减少5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。

在一些方面，本公开特征为一种用于防止个体(例如，具有HCMV感染的个体)的继发性HCMV感染的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述的调节剂(例如，NRP2、THBD和/或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂)，由此防止个体的继发性HCMV感染。在一些方面，本公开特征为本文描述的调节剂(例如，NRP2、THBD和/或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂)的用途，其用于制造用于防止个体的继发性HCMV感染的药物。在一些方面，继发性感染为通过未经感染组织的HCMV的感染。

在一些方面，相对于无调节剂的存在下的继发性感染，调节剂降低个体的继发性HCMV感染的可能性。在某些方面，相对于未治疗的患者或相对于使用对照方法(例如，SOC)治疗的患者，根据上述方法治疗的患者的继发性HCMV感染的可能性、程度或严重程度减少，例如，减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％(例如，减少5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。

C.组合疗法

在上述治疗和防止方法中的一些方面，该方法包括向个体施用至少一种额外疗法(例如，一种、两种、三种、四种或多于四种额外疗法)。NRP2、THBD和/或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂可以在至少一种额外疗法之前、同时或之后施用个体。

在一些方面，额外疗法为宿主细胞蛋白(例如，质膜表达的的宿主细胞蛋白)与HCMV gHgLgO三聚体之间的相互作用的调节剂，例如，减少HCMV gHgLgO三聚体与宿主细胞蛋白的结合的调节剂。此类相互作用的示例性调节剂在PCT/US2021/060887中提供，其通过引用以其整体并入本文。

D.递送方法

本文所述方法中利用的组成物(例如，NRP2、THBD和/或B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体之间的相互作用的调节剂，例如小分子、抗体、抗原结合片段、肽、模拟物、反义寡核苷酸或siRNA)可以通过任何适合的方法施用，该方法包括例如静脉内、肌内、皮下、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、结膜下、囊内、黏膜内、心包内、脐内、眼内、眶内、口服、透皮、玻璃体内(例如，通过玻璃体内注射)、通过滴眼剂、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注沐浴靶标细胞(bathing target cell)、通过导管、通过灌洗、以乳膏形式或以脂质组成物形式。本文所述的方法中使用的组成物也可以全身或局部施用。施用方法可以根据多种因素而变化(例如，施用的化合物或组成物以及待治疗的病状、疾病或疾患的严重程度)。在一些方面，蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂经静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、经植入、经吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。给药可通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于短暂施用还是长期施用。本文中考虑各种给药方案，其包括但不限于在多种时间点单次或多次施用、快速注射施用和脉冲输注。

本文所述的蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂(和任何额外的治疗剂)可按照与良好医学实践一致的方式进行调配、给药和施用。此背景中考虑的因素包括待治疗的特定疾病、待治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床状况、疾病的原因、递送药剂的部位、施用方法、施用日程和医疗从业者已知的其他因素。调节剂并非必须，但可以视情况与一种或多种目前用于防止或治疗所论述病症之一种或多种药剂一起调配及/或施用。此类其他治疗剂的有效量取决于存在于制剂中的调节剂的量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文中所述相同的剂量和施用途径，或本文中所述剂量的约1％至99％，或以经验上/临床上确定为适当的任何剂量和通过任何途径使用。

III.鉴定HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M之间的相互作用的调节剂的方法

A.相互作用调节的测定

在一些方面，本公开特征为鉴定HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与β-2-微球蛋白(B2M)之间的相互作用的调节剂，该方法包括：(a)提供候选调节剂(例如，本文章节II中所述的候选调节剂)；(b)使HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M在候选调节剂存在或不存在下在允许HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合的条件下接触；以及(c)测量HCMVgH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合，其中在候选调节剂存在下的结合相对于在候选调节剂不存在下的结合的增加或降低将候选调节剂鉴定为HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M之间相互作用的调节剂。

在一些方面，本公开特征为一种鉴定HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性的调节剂的方法，该方法包括：(a)提供候选调节剂；(b)使HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M在候选调节剂存在或不存在下在允许HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合的条件下接触；以及(c)测量HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性，其中在候选调节剂存在下的下游活性相对于在候选调节剂不存在下的下游活性的改变将候选调节剂鉴定为HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性的调节剂。

在一些方面，本公开特征为一种鉴定B2M的下游活性的调节剂的方法，该方法包含：(a)提供候选调节剂；(b)使B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体在候选调节剂存在或不存在下在允许B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合的条件下接触；以及(c)测量B2M的下游活性，其中在候选调节剂存在下的下游活性相对于在候选调节剂不存在下的下游活性的改变将候选调节剂鉴定为B2M的下游活性的调节剂。

在一些方面，结合的增加或降低为至少50％(例如，50％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)，如通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的。

在一些方面，调节剂为本文章节II中所述的调节剂，例如，为小分子、抗体或其抗原结合片段(例如，双Fab、Fv、Fab、Fab’-SH、F(ab’)₂、双体抗体、线性抗体、scFv、scFab、VH结构域、或VHH结构域)、肽、模拟物、或抑制性核酸(例如，ASO或siRNA)。

在一些方面，其中调节剂为抗体或其抗原结合片段，抗体或其抗原结合片段结合HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体。在一些方面，抗体或其抗原结合片段与B2M结合。例如，在一些方面，调节剂为结合HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的抗体或其抗原结合片段、结合B2M的抗体或其抗原结合片段、或结合HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体和B2M的抗体或其抗原结合片段。

在一些方面，下游活性为HCMV对细胞的感染，并且在调节剂存在下感染减少。感染的降低可以为降低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少至少80％、至少90％或100％(例如，可能为降低5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)，例如，如在使用假型颗粒的病毒进入测定或病毒感染测定中所测量。在一些方面，感染降低至少40％，如使用假型颗粒在病毒进入测定或病毒感染测定中所测量的。

在一些方面，将候选调节剂提供至细胞(例如，哺乳动物细胞)、细胞培养基、条件培养基和/或HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体和/或B2M的纯化形式。在一些方面，候选调节剂以至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、5μM或10μM的浓度提供。在一些方面，候选调节剂以0.1nM与10μM之间的浓度提供。在一些方面，候选调节剂在溶液中(例如，以可溶形式)提供。

在一些方面，如果结合增加至少70％，则候选调节剂被鉴定为调节剂。在一些方面，结合的增加为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或超过100％(例如，该增加为5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％、95％至100％或超过100％)。在一些方面，结合的增加为至少70％。

在一些方面，如果结合降低至少70％，则候选调节剂被鉴定为调节剂。在一些方面，结合的降低为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％(例如，结合的降低为5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％、或95％至100％)。在一些方面，结合的降低为至少70％。

i.蛋白质-蛋白质相互作用调节的测定

在一些方面，在候选调节剂存在或不存在下，HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合在蛋白质-蛋白质相互作用的测定中评估。HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M之间的相互作用的调节可鉴定为相较于在调节剂不存在下的蛋白质-蛋白质相互作用，在调节剂存在下的蛋白质-蛋白质相互作用增加，例如，增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、100％或超过100％(例如，增加5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％、95％至100％、或超过100％)。替代性地，调节可鉴定为相较于在调节剂不存在下的蛋白质-蛋白质相互作用，在调节剂存在下的蛋白质-蛋白质相互作用减少，例如，减少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％或100％(例如，减少5％至15％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或95％至100％)。蛋白质-蛋白质相互作用的测定可以为例如SPR测定、生物层干涉(BLI)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、如WO 2020/205626中所述的细胞外相互作用测定或如WO 2020/205626中所述的细胞表面相互作用测定。

本说明书中引用的所有专利、专利公开和参考文献的内容通过引用全文并入本文。

V.实例

实例1.用于HCMV五聚体受体辨识和抗体中和的结构基础

A.简介

人巨细胞病毒(HCMV)为β疱疹病毒(Betaherpesvirus)家族的成员，在免疫功能不全个体中导致严重发病率和死亡率(Kotton等人,Nat.Rev.Nephrol.,6:711-721,2010)。HCMV感染在怀孕期间尤其具有威胁性，并且是导致先天性出生缺陷的主要病毒原因(Hyde等人,Reviews in Medical Virology,20(5):311-326,2010)。

HCMV表现出广泛的细胞趋性，并利用gH/gL/UL128-130-131A五聚体复合体(“五聚体”)与不同的受体蛋白结合且感染多种细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞和骨髓细胞(Connolly等人,Nat.Rev.Microbiol.,19(2),110-121,2021；E等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,116(14):7043-7052,2019；Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018；Nguyen与Kamil,Viruses,10(12):704,2018)。认为HCMV受体结合为gB糖蛋白提供触发讯号以催化病毒与宿主细胞之间的膜融合，从而允许HCMV进入细胞、复制并建立其潜伏期(Malito等人,Curr.Opin.Virol.,31:43-51,2018)。已证明神经纤毛蛋白2(NRP2)缺乏使选定的内皮细胞和上皮细胞对HCMV感染具有抗性，指示NRP2作为HCMV受体的关键作用(Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)，但这种相互作用的结构基础仍然未知。HCMV五聚体也以奈摩尔亲和力结合至血栓调节素(THBD)，但THBD在HCMV入侵中的作用仍然是个谜(Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。

感染后，HCMV引发针对五聚体的极强中和抗体，强调了复合体作为针对HCMV的治疗剂和候选疫苗的重要性(Macagno等人,J.Virol.,84(2):1005-1013,2010)。尽管付出了相当大的努力，但针对HCMV的疫苗仍然代表着未满足的医疗需求，并且目前没有批准的疗法可用于治疗先天性HCMV感染(Biron,Antiviral Research,71(2-3):154-163,2006；Chen等人,Viruses,12(1):21,2019)。这种差距主要是由于缺乏对五聚体与宿主细胞受体之间相互作用的结构理解，以及对与五聚体中和相关的表位的了解有限。

在本实例中，确定了与细胞受体NRP2和THBD复合的五聚体的高分辨率结构。这些结构突出了HCMV五聚体-受体辨识所需的特异性相互作用，并揭露了五聚体-受体复合体的意外二聚化。重要的是，发现五聚体与NRP2或THBD之间的相互作用是相互排斥的，两者皆为介导入侵不同细胞类型内的功能性受体，而非共同受体。本实例也报导结合至一组有效中和抗体的五聚体的结构，该抗体鉴定针对HCMV的关键中和位点。这些研究为理解HCMV受体辨识和基于抗体的中和提供一个框架。

B.结果的总结

本文提供的实例呈现对HCMV五聚体的全面结构、生物物理和功能分析，以提供对其架构、受体辨识、细胞入侵和中和的重要洞见。这些研究揭露了五聚体的亚基UL128-131A的大部分如何结合至两种完全不同的功能受体蛋白NRP2和THBD，这揭示了HCMV如何实现不同细胞类型的广泛细胞趋性和受体特异性。神经纤毛蛋白1和神经纤毛蛋白2已显示使用其b1结构域与结合配偶体的CendR模体相互作用，该结合配偶体包括VEGF和SARS-CoV-2的棘蛋白(Daly等人,Science,370(6518):861-865,2020；Parker等人,J.Biol.Chem.,287(14):11082-11089,2012)；然而，现在的结构研究表明，NRP2不利用这个典型的结合位点，而是通过a2和b2结构域与UL128和UL131A亚基之间的关键相互作用与五聚体接合(图1E、图1F、图1H和图8A；Wrapp等人,bioRxiv,p.2021.03.25.436804,2021)。五聚体结合后，NRP2 a1结构域从a2b1b2核心移位并重新定位在UL128与gL之间的接附位点(图1D)。值得注意的是，NRP2a1结构域结合至由THBD受体辨识的五聚体的相同区(图1A至图1H和图2A至图2D)，指示HCMV五聚体已经进化出机会结合位点，能够以高亲和力辨识多个不同的相互作用配偶体以进入不同的细胞类型。

在这些实例中，首次显示THBD为HCMV的相关功能性受体(图3A和图3B)。这些结构和生物物理研究揭露的NRP2和THBD与五聚体的相互排斥的结合(图3D至图3F)进一步表明，HCMV可能使用五聚体通过两种替代性途径进入上皮细胞和内皮细胞，而非使用这些蛋白质作为共同受体。基于NRP2和THBD的表现谱，NRP2受体可能主要用于上皮细胞感染，而THBD为内皮细胞和骨髓细胞感染的主要受体(Sartain等人,J.Immunol.,196(2):832–845,2016；Bachem等人,J.Exp.Med.,207(6):1273–1281,2010)。先前提出，五聚体在受体结合后会进行大的构形变化，以触发gB介导的膜融合及HCMV入侵(Chandramouli等人,Sci.Immunol.,2(30):2017)。然而，目前的结构研究表明，NRP2或THBD相互作用不显著改变五聚体的构形(图9C和图9D)。因此，五聚体可能通过不同的机制触发gB活化而会发生大的五聚体构形变化，可能类似于最近提出的HCMV三聚体(Kschonsak等人,Cell,184(5):1232-1244.e16,2021)。

目前的结构揭露了HCMV五聚体可以进行二聚化，其中NRP2 a1和THBD凝集素样结构域变为夹在两个五聚体之间。这种明显的受体介导的五聚体二聚化分别通过UL128亚基和NRP2或THBD受体以头对头的方式发生(图2B和图3G)。这种通过五聚体的受体接合模式明显不同于对HCMV三聚体观察到的模式，在后者中观察到每个宿主受体仅与三聚体的一个复本接合(Kschonsak等人,Cell,184(5):1232-1244.e16,2021)。值得注意的是，这些结构观察似乎与鉴定参与三聚体或五聚体辨识的人类受体所需的实验设计相一致(Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。事实上，虽然使用典型的亲和纯化和质谱方法(Kabanova等人,Nat.Microbiol.,1(8):16082,2016)将PDGFRα鉴定为三聚体受体，但生理相关的五聚体-受体相互作用的鉴定只能通过五聚体的寡聚化来实现，可能是经由增加对受体的亲合力，并可能模仿两个相对膜(即病毒包膜和宿主细胞)的分子排列(Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。受体介导的五聚体二聚化的明显要求及受体结合后结构重排的缺乏支持图5所示的五聚体特异性HCMV入侵宿主细胞的模型。在该模型中，受体结合与五聚体二聚化相关，并继而介导受体聚集，以最终促进病毒膜与宿主细胞膜的高亲和力和稳定的连系。通过尚不清楚的机制，受体介导的五聚体二聚化和膜连系将会触发gB从其融合前构形到融合后构形的转变并启动膜融合，可能是通过五聚体聚集后的gB的局部捕获和/或病毒膜双层内的扰动进行。最近，处于融合前构形的HCMV gB的高分辨率结构(Liu等人,Sci.Adv.,7(10),2021)应该为检验这些假设和其他假设开辟了新途径。未来的高分辨率结构研究将需要解决HCMV五聚体(或三聚体)与融合前gB相互作用的结构基础以及触发膜融合所需的机制。

HCMV五聚体引发针对HCMV的最有效的中和抗体反应，但对这种中和的结构基础仍然知之甚少。这些结果表明Fab 2C12直接干扰NRP2结构域结合并阻断五聚体与NRP2之间的接附(图4A至图4M)。更重要的是，Fab 7I13结合至五聚体表面，这将会阻断NRP2和THBD两者，代表杰出的中和抗体以阻断五聚体的受体相互作用并且潜在地阻断五聚体二聚化(图4A至图4M)。总体而言，本实例呈现五聚体受体接合和中和的结构基础，其揭露了对HCMV的广泛细胞趋性和细胞入侵机制的洞见。这些发现为未来开发针对HCMV的有效疫苗和疗法提供了框架。

C.方法

i.HCMV糖蛋白和Fab构建体的生成

合成经密码子优化的(用于在人类细胞中表现)HCMV gH、gL、UL128、UL130、UL131A和NRP2基因，并次转殖至质体表现载体pRK5(建南德克(Genentech))中。gH基因仅包含细胞外区(前716个氨基酸)，并与C末端Myc-Avi-8xHIS标签融合。出于蛋白质纯化目的，UL130与C末端双Strep标签融合。

ii.蛋白质表现和纯化

HCMV五聚体在三个步骤中纯化，如先前对于HCMV三聚体所述(Kschonsak等人,Cell,184(5):1232-1244.e16,2021)。用编码单个亚基的质体转染EXPI293F^TM细胞。经由切向流过滤(TFF)将对应于50L表现的表现上清液浓缩至1L至2L的体积，装载于20mL NiSEPHAROSE^TM Excel树脂(Cytiva)上，用13个管柱体积(CV)洗涤缓冲液(50mM TRIS pH 8.0、300mM NaCl、5％甘油、20mM咪唑)洗涤并以5CV溶析缓冲液(50mM TRIS pH 8.0、300mMNaCl、5％甘油、400mM咪唑)溶析。将溶析液施加至3mLXT高亲和力树脂(IBA Lifesciences)并结合2小时。用10CV Strep洗涤缓冲液r(25mM HEPES pH 7.5、300mM NaCl、5％甘油)洗涤树脂，并在补充有50mM生物素的Strep-wash缓冲液中从珠上溶析。将溶析液用/>超离心过滤装置(30kDa MWCO)浓缩，并装载于在Pentamer-SEC缓冲液(25mM HEPES pH 7.5、300mM NaCl、5％甘油)中平衡的SUPERDEX^TM 200 10/300或16/60管柱上。

使人类Fc标记的NRP2蛋白在30mL的EXPI293F^TM细胞培养物中表现，用30μg质体DNA转染，并生长7天。在收获表现培养基培养上清液后，用0.15mLAF-r蛋白nA HC-650F(Tosoh Bioscience,Grove City,OH)纯化Fc融合蛋白。通过用10CV的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤去除未结合的蛋白质和培养基组分。使用溶析缓冲液(50mM磷酸，pH 2.9)从树脂溶析NRP2-huFc融合物，并立即通过添加0.05mL的20X PBS pH 11.0中和至pH～6.0。通过与ULTIMATE^TM 3000HPLC系统(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)连接的/>SEC 300管柱(Sepax Technology,Newark,DE)进行粒径筛析层析(SEC)纯化，进一步精制蛋白质。将管柱在1X PBS，pH 7.4中平衡，样品通过等度溶析以1.5ml/分钟的流速分离。

从10L表现上清液中纯化人类THBD-Flag和NRP2-Flag。将上清液与10mL M2琼脂糖Flag树脂(Sigma)一起孵育，并在4℃孵育20小时。将树脂用10CV FLAG洗涤缓冲液(25mMHEPES pH 7.5、200mM NaCl、5％甘油)洗涤，并用补充有0.2mg/ml FLAG肽的FLAG洗涤缓冲液溶析。将溶析液用超离心过滤装置(30kDa MWCO)浓缩，并装载于在SEC缓冲液(25mM HEPES pH 7.5、200mM NaCl)中平衡的SUPERDEX^TM 200 10/60管柱上。

将片段抗原结合区(Fab)MSL-109的重链和轻链在phoA启动子下在大肠杆菌34B8细胞(内部株)中在磷酸盐限制培养基(C.R.A.P)中在30℃共表现20小时。将来自1L表现体积的沉淀物重新悬浮在补充有Roche蛋白酶抑制剂锭剂的70mL裂解缓冲液(1x PBS，25mMEDTA)中，并通过音波震荡裂解。通过以25,000x g离心1小时使裂解产物澄清，然后使其通过0.45μm过滤器。将澄清的裂解产物装载于在裂解缓冲液中平衡的5mL HiTrap蛋白质G HP(Cytiva)管柱上。将管柱用10-20CV裂解缓冲液洗涤并用0.58％(v/v)乙酸溶析。通过立即添加SP-A缓冲液(20mM MES pH5.5)调节溶析液的pH，并将其装载于5mL HiTrap SP HP阳离子交换层析管柱(Cytiva)上。将Fab以线性20CV梯度溶析至SP-B缓冲液(20mM MES pH 5.5，500mM NaCl)。将溶析液使用超离心过滤装置(10kDa MWCO)浓缩，并在于Fab-S200缓冲液(25mM Tris pH 7.5，300mM NaCl)中平衡的SUPERDEX^TM 200 10/300管柱上进一步纯化。经纯化的Fab在/>超离心过滤装置(10kDa MWCO)中浓缩，在液N₂中冷冻，并在-80℃储存。Fab 2C12、7I13、8I21和13H11的重链和轻链在phoA启动子下在磷酸盐限制培养基(C.R.A.P.)中在大肠杆菌34B8细胞(内部株)中在30℃共表现20小时。将来自4L表现的沉淀重悬于补充有Roche蛋白酶抑制剂锭剂的250mL裂解缓冲液(25mM Tris pH7.5、150mM NaCl、5mM EDTA、2mM NaN₃)中并通过音波震荡裂解。随后的纯化遵循对于MSL-109描述的类似方案。

五聚体、Fab和THBD之间的复合体通过在冰上用至少1.2摩尔过量的Fab和受体孵育至少1小时来生成，并通过SEC纯化以去除过量的Fab/受体。五聚体-NRP2-Fab复合体分两步形成。首先，将五聚体与NRP2混合并通过SEC纯化，然后添加过量的Fab 8I21和13H11并进行第二次SEC纯化。

iii.CryoEM样品制造和数据采集

本研究中显示的HCMV五聚体复合体如先前针对HCMV三聚体所描述的来制造(Kschonsak等人,Cell,184(5):1232-1244.e16,2021)。对于HCMV五聚体gHgL-UL128-UL130-UL131A+NRP2+8I21+13H11复合体，使用Solarus电浆清洁器(Gatan)将多孔碳网格(25nM Au R 0.6/1 300目；/>)辉光放电20秒。对于全部其他五聚体复合体，将多孔碳网格(/>25nM Au R 0.6/1 300目；)与4mM单巯基烷(C11)PEG6-OH(11-巯基十一烷基)六乙二醇(SPT-0011P6，SensoPath Technologies,Inc.,Bozeman,MT)的硫醇反应性、自组装反应混合物一起孵育(Meyerson等人,Sci.Rep.,4:7084,2014)。将网格与这种自组装单层(SAM)溶液一起孵育24小时。在网格冷冻之前，将网格从SAM溶液中取出并用EtOH冲洗。将3μL样品以0.66mg/mL至1.8mg/mL浓度施加至网格上，并使用Leica EM GP(Leica)使用3.5秒的印渍时间在100％湿度下进行单面印渍，并在由液氮冷却之液态乙烷中快速冷冻。五聚体-NRP2-8I21-13H11样品在室温与0.025％EM级戊二醛温和交联10分钟，并在网格应用之前用9mMTris pH 7.5淬灭。

使用SerialEM(Mastronarde,J.Struct.Biol.,152(1):36-51,2005)在以300keV运行、具有配备K2 Summit直接电子探测器照相机的生物量子能量过滤器(Gatan Inc.,Pleasanton,CA)的Titan Krios G3i(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)上收集关于HCMV五聚体gHgL-UL128-UL130-UL131A+2C12+7I13+13H11和HCMV五聚体gHgL-UL128-UL130-UL131A+NRP2+8I21+13H11的动态影像堆栈。使用20eV能量狭缝以对应于每像素的165,000×放大率记录影像。每个影像堆栈包含50帧，每0.2秒记录一次，累积剂量为～/>且总曝光时间为10秒。以0.5μm至1.5μm的设定散焦范围记录影像。

使用SerialEM(Mastronarde,J.Struct.Biol.,152(1):36-51,2005)在以300keV运行、具有配备K3 Summit直接电子探测器照相机的生物量子能量过滤器(Gatan Inc.,Pleasanton,CA)的Titan Krios G3i(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)上收集关于HCMV五聚体gHgL-UL128-UL130-UL131A+THBD+MSL-109+13H11的动态影像堆栈。使用20eV能量狭缝以对应于每像素的105,000×放大率以EFTEM模式记录影像。每个影像堆栈包含60帧，每0.05秒记录一次，累积剂量为～/>且总曝光时间为3秒。以0.5μm至1.5μm的设定散焦范围记录影像。

iv.CryoEM数据处理

使用RELION(Scheres,J.Struct.Biol.,180(3):519-530,2012)、cisTEM(Grant等人,eLife,7:e35383,2018)和cryoSparc(Punjani等人,Nat.Methods,14(3):290–296,2017)软件包的组合，类似于在HCMV三聚体上进行的先前工作(Kschonsak等人,Cell,184(5):1232-1244.e16,2021)，处理CryoEM数据。

HCMV五聚体-2C12-7I13-13H11 cryoEM数据如图13A至图13H中所述进行处理。对于第一个从头开始重构的生成，对18,326个动态影像进行运动校正，并在cisTEM内拟合对比转移函数参数。使用cisTEM内的圆形斑点挑选工具挑选了总计1,527,802,766个潜在粒子。在2轮cisTEM 2D分类中对粒子进行分类，以选择最佳排列粒子，得到184,833个粒子。这些粒子在具有三个靶标体积的cisTEM内进行从头开始3D生成。对应于结合至Fab 2C12、7I13和13H11的HCMV五聚体的体积用作高分辨率3D细化的3D参考。对于五聚体-2C12-7I13-13H11复合体的高分辨率3D重构的生成，使用RELION中的MotionCor2(Zheng等人,NatureMethods,14:331-332,2017)实现方式校正了总计18,326个动态影像的帧运动，且使用CTFFIND-4(Rohou与Grigorieff,J.Struct.Biol.,192(2):216-221,2015)光谱的至波段拟合对比转移函数参数。根据检测到的拟合分辨率好于/>对CTF拟合影像进行滤波。使用/>低通过滤的五聚体-2C12-7I13-13H11复合体参考结构，通过用gautomatch(MRC Laboratory of Molecular Biology)进行模板匹配挑选出总计5,128,264个粒子。在RELION 2D分类期间对粒子进行分类，并将所选择的4,792,984个粒子导入cisTEM进行3D细化。第一个五聚体-2C12-7I13-13H11重构是在五聚体-2C12-7I13-13H11复合体周围使用屏蔽并且通过在屏蔽之外应用低通过滤器(过滤器分辨率/>)和0.30的评分阈值进行自动细化和手动细化后获得的，因此在每次循环时只有评分最高的30％的粒子影像将会包括在3D重构中。在迭代的手动细化轮次中，屏蔽外的权重从0.5逐渐减少到0.15(细化中没有使用超过/>的数据)。为了提高图的质量，在使用屏蔽将图分成三个不同的区并在屏蔽之外应用低通过滤器(过滤器分辨率/> )和0.20的评分阈值后，进行聚焦细化。聚焦图在cisTEM中使用以下参数进行锐化：从/>的分辨率平坦化，从倒易空间的原点至/>应用-/>的预截止B因子，并应用优值过滤器(figure-of-merit filter)(Rosenthal与Henderson,J.Mol.Biol.,333(4):721-745,2003)。对于模型构建和图形准备，使用phenix combine_focused_maps从三个单个聚焦3D图生成合成图(Afonine等人,Acta Crystallogr.Sect.D Struct.Biol.,74(6):531-544,2018)。

HCMV五聚体-THBD-13H11-MSL109 cryoEM数据如图10A至图10F中所述进行处理。使用Relion的运动校正实施对10,926个动态影像进行运动校正，并将经比对的显微照片经由CTFFIND4导入至cisTEM进行CTF估计。选择了总计9,167张CTF拟合分辨率至少为的影像用于从头开始粒子挑选，使用/>的排除和模板半径。使用400像素框尺寸和每像素提取所得的10,680,163个粒子坐标。多轮分层2D分类和类别选择最终产生了三个粒子堆栈：78,577个粒子的堆栈，由2D类组成，其中完整的二聚体经清晰地解析；172,398个粒子的堆栈，其含有几个其他类，其中二聚体几乎经完全解析；以及504,492个粒子的堆栈，含有具有至少由一些经解析的区的全部2D类。从该78,577个粒子的堆栈生成从头开始C2对称3D图，使用C2对称性进行自动3D细化产生初始中间分辨率初始图。将该172,398个粒子的堆栈导出至Relion，并将C2对称初始图用作3D自动细化的模板，首先在C2中，并最终使用C1对称和C2对称松弛。这产生了中间分辨率HCMV五聚体二聚体图，其中单个经不对称结合的THBD在二聚体界面处被解析。回到cisTEM，然后在C1中针对这种不对称图对最具包容性的504,492个粒子的堆栈进行细化，使用全分子屏蔽和三个不同的聚焦屏蔽：一个仅包括两种原体的THBD和UL128、UL130、UL131，一个仅包括假二聚体的单个原体的gL、gH、13H11和MSL109，并且一个仅包括另一个原体的gL、gH、13H11和MSL109。Phenix ResolveCryoEM密度改良应用于这些中的各者，并且用于模型构建的最终图系通过将UCSF Chimera中的密度改良图组合来生成，通过相关性将聚焦图拟合到全分子图，重新采样到公共网格，并为每个立体像素取三个聚焦图之间的最大值(vop最大值)。使用Relion后处理自未经锐化、未经过滤的半图计算局部分辨率。

HCMV五聚体-NRP2-13H11-8I21 cryoEM数据如图6A至图6I中所述进行处理。使用Relion对21,357个动态影像进行运动校正，并使用CTFFIND4估计CTF参数，并选择CTF拟合分辨率至少为的影像进行进一步处理。Relion从头开始Laplace-of-Gaussian粒子挑选产生了982,313个粒子坐标，该坐标系使用142像素的框尺寸和/>的像素尺寸提取。在2D分类后，将2D类的明显HCMV五聚体(69,767个粒子)重新提取到400像素和/>/像素的框尺寸，并进行Relion从头开始3D细化，然后进行3D自动细化，产生初始五聚体图。对于二聚五聚体-NRP2-8I21-13H11，2D类选择用作基于Relion模板的粒子挑选的模板，产生1,300,844个坐标。将这些坐标提取到一个400像素和每像素/>的框尺寸，并进行分层2D分类和选择，最终产生72,745个粒子。将这些粒子直接导入至cisTEM，并使用全分子屏蔽针对初始二聚体五聚体图进行细化(细化中未使用超过/>的数据)。对于单体五聚体-NRP2-8I21-13H11复合体，选择了21,357张CTF拟合分辨率至少为/>的影像进行进一步处理。通过用gautomatch(MRC Laboratory of Molecular Biology)与经/>低通过滤的单个的五聚体-NRP2-8I21-13H11重构的投影进行模板匹配，挑选了总计2,532,206个粒子。使用66px的框尺寸和/>像素尺寸提取粒子，使用Relion 2D分类进行分选，并且用280px的框尺寸和/>的像素尺寸提取了2,252,924个粒子。将这些粒子直接导入至cisTEM，并使用全分子屏蔽针对初始单体五聚体图进行细化(细化中未使用超过/>的数据)。为了提高图的质量，在使用屏蔽将图分成三个不同的区并在屏蔽之外应用低通过滤器(过滤器分辨率/>)和0.20的评分阈值后，进行聚焦细化。将Phenix ResolveCryoEM密度修改应用于这些图中的各者，然后通过将UCSF Chimera中的密度改良图组合来生成用于模型构建的最终图。对于二聚体五聚体-NRP2-8I21-13H11，使用Relion后处理对未经锐化、未经过滤的半图计算局部分辨率。对于单体五聚体-NRP2-8I21-13H11复合体，在cisTEM中使用重新实现的blocres算法确定局部分辨率。

v.模型构建和结构分析

HCMV五聚体结构的gH和gL、UL128、UL130和UL131A亚基(Chandramouli等人,Sci.Immunol.,2(30):2017)作为刚体拟合到cryoEM图中。THBD凝集素结构域是基于人类RegIIalpha(PDB：4MTH，(Mukherjee等人,Nature,505(7481):103–107,2014))使用SwissModel构建(Waterhouse等人,Nucleic Acids Res.,46(W1):W296–W303,2018)。NRP2(PDB：2QQO)的结构用作NRP2 a1-a2-b1b2结构域建模的模板。所得模型作为刚体拟合到cryoEM图中。在大量重建和手动调整后，使用phenix.real_space_refinement进行多轮真实空间细化(Afonine等人,Acta Crystallogr.Sect.D Struct.Biol.,74(6):531-544,2018)工具来校正初始模型与图之间的全局结构差异。该模型在Coot中进一步手动调整(Emsley等人,Acta Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.,66(4):486-501,2010)，该调整通过迭代的多轮建模以及Isolde(Croll,Acta Crystallogr.Sect.D Struct.Biol.,D74:519-530,2018)和Phenix(Afonine等人,Acta Crystallogr.Sect.DStruct.Biol.,74(6):531-544,2018)中的真实空间细化来进行。使用具有内置MolProbity评分(Williams等人,Protein Sci.,27(1):293-315,2018)的phenix.validation_cryoem(Afonine等人,Acta Crystallogr.Sect.D Struct.Biol.,74(6):531-544,2018)验证该模型。使用PyMOL(The PyMOL Molecular Graphics System，v.2.07LLC)和UCSF ChimeraX(Goddard等人,Protein Sci.,27(1):14-25,2018)制图。序列是使用Clustal Omega(Sievers等人,Mol.Syst.Biol.,7(1),2011)在JalView中比对(Waterhouse等人,Bioinformatics,25(9):1189-1191,2009)并且用ESPript3.0例示性说明(Robert与Gouet,Nucleic Acids Res.,42(W1):W320-W324,2014)。

vi.细胞与病毒

用于这些研究的细胞与Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018中所述者相同。ARPE-19为来源于自发产生的视网膜色素上皮(RPE)细胞系(ATCC CRL-2302)的雄性细胞系，并在补充有10％FBS和青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)的D-MEM/F-12+GLUTAMAX^TM(Thermo Fisher Scientific)中培养。HAP-1细胞为来源于KBM-7细胞系的雄性慢性骨髓性白血病(CML)细胞系，获自Horizon Genomics GmbH，并在10％FBS和青霉素/链霉素存在下在Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)+GLUTAMAX^TM中培养。人类脐静脉内皮细胞(HUVEC，来自男性和女性供体的池)获自Lonza，由Fondazione IRCCSPoliclinico San Matteo,Pavia,Italy提供，并在ENDOGRO^TM-VEGF完全培养基(Millipore)中培养。HEK293FT为女性人类胚胎肾细胞系分离物，来源于用SV40大T抗原(Thermo FisherScientific)转化的人类胚胎肾细胞。HEK 293FT细胞系在D-MEM+10％FBS、0.1mM MEM非必需氨基酸、GLUTAMAX^TM、1mM MEM丙酮酸钠和500mg/mL GENETICIN^TM(Thermo FisherScientific)中培养。确认全部细胞系皆不含霉浆菌。HCMV临床分离物VR1814由Virologiae Microbiologia,Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo,Pavia,Italy提供。HCMVVR1814在HUVEC中繁殖。ARPE-19和HAP-1细胞分别在ATCC和Horizon Genomics GmbH通过对短纵排重复序列(STR)基因座的分析进行验证。HUVEC通过CD31/105、von Willebrand因子VIII的表现进行验证，并且对于乙酰化低密度脂蛋白摄取呈阳性。HEK293FT是购自ThermoFisher Scientific，并通过其生产高效价感染性慢病毒粒子的能力进行验证。

vii.流式细胞分析技术染色

如Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018中所述进行流式细胞分析技术染色。对于细胞表面染色，用细胞刮刀轻轻分离黏附细胞(ARPE-19、HUVEC和HAP-1)并用PBS+2％FBS洗涤两次，在PBS+0.5％BSA+2mM EDTA中与特异性抗神经纤毛蛋白2抗体和抗CD46抗体(AF2215和AF2005，R&D systems)、抗凝血酶调节素抗体(殖株141C01，Abcam)或作为同型对照的2μg/ml正常绵羊IgG亲和纯(R&DSystems)在冰上一起孵育30分钟。两次洗涤后，将细胞与2mg/ml抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 594结合的(Thermo FisherScientific)二级抗体在冰上一起孵育30分钟，洗涤两次，并用FACS LSRFORTESSA^TM(BDBiosciences)流式细胞分析仪获取。使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。

viii.病毒微量中和

将抗体和可溶性重组蛋白的连续稀释液与HCMV临床分离物(VR1814株)在37℃预孵育1小时，然后添加到在96孔平底盘中培养的ARPE-19、HUVEC或HAP-1细胞的汇合单层中(感染复数(MOI)为1)。连续稀释液(1:3)用于微量中和测定，其中第一稀释液为20μg/mL。3天后收获感染的细胞并用BD CYTOFIX/CYTOPERM^TM(Thermo Fisher Scientific)固定，用PBS+2％FBS洗涤两次，并在PBS+0.5％BSA+2mM EDTA中与2μg/mL的特异性小鼠抗pp72抗体(殖株6E1，Santa Cruz Biotechnology，SC-69834)或同型对照在冰上一起孵育30分钟。两次洗涤后，将细胞与2μg/mL山羊抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 647结合至(Thermo FisherScientific)二级抗体在冰上一起孵育30分钟。通过用7-胺基放线菌素D(7-AAD；BioLegend)染色将死细胞排除在计数之外。使用FACS LSRFORTESSA^TM(BD Biosciences)流式细胞分析仪获取样品。使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。通过FACS计算感染的细胞的百分比。通过以相对感染的细胞针对MFI讯号绘图来生成剂量-反应曲线。使用Prism 8(GraphPad Software)通过非线性回归计算导致50％感染抑制的浓度(IC50)。

ix.基因过表现和基因KO

用于这些研究的基因过表现和敲除(KO)如Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018中所述进行。人类Nrp2(Accession#AF022860)、CD46(Accession#NM_002389)和THBD(Accession#AF495471)是自GenEZ ORF数据库(Genscript)订购，并在pCDH-EF1-MCS(System Biosciences)中选殖。慢病毒粒子是通过用pCDH-EF1-MCS(SystemBiosciences)、pMD2.G(Addgene)和psPAX(Addgene)对HEK293FT(Thermo FisherScientific)进行PEI转染生成，并在蔗糖垫上纯化。HAP-1KO由Horizon Genomics GmbH通过NRP2的CRISPR/Cas9生成。用0.5mg/ml嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)选择用慢病毒转导的HAP-1细胞3天。扩增单个殖株并通过流式细胞分析技术分析靶标基因的有效KO并通过Sanger定序确认。用于NRP2的CRISPR/Cas9的导引RNA为5’_GGGTAGTCCTGGGGGTAAC

C_3’(SEQ ID NO:8)。

x.扩散测定

为了研究细胞扩散，HAP 1细胞单层以0.1PFU/细胞的MOI接种HCMV VR1814(病毒在ARPE-19细胞上滴定)。然后在第2天或第8天用小鼠抗pp72抗体(殖株6E1.Santa CruzBiotechnology，SC-69834)或同型对照以2μg/mL在冰上染色30分钟。感染的HAP1-Nrp2 KO用作对照，且没有显示任何感染的存在。

xi.生物层干涉

NRP2、THBD、Fab与HCMV五聚体之间的相互作用通过生物层干涉使用Red96系统(ForteBio)进行分析，如先前所述(Kschonsak等人,Cell,184(5):1232-1244,2021)。使用96孔黑色平底盘(Greiner Bio-One)在25℃收集所有数据。将重组NRP2-Fc或THBD-Fc蛋白捕获到抗人Fc涂覆(AHC)的传感器(Sartorius)上，并测试与作为可溶性分析物的CMV五聚体的结合。按照制造商的说明，在PBS中进行测定之前，将传感器平衡10分钟。全部步骤，包括加载、基线、缔合和解离，皆在PBS中进行。

为了比较HCMV五聚体与NRP2 WT和突变型蛋白之间的相对结合，将NRP2-Fc蛋白捕获到AHC传感器上，并以50nM浓度测试与作为可溶性分析物的五聚体的结合。与NRP2突变型蛋白的结合相对于与NRP2 WT蛋白的结合来表示。缔合步骤结束时的结合单位用于计算图中显示的相对结合。对于NRP2-THBD竞争实验，相对于经预平衡的五聚体-NRP2-Fc复合体，以不同浓度(1:1；1:10；1:50；1:100摩尔过量)添加THBD-Flag。对于Fab竞争实验，将Fab2C12、7I13、8I21、13H11或MSL-109以100μg/ml的浓度过量添加至经预平衡的五聚体-NRP2-Fc复合体中。在全部情况下，数据皆使用Red96仪器(Forte Pall软件9.0版)获取。随后，利用Biaevaluation软件4.1版(GE Healthcare)计算动力学参数。将数据拟合至1:1Langmuir结合模型。

xii.定量和统计学分析

在图6A至图6I、图9A至图9D、图11A和图11B中，cryoEM密度图的分辨率估计是基于0.143傅里叶壳相关(FSC)标准(Rosenthal与Henderson,J.Mol.Biol.,333(4):721-745,2003)。

在图3A和图3B中，在图式和图式简要说明中报导了统计学参数，包括n的精确值、精度测量值(几何平均值±SEM)和统计学显著性。当p<0.05时，认为数据为统计学显著。没有使用统计学方法来预先确定样品量，不需要研究人员设盲，也没有排除数据点。使用Prism 8(GraphPad软件)分析数据，使用双尾非参数Mann-Whitney U检验进行两个组的比较，或使用Kruskall-Wallis检验(和Dunn事后检验)比较三个或更多个组(星号表示统计学显著性*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001)。使用Microsoft Excel(14.7版)分析并表示细胞表面相互作用筛选数据。

实例2.五聚体-NRP2受体结合的结构基础

先前对HCMV糖蛋白复合体的结构研究已指示这些分子由于其固有的柔韧性、细长性质和众多糖基化位点而难以进行高分辨率结构确定(Ciferri等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,112(6):1767-1772,2015)。因此，HCMV五聚体与神经纤毛蛋白2(NRP2)的可溶性胞外域以及中和Fabs13H11和8I21复合重构，并使用单粒子低温电子显微镜(cryo-EM)确定其等的结构(图1A至图1H和图6A至图6I)。二维类平均鉴定了两个粒子群。一个群体为单体的，代表在大多数粒子中，一个五聚体结合至一个NRP2复本。出乎意料的是，鉴定出第二个二聚体群，其中两个五聚体复合体包裹在单个NRP2分子周围并以头对头的方式排列(图6D至图6F)。

结合至13H11和8I21的单体五聚体-NRP2复合体的结构经确定为～的分辨率(图6G至图6I)。聚焦的3D重构允许构建大多数五聚体-13H11-8I21复合体以及NRP2 a2、b1和b2结构域的结构模型。(图1C、图1D和图7A以及表1)。NRP2的a1结构域的密度比复合体的其余部分弱，这可能是由于可挠性或a1结构域以不同方向与五聚体松散相互作用的能力(图1D和图6G)。没有观察到NRP2的C末端MAM结构域的密度，尽管它存在于蛋白质构建体和样品中。

表1.Cryo-EM数据收集、细化和验证统计

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鉴定了NRP2与五聚体之间相互作用的三个主要位点，与之前的观察结果相一致(Wrapp等人,bioRxiv,p.2021.03.25.436804,2021)(图1E至图1G)。在位点1处，NRP2的a2结构域中的钙配位区与位于五聚体的UL128的N末端结构域中的残基建立电荷相互作用(图1E至图1G)。具体而言，NRP2-D197即NRP2-D252与UL128-K47相互作用，而NRP2-N172接触UL128-R57(图1E)。位点2建立在NRP2的b2结构域与UL130和UL131A的C末端股之间(图1F和图1G)。值得注意的是，发现在位点1或位点2处的五聚体上的电荷反转突变破坏NRP2结合(图1H)。相对于未结合的NRP2结构，a1结构域在五聚体结合后从a2b1b2核心移位，并重新定位到第三相互作用位点Site3，该位点沿着UL128与gL之间附接位点的UL组分的凹面定位(图1D)。该区在cryoEM图中很难解析，表明a1结构域与单体五聚体的结合是动态的，这与以下发现相一致：在a1结构域不存在下，NRP2仍然能够与五聚体相互作用，尽管程度较低(Wrapp等人,bioRxiv,p.2021.03.25.436804,2021)。

虽然NRP1和NRP2的折迭是保守的，但NRP2与HCMV五聚体相互作用的位点在NRP1中是不同的，这为NRP2受体的特异性提供了结构原理(图8A至图8C；Appleton等人,EMBO J.,26:4902-4912,2007)。有趣的是，已知NRP1和NRP2蛋白与若干常见配偶体(包括VEGF和SARS-CoV-2的棘蛋白)通过以下模式相互作用，在该模式中，其等各自的b1结构域与结合配偶体中的[R/K]XX[R/K](CendR)模体相互作用(Daly等人,Science,370(6518):861-865,2020；Parker等人,J.Biol.Chem.,287(14):11082-11089,2012)。然而，本文呈现的结构和McLellan小组的研究(Wrapp等人,bioRxiv,p.2021.03.25.436804,2021)明确表明，五聚体与NRP2之间的相互作用不涉及b1结构域上的这种共同结合表面，而是需要NRP2的a2结构域和b2结构域与五聚体的UL组分，特别是UL128与UL131A之间的特异性相互作用(图1E至图1G和图8D；Daly等人,Science,370:861-865,2020；Parker等人,J.Biol.Chem.,287:11082-11089,2012)。这些特征突出了五聚体可以与之相互作用的多种细胞蛋白的结构经济性。

NRP2受体与五聚体的相互作用可以传播构形变化以启用或禁用其他HCMV糖蛋白的结合，诸如融合前gB的结合。将结合至NRP2的五聚体的cryo-EM结构与先前测定的在受体不存在下的五聚体的晶体结构(PDB：5VOB(Chandramouli等人,Sci.Immunol.,2(30):2017))以及HCMV gHgLgO三聚体的结构(仅gH和gL亚基(Kschonsak等人,Cell,184(5):1232-1244,2021)进行比较。值得注意且与之前的发现(Wrapp等人,bioRxiv,p.2021.03.25.436804,2021)相一致的是，在全部比较中皆观察到了非常相似的gH/gL构形(图9A和图9B)，这意味着HCMV融合机构的活化必须以不同的机制为基础，如下所述。

实例3.五聚体-THBD受体结合的结构基础

接下来，重构可溶性THBD胞外域与HCMV五聚体以及Fab 13H11和MSL-109的化学计量学复合体，并且其结构经确定为约～的总体分辨率(图2A至图2D、图7B和图10A至图10F以及表1)。联想起NRP2头对头五聚体二聚体群，二维分类揭露了两个五聚体分子以头对头方式缠绕在一个THBD受体上，通过UL128亚基进行相互作用(图2B)。在这种二聚体复合结构中，THBD N末端凝集素样结构域夹在两个五聚体分子之间，且具体而言，楔入由UL组分在UL128与gL之间的相互作用位点处形成的两个凹面之间(图2B)。在宿主细胞膜上受体的锚定点方向观察到额外的低分辨率密度，可能对应于THBD TME1和将其连接至由UL130和UL131A亚基形成的五聚体凸面上的THBD凝集素样结构域的连接符区(图11A)。正如对于NRP2-五聚体复合体所观察到的(图9C)，THBD的结合不诱导五聚体的任何主要结构重排(补充图S4D)。

THBD凝集素样结构域为球状结构域，由插入在b2与b3之间的六个β股(b1和b6)以及两个α螺旋(a1和a2)构成(图11B)。THBD的两个相对表面由两个接合的五聚体分子的相同区辨识，表明该界面的显著结构可塑性(图2B)。具体而言，UL128的N末端区(UL128-R42或UL128-Y44)分别与THBD-R83和THBD-E154或者THBD-A123和THBD-L125相互作用(图2B)。类似地，以残基UL130-Y169为中心的UL130发夹在一侧与THBD-S149相互作用，且在另一侧与THBD-C133相互作用(图2B)。此外，五聚体1UL128的C末端区(UL128-R131、UL128-N134、UL128-Y137)与THBD-V66和THBD-D69相互作用，而五聚体2UL128上的不同区(UL128-R158、UL128-R163、UL128-Y168)接触THBD-S49和THBD-D53(图2B)。总体而言，这种结构揭露了THBD与五聚体二聚体之间在UL128和UL130亚基上的重迭区处惊人的大且多特异性的相互作用足迹(图2C和图2D)。

实例4.THBD为HCMV的功能性受体并且与NRP2竞争五聚体结合

为了确定THBD是否为HCMV的功能性受体，测试了可溶性蛋白质和抗体抑制病毒入侵上皮细胞和内皮细胞的能力。正如所料，重组NRP2和泛NRP抗体(Appleton等人,EMBO J.,26(23):4902–4912,2007)以剂量依赖性模式抑制上皮细胞和内皮细胞中的HCMV感染(图3A；Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。重组THBD将病毒感染降低到低得多的程度，但重组THBD与NRP2的组合对于HCMV入侵的抑制高于单独的NRP2，表明THBD在HCMV感染中发挥潜在的功能作用(图3A)，并且与已发表的结果相一致(Martinez-Martin等人,Cell,174(5):1158-1171,2018)。为了进一步测试这一假设，检查了THBD在缺乏NRP2的细胞中介导HCMV入侵的能力(图3B和图12A)。THBD过表现对于HAP-1野生型(WT)的HCMV感染效应极小，但其在NRP2敲除(KO)细胞中的过表现显著增加病毒入侵(图3B、图12A和图12B)。作为对照，在0.1μg/mL的8I21 mAb存在下重复实验。五聚体特异性mAb的添加完全消除了感染，证实了五聚体特异性感染(图3B)。此外，观察到表现THBD的细胞能够扩散病毒(图12C)。总之，这些数据指示NRP2和THBD两者皆为HCMV的相关受体，可以作为独立受体或共同受体发挥作用。

这些结构分析表明了五聚体如何进化到与位于不同细胞的表面上的结构不同的受体接合。值得注意的是，NRP2和THBD通过独特的相互作用表面结合至五聚体，其中五聚体-NRP2与五聚体-THBD复合体的重迭表明这些受体在五聚体上共享叠加的结合位点(图3C)。具体而言，共同的相互作用位点位于UL128与gL接合的界面上并且负责NRP2 a1结构域与THBD N末端凝集素结构域的结合，指示这些相互作用配偶体不能同时结合五聚体(图3C)。为了测试观察结果，通过将结合至NRP2的HCMV五聚体与递增量的THBD一起孵育来进行竞争实验，并且观察到THBD可以在高浓度下竞争NRP2结合(图3D)。总体而言，这些结构和生物物理学数据指示NRP2和THBD不作为共同受体发挥作用，而是通过作为独立受体介导HCMV趋性。

实例5.HCMV五聚体二聚体以类似的架构与NRP2和THBD接合

结合至NRP2的五聚体的意外二聚体架构与在THBD结合后观察到的二聚体群高度相似(图3E)。NRP2的a1结构域包裹在两个五聚体分子之间，类似于THBD的N末端凝集素结构域，而NRP2的a2b1b2结构域仅与五聚体中之一者接合以形成明显不对称的组装(图3E)。值得注意的是，这些两个受体超组装体也共享保守的二聚化界面，该界面由位于五聚体最远端区的UL128亚基N末端区的残基的网络介导(图3F和图3G)，表明二聚体组装的潜在生理相关性。

实例6.通过单株抗体进行五聚体中和的结构基础

针对HCMV的高效中和抗体已从HCMV免疫供体的永生化记忆B细胞中分离出，并且已显示靶向五聚体的构形表位(Macagno等人,J.Virol.,84(2):1005-1013,2010；Ciferri等人,PLoS Pathog.,11(10),2015)。为了提供这些中和相互作用的视图，结合至高效中和Fab 2C12和7I13以及结合至gH结合Fab 13H11的五聚体的结构经确定为～的总体分辨率(图13A至图13H)。值得注意的是，2C12在由NRP2 a2b1b2结构域辨识的同一区域中结合五聚体的UL131A和UL128亚基(图4A至图4E和图4J)。具体而言，来自2C12的轻链的Y55、Y116、G119和N120在残基T24至N28之间结合UL131A的N末端区，而2C12的重链(N81、Q125和V130)辨识UL131A-K27以及UL128-R51、R108和I109(图4B至图4E)。Fab 7I13隐藏了大的足迹/>并且结合至辨识THBD和NRP2 a1结构域的五聚体上的同一表面(图4E至图4I和图4K)。来自7I13的轻链和重链两者的残基通过疏水、极性和电荷相互作用的组合在残基Y44、P59、R131、N134和L135上接触UL128，并在R168、Y169、M171和N200处结合UL130(图4F至图4I)。Fab 8I21，显示在五聚体-NRP2复合体的结构中(图6A至图6I)，其在与THBD或NRP2结合位点不重迭的区中辨识五聚体(图4A和图14A至图14C)。2C12-7I13-五聚体与NRP2-五聚体或THBD-五聚体结构的重迭指示2C12阻断NRP2结合，但不阻断THBD结合(图4J和图14B)，并且这些结构的比较表明7I13可以阻断两种受体亦即NRP2和THBD的结合(图4K和图14C)。事实上，对五聚体的竞争相互作用实验显示，NRP2结合被2C12和7I13阻断，但不被8I21或gH特异性中和抗体阻断(图4L)，而THBD结合被7I13阻断，但不被2C12、8I21或gH特异性中和抗体阻断(图4M)。实例7.鉴定β-2-微球蛋白为一种新型HCMV五聚体相互作用物

也发现β-2微球蛋白(B2M)作为额外的相互作用配偶体，并确定其与HCMV五聚体复合的结构。

先前的全基因体CRISPR/Cas9筛选将嗅觉受体(OR14L1)鉴定为HCMV五聚体的推定受体，并且表明包含OR14L1的N末端26个残基的合成肽作为相互作用所需的最小区(E等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,116:7043-7052,2019)。由于ORL4L1为属于嗅觉受体亚家族的多跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)，尝试用报导的与GFP融合的OR14L1最小肽重构HCMV五聚体，并观察到非化学计量结合(图16A和图16B)。Cryo-EM和多轮3D分类用于尝试分离结合至OR14L1肽的粒子以确定其结构(图16C至图16G)。尽管没有观察到导致OR14L1肽-GFP融合的额外密度(数据未显示)，但鉴定了显示额外密度(以～分辨率)的粒子的子集(～10％)，其对应于UL亚基的凹面界面处的β三明治折迭(图16E)。SDS-PAGE和质谱分析指示样品含有丰富的额外共纯化蛋白，亦即β-2-微球蛋白(B2M)，其为存在于体液和组织培养基中的11.8kDa细胞蛋白(图16B)。尽管B2M在cryoEM图中的存在是出乎意料的，但B2M先前已显示结合至HCMV病毒粒子并增加HCMV感染细胞的能力(Grundy等人,J.Gen.Virol.,68(3):793-803,1987)。刚体细化用于肯定地将自B2M的先前晶体结构测定的β-三明治折迭置于该密度(图15A和15B，Smith等人,Immunity,4:215-228,1996)。这种结构揭露B2M接触由THBD辨识的UL128和UL130上的相同区，进一步表明五聚体上这一区的结构可塑性(图15C和图15D)。

B2M正常情况下与I类主要组织兼容性复合体(MHC)的α3结构域非共价地结合，以促进细胞介导的针对病毒感染和恶性转化的免疫反应(Li等人,Chin.Med.J.(Engl.),129:448-455,2016)，但目前的结构分析指示B2M与五聚体之间的结合与同时结合至I类MHC不兼容(图15E)。

尽管为了清楚理解起见，通过图标和实例的方式对上述发明进行了详细描述，但是此等描述和实例不应被解释是限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容皆以引用的方式明确纳入其所有内容。

序列表

<110> 基因泰克公司

<120> 用于调节宿主细胞表面与人巨细胞病毒相互作用的方法

<130> 50474-270WO3

<150> US 63/345,811

<151> 2022-05-25

<150> US 63/193,529

<151> 2021-05-26

<160> 8

<170> PatentIn 版本 3.5

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<212> PRT

<213> 人巨细胞病毒

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Ser Leu Asn Gly Lys Asp Trp Glu Tyr Ile Gln Asp Pro Arg Thr Gln

530 535 540

Gln Pro Lys Leu Phe Glu Gly Asn Met His Tyr Asp Thr Pro Asp Ile

545 550 555 560

Arg Arg Phe Asp Pro Ile Pro Ala Gln Tyr Val Arg Val Tyr Pro Glu

565 570 575

Arg Trp Ser Pro Ala Gly Ile Gly Met Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys

580 585 590

Asp Trp Thr Asp Ser Lys Pro

595

<210> 8

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

gggtagtcct gggggtaacc 20

Claims

1.一种鉴定人巨细胞病毒(HCMV)gH/gL/UL128-131A五聚体与β-2-微球蛋白(B2M)之间相互作用的调节剂的方法，所述方法包括：

(a)提供候选调节剂；

(b)使所述HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M在所述候选调节剂存在或不存在下在允许所述HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合的条件下接触；以及

(c)测量所述HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的所述结合，其中在所述候选调节剂存在下的结合相对于在所述候选调节剂不存在下的结合的增加或降低将所述候选调节剂鉴定为所述HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M之间相互作用的调节剂。

2.一种鉴定HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性的调节剂的方法，所述方法包括：

(a)提供候选调节剂；

(c)测量所述HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性，其中在所述候选调节剂存在下的所述下游活性相对于在所述候选调节剂不存在下的所述下游活性的改变将所述候选调节剂鉴定为所述HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的下游活性的调节剂。

3.一种鉴定B2M的下游活性的调节剂的方法，所述方法包括：

(a)提供候选调节剂；

(b)使B2M与HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体在所述候选调节剂存在或不存在下在允许B2M与所述HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的结合的条件下接触；以及

(c)测量B2M的下游活性，其中在所述候选调节剂存在下的所述下游活性相对于在所述候选调节剂不存在下的所述下游活性的改变将所述候选调节剂鉴定为B2M的下游活性的调节剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合的增加或降低为至少50％，如通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述调节剂为所述HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体或B2M的所述下游活性的抑制剂。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述下游活性的所述改变为所述下游活性的量、强度或持续时间的减少。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抑制性核酸为ASO或siRNA。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、scFab、VH结构域或VHH结构域。

10.根据权利要求7或9所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合所述HCMVgH/gL/UL128-131A五聚体。

11.根据权利要求7或9所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合B2M。

12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中所述下游活性为HCMV对细胞的感染。

13.根据权利要求12所述的方法，其中感染在所述调节剂存在下降低。

14.根据权利要求13所述的方法，其中感染降低至少40％，如使用假型颗粒在病毒进入测定或病毒感染测定中所测量的。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述调节剂为结合所述HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体的抗体或其抗原结合片段。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述调节剂为结合B2M的抗体或其抗原结合片段。

17.一种人巨细胞病毒(HCMV)gH/gL/UL128-131A五聚体与神经纤毛蛋白2(NRP2)之间相互作用的调节剂，其使所述gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2的结合降低，其中所述调节剂结合至：

(a)NRP2的残基D197、D252、N172、M253、Y458和L459中的一者或多者；

(b)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基K47和R57中的一者或两者；

(c)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基R193；及/或

(d)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL131A亚基的残基A114和A117中的一者或两者。

18.根据权利要求17所述的调节剂，其中所述调节剂结合至：

(a)NRP2的残基D197、D252、N172、M253、Y458和L459中的全部六者；

(b)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基K47和R57两者；

(c)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基R193；及/或

(d)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL131A亚基的残基A114和A117两者。

19.根据权利要求17或18所述的调节剂，其中所述调节剂使所述gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2的结合降低至少50％。

20.根据权利要求19所述的调节剂，其中所述调节剂使所述gH/gL/UL128-131A五聚体与NRP2的结合降低至少90％。

21.一种HCMV gH/gL/UL128-131A五聚体与血栓调节素(THBD)之间相互作用的调节剂，其使所述gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低，其中所述调节剂结合至：

(a)THBD的残基S49、D53、V66、D69、R83、C96、E154、A123、L125、S149和C133中的一者或多者；

(b)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基R42、Y44、R131、N134、Y137、R158、R163和Y168中的一者或多者；及/或

(c)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基N164、Y169和M171中的一者或多者。

22.根据权利要求21所述的调节剂，其中所述调节剂结合至：

(a)THBD的残基S49、D53、V66、D69、R83、C96、E154、A123、L125、S149和C133中的全部十一者；

(b)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL128亚基的残基R42、Y44、R131、N134、Y137、R158、R163和Y168中的全部八者；及/或

(c)所述gH/gL/UL128-131A五聚体的UL130亚基的残基N164、Y169和M171中的全部三者。

23.根据权利要求21或22所述的调节剂，其中所述调节剂使所述gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低至少50％。

24.根据权利要求23所述的调节剂，其中所述调节剂使所述gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低至少90％。

25.一种人巨细胞病毒(HCMV)gH/gL/UL128-131A五聚体与β-2-微球蛋白(B2M)之间相互作用的调节剂，其使所述gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合降低。

26.根据权利要求25所述的调节剂，其中所述调节剂使所述gH/gL/UL128-131A五聚体与B2M的结合降低至少50％。

27.根据权利要求26所述的调节剂，其中所述调节剂使所述gH/gL/UL128-131A五聚体与THBD的结合降低至少90％。

28.根据权利要求19、20、23、24、26和27中任一项所述的调节剂，其中结合的所述降低是通过表面等离子体共振、生物层干涉或酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的。

29.根据权利要求17至28中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂使HCMV对细胞的感染相对于所述调节剂不存在下的感染而言降低。

30.根据权利要求29所述的调节剂，其中感染降低至少40％，如使用假型颗粒在病毒进入测定或病毒感染测定中所测量的。

31.根据权利要求17至30中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、肽、模拟物或抑制性核酸。

32.根据权利要求31所述的调节剂，其中所述抑制性核酸为反义寡核苷酸(ASO)或siRNA。

33.根据权利要求31所述的调节剂，其中所述抗原结合片段为双-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')₂、双体抗体、线性抗体、scFv、scFab、VH结构域或VHH结构域。

34.根据权利要求31所述的调节剂，其中所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。

35.根据权利要求17至34中任一项所述的调节剂，其进一步包括药用载体。

36.一种用于治疗个体的HCMV感染的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂，由此治疗所述个体。

37.根据权利要求36所述的方法，其中相对于尚未施用所述调节剂的个体，HCMV感染的持续时间或严重程度减少至少40％。

38.一种用于防止个体的HCMV感染的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂，由此防止所述个体的HCMV感染。

39.一种预防个体的继发性HCMV感染的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂，由此防止所述个体的继发性HCMV感染。

40.根据权利要求39所述的方法，其中继发性感染为未经感染组织的HCMV感染。

41.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述个体为免疫功能不全的、怀孕的、或为婴儿。

42.根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂在制造用于治疗个体的HCMV感染的药物中的用途。

43.根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂在制造用于防止个体的HCMV感染的药物中的用途。

44.根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂在制造用于预防个体的继发性HCMV感染的药物中的用途。

45.根据权利要求44所述的用途，其中继发性感染为未经感染组织的HCMV感染。

46.根据权利要求42至45中任一项所述的用途，其中所述个体为免疫功能不全的、怀孕的、或为婴儿。

47.根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂，其用于在治疗个体的HCMV感染的方法中使用，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂，由此治疗所述个体。

48.根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂，其用于在防止个体的HCMV感染的方法中使用，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂，由此防止所述个体的HCMV感染。

49.根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂，其用于在预防个体的继发性HCMV感染的方法中使用，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求17至35中任一项所述的调节剂，由此防止所述个体的继发性HCMV感染。

50.根据权利要求49所述使用的调节剂，其中继发性感染为未经感染组织的HCMV感染。

51.根据权利要求47至50中任一项所述使用的调节剂，其中所述个体为免疫功能不全的、怀孕的、或为婴儿。