CN113599427A - 具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法及其应用 - Google Patents

具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法,包括:将陈皮原料进行干燥和粉碎,得到陈皮粉,所述干燥的温度为100℃‑150℃,所述干燥的时间为2h‑5h;所述陈皮粉置于碱性溶液进行提取,经过滤得到陈皮提取液;所述陈皮提取液经冷冻干燥后得到具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物。本申请提供的制备方法可以制得具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物,其能够有效抑制冠状病毒的复制,具有抗病毒活性,在抗病毒领域具有广泛的应用前景。本申请还提供了具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物在制备预防或治疗冠状病毒感染的产品中的应用。

Description

具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法及其 应用
技术领域
本申请涉及生物医学领域,特别涉及具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法及其应用。
背景技术
冠状病毒属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属(Coronavirus),是自然界广泛存在的一大类线性单股正链的RNA病毒,其直径约80~120nm。冠状病毒能够感染脊椎动物,例如人、鼠、猪、猫、犬等。冠状病毒进入机体后能够进行大量的复制,并诱导宿主产生免疫-炎症反应。在冠状病毒感染早期,常伴有低热、咳嗽、乏力等症状,重症患者可出现呼吸困难、低氧血症,并进展为急性呼吸窘迫综合征及多器官功能衰竭。
目前,针对冠状病毒感染尚无有效的治疗方法,因此机体只能够依靠疫苗来预防冠状病毒感染。然而,任何一款疫苗的保护力很难能够达到100%,人体在接种了疫苗之后仍有感染的风险;再加上冠状病毒具有较高的突变率,使得疫苗的研发受到较大的挑战。此外,临床研究发现具有抗病毒活性的化学药物在针对冠状病毒感染过程中也未取得理想疗效,且这类抗病毒的化学药物具有较大的副作用。因此,研发出一款具有较强抗病毒活性且副作用小的药物显得迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此,本申请提供了一种具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法,该陈皮提取物毒性小、副作用小、抗病毒活性强,能够有效抑制冠状病毒的复制,在抗病毒领域,尤其是预防或治疗冠状病毒感染方向具有广泛的应用前景。
第一方面,本申请提供了一种具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法,包括:
将陈皮原料进行干燥和粉碎,得到陈皮粉,所述干燥的温度为100℃~150℃,所述干燥的时间为2h~5h;
所述陈皮粉置于碱性溶液进行提取,经过滤得到陈皮提取液;
所述陈皮提取液经冷冻干燥后得到具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物。
可选的,所述碱性溶液的pH大于7且小于12。
可选的,所述陈皮粉和所述碱性溶液的质量比为1:(10~20)。
可选的,所述提取的温度为60℃~100℃,所述提取的时间为20min~60min。
可选的,所述冷冻干燥包括在-80℃~-20℃进行速冻处理20min-60min,再在-80℃~-60℃的条件下进行冻干处理6h~8h。
可选的,所述陈皮粉的粒径小于8目。
可选的,所述陈皮提取物包括橘皮素、新橙皮苷、橙皮苷、橙皮素、5,7,8,4’-四甲氧基黄酮、3,3’,4’,5,6,7,8-七甲氧基黄酮、去甲基川陈皮素和川陈皮素中的至少一种。
可选的,所述碱性溶液为通过向水溶液中滴加碱液获得。
可选的,所述陈皮提取物能够抑制冠状病毒复制。
可选的,所述陈皮提取物的IC50浓度为3mg/mL~5mg/mL。
第二方面,本申请提供了第一方面所述的制备方法制得的具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物在制备预防或治疗冠状病毒感染的产品中的应用。
可选的,所述产品包括食品、药品和保健品中的至少一种。
本申请提供的制备方法简单,操作方便,可以制得具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物,该陈皮提取物毒性小、副作用小、抗病毒活性强,能够有效抑制冠状病毒的复制,在抗病毒领域,尤其是预防或治疗冠状病毒感染方向具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请一实施方式提供的一种具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法的流程图。
图2为实施例和对比例提供的陈皮提取物中活性成分含量对比图。
图3为实施例提供的陈皮提取物对Huh-7细胞的毒性检测图。
图4为实施例和对比例提供的陈皮提取物对HCoV-229E病毒感染的作用浓度-抑制率曲线。
图5为实施例提供的陈皮提取物对HCoV-229E病毒感染诱导的细胞病变免疫荧光图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
请参阅图1,为本申请一实施方式提供的一种具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法的流程图,包括:
S101:将陈皮原料进行干燥和粉碎,得到陈皮粉,干燥的温度为100℃~150℃,干燥的时间为2h~5h。
S102:陈皮粉置于碱性溶液进行提取,经过滤得到陈皮提取液。
S103:陈皮提取液经冷冻干燥后得到具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物。
在本申请中,在提取之前将陈皮进行粉碎并在高温下进行干燥,同时在提取中采用碱性溶液,极大地提高了陈皮提取物中活性成分的含量;相比于直接进行提取的工艺,本申请提供的制备方法使得陈皮提取物中活性成分的含量提高了近一倍,从而提高了陈皮提取物抑制冠状病毒的活性,更有利于其应用。
在本申请实施方式中,陈皮原料为广陈皮。具体的,陈皮原料产自广东新会天马产区。在本申请实施方式中,陈皮原料陈化时间不小于3年,从而有利于陈皮中活性成分的提取。进一步的,陈皮原料陈化时间不小于5年。
在本申请中,陈皮原料在粉碎前先进行干燥处理,既有利于后续粉碎的进行,同时还可以提高提取过程中抗病毒活性成分的提取量。在本申请中,干燥的温度为100℃~150℃,干燥的时间为2h~5h。进一步的,干燥的温度为110℃~140℃,干燥的时间为2.5h~4h。更进一步的,干燥的温度为120℃~135℃,干燥的时间为3h~4h。具体的,干燥的温度可以但不限于为100℃、110℃、125℃、130℃、135℃或145℃等,干燥的时间可以但不限于为2h、2.5h、3h、3.5h、4h或5h等。在一具体实施例中,陈皮原料在120℃干燥3h。
在本申请中,通过将陈皮原料进行粉碎,从而更有利于在提取过程中陈皮活性成分的提取,提高提取率。具体的,可以但不限于通过锤式粉碎机进行粉碎。在本申请实施方式中,陈皮粉的粒径小于8目。通过将陈皮原料粉碎至粒径小于8目,更有利于陈皮粉在碱性容易中的均匀分散,从而提高陈皮提取物中抗病毒活性成分含量。进一步的,陈皮粉的粒径小于20目。具体的,陈皮粉的粒径可以但不限于小于10目、14目、16目、18目、22目或24目等。
在本申请实施方式中,碱性溶液为通过向水溶液中滴加碱液获得。具体的,水溶液包括自来水、去离子水、超纯水、双蒸水等中的至少一种,碱液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水等中的至少一种。
在本申请实施方式中,碱性溶液的pH大于7且小于12。通过在上述碱性溶液中进行陈皮提取物的提取过程,有利于增加陈皮提取物中抗病毒活性成分的含量。进一步的,碱性溶液的pH为8-11。具体的,碱性溶液的pH可以但不限于为8、8.5、9、9.5、10、11或11.5等。在一具体实施例中,碱性溶液的pH为10。
在本申请实施方式中,陈皮粉和碱性溶液的质量比为1:(10~20)。在上述范围内陈皮粉能够更好地分散在碱性溶液中,有利于提取的进行,增加陈皮提取物中活性成分含量,提高陈皮提取物的抗病毒活性。进一步的,陈皮粉和碱性溶液的质量比为1:(12~18)。更进一步的,陈皮粉和碱性溶液的质量比为1:(13~16)。具体的,陈皮粉和碱性溶液的质量比可以但不限于为1:10、1:11、1:14、1:15、1:17、1:19或1:20等。在一具体实施例中,陈皮粉和碱性溶液的质量比为1:10。
在本申请实施方式中,提取的温度为60℃~100℃,提取的时间为20min~60min。上述提取工艺可以更好地获得陈皮中的抗病毒活性成分,如黄酮类物质等,以提高陈皮提取物的抗病毒活性。进一步的,提取的温度为70℃~90℃,提取的时间为30min~50min。具体的,提取的温度可以但不限于为63℃、70℃、78℃、80℃、88℃或95℃等,提取的时间可以但不限于为20min、23min、32min、35min、40min、44min、50min或55min等。在一具体实施例中,提取的温度为100℃,提取的时间为30min。
在本申请中,提取后将混合溶液进行过滤,除去提取后的陈皮粉,获得含有抗病毒活性成分的陈皮提取液。具体的,可以通过滤网进行过滤。在本申请一实施方式中,在冷冻干燥前,还可以对陈皮提取液进行中和。进一步的,在陈皮提取液中加入酸性溶液进行中和。具体的,可以但不限于加入柠檬酸进行中和。
在本申请实施方式中,冷冻干燥包括在-80℃~-20℃进行速冻处理20min-60min,再在-80℃~-60℃的条件下进行冻干处理6h~8h。上述冷冻干燥过程有利于减少活性成分的损失,同时有利于保持活性成分的活性,提高后续制得的陈皮提取物的抗病毒活性。进一步的,冷冻干燥包括在-80℃~-40℃进行速冻处理25min-40min,再在-75℃~-65℃的条件下进行冻干处理6h~7.5h。
本申请提取的方法能够更多的富集陈皮中多酚类物质,如黄酮类物质等,提高陈皮提取物的活性,从而增强其抗病毒的效果。具体的,黄酮类物质包括橙皮苷和柚皮苷中的至少一种。在本申请实施方式中,陈皮提取物包括橘皮素、新橙皮苷、橙皮苷、橙皮素、5,7,8,4’-四甲氧基黄酮、3,3’,4’,5,6,7,8-七甲氧基黄酮、去甲基川陈皮素和川陈皮素中的至少一种。
在本申请实施方式中,陈皮提取物能够抑制冠状病毒复制。因此,陈皮提取物在预防病毒入侵机体细胞的过程中能够发挥重要的保护作用,能够成为抗击冠状病毒感染的新的干预措施。在本申请一实施例中,陈皮提取物能够抑制HCoV-229E冠状病毒在细胞内的复制,从而产生抗病毒活性,使其能够在抗病毒方面具有应用前景。
在本申请实施方式中,陈皮提取物的IC50浓度为3mg/mL~5mg/mL。具体的,陈皮提取物的IC50浓度可以但不限于为3mg/mL、3.2mg/mL、3.59mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.3mg/mL、4.5mg/mL、4.7mg/mL、4.8mg/mL或5mg/mL等。
本申请提供的制备方法简单,操作方便,可以制得具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物,该陈皮提取物毒性小、副作用小、抗病毒活性强,能够有效抑制冠状病毒的复制,在抗病毒领域,尤其是预防或治疗冠状病毒感染方向具有广泛的应用前景。
本申请还提供了上述任一实施方式得到的具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物在制备预防或治疗冠状病毒感染的产品中的应用。
在本申请实施方式中,产品包括食品、药品和保健品中的至少一种。通过将上述陈皮提取物作为食品、药品和保健品中的活性成分,使食品、药品和保健品具有抗病毒的活性。在本申请一实施例中,具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物可以作为天然药物用于预防或治疗冠状病毒感染的药品中,提高药品的安全性,降低药品的副作用。
在本申请实施方式中,产品中还包括载体,载体用于负载陈皮提取物。在本申请一实施例中,载体可以但不限于包括溶剂、聚合物和脂质体中的至少一种。在一实施例中,溶剂包括但不限于水、生理盐水,以及其他非水性溶剂。在另一实施例中,聚合物包括聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸、明胶、环糊精、海藻酸钠、白蛋白和血红蛋白中的至少一种。在又一实施例中,脂质体可以由阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇、磷脂自组装而成,也可以由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇穿插于磷脂分子形成的磷脂层中形成。在本申请中,陈皮提取物可以分散或吸附在上述载体表面或内部,形成均匀且稳定的分散体系,有利于提高产品中陈皮提取物活性成分的稳定性,从而提高产品的抗冠状病毒效果。
在本申请实施方式中,产品中还包括辅料,辅料包括稀释剂、赋形剂和稳定剂中的一种或多种。在本发明中,稀释剂的主要作用为填充片剂的重量或体积从而便于压片,稀释剂包括淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐中的一种或多种。在本发明中,赋形剂是指在产品中的除了主要药物活性成以外的附加物,赋形剂包括如片剂中的黏合剂、填充剂、润滑剂,丸剂中的酒、醋、药汁等,半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分等。在本发明中,稳定剂的主要作用是为了稳定产品中的各个成分,稳定剂可以但不限于为防腐剂、抗氧剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂等。
为了评估本申请制备得到的具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的效果,进行如下效果实施例。
实施例一种具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物制备方法
将广陈皮在120℃下干燥3h后,进行粉碎,得到陈皮粉。将陈皮粉加入至100℃的双蒸水中,并用50%的氢氧化钠溶液调节混合溶液pH值至10,同时搅拌30min,其中,陈皮粉和双蒸水的质量比为1:10。经过滤后得到陈皮提取液,将陈皮提取液置于-80℃速冻60min,再在-60℃冻干处理6h,得到具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物。
对比例一种陈皮提取物的制备方法
将广陈皮加入至100℃的双蒸水中,同时维持加热4h,其中,陈皮粉和双蒸水的质量比为1:10。经过滤后得到陈皮提取液,将陈皮提取液置于-80℃速冻60min,再在-60℃冻干处理6h,得到陈皮提取物。
对实施例和对比例制得的陈皮提取物进行LC-MS检测,对其中的黄酮类物质进行定量分析,结果如图2所示,可以看出,与对比例相比,本申请提供的制备方法可以大幅度提高陈皮提取物中活性成分的含量,获得具有更高黄酮类物质的陈皮提取物。
本申请所用的HCoV-229E株系从武汉大学医学病毒学研究所获得,Huh-7细胞购买于中国科学院细胞库(上海),并严格按照每种细胞的培养模式进行体外培养。
将实施例制得的陈皮提取物配置成不同浓度的溶液,浓度分别为0.39mg/mL、0.78mg/mL、1.56mg/mL、3.12mg/mL、6.25mg/mL、12.5mg/mL;将不同浓度的陈皮提取物溶液分别孵育Huh7细胞24h,用CCK-8法测定陈皮提取物溶液对细胞毒性,结果如图3所示,可以看出,陈皮提取物溶液不高于6.25mg/mL时,其对细胞无明显毒性。
根据细胞毒性实验,选择对细胞没有明显毒性的浓度进行抗病毒实验。将实施例和对比例制得的陈皮提取物分别配置成不同浓度的溶液,浓度分别为0.39mg/mL、0.78mg/mL、1.56mg/mL、3.12mg/mL、6.25mg/mL,将不同浓度的陈皮提取物溶液分别孵育Huh7细胞48h后,进行染毒实验(HCoV-229E滴度MOI 0.01),染毒2h,在感染24h后采用qPCR的方法测定细胞上清液中病毒滴度,根据病毒滴度得到陈皮提取物对HCoV-229E病毒感染的作用浓度-抑制率曲线,结果如图4所示。从图4中可以计算得到对比例的陈皮提取物抑制HCoV-229E病毒复制的IC50为5.79mg/mL,而实施例的陈皮提取物能够更好的抑制病HCoV-229E病毒复制活性,其IC50为3.59mg/mL,效果更佳。将余下的细胞中加入鼠抗229E病毒抗体,以及携带荧光的二抗,进行免疫荧光检测,结果如图5所示,其中,图5中灰白点为HCoV-229E病毒。可以看出本申请提供的陈皮提取物显示出了较好的抑制病毒在细胞内复制的活性,陈皮提取物浓度越高,对病毒的抑制活性越强。
以上所揭露的仅为本申请较佳实施例而已,当然不能以此来限定本申请之权利范围,本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程,并依本申请权利要求所作的等同变化,仍属于发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种具有抑制冠状病毒复制活性的陈皮提取物的制备方法,其特征在于,包括:
将陈皮原料进行干燥和粉碎,得到陈皮粉,所述干燥的温度为100℃~150℃,所述干燥的时间为2h~5h;
所述陈皮粉置于碱性溶液进行提取,经过滤得到陈皮提取液;
所述陈皮提取液经冷冻干燥后得到所述陈皮提取物。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述碱性溶液的pH大于7且小于12。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述陈皮粉和所述碱性溶液的质量比为1:(10~20)。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述提取的温度为60℃~100℃,所述提取的时间为20min~60min。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述冷冻干燥包括在-80℃~-20℃进行速冻处理20min-60min,再在-80℃~-60℃的条件下进行冻干处理6h~8h。
6.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述陈皮粉的粒径小于8目。
7.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述碱性溶液为通过向水溶液中滴加碱液获得。
8.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述陈皮提取物包括橘皮素、新橙皮苷、橙皮苷、橙皮素、5,7,8,4’-四甲氧基黄酮、3,3’,4’,5,6,7,8-七甲氧基黄酮、去甲基川陈皮素和川陈皮素中的至少一种。
9.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述陈皮提取物的IC50浓度为3mg/mL~5mg/mL。
10.如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的陈皮提取物在制备预防或治疗冠状病毒感染的产品中的应用。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101747394A (zh) * 2009-12-31 2010-06-23 浙江工业大学 一种从陈皮中提取橙皮苷的方法

Patent Citations (1)

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Title
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井山林: "陈皮挥发油与橙皮苷提取工艺的实验研究", 《基层中药杂志》 *
崔琳琳: "基于网络药理学和分子对接的陈皮干预COVID-19 的可能机制", 《中药药理与临床》 *

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