CN113615576B - 一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法 - Google Patents

一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法，先将杜鹃兰的原球茎接入丛生芽诱导培养基中培养，30天时获得丛生芽，加入灭菌过的假鳞茎诱导及其增节拔节诱导剂，60天时丛生芽形成了丛生假鳞茎，假鳞茎节节的数量为2～6个，节间比较长；再将杜鹃兰丛生假鳞茎切分成单个假鳞茎，每个假鳞茎横切成带1个茎节的茎段，分别接入到增殖培养基中，达到提高杜鹃兰的增殖系数目的。通过在杜鹃兰丛生芽的培养基上加入假鳞茎及其增节拔节诱导剂，使得假鳞茎上的节数增多，节间距增长，增殖系数可在原来的基础上提高2.7～4.1倍，最高可达到21.32。该方法重复性好，安全高效，节能降耗，为杜鹃兰组培快繁技术应用于工厂化生产提供技术支撑。

Description

一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法。
背景技术
杜鹃兰（Cremastraappendiculata (D. Don) Makino）与独蒜兰的干燥假鳞茎为中药山慈菇，收载于历年版《中华人民共和国药典》，具有清热解毒、化痰散结功效，用于治疗痈肿疔毒、瘰疬痰核、淋巴结结核、蛇虫咬伤、瘸瘕痞块等症。此外，杜鹃兰还有抗肿瘤、抑菌、降血脂、降血糖等作用，倍受国内外广泛关注。
杜鹃兰为多年生珍稀药用兰科植物，野生于林下湿地或沟边湿地上，海拔500-2900米，主产于四川、云南、贵州、广西等地，在甘肃南部、陕西等黄河以南地区均有分布。随着杜鹃兰药理药效不断被挖掘，市场需求量不断增加，遭到了掠夺式采集，再加上生境破坏，野生种质资源急剧减少，加剧了杜鹃兰的市场需求与野生资源供给之间的矛盾。杜鹃兰野生繁育缓慢，主要有以下两方面的原因：一方面，由于杜鹃兰种子无胚乳，种胚仅为一团未分化成熟的细胞，在自然条件下萌发极为困难；另一方面，杜鹃兰的假鳞茎是其唯一的繁殖器官，每年仅由其一年生假鳞茎萌发 1 个芽，长成 1 个新的假鳞茎，经过多年生长形成假鳞茎串，繁殖系数低，产量极低，而且在采集时基本上是整株挖起，野生杜鹃兰挖一株少一株，导致野生资源急剧减少。
人工栽培是解决杜鹃兰资源紧缺的有效措施。人工栽培则需要有大量种苗作为保障，植物组培技术具有短时间内可以生产大量种苗优势，常应用于各种作物种苗繁育中，其中的增殖系数大小决定于该组培技术能否应用于工厂化生产，因为增殖系数与组培苗生产成本成负相关关系，提高增殖系数有利于降低生产成本。杜鹃兰一般的假鳞茎节节数量为2～3个，且节与节之间的距离短，在自然环境下，1个假鳞茎只萌发1个侧芽，但是每个假鳞茎节都有侧芽的芽点，因此，增加节节数量，并将每个节节上的侧芽诱导出来，即可大幅提高杜鹃兰的增殖系数。
发明内容
本发明在杜鹃兰继代增殖培养阶段对假鳞茎及其增节拔节进行诱导培养，探索出一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法。
实现本发明目的的技术方案是：
一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法，包括以下步骤：
（1）杜鹃兰原球茎诱导丛生芽培养：在超净工作台上，将杜鹃兰无菌播种获得的原球茎接入丛生芽诱导培养基中培养，10～15 天时原球茎陆续长出芽，30 天时获得丛生芽，增殖系数为3.0～5.2；
所述原球茎诱导丛生芽培养基为：1/3MS+KT0.1～1.0 mg/L+DA-60.1～1.0 mg/L+CPPU0.05～0.5 mg/L +IBA0.01～0.2 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）假鳞茎及其增节拔节诱导培养：在超净台上，在步骤（1）的丛生芽中加入灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，12～16天时，芽基部形成假鳞茎，30 天时，假鳞茎长大长长，节节的数量为2～6节，节与节的距离变长；
所述假鳞茎及其增节拔节诱导剂为：GA0.1～2.0 mg/L+BR0.01～0.5 mg/L+CPPU0.01～0.1 mg/L，pH值为6.0；
（3）茎节上侧芽诱导丛生芽培养：将步骤（2）中的获得的杜鹃兰丛生假鳞茎横切成单个假鳞茎，并将假鳞茎切成带1个茎节的茎段，统计增殖系数为8.1～21.32；将切好茎段分别接入到侧芽诱导丛生芽培养基中，暗培养3天，在弱光下培养7天，芽基部和茎段节间上长出芽点，20 天时长出丛生芽；
所述侧芽诱导丛生芽培养基为：1/3MS+6-BA0.1～1.0 mg/L+TDZ 0.01～0.5 mg/L+ CPPU0.01～0.1 mg/L +NAA0. 05～0.5 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（4）假鳞茎诱导培养：步骤（3）中的丛生芽培养10天，在超净工作台上，加入步骤（2）中灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，诱导丛生芽长出丛生假鳞茎，60 天时假鳞茎长大长长；
重复步骤（3）和（4），可大幅提高杜鹃兰的增殖系数；在成本投入方面只需比常规技术增加1/3左右的诱导剂成本，即可达到比常规技术4.1倍的增殖系数，投入产出比高达300%，高质低耗完成杜鹃兰增殖培养；
步骤（1）、（2）、（3）、（4）的培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为12 h/d，光照强度为1000 Lx。
进一步地，步骤（1）所述原球茎诱导丛生芽培养基优选为：1/3MS+KT0.5 mg/L+DA-60.5 mg/L+ CPPU0.3 mg/L +IBA0.08 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0。
进一步地，步骤（2）所述假鳞茎及其增节拔节诱导剂优选为：GA1.0 mg/L+BR0.3mg/L+ CPPU0.05 mg/L，pH值为6.0。
进一步地，步骤（3）所述侧芽诱导丛生芽培养基优选为1/3MS+6-BA0.5 mg/L+TDZ0.3 mg/L+ CPPU0.05 mg/L +NAA0.1 mg/L +蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0。
培养基中，MS为基本培养基，植物生长调节剂试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
原球茎诱导丛生芽培养基中，KT为激动素，具有促进细胞分裂，诱导芽分化和发育及增加气孔开度的作用；DA-6为胺鲜酯，具有促进植物细胞的分裂和伸长，调节体内养分的平衡作用；CPPU为氯吡苯脲，促进细胞分裂，促进细胞扩大伸长；IBA为吲哚丁酸，具有促进细胞分化和分裂作用；这些植物生长调节剂共同作用促进杜鹃兰原球茎长芽，并形成丛生芽。
假鳞茎及其增节拔节诱导剂中，GA为赤霉素，具有促进细胞的分裂、加速细胞的伸长作用，它可以促进细胞的扩大显著促进茎叶的生长；BR为油菜素内酯，促进植物茎杆伸长和细胞分裂，促进侧芽萌发，能够诱导芽的分化； CPPU为氯吡苯脲，促进细胞分裂，促进细胞扩大伸长，对器官的横向生长和纵向生长都有促进作用；这些植物生长调节剂共同作用促进杜鹃兰芽基部形成假鳞茎，并促进假鳞茎的伸长生长。
侧芽诱导丛生芽培养基中，6-BA为6-苄氨基嘌呤的细胞分裂素，促进细胞分裂和生长，促进芽的分化形成，促进侧芽生长，也可以诱导愈伤组织发生；TDZ为噻苯隆，具有很强的细胞分裂素活性，促进植物芽的再生和繁殖；CPPU为氯吡苯脲，促进细胞分裂，促进细胞扩大伸长；NAA为萘乙酸的生长素，具有促进细胞分化和分裂作用；这些植物生长调节剂共同作用促进杜鹃兰茎节上侧芽诱导丛生芽萌发和生长。
本发明方法，以杜鹃兰的原球茎为材料，诱导出芽和假鳞茎，每个假鳞茎的节上都有侧芽，为了进一步提高杜鹃兰的增殖系数，在诱导出丛生芽后，加入假鳞茎及其增节拔节诱导剂，达到增加假鳞茎上的节数和节间距，增殖系数最大值可达21.32。
本发明方法具有重复性好、安全高效，节能降耗等优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例1
一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法，包括以下步骤：
（1）杜鹃兰原球茎诱导丛生芽培养：在超净工作台上，将杜鹃兰无菌播种获得的原球茎接入丛生芽诱导培养基中培养，15天原球茎陆续长出芽，30 天时获得丛生芽，增殖系数为3.0；
所述原球茎诱导丛生芽培养基为：1/3MS+KT0.1 mg/L+DA-60.1 mg/L+ CPPU0.05mg/L +IBA0.01 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）假鳞茎及其增节拔节诱导培养：在超净台上，在步骤（1）的丛生芽中加入灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，16天时，芽基部形成假鳞茎，30 天时，假鳞茎长大长长，假鳞茎较粗壮，节间距较短，每个假鳞节节的数量平均为2.7节；
所述假鳞茎及其增节拔节诱导剂为：GA0.1 mg/L+BR0.01 mg/L+ CPPU0.01mg/L，pH值为6.0；
（3）茎节上侧芽诱导丛生芽培养：将步骤（2）中的获得的杜鹃兰丛生假鳞茎横切成单个假鳞茎，并将假鳞茎切成带1个茎节的茎段，统计增殖系数为8.1；将切好的茎段接入侧芽诱导丛生芽培养基中，暗培养3天，在弱光下培养7天，芽基部和茎段节间上长出芽点，20天时长出丛生芽；
所述侧芽诱导丛生芽培养基为：1/3MS+6-BA0.1 mg/L+TDZ0.01 mg/L+ CPPU0.01mg/L +NAA0. 05 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（4）假鳞茎诱导培养：步骤（3）中的丛生芽培养10天，在超净工作台上，加入步骤（2）中灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，诱导丛生芽长出丛生假鳞茎，60 天时假鳞茎长大长长；
重复步骤（3）和（4），可提高杜鹃兰的增殖系数；
步骤（1）、（2）、（3）、（4）的培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为12 h/d，光照强度为1000 Lx。
实施例2
一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法，包括以下步骤：
（1）杜鹃兰原球茎诱导丛生芽培养：在超净工作台上，将杜鹃兰无菌播种获得的原球茎接入丛生芽诱导培养基中培养，10天原球茎陆续长出芽，30 天时获得丛生芽，增殖系数为4.9，芽较细长，叶片卷曲；
所述原球茎诱导丛生芽培养基为：1/3MS+KT1.0 mg/L+DA-61.0 mg/L+ CPPU0.5mg/L +IBA0.2 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）假鳞茎及其增节拔节诱导：在超净台上，在步骤（1）的丛生芽中加入灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，12天时，芽基部形成假鳞茎，30 天时，假鳞茎长大长长，假鳞茎较细长，每个假鳞节间距长，数量平均为3.2节；
所述假鳞茎及其增节拔节诱导剂为：GA2.0 mg/L+BR0.5 mg/L+ CPPU0.1 mg/L，pH值为6.0；
（3）茎节上侧芽诱导丛生芽培养：将步骤（2）中的获得的杜鹃兰丛生假鳞茎横切成单个假鳞茎，并将假鳞茎切成带1个茎节的茎段，统计增殖系数为15.68；将切好茎段接入侧芽诱导丛生芽培养基中，暗培养3 天，在弱光下培养7 天，芽基部和茎段节间上长出芽点，20 天长出丛生芽；
所述侧芽诱导丛生芽培养基为：1/3MS+6-BA1.0 mg/L+TDZ0.5 mg/L+ CPPU0.1mg/L +NAA0.5 mg/L +蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（4）假鳞茎诱导培养：步骤（3）中的丛生芽培养10天，在超净工作台上，加入步骤（2）中灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，诱导丛生芽长出丛生假鳞茎，60 天时假鳞茎长大长长；
重复步骤（3）和（4），可大幅提高杜鹃兰的增殖系数；
步骤（1）、（2）、（3）、（4）的培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为12 h/d，光照强度为1000 Lx。
实施例3
一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法，包括以下步骤：
（1）杜鹃兰原球茎诱导丛生芽培养：在超净工作台上，将杜鹃兰无菌播种获得的原球茎接入丛生芽诱导培养基中培养，12天原球茎陆续长出芽，30 天后获得丛生芽，增殖系数为5.2，芽较壮，叶色翠绿；
所述原球茎诱导丛生芽培养基为：1/3MS+KT0.5 mg/L+DA-60.5 mg/L+ CPPU0.3mg/L +IBA0.08 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）假鳞茎及其增节拔节诱导：在超净台上，在步骤（1）的丛生芽中加入灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，12天时，芽基部形成假鳞茎，30 天时，假鳞茎长大长长，假鳞茎一般壮，每个假鳞节节较长，数量平均为4.1节；
所述假鳞茎及其增节拔节诱导剂为：GA1.0 mg/L+BR0.3 mg/L+ CPPU0.05 mg/L，pH值为6.0；
（3）茎节上侧芽诱导丛生芽培养：将步骤（2）中的获得的杜鹃兰丛生假鳞茎横切成单个假鳞茎，并将假鳞茎切成带1个茎节的茎段，统计增殖系数为21.32；将切好的茎段接入侧芽诱导丛生芽培养基中，暗培养3 天，在弱光下培养7 天，芽基部和茎段节间上长出芽点，20 天长出丛生芽；
所述侧芽诱导丛生芽培养基为1/3MS+6-BA0.5 mg/L+TDZ0.3 mg/L+ CPPU0.05mg/L +NAA0.1 mg/L +蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（4）假鳞茎诱导培养：步骤（3）中的丛生芽培养10天时，在超净工作台上，加入步骤（2）中灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，诱导丛生芽长出丛生假鳞茎，60 天时假鳞茎长大长长；
重复步骤（3）和（4），可大幅提高杜鹃兰的增殖系数；
步骤（1）、（2）、（3）、（4）的培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为12 h/d，光照强度为1000 Lx。

Claims (4)

1.一种以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）杜鹃兰原球茎诱导丛生芽培养：在超净工作台上，将杜鹃兰无菌播种获得的原球茎接入丛生芽诱导培养基中培养，10～15 天时原球茎陆续长出芽，30 天时获得丛生芽，增殖系数为3.0～5.2；
所述原球茎诱导丛生芽培养基为：1/3MS+KT0.1～1.0 mg/L+DA-60.1～1.0 mg/L+CPPU0.05～0.5 mg/L +IBA0.01～0.2 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（2）假鳞茎及其增节拔节诱导培养：在超净台上，在步骤（1）的丛生芽中加入灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，12～16天时，芽基部形成假鳞茎，30 天时，假鳞茎长大长长，节的数量为2～6节，节与节的距离变长；
所述假鳞茎及其增节拔节诱导剂为：GA0.1～2.0 mg/L+BR0.01～0.5 mg/L+ CPPU0.01～0.1 mg/L，pH值为6.0；
（3）茎节上侧芽诱导丛生芽培养：将步骤（2）中的获得的杜鹃兰丛生假鳞茎横切成单个假鳞茎，并将假鳞茎切成带1个茎节的茎段，统计增殖系数为8.1～21.32；将切好茎段分别接入到侧芽诱导丛生芽培养基中，暗培养3天，在弱光下培养7天，芽基部和茎段节间上长出芽点，20 天时长出丛生芽；
所述侧芽诱导丛生芽培养基为：1/3MS+6-BA0.1～1.0 mg/L+TDZ 0.01～0.5 mg/L+CPPU0.01～0.1 mg/L +NAA0. 05～0.5 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0；
（4）假鳞茎诱导培养：步骤（3）中的丛生芽培养10天，在超净工作台上，加入步骤（2）中灭菌过的假鳞茎及其增节拔节诱导剂，诱导丛生芽长出丛生假鳞茎，60 天时假鳞茎长大长长；
重复步骤（3）和（4），可大幅提高杜鹃兰的增殖系数；
步骤（1）、（2）、（3）、（4）的培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为12 h/d，光照强度为1000 Lx。
2.根据权利要求1所述的以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法，其特征在于：
步骤（1）所述原球茎诱导丛生芽培养基为：1/3MS+KT0.5 mg/L+DA-60.5 mg/L+CPPU0.3 mg/L +IBA0.08 mg/L+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0。
3.根据权利要求1所述的以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法，其特征在于：
步骤（2）所述假鳞茎及其增节拔节诱导剂为：GA1.0 mg/L+BR0.3 mg/L+ CPPU0.05 mg/L，pH值为6.0。
4.根据权利要求1所述的以杜鹃兰假鳞茎增节拔节提高增殖系数的方法，其特征在于：
步骤（3）所述侧芽诱导丛生芽培养基为1/3MS+6-BA0.5 mg/L+TDZ0.3 mg/L+ CPPU0.05mg/L +NAA0.1 mg/L +蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.0。
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