CN113621586A - 一种提高人源ii型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，包括：(1)BL21(DE3)gorˉ感受态细胞转化，(2)诱导表达与菌种处理，(3)2’5’‑ADP‑Sepharose亲和层析纯化。本发明是一种通过调节分离纯化过程中洗脱液pH提高hTrxR2稳定性的方法，与现有技术相比较具有以下优点：本发明操作简单且能提高分离纯化后的hTrxR2的稳定性和溶解性，并保持其酶活。本发明为后续开发以hTrxR2为靶点的药物的研究提供了高质量且稳定的hTrxR2目的蛋白，推动了与hTrxR2相关的疾病的药物研发进程。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白稳定技术，尤其涉及一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法。
背景技术
人源II型硫氧还蛋白还原酶又名人源线粒体型硫氧还蛋白还原酶(humanmitochondria thioredoxin reductase,hTrxR2)是位于线粒体的抗氧化硒蛋白，其蛋白分子量为56.2kDa，二级结构由一个α螺旋及β片层组成。hTrxR2通过分子内巯基和二硫键可逆地催化许多氧化还原反应，在抗氧化应激、阻止线粒体介导的细胞死亡、调节某些基因的表达等方面起到关键作用，与疾病的发病机制密切相关，已经成为药物研发领域的热点课题。
目前hTrxR2还未商品化，若想对其进行深入研究，获得高质量且稳定的目的蛋白是我们进一步认知hTrxR2的前提。目前hTrxR2的制备方法主要是通过使其在大肠杆菌中重组表达，获得hTrxR2的粗蛋白，然后再经过ADP-Sepharose亲和层析、Centri-Unit超滤杯浓缩和Superdex G200凝胶过滤这些分离纯化步骤获得蛋白产物。获得蛋白产物之后还需要对其酶学性质进行检测，才能进一步的对其进行应用。但经过如此繁琐的提蛋白过程，获得的hTrxR2的稳定性和溶解性并不高，很容易发生降解或失活，严重影响其在下一步研究中的应用。因此，提高hTrxR2在溶液中的稳定性迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述诸多问题，提出一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，该方法可以稳定分离纯化后的hTrxR2，保障其溶解度、稳定性以及酶活，能够满足后续研究的需求。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，包括如下步骤：
(1)BL21(DE3)gor-感受态细胞转化
从冰箱中取出BL21(DE3)gor-感受态细胞，解冻，于冰上放置；在超净台中取(1～3μL)质粒加入感受态细胞中并标记；冰上静置10～30min，随后35～45℃热激60～90sec，再立刻冰上静置3～5min；静置结束后，向感受态细胞中加入无抗性LB培养基，于30～40℃，180～220rpm条件下培养0.5～1h；培养结束后，取菌液均匀涂布在抗性平板上，30～40℃恒温箱过夜培养；观察对照组与实验组，空白组无菌落，实验组长有菌落表示成功转化；
(2)诱导表达与菌种处理
从抗性平板中挑取单克隆，1～5:100(个/mL)接种至LB培养基中，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使三种抗生素终浓度分别为10～15μg/mL、30～50μg/mL和30～40μg/mL，将菌液于30～42℃，180～220rpm条件下过夜培养；次日将过夜培养菌液按照1～2％体积比例接种至LB培养基，于30～42℃，180～220rpm条件下培养6～8h，至对数生长末期，随后添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷、亚硒酸钠、L-半胱氨酸在室温200～220rpm条件下继续培养18～24h；培养结束后，收集菌液，并4000～5000rpm离心15～30min，弃去上清，使用TEbuffer(50mmol/L Tris,20mmol/L EDTA,pH7.5)重悬菌体，噬菌体与TE buffer质量比为1：2～10，加入终浓度为0.5～1mg/mL溶菌酶，反复冻融2～5次释放内容物，并超声破碎打碎核酸，随后13000～15000rpm离心20～40min，收集上清液，并用0.22～0.80μm滤膜过滤除杂获得粗酶液；
(3)2’5’-ADP-Sepharose亲和层析纯化
分别先后使用5～10倍柱体积(Column volumn，CV)ddH2O，5～10CV TE Buffer平衡层析柱，随后将粗酶液匀速流过层析柱，并使用15～20CV TE Buffer清洗层析柱，然后使用2～5CV TE Buffer(含0.5mol/L NaCl)和2～5CV TE Buffer(含1.0mol/L NaCl)进行洗脱，分别收集洗脱液；使用再生液1(pH8.5)，再生液2(pH4.5)各3～5CV，交替清洗层析柱3～5次；使用5～10CV ddH2O，5～10CV 20％乙醇清洗层析柱，密封层析柱后4～8℃保存；
(4)首先用浓盐酸和1mol/L NaOH溶液将用于纯化蛋白的洗脱缓冲液TE Buffer缓冲液的pH调节为6.5～11.5，然后通过2’5’-ADP-Sepharose纯化收集hTrxR2。
进一步地，步骤(1)中存放BL21(DE3)gor-感受态细胞的冰箱温度为-80℃。
进一步地，步骤(1)所述解冻为室温解冻30～60sec。
进一步地，所述感受态细胞与无抗性LB培养基的用量比为2～7：50～90。
进一步地，步骤(2)所述四环素、卡那霉素和氯霉素，使三种抗生素终浓度分别为10～20μg/mL、30～70μg/mL和20～50μg/mL。
进一步地，步骤(2)所述异丙基-β-d-硫代半乳糖苷添加终浓度为0.1～1.0mmol/L、亚硒酸钠添加终浓度为3～7nmol/L、L-半胱氨酸添加终浓度为80～120μg/mL。
进一步地，步骤(2)中TE buffer为30～70mmol/L Tris,10～30mmol/LEDTA,pH7.2～7.6。
进一步地，步骤(3)将粗酶液按照1～2mL/min流速匀速流过层析柱。
进一步地，步骤(3)所述再生液1为0.1mol/L Tris-HCl+0.5mol/L NaCl,pH 8.5；所述再生液2为0.1mol/L CH3COONa+0.5mol/L NaCl,pH 4.5。
进一步地，步骤(3)所述洗脱包括：使用2～5CV含0.5mol/L NaCl的TE Buffer和2～5CV含1.0mol/L NaCl的TE Buffer进行洗脱。
进一步地，所述步骤(4)中TE buffer缓冲液的pH为7.0～9.5，更优选为8.5。
进一步地，分离纯化得到的hTrxR2储存于4～8℃。
进一步地，采用DNTB法还原测定酶活，包括以下步骤：
通过经典DTNB还原法进行酶活力检测，具体步骤如下：使用96孔酶标板的标准反应体系为200μL，反应液包括2.5mmol/L DTNB，3～20nmol/L纯化后hTrxR2和300μmol/LNADPH、TE Buffer(50mmol/L Tris,2mmol/LEDTA,pH7.5)；向反应体系加入5μL样品，在412nm下监测产物TNB-生成，选取反应初始阶段的线性部分。所有酶促反应均在室温条件下测试，读数间隔为10sec，总时长3min；DTNB反应体系包括终浓度为2.5mmol/L的DTNB、终浓度为300μmol/L的NADPH以及TE Buffer；测试体系：将5μL粗提后分离纯化得到的hTrxR2，加入195μL的上述DTNB反应体系。
本发明公开了一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，是一种通过调节分离纯化过程中洗脱液pH提高hTrxR2稳定性的方法，与现有技术相比较具有以下优点：
本发明操作简单且能提高分离纯化后的hTrxR2的稳定性和溶解性，并保持其酶活。本发明为后续开发以hTrxR2为靶点的药物的研究提供了高质量且稳定的hTrxR2目的蛋白，推动了与hTrxR2相关的疾病的药物研发进程。
附图说明
图1为洗脱液pH为8.5时4℃储存不同时间的hTrxR2的酶活力。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明：
实施例1
本实施例提供了一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，包括如下步骤：
(1)BL21(DE3)gor-感受态细胞转化
从-80℃冰箱中取出BL21(DE3)gor-感受态细胞，稍微解冻后于冰上放置。在超净台中取1μL质粒加入感受态细胞中并标记。冰上静置20min，随后42℃热激90sec，再立刻冰上静置3min。静置结束后，向感受态细胞中加入700μL无抗性LB培养基，于37℃，200rpm条件下培养1h。培养结束后，取200μL菌液均匀涂布在抗性平板，37℃恒温箱过夜培养。观察对照组与实验组，空白组无菌落，实验组长有菌落表示成功转化。
(2)诱导表达与菌种处理
从抗性平板中挑取单克隆，接种至含有30mL LB培养基中，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使三种抗生素终浓度分别为15μg/mL、50μg/mL和34μg/mL，将菌液于37℃，200rpm条件下过夜培养。次日按照1～2％接种量至含有300mL LB培养基(含四环素、卡那霉素和氯霉素)的三角瓶，于37℃，200rpm条件下培养6h，至对数生长末期，即OD600＝2.4，随后添加终浓度为0.5mmol/L IPTG、5nmol/L Selenite、100μg/mL L-cysteine，置于室温，220rpm条件下继续培养24h。培养结束后，收集菌液，并4000rpm离心20min，弃去上清，使用10mL TEbuffer(50mmol/L Tris,20mmol/L EDTA,pH7.5)重悬菌体，加入终浓度为1mg/mL溶菌酶，反复冻融3次释放内容物，并超声破碎打碎核酸，随后13000rpm离心30min，收集上清液，并用0.45μm滤膜过滤除杂获得粗酶液。
(3)2’5’-ADP-Sepharose亲和层析纯化
分别先后使用10CV ddH2O，10CV TE Buffer平衡层析柱，随后将粗酶液按照1mL/min流速匀速流过层析柱并使用20CV TE Buffer(50mM Tris,20mM EDTA,pH8.5)清洗层析柱收集洗脱液，然后使用3CV TE Buffer(0.5mol/L NaCl)和3CV TE Buffer(1.0mol/LNaCl)进行洗脱，分别收集洗脱液。使用再生液1(pH 8.5)，再生液2(pH 4.5)各3CV，交替清洗层析柱3次；使用10CV ddH2O，10CV 20％乙醇清洗层析柱，密封后4～8℃保存。
(4)DNTB法还原测定酶活
通过经典DTNB还原法进行酶活力检测，具体步骤如下：使用96孔酶标板的标准反应体系为200μL，反应液包括2.5mmol/L DTNB，20nmol/L纯化后hTrxR2和300μmol/L NADPH、TE Buffer(50mmol/L Tris,2mmol/LEDTA,pH7.5)。向反应体系加入5μL样品，在412nm下监测产物TNB-生成，选取反应初始阶段的线性部分。所有酶促反应均在室温条件下测试，读数间隔为10sec，总时长3min。
所述的一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法是指，在进行上诉步骤(3)时，首先用浓盐酸和1mol/L NaOH溶液将用于纯化蛋白的洗脱缓冲液TE Buffer(0.5mol/L NaCl)pH调节为8.5，然后通过2’5’-ADP-Sepharose纯化收集hTrxR2，通过DTNB法检测酶活，然后放置于4～8℃储存24h后，酶活力为0.59U/mL,酶浓度为0.19mg/mL,比活力为3.1U/mg，储存9天后酶活力(0.52U/mL)为储存24h后酶活力的88.14％(如图1所示)，足以满足正常实验需要。
实施例2
本实施例提供了一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，包括如下步骤：
(1)BL21(DE3)gor-感受态细胞转化
从-80℃冰箱中取出BL21(DE3)gor-感受态细胞，稍微解冻后于冰上放置。在超净台中取1μL质粒加入感受态细胞中并标记。冰上静置20min，随后42℃热激90sec，再立刻冰上静置3min。静置结束后，向感受态细胞中加入700μL无抗性LB培养基，于37℃，200rpm条件下培养1h。培养结束后，取200μL菌液均匀涂布在抗性平板，37℃恒温箱过夜培养。观察对照组与实验组，空白组无菌落，实验组长有菌落表示成功转化。
(2)诱导表达与菌种处理
从抗性平板中挑取单克隆，接种至含有30mL LB培养基中，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使三种抗生素终浓度分别为15μg/mL、50μg/mL和34μg/mL，将菌液于37℃，200rpm条件下过夜培养。次日按照1～2％接种量至含有300mL LB培养基(含四环素、卡那霉素和氯霉素)的三角瓶，于37℃，200rpm条件下培养6h，至对数生长末期，即OD600＝2.4，随后添加终浓度为0.5mmol/L IPTG、5nmol/L Selenite、100μg/mL L-cysteine，置于室温，220rpm条件下继续培养24h。培养结束后，收集菌液，并4000rpm离心20min，弃去上清，使用10mL TEbuffer(50mmol/L Tris,20mmol/L EDTA,pH7.5)重悬菌体，加入终浓度为1mg/mL溶菌酶，反复冻融3次释放内容物，并超声破碎打碎核酸，随后13000rpm离心30min，收集上清液，并用0.45μm滤膜过滤除杂获得粗酶液。
(3)2’5’-ADP-Sepharose亲和层析纯化
分别先后使用10CVddH2O，10CV TE Buffer平衡层析柱，随后将粗酶液按照1mL/min流速匀速流过层析柱并使用20CV TE Buffer(50mM Tris,20mM EDTA,pH8.0)清洗层析柱收集洗脱液，然后使用3CV TE Buffer(0.5mol/L NaCl)和3CV TE Buffer(1.0mol/LNaCl)进行洗脱，分别收集洗脱液。使用再生液1(pH 8.5)，再生液2(pH 4.5)各3CV，交替清洗层析柱3次；使用10CV ddH2O，10CV 20％乙醇清洗层析柱，密封后4～8℃保存。
(4)DNTB法还原测定酶活
通过经典DTNB还原法进行酶活力检测，具体步骤如下：使用96孔酶标板的标准反应体系为200μL，反应液包括2.5mmol/L DTNB，20nmol/L纯化后hTrxR2和300μmol/L NADPH、TE Buffer(50mmol/L Tris,2mmol/LEDTA,pH7.5)。向反应体系加入5μL样品，在412nm下监测产物TNB-生成，选取反应初始阶段的线性部分。所有酶促反应均在室温条件下测试，读数间隔为10sec，总时长3min。
所述的一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法是指，在进行上诉步骤(3)时，首先用浓盐酸和1mol/L NaOH溶液将用于纯化蛋白的洗脱缓冲液TE Buffer(0.5mol/L NaCl)pH调节为8.0，然后通过2’5’-ADP-Sepharose纯化收集hTrxR2，通过DTNB法检测酶活，然后放置于4～8℃储存，24h后，酶活力为0.25U/mL,酶浓度为0.11mg/mL,比活力为2.27U/mg。
实施例3
本实施例提供了一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，包括如下步骤：
(1)BL21(DE3)gor-感受态细胞转化
从-80℃冰箱中取出BL21(DE3)gor-感受态细胞，稍微解冻后于冰上放置。在超净台中取1μL质粒加入感受态细胞中并标记。冰上静置20min，随后42℃热激90sec，再立刻冰上静置3min。静置结束后，向感受态细胞中加入700μL无抗性LB培养基，于37℃，200rpm条件下培养1h。培养结束后，取200μL菌液均匀涂布在抗性平板，37℃恒温箱过夜培养。观察对照组与实验组，空白组无菌落，实验组长有菌落表示成功转化。
(2)诱导表达与菌种处理
从抗性平板中挑取单克隆，接种至含有30mL LB培养基中，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使三种抗生素终浓度分别为15μg/mL、50μg/mL和34μg/mL，将菌液于37℃，200rpm条件下过夜培养。次日按照1～2％接种量至含有300mL LB培养基(含四环素、卡那霉素和氯霉素)的三角瓶，于37℃，200rpm条件下培养6h，至对数生长末期，即OD600＝2.4，随后添加终浓度为0.5mmol/L IPTG、5nmol/L Selenite、100μg/mL L-cysteine，置于室温，220rpm条件下继续培养24h。培养结束后，收集菌液，并4000rpm离心20min，弃去上清，使用10mL TEbuffer(50mmol/L Tris,20mmol/L EDTA,pH7.5)重悬菌体，加入终浓度为1mg/mL溶菌酶，反复冻融3次释放内容物，并超声破碎打碎核酸，随后13000rpm离心30min，收集上清液，并用0.45μm滤膜过滤除杂获得粗酶液。
(3)2’5’-ADP-Sepharose亲和层析纯化
分别先后使用10CVddH2O，10CV TE Buffer平衡层析柱，随后将粗酶液按照1mL/min流速匀速流过层析柱并使用20CV TE Buffer(50mM Tris,20mM EDTA,pH 9.0)清洗层析柱收集洗脱液，然后使用3CV TE Buffer(0.5mol/L NaCl)和3CV TE Buffer(1.0mol/LNaCl)进行洗脱，分别收集洗脱液。使用再生液1(pH 8.5)，再生液2(pH 4.5)各3CV，交替清洗层析柱3次；使用10CV ddH2O，10CV 20％乙醇清洗层析柱，密封后4～8℃保存。
(4)DNTB法还原测定酶活
通过经典DTNB还原法进行酶活力检测，具体步骤如下：使用96孔酶标板的标准反应体系为200μL，反应液包括2.5mmol/L DTNB，20nmol/L纯化后hTrxR2和300μmol/L NADPH、TE Buffer(50mmol/L Tris,2mmol/LEDTA,pH7.5)。向反应体系加入5μL样品，在412nm下监测产物TNB-生成，选取反应初始阶段的线性部分。所有酶促反应均在室温条件下测试，读数间隔为10sec，总时长3min。
所述的一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法是指，在进行上诉步骤(3)时，首先用浓盐酸和1mol/L NaOH溶液将用于纯化蛋白的洗脱缓冲液TE Buffer(0.5mol/L NaCl)pH调节为9.0，然后通过2’5’-ADP-Sepharose纯化收集hTrxR2，通过DTNB法检测酶活，然后放置于4～8℃储存，24h后，酶活力为0.34U/mL,酶浓度为0.18mg/mL,比活力为1.85U/mg。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)BL21(DE3)gorˉ感受态细胞转化
从冰箱中取出BL21(DE3)gorˉ感受态细胞，解冻，于冰上放置；在超净台中取质粒加入感受态细胞中并标记；冰上静置10～30min，随后35～45℃热激60～90sec，再立刻冰上静置3～5min；静置结束后，向感受态细胞中加入无抗性LB培养基，于30～40℃，180～220rpm条件下培养0.5～1h；培养结束后，取菌液均匀涂布在抗性平板上，30～40℃恒温箱过夜培养；观察对照组与实验组，空白组无菌落，实验组长有菌落表示成功转化；
(2)诱导表达与菌种处理
从抗性平板中挑取单克隆，1～5:100(个/mL)接种至LB培养基中，，加入四环素、卡那霉素和氯霉素，使三种抗生素终浓度分别为10～15μg/mL、30～50μg/mL和30～40μg/mL，将菌液于30～42℃，180～220rpm条件下过夜培养；次日将过夜培养菌液按照1～2％体积比例接种至LB培养基，于30～42℃，180～220rpm条件下培养6～8h，至对数生长末期，随后添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷、亚硒酸钠、L-半胱氨酸在室温、200～220rpm条件下继续培养18～24h；培养结束后，收集菌液，并4000～5000rpm离心15～30min，弃去上清，使用TE buffer重悬菌体，噬菌体与TE buffer质量比为1：2～10，入终浓度为0.5～1mg/mL溶菌酶，反复冻融2～5次释放内容物，并超声破碎打碎核酸，随后13000～15000rpm离心20～40min，收集上清液，并用0.22～0.80μm滤膜过滤除杂获得粗酶液；
(3)2’5’-ADP-Sepharose亲和层析纯化
分别先后使用5～10倍柱体积ddH2O，5～10CV TE Buffer平衡层析柱，随后将粗酶液匀速流过层析柱，并使用15～20CV TE Buffer清洗层析柱，进行洗脱，分别收集洗脱液；使用再生液1，再生液2各3～5CV，交替清洗层析柱3～5次；使用5～10CV ddH2O，5～10CV 20％乙醇清洗层析柱，密封层析柱后4～8℃保存；
(4)首先用浓盐酸和NaOH溶液将用于纯化蛋白的洗脱缓冲液TE Buffer缓冲液的pH调节为7.0～9.5，然后通过2’5’-ADP-Sepharose纯化收集hTrxR2。
2.根据权利要求1提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)所述解冻为室温解冻30～60sec。
3.根据权利要求1提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，所述感受态细胞与无抗性LB培养基的体积用量比为2～7：50～90。
4.根据权利要求1提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，步骤(2)中TE buffer为40～60mmol/L Tris,10～30mmol/L EDTA,pH7.2～7.6。
5.根据权利要求1提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，步骤(2)所述异丙基-β-d-硫代半乳糖苷添加终浓度为0.3～0.6mmol/L、亚硒酸钠添加终浓度为3～7nmol/L、L-半胱氨酸添加终浓度为80～120μg/mL。
6.根据权利要求1提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，步骤(3)将粗酶液按照1～2mL/min流速匀速流过层析柱。
7.根据权利要求1提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，步骤(3)所述再生液1为0.1mol/L Tris-HCl+0.5mol/L NaCl,pH8.5；所述再生液2为0.1mol/LCH3COONa+0.5mol/L NaCl,pH 4.5。
8.根据权利要求1提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，步骤(3)所述洗脱包括：使用2～5CV含0.5mol/L NaCl的TE Buffer和2～5CV含1.0mol/L NaCl的TE Buffer进行洗脱。
9.根据权利要求1提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，所述步骤(4)中TE buffer缓冲液的pH为7.0～9.5。
10.根据权利要求1提高人源II型硫氧还蛋白还原酶稳定性的方法，其特征在于，分离纯化得到的hTrxR2储存于4～8℃。
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|---|---|---|---|---|
| WO2001012657A2 (en) * | 1999-08-16 | 2001-02-22 | Karolinska Innovations Ab | Methods and means for selenoprotein expression |
| CN108546688A (zh) * | 2018-04-08 | 2018-09-18 | 大连理工大学 | 一种提高硒蛋白TrxR表达的方法 |
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