CN113607863B - 一种他替瑞林有关物质的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种他替瑞林有关物质的高效液相色谱检测方法，属于药物分析技术领域。本发明提供的一种他替瑞林有关物质的高效液相色谱检测方法，色谱条件为：以直链淀粉‑三(3,5‑二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂，以正己烷‑无水乙醇‑碱50～70:30～50:0.005～0.02为流动相；进行流速梯度洗脱。本发明方法简单，操作简便，本发明的高效液相色谱法，能实现杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ与他替瑞林的分离，且分离度良好，均实现基线分离，能有效保证他替瑞林的产品质量，保证用药安全。

Description

一种他替瑞林有关物质的高效液相色谱检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种他替瑞林有关物质的高效液相色谱检测方法。
背景技术
他替瑞林是一种垂体激素释放兴奋药，由Tanabe Seiyaku(日本)公司研制开发，2000年9月首次在日本上市，是目前临床用于改善脊髓小脑变性患者的运动失调最为有效的药物。
申请号为2020102631206的专利“一种他替瑞林的合成方法”公开了如下合成路线：
Figure BDA0003260795500000011
该合成路线以SM1、SM2化合物为起始物料，选择性地脱去Boc基团与Trt基团，最终制得他替瑞林。申请人经过研究发现该合成路线会产生如下工艺杂质：
Figure BDA0003260795500000012
因此，提供一种他替瑞林有关物质的检测方法，能对上述杂质进行测定，从而有效保证他替瑞林产品质量，保证用药安全，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是：提供一种他替瑞林有关物质的检测方法，能对杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ、以及上述杂质的盐和溶剂化物进行检测，操作简便，结果准确。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的一种他替瑞林有关物质的高效液相色谱检测方法，色谱条件为：以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂，以正己烷-无水乙醇-碱50～70:30～50:0.005～0.02为流动相；按下表规定进行流速梯度洗脱：
时间min 流速ml/min
0 0.4～0.6
23 0.4～0.6
23.01 1.0～1.2
55 1.0～1.2
55.01 0.4～0.6
75 0.4～0.6
；所述有关物质包括以下化合物、或其盐或溶剂化物中的至少一种：
Figure BDA0003260795500000021
本发明的部分实施方案中，所述盐为有机盐或无机盐，优选为三氟酸乙酸盐、盐酸盐或硫酸盐；或/和所述溶剂化物为水合物。
本发明的部分实施例中，采用上述色谱条件对杂质Ⅰ三氟乙酸盐、杂质Ⅱ三氟乙酸盐、杂质Ⅴ三氟乙酸盐和杂质Ⅵ三氟乙酸盐进行检测，结果发现上述杂质与他替瑞林/他替瑞林三氟乙酸盐均能有效分离，且分离度良好。
本发明的高效液相色谱方法中，杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的盐、溶剂化物与游离碱的色谱行为一致，因此，本发明的方法可用于杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ或其盐或溶剂化物的检测。
本发明的部分实施方案中，所述碱为有机碱，优选地，为三乙胺或二乙胺；更优选为二乙胺。
本发明的部分实施方案中，所述流动相为正己烷-无水乙醇-碱55～65:35～45:0.008～0.015。
优选地，所述流动相为正己烷-无水乙醇-碱60:40:0.01。
本发明的部分实施方案中，按下表规定进行流速梯度洗脱：
时间min 流速ml/min
0 0.5
23 0.5
23.01 1.1
55 1.1
55.01 0.5
75 0.5
本发明的部分实施方案中，采用紫外检测器，检测波长为210nm。
本发明的部分实施方案中，色谱柱柱温为30-60℃；优选地，色谱柱柱温为35℃。
本发明的部分实施方案中，所述检测方法包括以下步骤：
步骤1.制备供试品溶液：取他替瑞林适量，加无水乙醇溶解后，用流动相稀释，制成浓度为1～4mg/ml的供试品溶液；
步骤2.制备杂质定位溶液：分别取他替瑞林、杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅴ对照品和杂质Ⅵ对照品各适量，置于同一容器中，加无水乙醇溶解，用流动相稀释，制成杂质定位溶液，所述杂质定位溶液中，他替瑞林浓度为1～4mg/ml，杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅴ对照品和杂质Ⅵ对照品的浓度均为5～20μg/ml；
步骤3.精密量取供试品溶液和杂质定位溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品色谱图中如有杂质峰，按峰面积归一化法计算。
本发明的部分实施方案中，所述供试品溶液的浓度为2mg/ml。
本发明的部分实施方案中，所述杂质定位溶液中，他替瑞林浓度为2mg/ml，杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅴ对照品和杂质Ⅵ对照品的浓度均为10μg/ml。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法简单，操作简便，本发明的高效液相色谱法，能实现杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ与他替瑞林的分离，且分离度良好，均实现基线分离，能有效保证他替瑞林的产品质量，保证用药安全。
附图说明
附图1为杂质Ⅰ的UV图；
附图2为杂质Ⅱ的UV图；
附图3为杂质Ⅴ的UV图；
附图4为杂质Ⅵ的UV图；
附图5为他替瑞林的UV图；
附图6为实施例3的HPLC检测图；
附图7为实施例5的HPLC检测图；
附图8为实施例6的HPLC检测图；
附图9为对比例1的HPLC图；
附图10为对比例2的HPLC图；
附图11为对比例3的HPLC图；
附图12为对比例4的HPLC图；
附图13为对比例5的HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1
本实施例公开了本发明的检测方法中检测波长的考察，具体为：
1.他替瑞林供试品溶液：精密称取他替瑞林1mg，置10ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取1ml贮备液，置10ml量瓶中，加无水乙醇4ml，加正己烷-无水乙醇-二乙胺(60:40:0.01)稀释至刻度。
2.杂质Ⅰ溶液：精密称取杂质Ⅰ1mg，置10ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；取2ml贮备液，置10ml量瓶中，加入正己烷-无水乙醇-二乙胺(60:40:0.01)2ml，摇匀。
按杂质I溶液的制备方法制备杂质Ⅱ溶液、杂质Ⅴ溶液、杂质Ⅵ溶液。
分别取上述溶液，用紫外分光光度计进行全波长(190～400nm)扫描，结果如附图1-5所示。
结论：由附图1-5可知，他替瑞林、杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ在190～400nm波长范围内，均为末端吸收，在210nm波长处均有较大吸收，因此本发明方法的检测方法波长为210nm。
实施例2
按实施例1的他替瑞林供试品溶液的制备方法制备他替瑞林三氟乙酸盐供试品溶液；
按实施例1的杂质I溶液的制备方法制备杂质I三氟乙酸盐溶液、杂质Ⅱ三氟乙酸盐溶液、杂质Ⅴ三氟乙酸盐溶液、杂质Ⅵ三氟乙酸盐溶液。
分别取上述溶液，用紫外分光光度计进行全波长(190～400nm)扫描，结果发现，他替瑞林三氟乙酸盐、杂质I三氟乙酸盐、杂质Ⅱ三氟乙酸盐、杂质Ⅴ三氟乙酸盐、杂质Ⅵ三氟乙酸盐的UV图与其游离碱一致，因此，他替瑞林三氟乙酸盐、杂质I三氟乙酸盐、杂质Ⅱ三氟乙酸盐、杂质Ⅴ三氟乙酸盐、杂质Ⅵ三氟乙酸盐检测方法波长也设置为210nm。
实施例3
本实施例公开了本发明的高效液相色谱检测法，具体为：
1.供试品溶液取他替瑞林约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇5ml超声溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀。
2.杂质储备液取杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ三的对照品各约10mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，用无水乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。
3.杂质定位溶液取他替瑞林约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加无水乙醇4ml溶解，加入杂质储备液1ml，用流动相稀释至刻度，摇匀。
色谱条件：用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂(CHIRALPAK AD-H，4.6×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)；以正己烷-无水乙醇-二乙胺(60:40:0.01)为流动相；按下表进行流速梯度洗脱；柱温为35℃；检测波长为210nm；进样体积为10μl。
时间(分钟) 流速(ml/min)
0 0.5
23 0.5
23.01 1.1
55 1.1
55.01 0.5
75 0.5
系统适用性要求杂质定位溶液中，杂质Ⅰ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ、杂质Ⅱ依次出峰。
测定法精密量取供试品溶液、杂质定位溶液、空白溶剂，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果如附图6所示，由试验结果可知：混合杂质中各杂质均能分开，空白溶剂不干扰杂质的检出。
实施例4
本实施例公开了本发明的高效液相色谱检测法，具体为：
1.供试品溶液：按实施例3的供试品溶液的制备方法制备。
2.杂质定位溶液：按实施例3的杂质定位溶液的制备方法制备，区别在于将杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ分别替换为杂质I三氟乙酸盐、杂质Ⅱ三氟乙酸盐、杂质Ⅴ三氟乙酸盐、杂质Ⅵ三氟乙酸。
色谱条件、测定方法同实施例3。
结果发现，混合杂质中各杂质均能分开，空白溶剂不干扰杂质的检出；且杂质I三氟乙酸盐、杂质Ⅱ三氟乙酸盐、杂质Ⅴ三氟乙酸盐、杂质Ⅵ三氟乙酸的出峰位置分别与杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ相对应。本发明方法中杂质I、杂质Ⅱ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ与其盐的色谱行为一致。
实施例5
本实施例公开了本发明的高效液相色谱检测法，其色谱条件为：
以正己烷-无水乙醇-二乙胺(58:42:0.01)为流动相；按下表进行流速梯度洗脱；
Figure BDA0003260795500000061
Figure BDA0003260795500000071
其余条件同实施例2。
结果如附图7显示，混合杂质中各杂质均能分开，空白溶剂不干扰杂质的检出。
实施例6
本实施例公开了本发明的高效液相色谱检测法，其色谱条件为：
以正己烷-无水乙醇-二乙胺(62:38:0.01)为流动相；按下表进行流速梯度洗脱；
时间min 流速ml/min
0 0.5
23 0.5
23.01 1.1
55 1.1
55.01 0.5
75 0.5
其余条件同实施例2。
结果如附图8显示，混合杂质中各杂质均能分开，空白溶剂不干扰杂质的检出。
实施例7
本实施例公开了本发明的杂质I及其盐的制备方法，其合成路线为：
Figure BDA0003260795500000081
具体制备方法为：将30.0g SM1加入至反应瓶中，加入300mL DCM，开启搅拌。降温至0～5℃，加入11.8g N-甲基吗啉。加入22.4g TBTU，加入6.7g D-脯氨酰胺。保持0～5℃搅拌反应10小时。停止反应，滴加入300mL水，搅拌20min，静置分层。收集下层溶液，浓缩至干，得泡沫状固体。将浓缩剩余物溶解入90mL乙酸乙酯，滴加入900mL搅拌下的正庚烷中，析出固体。滴毕，搅拌40min，过滤，滤饼用90mL正庚烷洗涤抽干。将滤饼于40℃减压干燥5小时得到白色固体35.9g中间体1杂质I。
取35.0g中间体1杂质I加入至反应瓶中，加入175mL乙酸乙酯，搅拌溶解。降温至0～10℃，通入氯化氢气体，直至TLC反应完全。过滤，90mL乙酸乙酯洗涤滤饼，滤饼25℃减压干燥得白色固体27.9g中间体2杂质I。
将8.1g SM3加入至反应瓶中，加入250mL二氯甲烷，开启搅拌。降温至0～5℃，加入14.3g N-甲基吗啉、18.2g TBTU、25.0g中间体2杂质I(1901-200401-中间体2杂质I)，0～10℃搅拌反应22小时。停止反应，滴加入250mL水，搅拌，静置分层。下层有机相依次用250mL5％柠檬酸溶液、250mL 5％碳酸氢钠溶液、250mL10％氯化钠溶液各洗涤一次。布氏漏斗垫少量活性炭过滤有机相，滤液减压浓缩至干，得泡沫状固体。将浓缩剩余物溶解入60mL二氯甲烷中，滴加入搅拌下的300mL甲基叔丁基醚中，滴毕，搅拌1.5小时。过滤，滤饼用60mL甲基叔丁基醚洗涤抽干。滤饼减压干燥，得12.5g白色固体，即中间体3杂质I。
将10.0g中间体3杂质I加入至反应瓶中，加入30mL二氯甲烷，开启搅拌。降温至0～10℃，加入2.8g三异丙基硅烷，滴加30mL三氟乙酸，滴毕，控制温度15～20℃搅拌反应至终点。降温至0～10℃，滴加入60mL乙酸乙酯，滴加入180mL甲基叔丁基醚。滴毕，搅拌1小时，过滤，30mL甲基叔丁基醚洗涤滤饼，抽干。将滤饼减压干燥得白色固体，即杂质I三氟乙酸盐6.4g。
杂质I三氟乙酸盐5.0g溶解入22.5ml纯化水中，加入碳酸氢钠调节pH至7～8，加入活性炭脱色，过滤，用水洗涤滤饼。将滤液上样至HP-20树脂层析柱吸附，用纯化水冲洗去除无机盐，用26.6％甲醇溶液冲洗树脂柱，收集甲醇冲洗液，树脂柱流出的液体点硅胶板，无碘吸收后停止冲洗。将收集到甲醇溶液在64℃以下减压浓缩至干，浓缩物称重。加入纯化水(浓缩物重量*3.0)，30～40℃搅拌总结，加入活性炭(0.1w/w，中间体4)搅拌脱色，过滤，纯化水洗涤，将滤液搅拌下降温至5～10℃，继续降温至0～5℃结晶3～6小时，过滤，滤饼用0～5℃丙酮洗涤抽干，湿品在室温下干燥，得到成品杂质I 4.6g。
将1.0g杂质I溶解在5ml水中，加入1ml浓盐酸，搅拌1小时，缓慢滴加到20ml丙酮中，析出大量固体，过滤，丙酮洗涤，干燥得到杂质I盐酸盐1.1g。
1ml浓硫酸溶解在5ml水中，将1.0g杂质I加入，搅拌1小时，缓慢滴加到20ml丙酮中，析出大量固体，过滤，丙酮洗涤，干燥得到杂质I硫酸盐1.2g。
参照本实施例的方法，可以制得杂质I的其他盐。
实施例8
本实施例公开了本发明的杂质II及其盐的制备方法，其合成路线为：
Figure BDA0003260795500000101
操作过程为：将25.08g Boc-D-His(Trt)-OH加入至反应瓶中，加入250mL DCM，开启搅拌。加入5.72g SM2，降温至0～5℃，加入10.2g N-甲基吗啉。加入19.33g TBTU，保持6～9℃搅拌反应16小时。停止反应，滴加入250mL水，搅拌1小时。静置，分层，上层水相废液处理。下层有机相用依次用250mL 5％柠檬酸溶液、250mL 8％碳酸氢钠溶液、250mL25％氯化钠溶液各洗涤一次。将有机相用30.4g无水硫酸钠干燥，过滤。滤液39℃减压浓缩至干，得脆性泡沫状固体。
将浓缩剩余物溶解入75mL乙酸乙酯，滴加入750mL搅拌下的正庚烷中，析出固体。滴毕，搅拌30min，过滤，滤饼用50mL正庚烷洗涤抽干。将滤饼于60℃减压干燥7小时得到白色固体29.4g，即中间体1杂质II。
取26.50g中间体1杂质II加入至反应瓶中，加入265mL乙酸乙酯，搅拌溶解。降温至0～10℃，通入氯化氢气体，直至TLC反应完全。过滤，100mL乙酸乙酯洗涤滤饼，滤饼室温减压干燥得白色固体22.21g中间体2杂质II。
将4.92g SM3加入至反应瓶中，加入150mL二氯甲烷，开启搅拌。降温至0～5℃，加入14.32g N-甲基吗啉、18.23g TBTU、15.02g中间体2杂质II，3～12℃搅拌反应19小时。停止反应，滴加入150mL水，搅拌，静置分层。下层有机相依次用150mL 5％柠檬酸溶液、150mL5％碳酸氢钠溶液、150mL10％氯化钠溶液各洗涤一次。布氏漏斗垫少量硅藻土过滤有机相，滤液减压浓缩至干，得泡沫状固体。将浓缩剩余物溶解入40mL二氯甲烷中，滴加入搅拌下的200mL甲基叔丁基醚中，滴毕，搅拌0.5小时。过滤，滤饼用50mL甲基叔丁基醚洗涤抽干。滤饼减压干燥，得白色固体，即中间体3杂质II。
将7.1g中间体3杂质II加入至反应瓶中，加入14mL二氯甲烷，开启搅拌。加入1.9g三异丙基硅烷，降温至0～10℃，滴加14mL三氟乙酸，滴毕，控制温度15～25℃搅拌反应至终点。降温至0～10℃，滴加入14mL乙酸乙酯，滴加入168mL甲基叔丁基醚。滴毕，搅拌1小时，过滤，80mL甲基叔丁基醚洗涤滤饼，抽干得滤饼1；反应瓶壁上有许多粘稠物，加入50mL乙酸乙酯，室温搅拌过夜，过滤，滤饼用30mL乙酸乙酯洗涤抽干，得滤饼2。将滤饼减压干燥得白色固体，即杂质II三氟乙酸盐5.2g。
杂质II三氟乙酸盐4.0g溶解入18.0ml纯化水中，加入碳酸氢钠调节pH至7～8，加入活性炭脱色，过滤，用水洗涤滤饼。将滤液上样至HP-20树脂层析柱吸附，用纯化水冲洗去除无机盐，用26.6％甲醇溶液冲洗树脂柱，收集甲醇冲洗液，树脂柱流出的液体点硅胶板，无碘吸收后停止冲洗。将收集到甲醇溶液在64℃以下减压浓缩至干，浓缩物称重。加入纯化水(浓缩物重量*3.0)，30～40℃搅拌总结，加入活性炭(0.1w/w，中间体4)搅拌脱色，过滤，纯化水洗涤，将滤液搅拌下降温至5～10℃，继续降温至0～5℃结晶3～6小时，过滤，滤饼用0～5℃丙酮洗涤抽干，湿品在室温下干燥，得到成品杂质II 3.8g。
将1.0g杂质II溶解在5ml水中，加入1ml浓盐酸，搅拌1小时，缓慢滴加到20ml丙酮中，析出大量固体，过滤，丙酮洗涤，干燥得到杂质II盐酸盐1.1g。
1ml浓硫酸溶解在5ml水中，将1.0g杂质II加入，搅拌1小时，缓慢滴加到20ml丙酮中，析出大量固体，过滤，丙酮洗涤，干燥得到杂质II硫酸盐1.2g。
参照本实施例的方法，可以制得杂质II的其他盐。
实施例9
本实施例公开了杂质V及其盐的制备方法，其合成路线为：
Figure BDA0003260795500000121
操作过程为：将27.01g中间体1杂质I加入至反应瓶中，加入540mL乙酸乙酯，开启搅拌。控制温度0～10℃，通入氯化氢气体，原料完全消失。控制温度0～10℃，抽真空去除氯化氢气体1小时，固体全部粘附于瓶壁，倾倒出清液。向剩余物中加入300mL乙酸乙酯，开启搅拌，室温搅拌过夜。过滤，滤饼用50mL乙酸乙酯洗涤抽干。滤饼室温减压干燥3小时，得到24.18g中间体2杂质I。
将2.0g 1-甲基-D-4,5-二氢乳清酸加入至反应瓶中，加入60mL二氯甲烷，开启搅拌。降温至0～5℃，加入3.68g N-甲基吗啉、4.46g TBTU、6.18g中间体2杂质I，3～12℃搅拌反应14小时。停止反应，滴加入60mL水，搅拌，静置分层。下层有机相依次用60mL 5％柠檬酸溶液、60mL 5％碳酸氢钠溶液、60mL25％氯化钠溶液各洗涤一次。有机相用10.64g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得泡沫状固体。将浓缩剩余物溶解入16mL二氯甲烷中，滴加入搅拌下的80mL甲基叔丁基醚中，滴毕，搅拌0.5小时。过滤，滤饼用5mL甲基叔丁基醚洗涤抽干。滤饼减压干燥，得白色固体3.9g，即中间体3杂质V。
取2.8g中间体3杂质V加入至反应瓶中，加入8.4mL二氯甲烷，开启搅拌。降温至0～10℃，加入1.0mL三异丙基硅烷，滴加8.4mL三氟乙酸。滴毕，10～20℃搅拌反应3小时，反应完全。滴加入16.8mL乙酸乙酯，滴加入50.4mL甲基叔丁基醚，析出固体。滴毕，搅拌1小时，过滤，滤饼减压干燥得到白色固体，即杂质V三氟乙酸盐2.0g。
杂质V三氟乙酸盐1.8g溶解入8.1ml纯化水中，加入碳酸氢钠调节pH至7～8，加入活性炭脱色，过滤，用水洗涤滤饼。将滤液上样至HP-20树脂层析柱吸附，用纯化水冲洗去除无机盐，用26.6％甲醇溶液冲洗树脂柱，收集甲醇冲洗液，树脂柱流出的液体点硅胶板，无碘吸收后停止冲洗。将收集到甲醇溶液在64℃以下减压浓缩至干，浓缩物称重。加入纯化水(浓缩物重量*3.0)，30～40℃搅拌总结，加入活性炭(0.1w/w，中间体4)搅拌脱色，过滤，纯化水洗涤，将滤液搅拌下降温至5～10℃，继续降温至0～5℃结晶3～6小时，过滤，滤饼用0～5℃丙酮洗涤抽干，湿品在室温下干燥，得到成品杂质V1.3g。
将0.5g杂质V溶解在2.5ml水中，加入0.5ml浓盐酸，搅拌1小时，缓慢滴加到10ml丙酮中，析出大量固体，过滤，丙酮洗涤，干燥得到杂质V盐酸盐0.5g。
0.5ml浓硫酸溶解在2.5ml水中，将0.5g杂质V加入，搅拌1小时，缓慢滴加到10ml丙酮中，析出大量固体，过滤，丙酮洗涤，干燥得到杂质V硫酸盐0.6g。
参照本实施例的方法，可以制得杂质V的其他盐。
实施例10
本实施例公开了本发明的杂质VI及其盐的制备，其合成路线为：
Figure BDA0003260795500000141
操作过程为：将50mL丙酮加入至反应瓶中，降温至0～10℃。通入氯化氢气体(72mL浓盐酸滴加入100mL浓硫酸中产生氯化氢气体，通过浓硫酸干燥制备)制备得到氯化氢丙酮溶液。将10.0g中间体1杂质杂质II加入至氯化氢丙酮溶液中，控制温度0～10℃反应完全。20℃以下减压浓缩去除溶剂，加入100mL乙酸乙酯，控制温度0～15℃搅拌1小时。过滤，滤饼用30mL乙酸乙酯洗涤抽干。滤饼室温减压干燥10小时，得到9.40g中间体2杂质杂质II。
将3.0g 1-甲基-D-4,5-二氢乳清酸加入至反应瓶中，加入90mL二氯甲烷，开启搅拌。降温至0～5℃，加入5.49g N-甲基吗啉、6.66g TBTU、9.36g中间体2杂质II，6～9℃搅拌反应17小时。停止反应，滴加入90mL水，搅拌，静置分层。下层有机相依次用90mL 5％柠檬酸溶液、90mL 5％碳酸氢钠溶液、90mL25％氯化钠溶液各洗涤一次。有机相用17.49g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得泡沫状固体。将浓缩剩余物溶解入24mL二氯甲烷中，滴加入搅拌下的120mL甲基叔丁基醚中，滴毕，搅拌0.5小时。过滤，滤饼用30mL甲基叔丁基醚洗涤抽干。滤饼减压干燥，得白色固体7.2g，即中间体3杂质VI。
取5.4g中间体3杂质VI加入至反应瓶中，加入16.2mL二氯甲烷，开启搅拌。降温至0～10℃，加入1.8mL三异丙基硅烷，滴加16.2mL三氟乙酸。滴毕，10～20℃搅拌反应3.5小时，反应完全。滴加入32.4mL乙酸乙酯，滴加入97.2mL甲基叔丁基醚，析出固体。滴毕，搅拌1小时，过滤，滤饼减压干燥得到白色固体，即杂质VI三氟乙酸盐4.2g。
杂质VI三氟乙酸盐5.0g溶解入22.5ml纯化水中，加入碳酸氢钠调节pH至7～8，加入活性炭脱色，过滤，用水洗涤滤饼。将滤液上样至HP-20树脂层析柱吸附，用纯化水冲洗去除无机盐，用26.6％甲醇溶液冲洗树脂柱，收集甲醇冲洗液，树脂柱流出的液体点硅胶板，无碘吸收后停止冲洗。将收集到甲醇溶液在64℃以下减压浓缩至干，浓缩物称重。加入纯化水(浓缩物重量*3.0)，30～40℃搅拌总结，加入活性炭(0.1w/w，中间体4)搅拌脱色，过滤，纯化水洗涤，将滤液搅拌下降温至5～10℃，继续降温至0～5℃结晶3～6小时，过滤，滤饼用0～5℃丙酮洗涤抽干，湿品在室温下干燥，得到成品杂质VI 4.4g。
将1.0g杂质I溶解在5ml水中，加入1ml浓盐酸，搅拌1小时，缓慢滴加到20ml丙酮中，析出大量固体，过滤，丙酮洗涤，干燥得到杂质I盐酸盐1.0g。
1ml浓硫酸溶解在5ml水中，将1.0g杂质I加入，搅拌1小时，缓慢滴加到20ml丙酮中，析出大量固体，过滤，丙酮洗涤，干燥得到杂质I硫酸盐1.1g。参照本实施例的方法，可以制得杂质VI的其他盐。
对比例1
本对比例中，色谱条件为：色谱柱：
Figure BDA0003260795500000151
Y34.6×250mm，5μm；
波长210nm，柱温50℃，进样体积10μl，流速0.4ml/min；
稀释剂：流动相
供试品：5mg/ml(他替瑞林三氟乙酸盐)
流动相：正己烷-乙醇-异丙醇-甲酸-二乙胺(40:30:30:0.05:0.05)
其余条件同实施例3。
结果如附图9所示，杂质Ⅰ三氟乙酸盐、杂质Ⅱ三氟乙酸盐、杂质Ⅴ三氟乙酸盐、杂质Ⅵ三氟乙酸盐不能有效分离，且色谱柱批间差异大，本对比例的方法不采用。
对比例2
本对比例中，色谱柱为：CHIRALPAK AY-H 4.6×250mm，5μm；
波长210nm，柱温50℃，进样体积10μl，流速0.4ml/min；
流动相：正己烷-乙醇-异丙醇-甲酸-二乙胺(40:30:30:0.05:0.05)；
稀释剂：乙醇-流动相(1:1)；
供试品：5mg/ml(他替瑞林三氟乙酸盐)
其余条件同实施例3。
结果如附图10所示，杂质Ⅰ三氟乙酸盐、杂质Ⅱ三氟乙酸盐、杂质Ⅴ三氟乙酸盐、杂质Ⅵ三氟乙酸盐出峰靠前，且分不开，本对比例的方法不采用。
对比例3
本对比例中，色谱柱为：CHIRALPAK AD-H 4.6×250mm，5μm；
波长210nm，柱温35℃，进样体积10μl，流速0.8ml/min；
流动相：正己烷-乙醇-二乙胺(60:40)；
稀释剂：乙醇-流动相(1:1)；
供试品：5mg/ml(他替瑞林)
其余条件同实施例3。
结果如附图11所示，他替瑞林的峰宽太宽，本对比例的方法不采用。
对比例4
本对比例中，色谱柱为：CHIRALPAK AD-H 4.6×250mm，5μm；
波长210nm，柱温35℃，进样体积10μl，流速0.5ml/min
流动相：正己烷-乙醇-甲酸-二乙胺(60:40：0.01:0.01)
稀释剂：乙醇-流动相(1:1)
供试品：2mg/ml(他替瑞林)
其余条件同实施例3。
结果如附图12所示，混合杂质中各杂质均未达到基线分离，他替瑞林出峰太晚，本对比例的方法不采用。
对比例5
本对比例中，色谱柱为：CHIRALPAK AD-H 4.6×250mm，5μm
波长210nm，柱温35℃，进样体积10μl，
流动相：正己烷-乙醇-甲酸-二乙胺(60:40:0.01:0.01)
流速见下表
时间(分钟) 流速(ml/min)
0 0.5
23 0.5
23.01 1.1
55 1.1
55.01 0.5
75 0.5
稀释剂：乙醇-流动相(1:1)
其余条件同实施例3。
结果如附图13所示，混合杂质出峰位置有峰干扰，本对比例的方法不采用。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种他替瑞林有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，色谱条件为：以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅胶为填充剂，以正己烷-无水乙醇-碱58～62:38～42:0.01为流动相；按下表规定进行流速梯度洗脱：
时间min 流速ml/min 0 0.5 23 0.5 23.01 1.1 55 1.1 55.01 0.5 75 0.5
；
所述有关物质包括以下化合物、或其盐或其溶剂化物中的至少一种：
Figure FDA0004033417820000011
所述碱为三乙胺或二乙胺。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述盐为有机盐或无机盐；或/和所述溶剂化物为水合物。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述盐为三氟乙酸盐、盐酸盐或硫酸盐。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述碱为二乙胺。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相为正己烷-无水乙醇-碱60:40:0.01。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，采用紫外检测器，检测波长为210nm。
7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，色谱柱柱温为30-60℃。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，色谱柱柱温为35℃。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.制备供试品溶液：取他替瑞林适量，加无水乙醇溶解后，用流动相稀释，制成浓度为1～4mg/ml的供试品溶液；
步骤2.制备杂质定位溶液：分别取他替瑞林、杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅴ对照品和杂质Ⅵ对照品各适量，置于同一容器中，加无水乙醇溶解，用流动相稀释，制成杂质定位溶液，所述杂质定位溶液中，他替瑞林浓度为1～4mg/ml，杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅴ对照品和杂质Ⅵ对照品的浓度均为5～20μg/ml；
步骤3.精密量取供试品溶液和杂质定位溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品色谱图中如有杂质峰，按峰面积归一化法计算。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的浓度为2mg/ml。
11.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述杂质定位溶液中，他替瑞林浓度为2mg/ml，杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅴ对照品和杂质Ⅵ对照品的浓度均为10μg/ml。
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