CN113599414A - 分心木水提物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分心木水提物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。本发明的分心木水提物能够有效治疗和缓解体重降低、腹泻和便血等溃疡性结肠炎的症状，能够抑制包括TNF‑α、IL‑6或IL‑1β等炎症介质的产生，能够调节肠道菌群组成和促进菌群恢复，以及能够进一步保护粘膜屏障和改善DSS诱导的结肠损伤。因此，分心木水提物可以作为溃疡性结肠炎的有效治疗药物，制备成各种剂型药物或药物组合物用于溃疡性结肠炎的治疗。

Description

分心木水提物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及分心木水提物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术

分心木(Diaphragma juglandis Fructus)，又称胡桃衣、胡桃夹或核桃隔膜等，是胡桃科核桃属植物，核桃(Juglans regia L.)果核内的隔膜，即核桃中夹在核桃仁之间的木质小薄片。分心木呈片状，质脆，易折断，通常占核桃质量的4％～5％，其特点为味苦、涩，性平，入脾、肾二经，具有固肾涩精功效，可以治疗遗精、遗尿、多汗、泻痢以及失眠多梦等多种疾病。分心木中含有的化学成分有黄酮、生物碱、皂苷、糖类以及丰富的酚酸类成分，药理活性研究表明分心木除具有补肾作用外，还具有抑菌、抗氧化等作用。但人们在食用或加工核桃时往往只利用了核桃仁，同时产生的大量分心木除了在少部分地区被用来泡茶喝外，绝大部分都被作为废弃物处理，造成资源的极大浪费。分心木的进一步研究开发，对提高核桃附加值，减少资源浪费具有重要意义。

溃疡性结肠炎是一种以侵犯大肠黏膜和黏膜下层为主的炎症性肠病，主要症状有腹泻、腹痛、发烧以及直肠出血等。已有研究证实，遗传、环境和微生物等多种因素作用下，能引起肠道免疫反应过度亢进，最终导致溃疡性结肠炎的发生。近二十年我国溃疡性结肠炎的发病率逐渐升高，随着我国卫生医疗条件的改善、人们生活方式的改变，今后我国溃疡性结肠炎的发病率将进一步提高。临床上用来治疗溃疡性结肠炎的方法主要有糖皮质激素、免疫抑制剂和氨基水杨酸等，虽然能够在一定程度上缓解病情，然而副作用较大，而且长期服用具有一定的依赖性，严重影响患者的生活质量，且与结肠癌的发生发展存在一定联系，因此被世界卫生组织列为现代难治病之一。因此，亟需寻找新的药物和方法治疗溃疡性结肠炎。

目前，国内外未见分心木提取物的制备方法和以该提取物为活性成份的药物组合物，及其在治疗溃疡性结肠炎药物中应用的报道。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种分心木水提物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

根据本发明的一种具体的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明的分心木水提物，能够有效治疗和缓解溃疡性结肠炎的症状：包括体重降低、腹泻和便血等情况；能够抑制炎症介质的产生：包括TNF-α、IL-6或IL-1β等炎症分子，缓解炎症症状和减轻肠道症状；能够调节肠道菌群组成、促进菌群恢复，调节肠道健康；以及能够进一步保护粘膜屏障和修复结肠损伤；因此，分心木水提物可以作为溃疡性结肠炎的有效治疗药物。

在本发明的一些实施方式中，所述分心木水提物的组成包括：总黄酮含量为30％～40％，总多糖含量为25％～35％，总多酚含量为20％～30％。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述分心木水提物的组成包括：总黄酮含量为33.40±0.88％，总多糖含量为30.80±2.28％，总多酚含量为24.62±0.86％。

在本发明的一些实施方式中，所述分心木水提物由以下步骤制备得到：S1：用水加热回流提取分心木中的成分，过滤后得到水溶液；S2：通过旋转蒸发和/或冷冻干燥除去水后，得到所述分心木水提物。

在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中所述分心木和水的质量比为1：(5～20)。优选地，所述分心木和水的质量比为1：(8～15)；更优选地，所述分心木和水的质量比约为1：10。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述步骤包括：称取分心木药材1000g，用蒸馏水清洗，加入10L蒸馏水浸泡，浸泡2h后，100℃加热回流提取1h。收集提取液，过滤，用旋转蒸发仪在60℃条件下浓缩至200mL，-70℃预冻6h，-50℃真空冷冻干燥48h，即得到深褐色分心木水提物，提取率为9.41±0.82％。

在本发明的一些实施方式中，所述治疗溃疡性结肠炎包括缓解体重降低、腹泻和便血的溃疡性结肠炎症状中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述分心木水提物能够抑制炎症介质。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述炎症介质包括TNF-α、IL-6或IL-1β中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述分心木水提物能够保护结肠粘膜屏障和/或修复DSS诱导的结肠损伤。

在本发明的一些实施方式中，所述分心木水提物能够调节肠道菌群组成和/或促进菌群恢复。

在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液体制剂或注射剂。

在本发明的一些实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载体。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如甜味剂、香味剂等。

在本发明的一些实施方式中，所述分心木水提物的用药剂量为每千克个体体重施用500mg。

本发明中“药学上可接受的载体”是指与活性成分一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、并发症或其它问题，并且具有合理的益处/风险比。

本发明中，所用术语“治疗”，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况；抑制并发症的产生：改善或预防潜在代谢综合征；抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展；减轻疾病或症状；使疾病或症状减退；减轻由疾病或症状引起的并发症，或预防或治疗由疾病或症状引起的征兆。如本文所用，给药后，可以使某一疾病、症状或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠体重的影响示意图；

图2为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠的粪便性状分数的影响示意图；

图3为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠的平均粪便血分数的影响示意图；

图4为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠的DAI值的影响示意图；

图5为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠结肠长度的影响示意图；

图6为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠结肠HE和AB-PAS染色图；

图7为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠结肠的病理组织学评分的影响示意图；

图8为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的影响示意图；

图9为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠肠道菌群结构的影响示意图；

图10为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠肠道菌群α多样性分析示意图。

图11为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠肠道菌群PCoA(2D)分析示意图；

图12为本发明实施例中分心木水提物对DSS诱导的小鼠肠道菌群物种差异性分析示意图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：分心木水提物的制备与成分分析

1.心木水提物的制备

称取分心木药材1000g，用蒸馏水清洗，加入10L蒸馏水浸泡，浸泡2h后，100℃加热回流提取1h。收集提取液，过滤，用旋转蒸发仪在60℃条件下浓缩至200mL，-70℃预冻6h，-50℃真空冷冻干燥48h，即得到深褐色分心木水提物，提取率为9.41±0.82％。

2.分心木水提物的成分分析

分心木水提物的组成包括：总黄酮含量为33.40±0.88％，总多糖含量为30.80±2.28％，总多酚含量为24.62±0.86％。

实施例2：分心木水提物对小鼠溃疡性结肠炎的作用研究

1.动物分组及给药方案

C57BL/6小鼠，雄性，6周龄，体质量20±2g，SPF级，购自海军特色医学中心动物中心。小鼠适应性饲养5天后，用SPSS软件将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为对照组、模型组、中药组(分心木水提物500mg/kg)、阳性药组(美沙拉嗪600mg/kg)。采用DSS诱导法建立溃结模型：除对照组外，小鼠自由饮用3％DSS溶液，连续七天。自造模第一天起，连续给药，每日一次，连续九天，分心木组每天灌胃给药500mg/kg分心木水提物，阳性药组灌胃给药美沙拉嗪600mg/kg，对照组和模型组灌胃给予对照组和模型组给予等体积的蒸馏水。

对于结肠炎模型的构建，葡聚糖硫酸钠盐(Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS)结肠炎(ulcerative colitis，UC)模型应用最广。

使用的阳性药美沙拉嗪，是治疗溃疡性结肠炎的常用药物之一。对肠壁的炎症有显著的抑制作用。美沙拉嗪可以抑制引起炎症的前列腺素的合成和炎性介质白三烯的形成，从而对肠黏膜的炎症起显著抑制作用。美沙拉嗪可以剂量依赖方式抑制前列腺素的合成，减少前列腺素E2(PGE2)在人结肠黏膜的释放。

2.实验方法及数据处理

2.1疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分

每天观察并记录小鼠体重、饮食饮水状况、粪便黏稠情况和便血情况。按照DAI评分标准进行评分，其中，粪便性状分数的评分标准为：正常为0分，介于正常与松散状之间为1分，松散状为2分，介于松散状与稀便之间为3分，稀便为4分；隐血程度分数的评分标准为：无便血为0分，介于无便血和隐血间为1分，隐血阳性为2分，介于隐血与肉眼便血间为3分，肉眼便血为4分，DAI＝(体质量减轻率分数+粪便性状分数+隐血程度分数)/3。

2.2结肠长度

于实验第9天，采用颈椎脱臼法处死各组小鼠，分离整段结肠组织，用标尺测量各组小鼠结肠长度，进行统计学分析。

2.3结肠病理组织学观察及评分

取各组小鼠病变结肠组织常规石蜡包埋，切片，HE和AB-PAS染色。参照Boirivant等的标准行盲法评分，根据上皮细胞形态、炎症细胞浸润情况等，由2位病理科医师分别双盲阅片，结果取均值进行评分。

2.4结肠组织炎症因子检测

取结肠组织200mg，加入2mL生理盐水进行匀浆，以4000r/min离心10min后取上清液，按照试剂盒说明书步骤测定IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

2.5粪便样品采集及处理

于实验第9天处死小鼠，剖开腹腔，取出肛门至盲肠末端的完整结肠组织并置于冰盘上，沿肠系膜纵向剖开结肠组织，取出结肠内粪便颗粒(2～3粒)收集于冻存管中，立即放于液氮内保存，待提取粪便中细菌的DNA。

2.6粪便中细菌DNA的提取及测序

2.6.1 DNA的提取与检测

使用DNA提取试剂盒提取粪便中的总DNA，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。

2.6.2 PCR扩增与产物回收

以细菌16SrRNA基因的V3～V4可变区序列为靶标，以带有barcode序列的338F-806R为引物，进行PCR扩增，获取PCR产物，使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，美国)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2％琼脂糖电泳检测。

2.6.3荧光定量

参照电泳初步定量结果，利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)进行检测定量。之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

2.6.4测序分析

样品在Illumina NovaSeq平台上按照制造商的建议进行测序，由LC-Bio提供。根据样品独特的条形码，将配对端序列分配给样品，并将建库引入的barcode和引物序列去除。使用FLASH合并匹配端读取。根据fqtrim(v0.94)，在特定的过滤条件下对原始读数据进行质量过滤，以获得高质量的clean标签。使用Vsearch软件对嵌合序列进行过滤(v2.3.4)。利用DADA2进行解调，得到特征表和特征序列。多样性和多样性通过归一化到相同的随机序列来计算。然后根据SILVA(release132)分类器，利用每个样本的相对丰度对特征丰度进行归一化。Alpha多样性用于分析样本物种多样性的复杂性，通过5个指标，包括Chao1、Observedspecies、Goodscoverage、Shannon、Simpson(这些指标通过QIIME2计算)。Beta多样性由QIIME2计算，R包绘制。采用Blast进行序列比对，每个代表性序列用SILVA数据库对特征序列进行注释。通过使用R包(v3.5.2)绘制结果图和进行序列分析。

2.7数据统计学处理

数据分析采用SPSS22.0统计学软件包，正态分布连续性资料以表示，多样本均数比较且方差齐者使用方差分析。

3.结果与讨论

3.1小鼠一般情况和疾病活动指数变化

记录分析各组小鼠体质量、摄食量及饮水量。结果如图1所示，分别记录对照组、模型组(即造模组)、阳性对照组和中药组(指分心木水提取物)每天的体重变化情况，图中，横坐标为天数，纵坐标表示体重变化百分数(weight change(％))。对照组小鼠摄食量及饮水量正常，且体质量呈上升趋势；模型组小鼠自造模开始后，摄食量和饮水量皆减少，且从造模第4天起，体重有下降趋势，且较对照组有统计学意义。分心木组小鼠体质量也有所下降，但从第6天起，与模型组比较差异显著，与阳性药组效果相当。

3.2粪便粘稠度和便血情况

粪便粘稠度和便血情况结果如图2～图4所示，其中，图2显示了不同组小鼠的粪便性状分数，图3显示了不同组小鼠的右图为平均粪便血分数(mean stool blood score)，图4显示了不同组小鼠的DAI值。模型组小鼠第三天后排便次数增加，出现软便、水样便等情况；第四天后出现大便隐血、血便等情况；第五天后水样便、血便情况加剧，出现排便困难等情况。阳性药组和分心木组给予干预后，小鼠活动增加，毛发情况改善，第8天时，较模型组相比，给予分心木水提物干预后，粪便粘稠度和便血情况有所改善。

3.3结肠一般情况与病理学观察结果

分离出整段结肠组织，用直尺测量各组小鼠结肠长度，并进行相关统计学分析。结果如图5所示，对照组小鼠结肠长度最长，模型组小鼠结肠长度最短，且模型组与对照组相比，差异显著(P＜0.001)；分心木组结肠长度要显著长于模型组。

对结肠病变组织进行HE染色和AB-PAS染色，并进行病理组织学评分。染色结果如图6所示，对照组小鼠黏膜层肠腺排列紧密，肠腺上皮细胞形态正常，结构正常无缺损；模型组小鼠结肠可见肠腺及上皮细胞丧失，且有明显缺损，并伴有大量炎性细胞浸润，炎症侵袭黏膜下层及肌层；阳性药组和分心木组干预给药后，炎性细胞浸润减少，肠黏膜上皮细胞完整性有所改善。病理学组织评分结果如图7所示，与对照组比较，模型组病变评分显著增高(P＜0.001)。与模型组相比，分心木组小鼠病理评分显著降低(P＜0.01)。结果表明分心木水提物能改善DSS诱导的小鼠结肠炎症，具有减轻溃疡性结肠炎小鼠结肠局部病变损害作用。

3.4结肠组织炎症因子检测结果

检测各组小鼠结肠组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。结果如图8所示，对照组小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平最低；模型组结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平最高，且较对照组显著升高(P＜0.001)；阳性药组和分心木组结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平与模型组比较也显著降低(P＜0.001)。结果表明分心木水提物可以抑制溃疡性结肠炎小鼠局部结肠组织IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。

3.5结肠肠道菌群物种注释

基于OUT的绝对丰度及注释信息，对每一例样本在门水平和属水平上的序列数目占总序列数的比例进行统计分析，确定了各组在门和属水平上的物种组成差异。图9显示了不同组小鼠肠道菌群的结构图。在对照组中，菌群谱反映正常小鼠肠道菌群的构成，其中Bacteroidetes(79.26％)、Firmicutes(16.40％)、Proteobacteria(1.01％)、Epsilonbacteraeota(0.63％)为4大主要细菌门类。Muribaculaceae_unclassified、Alloprevotella、Muribaculum、Alistipes是对照组主要属水平上的构成。在模型组中，菌群谱反映了疾病情况下，小鼠肠道菌群的构成，其中Firmicutes(60.23％)、Epsilonbacteraeota(15.55％)、Bacteroidetes(13.91％)、Proteobacteria(8.44％)为4大主要的细菌门类。相较对照组而言，Firmicutes、Epsilonbacteraeota和Proteobacteria比例有所上升，而Bacteroidetes比例则有所下降。在分心木组中，Bacteroidetes(41.38％)、Firmicutes(32.02％)、Verrucomicrobia(11.67％)和Proteobacteria(6.66％)为4大主要的细菌门类，其中Bacteroidetes和Firmicutes两类菌的占比与空白对照组相似，其中Verrucomicrobia首次出现在主要菌种中，提示该菌可能参与分心木水提物缓解溃疡性结肠炎的作用过程中。

3.6结肠肠道菌群物种多样性分析

通过对单独样品的多样性分析(α分析)可以反映微生物群落的物种丰度和多样性，我们采用两个指标进行评价，Chao1反映样本中物种丰富度，而不考虑每个物种的占比情况(均匀度)；Simpson反映物种的丰富度和均匀度，结果如图10所示。发现分心木水提物干预后并没有改善肠道菌群内微生物群落的物种丰度和多样性。β多样性是度量不同样本间菌群组成的相似度大小的指标，通过加权的PCoA分析，可以反映出各个样本之间的物种距离，分析结果如图11所示。模型组距离较对照组距离较远，而阳性药组和分心木组较模型组距离对照组更近。因此，经分心木水提物处理后，肠道菌群内容有所改变，与正常肠道菌群内结构更相近。

3.7结肠肠道菌群物种差异性分析

进一步采用LeFSe分析比较3％DSS诱导处理所引起的肠道菌群丰度在各物种分类水平上的差异。LeFSe分析是非参数检验和线性判别分析的结合，适合菌群丰度差异检验，以LDA＞4，P＜0.5作为筛选标准，确定各个组中的差异微生物。结果如图12所示，实验结果表明，p_Bacteroidetes、f_Muribaculaceae、g_Alloprevotella为对照组主要的显著差异菌；f_Helicobacteraceae、p_Epsilonbacteraeota、c_Campylobacteria、f_Ruminococcaceae为模型组主要的差异菌；p_Proteobacteria、c_Gammaproteobacteria、f_Enterobacteriaceae、g_Akkermansia为分心木组主要的差异菌。以上结果表明，分心木水提物给药干预后，Bacteroidetes比例显著增高、Firmicutes和Proteobacteria比例显著降低，此外Akkermansia、Alloprevotella等益生菌比有所上升，菌群结构和组分的改变可能在溃疡性结肠炎发病中发挥作用。

本发明通过建立DSS诱导的急性小鼠结肠炎模型来评估本发明的效果。该动物模型常用于研究溃疡性结肠炎的病理机制和药物疗效评价。通过DSS诱导的结肠炎小鼠模型，我们对小鼠一般体质量特征、DAI评分、结肠长度、结肠组织病理学评分进行检测。以上实验结果表明，分心木水提物，能够有效治疗和缓解溃疡性结肠炎的症状：包括体重降低、腹泻和便血等情况；能够抑制炎症介质的产生：包括TNF-α、IL-6或IL-1β等炎症分子，缓解炎症症状；能够调节肠道菌群组成、促进菌群恢复，调节肠道健康；以及能够进一步保护粘膜屏障和修复结肠损伤。因此，分心木水提物可以作为溃疡性结肠炎的有效治疗药物，制备成各种剂型药物或药物组合物用于溃疡性结肠炎的治疗。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.分心木水提物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分心木水提物的组成包括：总黄酮含量为30％～40％，总多糖含量为25％～35％，总多酚含量为20％～30％。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分心木水提物由以下步骤制备得到：

S1：用水加热回流提取分心木中的成分，过滤后得到水溶液；

S2：通过旋转蒸发和/或冷冻干燥除去水后，得到所述分心木水提物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗溃疡性结肠炎包括缓解体重降低、腹泻和便血的溃疡性结肠炎症状中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分心木水提物能够抑制炎症介质。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述炎症介质包括TNF-α、IL-6或IL-1β中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分心木水提物能够保护结肠粘膜屏障和/或修复DSS诱导的结肠损伤。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分心木水提物能够调节肠道菌群组成和/或促进菌群恢复。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液体制剂或注射剂。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

Images