WO2018101425A1 - 抗ｔｌｒ９抗体、医薬組成物及びキット - Google Patents

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seq
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健介 三宅
祐輔 村上
竜太郎 福井
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments

Definitions

  • the present invention relates to an anti-TLR9 antibody, a pharmaceutical composition and a kit.
  • TLRs Toll-like receptors
  • TLR3, TLR7, TLR8, and TLR9 are distributed in the endoplasmic reticulum, which is an intracellular organelle, and recognize nucleic acids derived from bacteria and viruses.
  • TLR7 and TLR8 recognize single-stranded RNA
  • TLR9 recognizes unmethylated single-stranded DNA (CpG-DNA) containing a CpG motif.
  • CpG-DNA unmethylated single-stranded DNA
  • the autoimmune reaction by TLR9 is regulated by limiting the location for recognizing nucleic acids to endolysosomes (Non-patent Document 1). Normally, the nucleic acid outside the cell is rapidly degraded, so it does not reach the endolysosome in the cell and is not recognized by TLR9. On the other hand, since the nucleic acid of microorganisms is protected by bacterial cell walls and virus particles, it reaches the endolysosome, where it is released for the first time and is recognized by TLR9.
  • TLR9 has been suggested to be associated with psoriasis and systemic lupus erythematosus (SLE) (Non-patent Document 2).
  • TLR9 is considered a therapeutic target for TLR9-dependent autoimmune diseases such as psoriasis and SLE, and various methods for suppressing the expression and function of TLR9 have been proposed so far. Specifically, methods using oligo DNA having an antagonistic action on TLR9, microRNA that suppresses expression of TLR9, and the like have been attempted. However, in general, the safety of nucleic acid drugs is unknown, and if the function of TLR9 is completely suppressed, the possibility of infectious diseases and the like cannot be denied.
  • TLR9 is localized on the endolysosome to limit the autoimmune reaction, isolated from the cell surface, and acts only on the cell surface. Thus, it has been considered that the antibody to be used cannot be used, and there has been almost no attempt to use an antibody drug against TLR9.
  • Non-patent Document 3 it has been reported that in order to express the function of TLR9, it is necessary that the extracellular domain of TLR9 is cleaved by cathepsin or the like in endolysosome. That is, in order to express the function of TLR9, it was thought that the C-terminal side of TLR9 was mainly important.
  • the present invention aims to provide a novel antibody targeting TLR9.
  • N-terminus of TLR9 is at least one of the following amino acid sequences: (A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (B) an amino acid sequence having a deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and (c) 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid sequences having the identity of [5] comprising at least one of the following amino acid sequences: (A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (B) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; (C) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6; (D) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; (E) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10; (F) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; (G) an amino acid sequence having one or more amino acid deletions, substitutions or additions in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 10; and (h) SEQ ID NO: : An amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by any one of 2, 4, 6, 8, and 10.
  • [6] The antibody according to any one of [1] to [5], wherein the N-terminus of TLR9 is the N-terminus of mouse TLR9.
  • a pharmaceutical composition used for treatment or prevention of a disease associated with TLR9 comprising the antibody according to any one of [1] to [6].
  • the pharmaceutical composition according to [7], wherein the disease associated with TLR9 is systemic lupus erythematosus, psoriasis, or nonalcoholic steatohepatitis.
  • a kit used for diagnosis of a disease associated with TLR9 comprising the antibody according to any one of [1] to [6].
  • TLR9 tumor necrosis factor
  • mice administered with TLR9 agonists result in individual death due to hepatocyte apoptosis induced by TNF ⁇ produced from hepatocyte-derived macrophages, but such antibodies are administered.
  • TLR9 agonists CpG-B and D-galactosamine
  • the antibody of the present invention can control a pathological condition in which TLR9 is abnormally activated.
  • the induction of SLE is considered to be due to the fact that DNA accumulation due to the deficiency of the DNA degrading enzyme gene stimulates the DNA sensor, thereby producing type I IFN.
  • the antibody of the present invention is a DNA sensor. Since TLR9 can be controlled, it can be used for treatment or prevention of SLE.
  • the antibody of the present invention it is possible to prevent or treat a disease associated with TLR9 by inhibiting the function of TLR9 present on the cell surface.
  • the antibody according to the present invention is excellent in safety because of its high specificity for TLR9.
  • the antibody according to the present invention is an extracellular main that is cleaved within the N-terminus of TLR9, particularly endolysosome, and its The surroundings can be recognized.
  • the antibody according to the present invention is also referred to as “N-terminal recognition antibody” or “anti-TLR9 antibody”.
  • N-terminal of TLR9 refers to a structure on the amino acid unit side in which an amino group is not bound and a carboxyl group is bound in a protein of TLR9, in particular, cleaved within endolysosomes.
  • the extracellular domain means a region from position 1 to position 818 from the N-terminus of TLR9.
  • TLR9 C-terminal refers to a structure on the amino acid unit side where a carboxyl group is not bonded and an amino group is bonded in the TLR9 protein, particularly a structure obtained by removing the extracellular domain from TLR9. Means.
  • the amino acid unit to which the amino group is not bonded and the carboxyl group is bonded is defined as the 1st position, and the 2nd and 3rd positions are referred from the N-terminal of TLR9 to the C-terminal of TLR9.
  • the N-terminal recognition antibody recognizes, for example, the region of 1st to 166th position, 1st to 242nd position, 1st to 306th position, 1st to 356th position, 1st to 440th position at the N-terminal of TLR9, preferably
  • the first to 356th regions are recognized, more preferably the 167th to 356th regions are recognized, and even more preferably the 243rd to 356th regions are recognized.
  • the N-terminal recognition antibody recognizes the N-terminal of TLR9, which is at least one of the following amino acid sequences.
  • TLR has 12 known families for mice and 10 known families for humans.
  • TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, and TLR6 are distributed on the cell surface and recognize bacterial proteins such as lipoproteins, glycolipids such as LPS, and proteins such as flagellin.
  • TLR3, TLR7, TLR8, and TLR9 are distributed in the endoplasmic reticulum, which is an intracellular organelle, and recognize nucleic acids derived from bacteria and viruses.
  • TLR is a type I membrane protein and has Leucine rich repeat (LRR) outside the cell.
  • LRR Leucine rich repeat
  • the N-terminal recognition antibody recognizes the N-terminal of mouse TLR9, human TLR9, or mouse / human chimeric TLR9, but is not particularly limited as long as it is the N-terminal of TLR9.
  • the N-terminus of TLR9 recognized by the N-terminal recognition antibody is the N-terminus of mouse / human chimeric TLR9 shown in FIG.
  • the N-terminal recognition antibody is not particularly limited as long as it recognizes the N-terminal of TLR9, and includes, for example, at least one amino acid sequence shown below.
  • the N-terminal recognizing antibody comprises at least one of heavy chain CDR1 to 3 and light chain CDR1 to 3, preferably at least one of heavy chain CDR1 to 3, more preferably heavy chain CDR3.
  • the amino acid sequence may be included.
  • amino acid is used in its broadest sense and means not only natural amino acids but also non-natural amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • amino acids include natural proteogenic L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; natural non-proteinogenic amino acids such as norleucine, ⁇ -alanine, ornithine; And chemically synthesized compounds having properties known in the art, but are not limited thereto.
  • non-natural amino acids include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine, ⁇ -methyl-histidine, etc.), amino acids having an extra methylene in the side chain (“homo” amino acids), and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are substituted with sulfonic acid groups (such as cysteic acid)
  • ⁇ -methyl amino acids such as ⁇ -methylalanine
  • D-amino acids histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine, ⁇ -methyl-histidine, etc.
  • amino acids having an extra methylene in the side chain (“homo” amino acids)
  • amino acids having an extra methylene in the side chain
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, etc. indicates that the resulting CDR set retains the antigen recognition function.
  • plural here means an integer of 2 or more, preferably several, for example 2 to 5, more preferably 2, 3, or 4.
  • the positions of deletions, substitutions or additions in each CDR may be N-terminal, C-terminal, or intermediate as long as the resulting set of CDRs retains the antigen recognition function.
  • “having an identity of Y% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: X” means alignment (alignment) so as to maximize the coincidence of amino acid sequences of two polypeptides. Sometimes, the ratio of the number of common amino acid residues to the total number of amino acids shown in SEQ ID NO: X is Y% or more.
  • the N-terminal recognition antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Further, the N-terminal recognition antibody may be any isotype of IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • the N-terminal recognition antibody may be a mouse antibody, a human CDR-grafted antibody, a human chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully human antibody as long as it binds to TLR9 on the cell surface and inhibits its function, although it may be a low molecular antibody, it is not limited to these.
  • the human CDR-grafted antibody is an antibody obtained by replacing the CDR of an antibody of a non-human animal with the CDR of a human antibody.
  • a human chimeric antibody is an antibody comprising a variable region derived from an antibody of a non-human animal and a constant region derived from a human antibody.
  • the humanized antibody refers to a non-human animal antibody in which a part derived from a human antibody is incorporated, leaving a part of a highly safe region, and a human-type chimeric antibody and a human-type antibody
  • the concept includes CDR-grafted antibodies.
  • small molecule antibody means an antibody fragment or an antibody fragment bound with an arbitrary molecule and recognizing the same epitope as the original antibody.
  • Fab composed of VL, VH, CL, and CH1 regions; F (ab ′) 2 in which two Fabs are linked by a disulfide bond at the hinge region; Fv composed of VL and VH;
  • scFv which is a single chain antibody linked by a polypeptide linker, sdFv, Diabody, and sc (Fv) 2 are included, but not limited thereto.
  • the method for producing the N-terminal recognition antibody is not limited.
  • hybridomas are produced by isolating antibody-producing cells from non-human mammals immunized with TLR9 or a fragment thereof and fusing them with myeloma cells. It can be obtained by purifying the antibody produced by this hybridoma.
  • Polyclonal antibodies can also be obtained from the serum of animals immunized with TLR9 fragments.
  • the TLR9 fragment used for immunization is not particularly limited as long as the obtained antibody binds to TLR9 on the cell surface and inhibits its function.
  • an appropriate host is transformed with an expression vector containing a nucleic acid encoding the antibody, and the transformant is cultured under appropriate conditions to express the antibody.
  • An antibody can be prepared by isolation and purification according to a known method. Examples of the isolation and purification method include affinity columns using protein A and the like, other chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, and the like, and these can be combined as appropriate.
  • Antibody Y that specifically binds to the same epitope as an antibody X can be prepared after determining the epitope sequence as described below.
  • a peptide having a large number of random sequences immobilized on a solid support, arrayed, reacted with antibody X, detected with an enzyme-labeled secondary antibody, and the amino acid sequence of the peptide to which antibody X specifically binds It is possible to determine the epitope on the antigen protein by examining the homology between this amino acid sequence and the amino acid sequence of the antigen protein.
  • the peptides to be immobilized on the solid phase carrier may be used in advance as a partial peptide group of the antigen protein.
  • an antibody Y that specifically binds to the epitope sequence can be prepared by a person skilled in the art according to a known method.
  • an antibody that specifically binds to the same epitope can be obtained by immobilizing a peptide containing the epitope sequence on a solid phase carrier and detecting the binding between the peptide and various antibodies.
  • variable antibodies those obtained by immunizing an animal with an antigen protein or a partial peptide thereof may be used, or an antibody library or an antibody fragment library prepared by a phage display method may be used. Good.
  • antibody Y that specifically binds to the same epitope can also be obtained by fixing a peptide containing the epitope sequence to a solid phase carrier and repeating panning.
  • Human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies are prepared by cloning an antibody gene from mRNA of a hybridoma that produces an antibody of a non-human animal and ligating it with a part of the human antibody gene by gene recombination technology. be able to.
  • cDNA is synthesized by reverse transcriptase from the hybridoma mRNA producing a mouse antibody, and the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (LH) are cloned by PCR and sequenced.
  • VH heavy chain variable region
  • LH light chain variable region
  • a 5 ′ primer containing a leader sequence is prepared from the antibody base sequence having a high concordance rate, and PCR is performed from the cDNA to the 3 ′ end of the variable region from the above cDNA using the 5 ′ primer and the variable region 3 ′ primer.
  • the heavy and light chain constant regions of human IgG1 are cloned, and the mouse antibody-derived variable region and the human antibody-derived constant region are ligated by PCR using the OverlappinglHanging method for amplification. To do.
  • the obtained DNA can be inserted into a suitable vector and transformed to obtain a human chimeric antibody.
  • the human antibody variable region having the highest homology with the mouse antibody variable region to be used is selected and cloned, and the CDR base sequence is modified by site-directed mutagenesis using the megaprimer method.
  • the amino acid sequence constituting the framework region cannot be specifically bound to the antigen when humanized, it is possible to convert some amino acids of the framework from human type to rat type.
  • a CDR consisting of a “characteristic amino acid sequence” can be prepared using a known method such as site-directed mutagenesis, random mutagenesis, chain shuffling, or CDR walking.
  • the Adlib method for obtaining an antibody-producing strain from a DT40 cell line derived from trichostatin A-treated chicken B cells (Seo, H. , A method for producing a human antibody by immunizing a KM mouse, which is a mouse antibody gene disrupted and a human antibody gene introduced (Itoh, K. et al., Jpn. J. Cancer Res., 92: 1313- 1321, 2001; Koide, A. et al., J. Mol. Biol., 284: 1141-1151, 1998), and the like, which can also be applied to the production of N-terminal recognition antibodies.
  • the N-terminal recognition antibody is a low-molecular antibody
  • it may be expressed by the above method using DNA encoding the low-molecular antibody, or the full-length antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin. May be.
  • N-terminal recognition antibodies may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence of sugar chain, form, etc. depending on the production method and purification method. However, as long as the obtained antibody has a function equivalent to the N-terminal recognition antibody, the antibody is included in the present invention. For example, when an N-terminal recognition antibody is expressed in prokaryotic cells such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminal of the amino acid sequence of the original antibody. However, the present invention also includes such antibodies.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains an N-terminal recognition antibody and is used for treatment or prevention of a disease associated with TLR9.
  • Whether it is used for the treatment or prevention of a disease related to TLR9 can be appropriately determined by those skilled in the art. For example, according to the method shown in the Examples, (i) whether the obtained antibody binds to TLR9 on the cell surface; (ii) contact with the obtained antibody while stimulating immune cells with a ligand of TLR9 Whether or not the amount of inflammatory cytokines secreted from immune cells is suppressed when allowed to occur; (iii) B cells are stimulated with a ligand of TLR9 and contacted with the obtained antibody. And (iv) confirming at least one of whether the disease state is improved by administering the antibody obtained to the inflammatory disease model animal, It can be determined whether it is used for the treatment or prevention of diseases associated with TLR9.
  • TLR9 Diseases associated with TLR9 include various autoimmune diseases (rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE), scleroderma, polymyositis, Sjogren's syndrome (SS), ANCA-related vasculitis, Behcet's disease, Kawasaki disease, mixed cryoglobulinemia, multiple sclerosis (MS), Guillain-Barre syndrome, myasthenia, type 1 diabetes, Graves' disease, Hashimoto's disease, Addison's disease, IPEX, APS type-II, autoimmune myocardium Inflammation, interstitial pneumonia, bronchial asthma, autoimmune hepatitis, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), primary biliary cirrhosis, inflammatory bowel disease (IBD), Crohn's disease, ulcerative colitis, psoriasis, atopy Dermatitis, hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis
  • an N-terminal recognition antibody suppresses abnormal immune activation by recognizing TLR9 on the cell surface and inhibiting the TLR9 response of the cell. Thus, it is thought to contribute to the treatment or prevention of psoriasis associated with TLR9.
  • steroidal agents such as prednisolone have been conventionally used for systemic scleroderma, which is SLE and related diseases.
  • an antibody berimumab against B lymphocyte stimulating factor (Blys) involved in B cell activation is also used as a biological preparation.
  • Blys B lymphocyte stimulating factor
  • SLE produces excessive I-type interferon (IFN).
  • IFN I-type interferon
  • pDCs plasmacytoid dendritic cells
  • TLR9 a DNA sensor expressed in pDCs as a therapeutic target, it is useful for treatment or prevention of SLE.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains an N-terminal recognition antibody as an active ingredient, and further contains a pharmaceutically acceptable carrier and additive.
  • Examples of carriers and additives include pharmaceutically acceptable organic solvents such as water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, Sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol , Stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, surfactants, etc. Not a constant.
  • organic solvents such as water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrol
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be in various forms, for example, liquids (for example, injections), dispersions, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, and the like.
  • a preferred embodiment is an injection, which is preferably administered parenterally (for example, intravenously, transdermally, intraperitoneally, intramuscularly).
  • treatment or prevention refers to at least one of prevention or delay of onset, prevention or delay of progression of disease, and alleviation of at least one symptom associated with disease in addition to cure or remission of the disease. It means to produce one.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered to mammals (eg, humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, dogs, horses, monkeys, pigs, etc.), particularly humans, It varies depending on gender, body weight, sensitivity difference, administration method, administration interval, active ingredient type, formulation type, and is not particularly limited. For example, 30 ⁇ g to 1000 mg, 100 ⁇ g to 500 mg, 100 ⁇ g to 100 mg are divided into one or several times. Can be administered. In the case of injection administration, 1 ⁇ g / kg to 5000 ⁇ g / kg, 3 ⁇ g / kg to 3000 ⁇ g / kg may be administered once or divided into several times depending on the body weight of the patient.
  • kit The kit according to the present invention includes an N-terminal recognition antibody.
  • the use is not particularly limited, and it is used for detection of TLR9 and diagnosis of diseases related to TLR9.
  • the kit may contain a reagent and a carrier and an additive in the same manner as the pharmaceutical composition according to its use, and may further contain a buffer solution, a container, an instruction manual and the like.
  • the method according to the present invention includes the step of administering an N-terminal recognition antibody to a subject.
  • the N-terminal recognition antibody can be administered as a pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the method of the present invention it is possible to treat or prevent a disease associated with TLR9 in a target human or other mammal.
  • the method of the present invention may be used for other applications, such as diagnosis.
  • TLR9-Ba / F3 suspended in PBS phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • mice spleen cells and mouse myeloma-derived cell line SP2 / O cells were fused using Sendai virus-derived envelope protein (GenomeONE-CF) purchased from Ishihara Sangyo Co., Ltd.
  • Sendai virus-derived envelope protein GenomeONE-CF
  • TLR9-Ba / F3 Cell membrane permeation staining was performed and analyzed by flow cytometry. The subclass of NaR9 was determined to be IgG2a / ⁇ using the Mouse antibody Isotype kit purchased from BIO-RAD.
  • mice Wild-type C57BL / 6 mice were purchased from Japan SLC. C57BL / 6 background TLR9-deficient mice (Tlr9 ⁇ / ⁇ ) were established in this laboratory. BALB / c background Tlr9 ⁇ / ⁇ mice were established by mating 7 times with wild-type BALB / c mice purchased from Japan SLC. Mice were bred in an SPF environment, and all animal experiments were conducted according to the ethical regulations with the approval of the Animal Experiment Committee of the Institute of Medical Science, the University of Tokyo.
  • Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro8-oxo-guanosine) was purchased from Enzo Life Science.
  • Saponin and D-(+)-Galactosamine were purchased from Sigma-Aldrich.
  • FuGene6 and DOTAP were purchased from Roche Applied Science.
  • Anti-mouse TLR9 monoclonal antibody NaR9, J15A7 or B33A4 was purified from ascites after inoculating hybridomas into nude mice purchased from Oriental Yeast Co., Ltd.
  • Streptavidin-PE anti-mouse IgG1-PE, anti-mouse IgG2a-PE, isotype control antibodies (mouse IgG1, mouse IgG2a), anti-mouse CD16 / 32, anti-mouse CD19-APC-Cy7, anti-mouse CD11b- APC, anti-mouse CD11c-APC, anti-mouse CD11c-PE-Cy7, anti-mouse Siglec-H-FITC, and anti-mouse Ly-6G-PerCP-Cy5.5 were purchased from BioLegend.
  • Anti-mouse B220-APC was purchased from TONBO biosciences. J15A7-PE, anti-mouse CD49b-BV421 and anti-mouse CD11b-BV510 were purchased from BD Biosciences.
  • BM-MCs Bone marrow-derived macrophage
  • cDC conventional DC
  • pDC plasmacytoid DC
  • 1 ⁇ 10 7 bone marrow cells were cultured in 10 cm cell culture dishes for 6 days, 10% FCS-RPMI1640 supplemented with 100 ng / ml recombinant M-CSF (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) In culture.
  • 1 ⁇ 10 7 bone marrow cells were grown in 10 cm cell culture dishes for 7 days, 10 ng / ml recombinant GM-CSF or 100 ng / ml Flt3-L (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) plus 10% FCS-RPMI1640.
  • mice and human TLR9 Plasmid construction and gene transfer using retroviral vectors
  • the sequences of mouse and human TLR9 were amplified by PCR and cloned into pMX or pMXs retroviral vectors provided by Dr. Toshio Kitamura of the University of Tokyo.
  • Mouse and human TLR9 chimeric mutants were constructed as follows.
  • TLR9 166 (mouse TLR9 is 1-166, human TLR9 is 167-1016 amino acids), TLR9 242 (mouse TLR9 is 1-224, human TLR9 is 243-1016 amino acids), TLR9 356 (mouse TLR9 is 1-356, human TLR9 357-1016 amino acids), TLR9 440 (mouse TLR9 1-440, human TLR9 441-1016 amino acids) and TLR9 544 (mouse TLR9 1-544, human TLR9 545-1016 amino acids) are TLR9 mutant C It was cloned into a pMX-GFP vector so that GFP was added to the terminal side.
  • the plasmid was gene-transferred into Plat-E packaging cells 1 ⁇ 10 5 / well together with polyethylenimine (Polysciences, Inc.). Two days later, the culture supernatant containing the virus was added to Ba / F3 cells together with DOTAP, and centrifuged at 2000 rpm for 60 minutes.
  • Spleen immune cell staining and flow cytometric analysis Spleens were collected from C57BL / 6N strain wild-type mice and TLR9 knockout mice, and cells were isolated using a slide glass. The isolated cells were treated with an erythrocyte lysis buffer (BioLegend), and after removing the erythrocytes, the cell surface Fc receptor was blocked with purified anti-CD16 / 32 (BioLegend, clone 93).
  • TLR9 on the cell surface and inside the cell was stained.
  • purified anti-TLR9 was reacted under non-fixing conditions, and PE-conjugated-rat-anti-mouse-IgG2a (BioLegend, clone-RMG2a-62) was used as a secondary antibody.
  • TLR9 inside the cells was stained using BD Cytofix / Cytoperm fixatation / permeabilization solution kit. These cells were replaced with a staining buffer and analyzed by LSR-Fortessa-X-20 (BD).
  • BM-cDC was washed twice with 1 ⁇ PBS and collected.
  • Lysis buffer 1% Triton X 100, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 10% Glycerol, 1 mM DTT and Complete protease Inhibit) (Cocktail (Roche)) for 30 minutes, and after high speed centrifugation, the supernatant of the cell lysate was collected.
  • the collected cell lysate was added to N-hydroxy succinimide-activated Sepharose 4FF beads conjugated with anti-TLR9 monoclonal antibody (NaR9) and stirred at 4 ° C. for 2 hours. Through this step, TLR9 was immunoprecipitated. After stirring, the beads were ice-cooled with a washing buffer (0.1% TritonX100, 20 mM Tris / HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1% Glycerol, 1 mM DTT). Washed twice.
  • TritonX100 20 mM Tris / HCl (pH 7.4)
  • the antibody used for the Western blot was a home-made polyclonal antibody purified from serum collected by immunizing a rabbit with the TIR domain of mouse TLR9.
  • TLR9 response inhibition experiment with anti-TLR9 monoclonal antibody The cells used were BM-MCs, BM-cDCs, and BM-pDCs.
  • a 96-well flat-bottom plate was seeded with 5 (10 4 BM-MCs, BM-cDCs, and BM-pDCs, and anti-TLR9 antibody was added at each concentration.
  • the TLR ligand was seeded.
  • the culture supernatant was collected 24 hours after addition of the TLR ligand, and the collected culture supernatant was detected by ELISA to measure the cytokine produced by ligand stimulation.
  • TLR9 monoclonal antibody NaR9 was analyzed by GeneScript.
  • Total RNA was recovered from the hybridoma using TRIzol (registered trademark) Reagent manufactured by Ambion, and reverse transcription reaction was performed on cDNA using PrimeScript (registered trademark) 1st Strand cDNA Synthesis Kit manufactured by TAKARA.
  • VH and VL fragments were amplified from this cDNA, and each fragment was cloned into a general cloning vector. After transformation into E. coli, colony PCR was performed, and plasmids were collected from at least 5 clones of the correct size band and subjected to sequence analysis.
  • FIG. 9 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) of the heavy chain of the NaR9 antibody
  • FIG. 10 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 15) of the heavy chain of the NaR9 antibody
  • FIG. 11 shows the NaR9 antibody
  • FIG. 12 shows the nucleotide sequence of the light chain of the NaR9 antibody (SEQ ID NO: 17).
  • TLR9 response inhibition experiment with anti-TLR9 monoclonal antibody (1)
  • BM-MCs were induced from wild-type mice and used for experiments.
  • TNF- ⁇ and IL-12p40 production by CpGB or CpGA response was suppressed by BM-MCs in an antibody concentration-dependent manner (FIG. 4).
  • Similar results were obtained for BM-cDC (results not shown).
  • Loxoribine response of TLR7 ligand was not affected.
  • BM-pDC did not show TLR9 response suppression effect by NaR9 (results not shown).
  • TLR9 response inhibition experiment with anti-TLR9 monoclonal antibody (2) Subsequently, in order to verify the in vivo TLR9 response inhibitory effect of NaR9, an experiment was conducted in which CpGB and D-(+)-Galactosamine were administered to mice. In the group pre-administered with PBS or IgG2a control antibody, about 90% of mice died within 10 hours after ligand stimulation, and the group pre-administered with NaR9 suppressed mortality to 20%. (FIG. 5). Furthermore, as a result of measuring TNF- ⁇ in blood 1, 3, and 6 hours after ligand stimulation, cytokine production was significantly suppressed in the NaR9 antibody administration group compared to the IgG2a control antibody administration group. (FIG. 6).
  • the heavy chain amino acid sequence of the monoclonal antibody obtained from the hybridoma strain NaR9 is shown in SEQ ID NO: 14, and the light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the base sequences corresponding to these amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 15 and 17, respectively.
  • the amino acid sequences of the heavy chain CDRs 1 to 3 of the antibody are shown in SEQ ID NOs: 2, 4, and 6, and the amino acid sequences of the light chain CDRs 1 to 3 are shown in SEQ ID NOs: 8, 10, and 12, respectively.
  • the nucleotide sequences corresponding to these amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, and 13.
  • Mouse TLR9 is amino acids 1 to 544 (TLR9 544 ), 1 to 454 (TLR9 454 ), 1 to 356 (TLR9 356 ), and 1 to 242 (TLR9) of TLR9 shown in SEQ ID NO: 1. 242 ), and the C-terminal side was prepared with the human TLR9 sequence (FIG. 7) and expressed in a cell line, and the binding between each chimeric TLR9 and NaR9 was measured by flow cytometry. The results are shown in FIG. Although NaR9 did not bind to TLR9 242 but bound to TLR9 356 , NaR9 was considered to have an epitope in the vicinity of the region from position 243 to position 356 of the amino acid sequence of TLR9.
  • SEQ ID NO: 1 represents the amino acid sequence of mouse TLR9.
  • SEQ ID NO: 2 represents the amino acid sequence of heavy chain CDR1 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 3 represents the nucleotide sequence of heavy chain CDR1 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 4 represents the amino acid sequence of heavy chain CDR2 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 5 represents the nucleotide sequence of heavy chain CDR2 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 6 represents the amino acid sequence of heavy chain CDR3 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 7 represents the nucleotide sequence of heavy chain CDR3 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 8 represents the amino acid sequence of light chain CDR1 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 9 represents the nucleotide sequence of light chain CDR1 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 10 represents the amino acid sequence of light chain CDR2 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 11 represents the nucleotide sequence of light chain CDR2 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 12 represents the amino acid sequence of light chain CDR3 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 13 represents the nucleotide sequence of light chain CDR3 of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 14 represents the amino acid sequence of the heavy chain of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 15 represents the nucleotide sequence of the heavy chain of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 16 represents the amino acid sequence of the light chain of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 17 represents the nucleotide sequence of the light chain of NaR9 antibody.
  • SEQ ID NO: 18 represents the DNA sequence of CpGB.
  • SEQ ID NO: 19 represents the DNA sequence of CpGA.
  • SEQ ID NO: 20 represents the RNA sequence of PolyU.

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Abstract

本発明は、ＴＬＲ９を標的とする新規な抗体を提供する。

Description

抗ＴＬＲ９抗体、医薬組成物及びキット
　本発明は、抗ＴＬＲ９抗体、医薬組成物及びキットに関する。
　Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor；ＴＬＲ）は病原体センサーの一つのファミリーを形成しており、病原体成分に応答して活性化シグナルを誘導し、感染防御反応を誘導する。ＴＬＲは感染防御に重要であるばかりでなく、自己免疫疾患などの病態における炎症誘導にも関わっている。
　約１０種類のＴＬＲのうちＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９は、細胞内小器官である小胞体に分布し、細菌やウイルス由来の核酸を認識する。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は１本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９はＣｐＧモチーフを含む非メチル化１本鎖ＤＮＡ（ＣｐＧ－ＤＮＡ）を認識する。しかし、ウイルス特有の２本鎖ＲＮＡとは異なり、一本鎖ＲＮＡやＤＮＡは宿主由来の核酸と大きな違いはなく、ＴＬＲによるリガンド認識機構が厳密に制御されなければ、自己に対する反応を惹起し、自己免疫疾患に陥ってしまう。
　この点、ＴＬＲ９による自己免疫反応は、核酸を認識する場所をエンドリソソームに限定することによって調節されている（非特許文献１）。定常時、細胞外にある自己の核酸は急速に分解されるため、細胞内のエンドリソソームには到達せず、ＴＬＲ９には認識されない。一方、微生物の核酸は、細菌の細胞壁やウイルス粒子に保護されているのでエンドリソソームに到達し、そこで初めて放出され、ＴＬＲ９に認識される。
　これに対し、抗微生物ペプチドや自己抗体との相互作用によって自己の核酸が分解に耐性を有するようになり、エンドリソソームに到達できるようになると、ＴＬＲ９依存性自己免疫反応が引き起こされる。実際、ＴＬＲ９については、乾癬や全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus；ＳＬＥ）との関連が示唆されている（非特許文献２）。
　したがって、ＴＬＲ９は、乾癬やＳＬＥ等のＴＬＲ９依存性自己免疫疾患の治療標的と考えられ、これまでにＴＬＲ９の発現や機能を抑制する様々な方法が提案されている。具体的には、ＴＬＲ９に対して拮抗作用を持つオリゴＤＮＡや、ＴＬＲ９の発現を抑制するマイクロＲＮＡ等を用いた方法が試みられている。しかしながら、一般に核酸医薬の安全性は未知数であり、また、ＴＬＲ９の機能を完全に抑制すると、感染症等の危険性を招く可能性も否定できない。
　安全性及び特異性の面では抗体医薬が望ましいが、上述のとおり、ＴＬＲ９は、自己免疫反応を制限するためにエンドリソソームに局在し、細胞表面からは隔絶されており、細胞表面にのみ作用する抗体は使用できないと考えられており、ＴＬＲ９に対する抗体医薬を使用する試みはこれまでほとんどなされていない。
　また、ＴＬＲ９の機能を発現するためには、ＴＬＲ９の細胞外ドメインがエンドリソソーム内でカテプシン等により切断されることが必要であることが報告されている（非特許文献３）。すなわち、ＴＬＲ９の機能を発現するために、主としてＴＬＲ９のＣ末端側が重要であると考えられていた。
Barton, G.et al. d Medzhitov, R. Nat Immunol 7, 49-56. (2006). Lande, R. et al. Nature 449, 564-569 (2007). Ewald, S. E. et al. The ectodomain of Toll-like receptor 9 is cleaved to generate afunctional receptor. Nature 456, 658-662 (2008)..
　本発明は、ＴＬＲ９を標的とする新規な抗体を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、驚くべきことに、ＴＬＲ９から切断される、細胞外領域であるＮ末端を認識する抗体がＴＬＲ９応答抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本願は以下の発明を包含する。
〔１〕　ＴＬＲ９のＮ末端を認識する、抗体。
〔２〕　ＴＬＲ９のＮ末端における１位～３５６位の領域を認識する、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕　ＴＬＲ９のＮ末端における２４３位～３５６位の領域を認識する、〔１〕又は〔２〕に記載の抗体。
〔４〕　ＴＬＲ９のＮ末端が、以下の少なくとも１つのアミノ酸配列である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗体：
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
〔５〕　以下の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の抗体：
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号：２、４、６、８、及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
（ｈ）配列番号：２、４、６、８、及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
〔６〕　ＴＬＲ９のＮ末端が、マウスＴＬＲ９のＮ末端である、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗体。
〔７〕　〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の抗体を含む、ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられる医薬組成物。
〔８〕　ＴＬＲ９に関連する疾患が、全身性エリテマトーデス、乾癬、又は非アルコール性脂肪性肝炎である、〔７〕に記載の医薬組成物。
〔９〕　〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の抗体を含む、ＴＬＲ９に関連する疾患の診断に用いられるキット。
　ＴＬＲ９のＮ末端側を認識する抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの骨髄由来マクロファージ（ＢＭ－ＭＣｓ）において、ＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧ－Ｂとともに投与した場合でもＴＬＲ９応答を阻害し、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；ＴＮＦ）－αの産生を抑制した。
　また、かかる抗体のＴＬＲ９応答抑制効果はｉｎ　ｖｉｖｏでも同様に確認された。具合的には、ＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ－Ｂ及びＤ－ガラクトサミン）を投与されたマウスは、肝細胞由来マクロファージから産生されるＴＮＦαによって誘導される肝細胞アポトーシスにより個体死に至るが、かかる抗体を投与することで、血清中のＴＮＦαやＩＬ－１２ｐ４０などのサイトカインの産生が有意に抑制され、結果としてマウスの個体死が回避されることが明らかとなった。
　これらの結果は、本発明の抗体はＴＬＲ９が異常に活性化される病態を制御し得ることを示唆している。例えば、ＳＬＥの誘導は、ＤＮＡ分解酵素遺伝子の欠損によるＤＮＡ蓄積がＤＮＡセンサーを刺激し、これによりＩ型ＩＦＮが産生されることが一因として考えられるが、本発明の抗体はＤＮＡセンサーであるＴＬＲ９を制御することができるため、ＳＬＥの治療又は予防等に使用可能であると考えられる。
　このように、本発明に係る抗体によれば、細胞表面に存在するＴＬＲ９の機能を阻害して、ＴＬＲ９に関連する疾患を予防又は治療することが可能である。また、本発明に係る抗体は、ＴＬＲ９に対する特異性が高いため、安全性に優れる。
抗体の特異性を検証するためにマウス脾臓のcDCを用いて、TLR9の発現を明らかにした実験結果である。 脾臓cDCを用いて、TLR9の免疫沈降実験を行った結果である。 TLR9抗体（B33A4、J15A7）を用いた、染色阻害実験を行った結果である。 NaR9のTLR9応答抑制効果を検証するために、野生型マウスよりBM-MCsを誘導した実験結果である。 NaR9によるin vivoでのTLR9応答抑制効果を検証するために、CpGBとD-(+)-Galactosamineをマウスに投与する実験を行った結果である。 リガンド刺激後、１、３、６時間後の血中のTNF-αを測定した結果である。 マウスTLR9とヒトTLR9のキメラTLR9を作製したキメラTLR9である。 キメラTLR9に対するNaR9抗体の結合を調べることによってNaR9抗体のエピトープを解析した結果である。 ＮａＲ９抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）である。 ＮａＲ９抗体の重鎖の塩基配列（配列番号１５）である。 ＮａＲ９抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６）である。 ＮａＲ９抗体の軽鎖の塩基配列（配列番号１７）である。
〔抗体〕
　ＴＬＲ９の機能を発現するために、主としてＴＬＲ９のＣ末端側が重要であると考えられていたところ、本発明に係る抗体は、ＴＬＲ９のＮ末端、特にエンドリソソーム内で切断される細胞外メイン及びその周辺を認識し得る。以下、本発明に係る抗体は、「Ｎ末端認識抗体」又は「抗ＴＬＲ９抗体」ともいう。
　本明細書において、「ＴＬＲ９のＮ末端」とは、ＴＬＲ９のタンパク質において、アミノ基が結合しておらず、かつカルボキシル基が結合しているアミノ酸単位側の構造、特に、エンドリソソーム内で切断される細胞外ドメインのうち、ＴＬＲ９のＮ末端における４４０位又は４５４位の領域より前半を意味する。なお、細胞外ドメインとは、ＴＬＲ９のＮ末端から１位～８１８位の領域を意味する。また、「ＴＬＲ９のＣ末端」とは、ＴＬＲ９のタンパク質において、カルボキシル基が結合しておらず、かつアミノ基が結合しているアミノ酸単位側の構造、特に、ＴＬＲ９から細胞外ドメインを除いた構造を意味する。
　ＴＬＲ９のタンパク質において、アミノ基が結合しておらず、かつカルボキシル基が結合しているアミノ酸単位を１位として、ＴＬＲ９のＮ末端からＴＬＲ９のＣ末端へ向けて、２位、３位という。
　Ｎ末端認識抗体は、例えば、ＴＬＲ９のＮ末端における１位～１６６位、１位～２４２位、１位～３０６位、１位～３５６位、１位～４４０位の領域を認識し、好ましくは１位～３５６位の領域を認識し、より好ましくは１６７位～３５６位の領域を認識し、さらに好ましくは２４３位～３５６位の領域を認識する。
　Ｎ末端認識抗体は、具体的に、以下の少なくとも１つのアミノ酸配列であるＴＬＲ９のＮ末端を認識する。
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　ＴＬＲは、マウスで１２種類、ヒトで１０種類のファミリーが知られている。ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、及びＴＬＲ６は細胞表面に分布し、細菌膜成分であるリポタンパク質、ＬＰＳ等の糖脂質、フラジェリン等のタンパク質を認識する。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９は細胞内小器官である小胞体に分布し、細菌やウイルス由来の核酸を認識する。また、ＴＬＲはＩ型の膜タンパク質で細胞外にLeucine rich repeat（ＬＲＲ）を有する。
　Ｎ末端認識抗体は、マウスＴＬＲ９やヒトＴＬＲ９、マウス／ヒトのキメラＴＬＲ９のＮ末端を認識するが、ＴＬＲ９のＮ末端であれば特に限定されない。例えば、Ｎ末端認識抗体が認識するＴＬＲ９のＮ末端は、図７に示すマウス／ヒトのキメラＴＬＲ９のＮ末端である。
　Ｎ末端認識抗体は、ＴＬＲ９のＮ末端を認識するものであれば特に限定されないが、例えば、以下の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号：２、４、６、８、１０、及び１２のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列
（ｈ）配列番号：２、４、６、８、１０、及び１２のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　Ｎ末端認識抗体は、重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３の少なくとも１つ、好ましくは重鎖ＣＤＲ１～３の少なくとも１つ、より好ましくは重鎖ＣＤＲ３に、上記（ａ）～（ｃ）のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
　本明細書において、「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含むものを意味する。アミノ酸の例としては、天然タンパク原性Ｌ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチン等の天然非タンパク原性アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられるがこれらに限定されない。非天然アミノ酸の例としては、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニン等）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン、α－メチル－ヒスチジン等）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）が挙げられるがこれらに限定されない。
　本明細書において、「１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する」という場合、欠失、置換等されるアミノ酸の個数は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗原認識機能を保持する限り特に限定されない。また、ここでの「複数」は、２以上の整数を意味し、好ましくは、数個例えば２～５個、より好ましくは２個、３個、４個である。各ＣＤＲにおける欠失、置換又は付加の位置は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗原認識機能を保持する限り、Ｎ末端でも、Ｃ末端でも、その中間であってもよい。
　本明細書において、「配列番号：Ｘで表されるアミノ酸配列とＹ％以上の同一性を有する」とは、２つのポリペプチドのアミノ酸配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通するアミノ酸残基数の、配列番号：Ｘに示す全アミノ酸数に対する割合が、Ｙ％以上であることを意味する。
　Ｎ末端認識抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、Ｎ末端認識抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよい。
　Ｎ末端認識抗体は、細胞表面のＴＬＲ９にそれぞれ結合してその機能を阻害する限り、マウス抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であってもよく、低分子抗体であってもよいが、これらに限定されない。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体のＣＤＲで置換した抗体である。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体に由来する可変領域と、ヒト抗体に由来する定常領域からなる抗体である。また、ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物の抗体において、安全性の高い一部の領域を残して、ヒトの抗体に由来する部分を組み込んだものをいい、ヒト型キメラ抗体、及びヒト型ＣＤＲ移植抗体を含む概念である。
　本明細書において「低分子抗体」とは、抗体の断片又は抗体の断片に任意の分子を結合させたものであって、もとの抗体と同一のエピトープを認識するものを意味する。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ´）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｓｄＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられるが、これらに限定されない。
〔抗体の作製方法〕
　Ｎ末端認識抗体の作製方法は限定されないが、例えば、モノクローナル抗体は、ＴＬＲ９又はその断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、ＴＬＲ９はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。免疫に用いるＴＬＲ９の断片は、得られる抗体が細胞表面のＴＬＲ９に結合してその機能を阻害する限り特に限定されない。
　特定のアミノ酸配列を有する抗体を作製する場合は、例えば、抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、この形質転換体を適当な条件で培養して抗体を発現させ、公知の方法に従って単離精製することによって、抗体を作製することができる。単離精製方法としては、例えば、プロテインＡ等を用いたアフィニティカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等が挙げられ、これらを適宜組み合わせることができる。
　また、「ある抗体Ｘと同一のエピトープに特異的に結合する抗体Ｙ」は、下記のようにエピトープの配列を決定してから作製することができる。
　例えば、多数のランダムな配列のペプチドを固相担体に固定してアレイ化し、抗体Ｘと反応させ、酵素標識２次抗体で結合を検出して、抗体Ｘが特異的に結合するペプチドのアミノ酸配列を調べ、このアミノ酸配列と抗原タンパク質のアミノ酸配列の相同性を検索することによって、抗原タンパク質上のエピトープを決定することが可能である。固相担体に固定するペプチドを、予め、抗原タンパク質の部分ペプチド群としてもよい。また、抗原タンパク質の種々の部分ペプチドの存在下で、抗体Ｘと抗原タンパク質との結合をＥＬＩＳＡ法で検出し、競合活性の有無を調べることによっても、抗原タンパク質上のエピトープを決定することが可能である。
　エピトープの配列を決定することができれば、これに特異的に結合する抗体Ｙは、公知の方法にしたがって当業者が作製することができる。例えば、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定し、当該ペプチドと種々の抗体の結合を検出することにより、同エピトープに特異的に結合する抗体を得ることができる。
　ここで、「種々の抗体」としては、動物を抗原タンパク質又はその部分ペプチドで免疫することによって得たものを用いてもよいし、ファージディスプレイ法によって作製した抗体ライブラリ又は抗体フラグメントライブラリを用いてもよい。ファージディスプレイ法によるライブラリを用いる場合、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定しパニングを繰り返すことによって、同エピトープに特異的に結合する抗体Ｙを得ることもできる。
　また、ヒトキメラ抗体及びヒトＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから抗体遺伝子をクローン化し、これをヒト抗体遺伝子の一部と遺伝子組換え技術で連結することによって作製することができる。
　例えば、ヒト型キメラ抗体の場合、マウス抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＬＨ）をＰＣＲでクローニングして配列を解析する。次に、一致率の高い抗体塩基配列から、リーダー配列を含む５’プライマーを作製し、５’プライマーと可変部３’プライマーによって上記ｃＤＮＡから、シグナル配列から可変領域の３’末端までをＰＣＲでクローニングする。一方で、ヒトＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖の定常領域をクローニングし、重鎖と軽鎖それぞれについて、マウス抗体由来可変領域と、ヒト抗体由来定常領域とをＰＣＲによるOverlapping Hanging法で連結し、増幅する。得られたＤＮＡを適当なベクターに挿入し、これを形質転換して、ヒト型キメラ抗体を得ることができる。
　ＣＤＲ移植抗体の場合、使用するマウス抗体可変部と最も相同性の高いヒト抗体可変部を選択してクローン化し、メガプライマー法を用いた部位選択的突然変異導入により、ＣＤＲの塩基配列を改変する。なお、フレームワーク領域を構成するアミノ酸配列をヒト化すると抗原との特異的な結合ができなくなる場合には、フレームワークの一部のアミノ酸をヒト型からラット型に変換してもよい。
　「配列番号：Ｘに示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列」からなるＣＤＲや、「配列番号：Ｘで表されるアミノ酸配列とＹ％以上の同一性を有するアミノ酸配列」からなるＣＤＲは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、ＣＤＲウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。
　これらの方法により、ファージディスプレイ法によってＣＤＲに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したＣＤＲを得られることが当業者によく知られている（例えば、Wu et al., PNAS, 95:6037-6042(1998); Schier, R. et al., J. Mol. Bio. 263:551-567(1996); Schier, R. et al., J.Mol. Biol. 255:28-43(1996); Yang, W.P. et al., J. Mol. Biol., 254:392-403(1995)）。本発明は、このような方法で成熟させたＣＤＲを含む抗体も包含する。
　その他の抗体の製造方法として、トリコスタチンＡ処理ニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞株から抗体産生株を取得するＡｄｌｉｂ法（Seo, H. et al., Nat. Biotechnol., 6:731-736, 2002）、マウス抗体遺伝子が破壊されヒト抗体遺伝子が導入されたマウスであるＫＭマウスを免疫してヒト抗体を作製する方法（Itoh,K. et al., Jpn. J. Cancer Res., 92:1313-1321, 2001;Koide, A. et al., J. Mol. Biol., 284:1141-1151, 1998）等があり、これらもＮ末端認識抗体の産生に応用することができる。
　Ｎ末端認識抗体が低分子抗体である場合、該低分子抗体をコードするＤＮＡを用いて上記方法で発現させてもよいし、また、全長の抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理して作製してもよい。
　Ｎ末端認識抗体は、作製方法や精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、Ｎ末端認識抗体と同等の機能を有している限り、その抗体は本発明に含まれる。例えば、Ｎ末端認識抗体を、大腸菌等の原核細胞で発現させた場合、元の抗体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。しかし、本発明は、かかる抗体も包含する。
〔医薬組成物〕
　本発明に係る医薬組成物は、Ｎ末端認識抗体を含み、ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられる。
　ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられるか否かは、当業者が適宜決定することができる。例えば、実施例に示される方法にしたがって、（ｉ）得られた抗体が細胞表面のＴＬＲ９に結合するか否か；（ｉｉ）免疫細胞をＴＬＲ９のリガンドによって刺激しつつ、得られた抗体と接触させたときに、免疫細胞から分泌される炎症性サイトカイン量が抑制されるか否か；（ｉｉｉ）Ｂ細胞をＴＬＲ９のリガンドによって刺激しつつ、得られた抗体と接触させたときに、Ｂ細胞の増殖が抑制されるか否か；及び、（ｉｖ）炎症性疾患モデル動物に得られた抗体を投与することによって、病態が改善されるか否か、の少なくとも１つを確認することにより、ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられるかを決定できる。
　ＴＬＲ９に関連する疾患としては、各種の自己免疫疾患（関節リウマチ（ＲＡ）、全性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、多発性筋炎、シェーグレン症候群（ＳＳ）、ＡＮＣＡ関連性血管炎、ベーチェット病、川崎病、混合性クリオグロブリン血症、多発性硬化症（ＭＳ）、ギランバレー症候群、筋無力症、１型糖尿病、バセドウ病、橋本病、アジソン病、ＩＰＥＸ、ＡＰＳ　ｔｙｐｅ－ＩＩ、自己免疫性心筋炎、間質性肺炎、気管支喘息、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性若年性関節炎の多関節炎型等）や、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が挙げられる。
　この中でも、その発症の機序に特にＴＬＲ９が関与する、ＳＬＥや乾癬、ＮＡＳＨへの用途が有望である。例えば、理論に拘束されることを意図するものではないが、Ｎ末端認識抗体は、細胞表面のＴＬＲ９を認識し、当該細胞のＴＬＲ９応答を阻害することにより、免疫の異常な活性化を抑制してＴＬＲ９に関連する乾癬の治療又は予防に寄与すると考えられる。
　例えば、ＳＬＥやその関連疾患である全身性強皮症に対しては、従来からプレドニゾロン等のステロイド剤が用いられている。また、生物学的製剤としてＢ細胞の活性化に関わるＢリンパ球刺激因子（Ｂｌｙｓ）に対する抗体のベリムマブも用いられている。しかし、いずれも抵抗性の症例がある。したがって、このような疾患に対して、新たな分子を標的とする治療薬が求められている。
　ここで、ＳＬＥではＩ型インターフェロン（Interferon；ＩＦＮ）を過剰に産生している。Ｉ型ＩＦＮを産生している細胞は、ｐＤＣｓ（plasmacytoid dendritic cells）であり、その産生はＤＮＡによる刺激で誘導されている。Ｎ末端認識抗体は、ｐＤＣｓに発現しているＤＮＡセンサーとしてのＴＬＲ９を治療標的とすることができるため、ＳＬＥの治療又は予防に有用である。
　本発明に係る医薬組成物は、Ｎ末端認識抗体を有効成分として含み、薬学的に許容できる担体や添加物をさらに含む。
　担体及び添加物の例として、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明に係る医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤等とすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、それを非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
　本明細書において、「治療又は予防」とは、疾患の治癒や寛解に加え、発症の防止又は遅延、疾患の進行の防止又は遅延、及び疾患に関連する少なくとも１つの症状の緩和のうち、少なくとも１つを生じさせることを意味する。
　本発明に係る医薬組成物を、哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、ブタ等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、３０μｇ～１０００ｍｇ、１００μｇ～５００ｍｇ、１００μｇ～１００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。注射投与の場合、患者の体重により、１μｇ／ｋｇ～５０００μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ～３０００μｇ／ｋｇを１回又は数回に分けて投与してもよい。
（キット）
　本発明に係るキットは、Ｎ末端認識抗体を含む。用途は特に限定されず、ＴＬＲ９の検出や、ＴＬＲ９に関連する疾患の診断に用いられる。
　キットは、その用途に応じて試薬や、医薬組成物と同様に担体や添加物を含んでいてもよく、更には緩衝液、容器、使用説明書等を含んでいてもよい。
（方法）
　本発明に係る方法は、Ｎ末端認識抗体を、対象に投与する工程を含む。
　本発明に係る方法においては、Ｎ末端認識抗体を本発明に係る医薬組成物として投与することができる。
　本発明に係る方法によれば、対象であるヒト又はその他の哺乳類等において、ＴＬＲ９に関連する疾患を治療又は予防することができる。あるいは、本発明の方法を他の用途、例えば診断に用いてもよい。
　本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
抗ＴＬＲ9抗体の樹立、一次免疫細胞におけるＴＬＲ9の検出、及び抗ＴＬＲ9抗体によるＴＬＲ9応答阻害実験
〔材料と方法〕
抗ＴＬＲ9モノクローナル抗体、NaR9の作製
　抗マウスTLR9モノクローナル抗体を樹立するために、BALB/cバックグランドのTlr9-/-マウスにマウスTLR9を強制発現したBa/F3細胞（TLR9-Ba/F3）を腹腔内投与して免疫を行った。初回の免疫で、免疫賦活剤としてComplete Freund's adjuvant (CFA)を用いた。2回目、3回目の免疫で、免疫賦活剤としてIncomplete Freund's adjuvant (IFA)を用いた。4回目の免疫で、1(PBS (リン酸緩衝生理食塩水)で懸濁したTLR9-Ba/F3を腹腔内投与した。最後の免疫から5日後、マウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株SP2/Oを細胞融合した。細胞融合には石原産業株式会社より購入したセンダイウイルス由来エンベロープ蛋白（GenomeONE-CF）を用いた。TLR9抗体を産生するハイブリドーマを選択するために、TLR9-Ba/F3を用いて細胞膜透過染色を行いフローサイトメトリーにより解析した。BIO-RADより購入したMouse antibody Isotype kitを用いてNaR9のサブクラスをIgG2a/κと決定した。
マウス
　野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは日本ＳＬＣより購入した。
　Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドＴＬＲ9欠損マウス（Tlr9-/-）は本研究室で樹立した。BALB/cバックグラウンドTlr9-/-マウスは日本SLCより購入した野生型BALB/cマウスと7回交配して樹立した。マウスはＳＰＦ環境にて飼育し、すべての動物実験は東京大学医科学研究所の動物実験委員会の承認を受け倫理規定に基づいて実験を行った。
試薬と抗体
　CpGA 1585 (5'-G*G*GGTCAACGTTGAG*G*G*G*G*G-3', アスタリスクはホスホロチオエート化残基を示す)（配列番号１９）, PolyU (5'-UUUUUUUUUUUUUUUUUUU-3', すべてホスホロチオエート化残基) （配列番号２０）そして CpGB 1688 (5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3', すべてホスホロチオエート化残基) （配列番号１８） はファスマックにより合成された。 Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro8-oxo-guanosine) はEnzo Life Scienceから購入した。 Saponin と D-(+)-GalactosamineはSigma-Aldrichより購入した。 FuGene6 と DOTAP はRoche Applied Scienceより購入した。抗マウスTLR9モノクローナル抗体であるNaR9、J15A7またはB33A4は、オリエンタル酵母株式会社より購入したヌードマウスにハイブリドーマを接種後、腹水から精製された。Streptavidin-PE、anti-mouse IgG1-PE、anti-mouse IgG2a-PE、isotype control antibodies (mouse IgG1, mouse IgG2a)、anti-mouse CD16/32、anti-mouse CD19-APC-Cy7、anti-mouse CD11b-APC、anti-mouse CD11c-APC、anti-mouse CD11c-PE-Cy7、anti-mouse Siglec-H-FITC、そして anti-mouse Ly-6G-PerCP-Cy5.5 はBioLegendより購入した。 Anti-mouse B220-APC はTONBO biosciencesより購入した。 J15A7-PE、anti-mouse CD49b-BV421とanti-mouse CD11b-BV510はBD Biosciencesより購入した。
細胞培養
　Ba/F3 細胞はRoswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium（IL-3, 10% FBS, PS/Gln そして50μM 2-ME添加）で培養された。Bone marrow-derived macrophage (BM-MCs), conventional DC (cDC) またはplasmacytoid DC (pDC) は野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはTlr9-/-マウスより誘導された。 マクロファージを誘導するために、1×107個の骨髄細胞は10cm cell culture dishes で6日間、recombinant M-CSF (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 100 ng/mlを加えた10% FCS-RPMI1640で培養された。cDCまたはpDCを誘導するために 1×107個の骨髄細胞は10cm cell culture dishes で７日間、10 ng/mlのrecombinant GM-CSFまたは100ng/mlのFlt3-L (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)を加えた10% FCS-RPMI1640で培養された。
プラスミドの構築とレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入
　マウス及びヒトTLR9の配列はPCR法によって増幅され、東京大学の北村俊雄博士より分与していただいたｐMXまたはｐMXｓレトロウイルスベクターにクローニングされた。マウスとヒトTLR９キメラ変異体は以下のものを構築した。TLR9166 (マウスTLR9が１-166、ヒトTLR9が167‐1016アミノ酸)、TLR9242(マウスTLR9が１-242、ヒトTLR9が243‐1016アミノ酸)、TLR9356(マウスTLR9が１-356、ヒトTLR9が357‐1016アミノ酸)、TLR9440(マウスTLR9が１-440、ヒトTLR9が441‐1016アミノ酸)そしてTLR9544(マウスTLR9が１-544、ヒトTLR9が545‐1016アミノ酸)はTLR9変異体のC末端側にGFPが付加するようにｐMX-GFPベクターにクローニングされた。
　プラスミドは、polyethylenimine (Polysciences, Inc.)と共にPlat-Eパッケージング細胞 1×105/wellに遺伝子導入された。二日後、ウイルスを含む培養上清をDOTAPと共にBa/F3細胞に加え、2000rpmで60分間の遠心を行った。
脾臓免疫細胞の染色とフローサイトメトリー解析
　C57BL/6N系統の野生型マウスおよびTLR9ノックアウトマウスから脾臓を採取し、スライドグラスを用いて細胞を単離した。単離した細胞を赤血球溶解バッファー（BioLegend）によって処理し、赤血球を除去した後にpurified anti-CD16/32 (BioLegend, clone 93)を用いて細胞表面のFc受容体をブロックした。
　Fc受容体をブロックした後、Fluorescein (FITC)-conjugated anti-mouse SiglecH (BioLegend, 551)および Phycoerythrin (PE)-Cy7-conjugated anti-mouse CD11c (BioLegend, N418)によって染色し、CD11c陽性/SiglecH陽性の画分をpDCとした。また、CD11c高発現/SiglecH陰性の画分をcDCとした。
　細胞表面のSiglecHとCD11cを染色した後、細胞表面および細胞内部のTLR9を染色した。細胞表面のTLR9を染める際には、非固定条件下でpurified anti-TLR9を反応させ、PE conjugated rat anti-mouse IgG2a (BioLegend, clone RMG2a-62)を２次抗体として用いた。細胞内部のTLR9については、BD Cytofix/Cytoperm fixatation/permeabilization solution kitを用いて染色した。これらの細胞は染色用バッファーに置換し、LSR Fortessa X-20 (BD)によって解析を行った。
免疫沈降およびウエスタンブロット
　ＴＬＲ９のタンパク質発現をウエスタンブロットにより解析した。BM-cDCは１×ＰＢＳにより２回洗浄し、回収した。回収し
た細胞を氷冷した溶解用緩衝液（１％　Triton X １００，　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ　７．４），　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ　ＣａＣｌ2，　１ｍＭ　ＭｇＣｌ2，　１０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　１ｍＭ　ＤＴＴ　及びＣｏｍｐｌｅｔｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ　（Ｒｏｃｈｅ））により３０分間、溶解し、高速遠心後、細胞溶解液の上清を回収した。
　回収した細胞溶解液を抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体（NaR9）と結合させたＮ－ｈｙｄｒｏｘｙ　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４ＦＦビーズに加え、２時間、４℃で撹拌した。この工程により、ＴＬＲ９を免疫沈降した。撹拌後、ビーズを氷冷した洗浄用緩衝液（０．１％　TritonX１００、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ　７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ　ＤＴＴ）で３回洗浄した。洗浄したビーズにＳＤＳサンプル緩衝液（１２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ　［ｐＨ　６．８］，　２０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　４％　ＳＤＳ，　１０％　２－ＭＥ，　０．００５％　ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を加え、９６℃で５分間加熱してタンパク質を変性処理した。これら調製したサンプルはポリアクリルアミド電気泳動して、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ウエスタンブロットした。
　ウエスタンブロットに使用した抗体は、マウスTLR9のTIRドメインをウサギに免疫し、回収した血清より精製した自家製のポリクローナル抗体を用いた。
統計処理
　抗体によるマウス投与実験において、抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体投与群とコントロール抗体投与群の間におけるデータの有為差検定はＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定により算定した。Ｔ検定における危険率が０．０１未満の場合、比較群間の差が優位であると判定した。
抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体によるＴＬＲ９応答阻害実験
（試験管内試験）
　細胞はＢＭ－ＭＣｓ、ＢＭ－ｃＤＣｓ、ＢＭ－ｐＤＣｓを用いた。９６ｗｅｌｌ平底プレートにＢＭ－ＭＣｓ、ＢＭ－ｃＤＣｓ、ＢＭ－ｐＤＣｓを５(１０4播種し、抗ＴＬＲ９抗体を各々の濃度で添加した。抗体を添加してから４時間後、ＴＬＲリガンドを藩種した培養細胞に加えた。ＴＬＲリガンド添加した２４時間後、培養上清液を回収した。回収した培養上清液はリガンド刺激によって、産生されたサイトカインを測定するためにＥＬＩＳＡ法により検出した。
（生体試験）
　野生型マウスにCpGBリガンドとD-(+)-Galactosamineを同時に腹腔内投与すると10時間以内に死亡することが報告されている。（Sparwasser, T. et al. Eur J Immunol 27, 1671-1679, doi:10.1002/eji.1830270712 (1997)）野生型C57BL/6マウスに抗体またはPBS（リン酸緩衝溶液）を腹腔内投与し、15時間後、さらに CpGB 10 nmol と D-(+)-Galactosamine 20mgを腹腔内投与した。リガンド投与前と投与後、１、３、6時間後の血液を各マウスから採取し、その血清を用いてTNF-αまたはIL-12p40をELISAにて測定した。
抗体及びＣＤＲのアミノ酸配列及び塩基配列解析
　TLR9モノクローナル抗体NaR9のアミノ酸配列は、ジーンスクリプト社によって解析された。Ambion社製TRIzol（登録商標）Reagentを用いてハイブリドーマよりトータルRNAを回収し、TAKARA社製PrimeScript（登録商標）1st Strand cDNA Synthesis Kitを用いて、cDNAへ逆転写反応を行った。このcDNAからVHとVL断片を増幅し、各断片は一般的なクローニング用ベクターにクローニングされた。大腸菌に形質転換後、コロニーPCRを行い、サイズの正しいバンドの最低５クローンからプラスミドを回収し、シークエンス解析を行った。シークエンス解析から、最もコンセンサスな配列を抗体の配列として決定した。決定した抗体の配列として、図９はＮａＲ９抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）であり、図１０はＮａＲ９抗体の重鎖の塩基配列（配列番号１５）であり、図１１はＮａＲ９抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６）であり、図１２はＮａＲ９抗体の軽鎖の塩基配列（配列番号１７）である。
〔結果〕
抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体の樹立とＴＬＲ９の検出
　一次免疫細胞（ｐｒｉｍａｒｙ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｅｌｌ）の内因性ＴＬＲ９の細胞内発現を調べるため、マウスＴＬＲ９に対するモノクローナル抗体NaR9抗体を樹立した。抗体の特異性を検証するためにマウス脾臓のcDCを用いて、ＴＬＲ9の発現を明らかにした。染色の特異性は、TLR9ノックアウトマウスの脾臓cDCが染色されないことによって確認した（図１）。さらに、BM-cDCを用いて、TLR9の免疫沈降実験を行った。以前樹立された、TLR9抗体（J15A7）と比較して、NaR9はより強くTLR9を免疫沈降することが示された（図２）。NaR9の認識部位を明らかにするために、まず、以前樹立されたTLR9抗体（B33A4、J15A7）を用いた、染色阻害実験を行った（B33A4及びJ15A7については、国際公開第２０１４／１７４７０４号公報を参照する。）。NaR9のTLR9染色は、J15A7の細胞前処理によって阻害された（図３）。同様に、J15A7のTLR9染色は、NaR9の細胞前処理によって阻害された（図３）。以上の結果より、新規に樹立されたNaR9は一次免疫細胞のTLR9を認識し、細胞染色や免疫沈降に利用できること、J15A7と抗原認識部位が近いことが判明した。
抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体によるＴＬＲ９応答阻害実験（１）
　NaR9のTLR9応答抑制効果を検証するために、野生型マウスよりBM-MCｓを誘導し実験に用いた。NaR9を前投与した群では、BM-MCｓでCpGBまたはCpGA応答によるTNF-α及びIL-12p40産生を抗体濃度依存的に抑制した（図４）。BM-cDCについても同様の結果が得られた（結果は示さず）。一方、TLR7リガンドのLoxoribine応答に影響はしなかった。一方、BM-pDCについてはNaR9によるTLR9応答抑制効果は見られなかった（結果は示さず）。
抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体によるＴＬＲ９応答阻害実験（２）
　続いて、NaR9によるin vivoでのTLR9応答抑制効果を検証するために、CpGBとD-(+)-Galactosamineをマウスに投与する実験を行った。PBSまたはIgG2aコントロール抗体を前投与した群で、リガンド刺激後１０時間内に、90％前後のマウスが死亡したのと比較して、NaR9を前投与した群は、20％まで死亡率を抑制した（図５）。さらに、リガンド刺激後、１、３、６時間後の血中のTNF-αを測定した結果、IgG2aコントロール抗体投与群と比較して、NaR9抗体投与群では、有意にサイトカイン産生を抑制していた（図６）。
NaR9、可変領域のアミノ酸配列解析
　ハイブリドーマ株NaR9から得られるモノクローナル抗体の重鎖アミノ酸配列を配列番号：１４に、軽鎖アミノ酸配列を配列番号：１６に示す。また、これらのアミノ酸配列に対応する塩基配列を配列番号１５、１７に示す。
　また、同抗体の重鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を配列番号：２、４、６に、軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を配列番号：８、１０、１２に示す。また、これらのアミノ酸配列に対応する塩基配列を配列番号３、５、７、９、１１、１３に示す。
NaR9の抗原認識部位解析
　NaR9の抗原認識部位を決定するために、マウスTLR9とヒトTLR9のキメラTLR9を発現する細胞株を作製した。マウスTLR9は配列番号：１に示すＴＬＲ９のアミノ酸１位から544位（TLR9544）、１位から４５４位（TLR9454）、１位から３５６位（TLR9356）、及び１位から２４２位（TLR9242）までとし、C末端側をヒトTLR9の配列でそれぞれ作製し（図７）、細胞株に発現させ、各キメラTLR9とNaR9との結合をフローサイトメトリーで測定した。
　結果を図８に示す。TLR9242にはNaR9が結合しなかったが、TLR9356には結合したことから、NaR9は、ＴＬＲ９のアミノ酸配列の２４３位から３５６位の領域付近にエピトープを有すると考えられた。
配列番号：１は、マウスＴＬＲ９のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号：３は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ１の塩基配列を表す。
配列番号：４は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号：５は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ２の塩基配列を表す。
配列番号：６は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号：７は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ３の塩基配列を表す。
配列番号：８は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号：９は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ１の塩基配列を表す。
配列番号：１０は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１１は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ２の塩基配列を表す。
配列番号：１２は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１３は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ３の塩基配列を表す。
配列番号：１４は、ＮａＲ９抗体の重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１５は、ＮａＲ９抗体の重鎖の塩基配列を表す。
配列番号：１６は、ＮａＲ９抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１７は、ＮａＲ９抗体の軽鎖の塩基配列を表す。
配列番号：１８は、ＣｐＧＢのＤＮＡ配列を表す。
配列番号：１９は、ＣｐＧＡのＤＮＡ配列を表す。
配列番号：２０は、ＰｏｌｙＵのＲＮＡ配列を表す。

Claims (9)

  1. 　ＴＬＲ９のＮ末端を認識する、抗体。
  2. 　ＴＬＲ９のＮ末端における１位～３５６位の領域を認識する、請求項１に記載の抗体。
  3. 　ＴＬＲ９のＮ末端における２４３位～３５６位の領域を認識する、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. 　ＴＬＲ９のＮ末端が、以下の少なくとも１つのアミノ酸配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体：
    （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
    （ｃ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
  5. 　以下の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体：
    （ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列；
    （ｆ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列；
    （ｇ）配列番号：２、４、６、８、及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
    （ｈ）配列番号：２、４、６、８、及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
  6. 　ＴＬＲ９のＮ末端が、マウスＴＬＲ９のＮ末端である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられる医薬組成物。
  8. 　ＴＬＲ９に関連する疾患が、全身性エリテマトーデス、乾癬、又は非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＴＬＲ９に関連する疾患の診断に用いられるキット。
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