CN113599413A - 一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，其中，所述方法包括：对核桃青皮进行清洗、晾晒至水分得率低于10％；对晾晒后的核桃青皮进行研磨，控制核桃青皮粉末到预定目数范围后，进行均匀封装；通过设置不同剂量的电子束对封装后的核桃青皮粉末进行辐照预处理；对预处理后的核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，获得核桃青皮溶液；对超声提取的核桃青皮溶液进行冷却、离心、浓缩，干燥，获得核桃青皮中的黄酮提取物。解决了现有技术中存在核桃青皮中黄酮类物质的提取缺少强度高、生产成本低的预处理技术导致提取率不高以及提取的黄酮类物质抑菌活性较差等技术问题。

Description

一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法

技术领域

本发明涉及黄酮提取技术领域，具体地，涉及一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法。

背景技术

一直以来，核桃都被认为具有极高的营养价值以及良好的保健功能，人们开始热衷品质生活与健康饮食，核桃市场随之快速发展，但是长期以来整个产业都以核桃仁加工为主，副产品众多但资源利用率较低，尤其是在采收季，大量堆积在市场的废弃核桃青皮由于人们粗糙的处理方式造成了难以忽视的环境污染问题。黄酮类化合物广泛存在于果蔬、谷物、茶等植物原料中，它是以2-苯基色原酮为母核衍生出的一类黄色色素，大多数以与糖结合成苷类或是以碳糖基的形式存在，已经确定的黄酮化合物多达4000种。黄酮类化合物具有极性，提取时多用极性溶剂，常用水、碱及有机溶剂等进行浸提，与传统的提取方法相比超声波具有热特性、非热特性、高频性和波动性四大特点，超声提取技术具有操作时间缩短、受热均匀、减少试剂用量、易于控制等特点，是一种高效可行的提取方法，因此，食品工业将超声提取技术广泛应用到天然产物的提取。

但本申请发明人在实现本申请实施例中发明技术方案的过程中，发现上述技术至少存在如下技术问题：

现有技术中存在核桃青皮中黄酮类物质的提取缺少强度高、生产成本低的预处理技术导致提取率不高，以及提取的黄酮类物质抑菌活性较差等技术问题。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本申请实施例的目的是，通过提供一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，解决了现有技术中存在核桃青皮中黄酮类物质的提取缺少强度高、生产成本低的预处理技术导致提取率不高以及提取的黄酮类物质抑菌活性较差等技术问题。达到促进植物细胞中活性物质的有效溶出，显著促进核桃青皮中黄酮物质的提取、提高黄酮物质抑菌活性的技术效果。

一方面，本申请实施例提供一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，其中，所述方法包括：对核桃青皮进行清洗、晾晒至水分得率低于10％；对晾晒后的所述核桃青皮进行研磨，控制核桃青皮粉末到预定目数范围后，进行均匀封装；通过设置不同剂量的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行辐照预处理；对预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，获得核桃青皮溶液；对超声提取后的所述核桃青皮溶液进行冷却、离心、浓缩，干燥，获得核桃青皮中的黄酮提取物。

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

对核桃青皮进行清洗、晾晒至水分得率低于10％；对晾晒后的所述核桃青皮进行研磨，控制核桃青皮粉末到预定目数范围后，进行均匀封装；通过设置不同剂量的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行辐照预处理；对预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，获得核桃青皮溶液；对超声提取后的所述核桃青皮溶液进行冷却、离心、浓缩，干燥，获得核桃青皮中的黄酮提取物。基于此，能够得到一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，将电子束辐照作为预处理技术耦合超声波提取技术，达到促进植物细胞中活性物质的有效溶出，显著促进核桃青皮中黄酮物质的提取、提高黄酮物质抑菌活性的技术效果。

上述说明仅是本申请技术方案的概述，为了能够更清楚了解本申请的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本申请的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本申请的具体实施方式。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所做的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本申请实施例一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法的流程示意图；

图2为乙醇浓度对黄酮得率的影响的折线图；

图3为粉碎度对黄酮得率的影响的折线图；

图4为液料比对黄酮得率的影响的折线图；

图5为提取温度对黄酮得率的影响的折线图；

图6为超声功率对黄酮得率的影响的折线图；

图7为超声时间对黄酮得率的影响的折线图；

图8为本申请实施例一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法的响应面试验交互作用图；

图9为金属离子对核桃青皮粗提物抑菌稳定性的影响的柱状图；

图10为辐照剂量对核桃青皮粗提物抑菌效果的影响的柱状图。

具体实施方式

本申请实施例通过提供一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，解决了现有技术中存在核桃青皮中黄酮类物质的提取缺少强度高、生产成本低的预处理技术导致提取率不高，以及提取的黄酮类物质抑菌活性较差等技术问题。达到了促进植物细胞中活性物质的有效溶出，显著促进核桃青皮中黄酮物质的提取、提高黄酮物质抑菌活性的技术效果。

下面，将参考附图对本申请的示例实施例中的技术方案进行清楚、详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是本申请的全部实施例，应理解，本申请不受这里描述的示例实施例的限制。基于本申请的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请的保护范围。

申请概述

一直以来，核桃都被认为具有极高的营养价值以及良好的保健功能，人们开始热衷品质生活与健康饮食，核桃市场随之快速发展，但是长期以来整个产业都以核桃仁加工为主，副产品众多但资源利用率较低，尤其是在采收季，大量堆积在市场的废弃核桃青皮由于人们粗糙的处理方式造成了难以忽视的环境污染问题。黄酮类化合物广泛存在于果蔬、谷物、茶等植物原料中，它是以2-苯基色原酮为母核衍生出的一类黄色色素，大多数以与糖结合成苷类或是以碳糖基的形式存在，已经确定的黄酮化合物多达4000种。黄酮类化合物具有极性，提取时多用极性溶剂，常用水、碱及有机溶剂等进行浸提，与传统的提取方法相比超声波具有热特性、非热特性、高频性和波动性四大特点，超声提取技术具有操作时间缩短、受热均匀、减少试剂用量、易于控制等特点,是一种高效可行的提取方法，因此，食品工业将超声提取技术广泛应用到天然产物的提取。目前，存在核桃青皮中黄酮类物质的提取缺少强度高、生产成本低的预处理技术导致提取率不高，以及提取的黄酮类物质抑菌活性较差等技术问题。

针对上述技术问题，本申请提供的技术方案总体思路如下：

本申请实施例提供一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，其中，所述方法包括：对核桃青皮进行清洗、晾晒至水分得率低于10％；对晾晒后的所述核桃青皮进行研磨，控制核桃青皮粉末到预定目数范围后，进行均匀封装；通过设置不同剂量的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行辐照预处理；对预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，获得核桃青皮溶液；对超声提取后的所述核桃青皮溶液进行冷却、离心、浓缩，干燥，获得核桃青皮中的黄酮提取物。

为了更好地理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。

实施例一

如图1所示，本申请实施例提供了一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，其中，所述方法包括：

步骤S100：对核桃青皮进行清洗、晾晒至水分得率低于10％；

具体而言，取核桃青皮将核桃青皮进行清洗，去除表面杂质后，晾晒至水分得率低于10％，所述水分得率指在晾晒过程中，随机取部分核桃青皮进行水分含量的测定，直至水分得率低于10％后，停止晾晒，将晒好的核桃青皮进行收集，待后续处理，将水分得率控制在10％以下能够减少核桃青皮回水腐烂，便于长时间存放，也能够保障后续结果的准确性和可靠性。

步骤S200：对晾晒后的所述核桃青皮进行研磨，控制核桃青皮粉末到预定目数范围后，进行均匀封装；

具体而言，想要提取所述核桃青皮中的黄酮物质，首先要对核桃青皮进行破碎处理，通过研磨处理将所述核桃青皮研磨至预定目数范围内，所述研磨处理指利用组织捣碎机将核桃青皮粉碎成不同目数粉末，主要通过控制研磨时间达成，控制目数的方法是过对应目数的筛网，收集筛下物，按照一定的封装标准进行均匀封装后放置于室温条件下备用，为后续黄酮物质的提取方法的研究夯实基础。

步骤S300：通过设置不同剂量的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行辐照预处理；

具体而言，电子束辐照作为一种安全环保的预处理方法，相比于紫外、X光等手段，它具有高度的灵活性，容易操控，安全无污染。通过设置不同电子束辐照剂量，来优化电子束辐照预处理工艺，采用不同剂量的电子束辐照处理所述核桃青皮粉末，所述核桃青皮粉末在辐照场中经过电子束的照射后，能够破坏植物细胞壁，从而达到提高活性物质的溶出的效果。

步骤S400：对预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，获得核桃青皮溶液；

具体而言，超声波具有热特性、非热特性、高频性和波动性四大特点，超声提取技术具有操作时间缩短、受热均匀、减少试剂用量、易于控制等特点，是一种高效可行的提取方法，所述超声提取方法具体为有机溶剂辅助超声提取，按照一定料液比加入有机溶剂后，进行超声处理，所述预定条件包括料液比、溶液浓度、超声波功率以及超声时间，通过超声提取得到核桃青皮溶液即核桃青皮粗提液，为后续测定黄酮得率奠定基础。

步骤S500：对超声提取的所述核桃青皮溶液进行冷却、离心、浓缩，干燥，获得核桃青皮中的黄酮提取物。

具体而言，超声提取反应结束后，冷却样液至室温，高速离心机离心，转速为8000r/min，离心10min，取上清液，弃去沉淀后置于旋转蒸发仪上减压浓缩回收溶剂至近干，所述旋转蒸发仪厂家为青岛聚创，型号为JC-ZF-RE5000，得到干膏，获得核桃青皮中的黄酮提取物，所述黄酮提取物用甲醇溶解并定容，作为供试品溶液，进行后续指标测定。电子束辐照预处理结合超声波提取法能够提高活性物黄酮的提取率，同时提升黄酮的抑菌活性，从而解决核桃青皮废弃物的综合利用问题，变废为宝。

进一步的，所述通过设置不同剂量的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行辐照预处理，还包括：将加速器频率为50-60Hz，托盘运行速度为5-10m/min，10MeV/20kW电子束直线型加速器产生的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行电辐照预处理。

具体而言，电子束辐照预处理的过程中，使用的加速器频率为50-60Hz，辐照托盘运行速度为5-10m/min。所使用的高能电子束直线型加速器型号为10MeV/20kW ESS-010-03电子直线加速器，额定能量10MeV、功率10kW，扫宽800cm，束流2mA，频率为50-60Hz，高能电子束直线型加速器是按照能量对电子直线型加速器进行分类，在工业电子辐照加速器范畴内可分为三个能区，80keV-0.3MeV为低能加速器，0.3MeV-5MeV为中能加速器，5MeV-10MeV为高能加速器。10MeV/20kW的含义为高能电子辐照加速器输出能量为10MeV的电子束，最大束流功率为20kW。通过不同电子束辐照剂量辐照处理后的所述核桃青皮粉末，留存备用，辐照预处理技术的应用能够促进活性物质的溶解，提高活性物质的提取率。

进一步的，本申请实施例还包括：所述辐照剂量分别设置为20-60kGy。

具体而言，设置辐照剂量为20-60kGy，同时设置0kGy为对照组，进行电子束辐照处理效果的验证，同时，辐照剂量超过60kGy时，由于剂量过高，将会导致核桃青皮中的黄酮物质提取效率变差。因此20-60kGy剂量范围的选择是一可靠、合理的剂量范围。

进一步的，本申请实施例还包括：将所述核桃青皮粉末进行均匀封装，包括药用PE封口袋封装，每袋0.3-0.7kg，厚度1-2cm。

具体而言，所述封装过程是将所述核桃青皮粉末装入市售药用PE封口袋，每袋0.3-0.7kg，厚度1-2cm，这样能够保证样品不受污染，厚度1-2cm能够保证电子束完全穿透样品，保证辐照效果，规定每袋样品的重量、厚度能够使得整个实验过程可重复性、可操作性强，便于整个过程标准化，同时也为该方法的推广以及大规模处理奠定了基础。

进一步的，所述对预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，还包括：所述预定条件为料液比1:45-1:50g/mL，乙醇溶液浓度75％-76％，超声波功率480-500W，超声时间110-130min。

具体而言，超声波辅助提取工艺包括液料比、乙醇溶液浓度、超声功率、时间等，将预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，所述预定条件为料液比1:45-1:50g/mL，乙醇溶液浓度75％-76％，超声波功率480-500W，超声时间110-130min。在这个超声提取条件下，能够较好的提取核桃青皮中的黄酮物质，为后续抗菌性实验奠定基础。

进一步的，本申请实施例还包括：所述核桃青皮的采收时间为7-8月。

具体而言，7-8月为核桃采收旺季，收集新新2、西扶1号、西扶2号、香玲、大露仁五个品种新鲜核桃的核桃青皮，在采收旺季消费者在购买核桃时，会产生大量的核桃青皮，此时收购核桃青皮样品既能够保证核桃青皮的新鲜度，又能够对核桃青皮进行利用，减少环境污染。同时，新鲜的核桃青皮样品也能够保证实验数据的准确性。

进一步的，本申请实施例还包括：所述核桃青皮粉末的所述预定目数范围为60-100目。

具体而言，为了探究不同粉碎度的核桃青皮粉末原料对于黄酮提取率的影响效果，将所述核桃青皮粉末研磨至60-100目，一般来讲，原料粉碎度越高，粉末越细，提取过程中的溶解、渗透、扩散越快，提取效率越高。但是，粉末过细，粉末颗粒表面积大，吸附作用增强反而影响扩散速度。而且，若原料含蛋白质、多糖成分多时，粉碎过细，这些成分溶出过多，提取液就会更黏稠，甚至产生胶胨现象，影响其他操作。因此通过对不同粉碎度的核桃青皮粉末进行实验，从而探究出最适宜的粉碎度对于提取工艺是至关重要的。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、对核桃青皮进行清洗、晾晒至水分得率低于10％；对晾晒后的所述核桃青皮进行研磨，控制核桃青皮粉末到预定目数范围后，进行均匀封装；通过设置不同剂量的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行辐照预处理；对预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，获得核桃青皮溶液；对超声提取后的所述核桃青皮溶液进行冷却、离心、浓缩，干燥，获得核桃青皮中的黄酮提取物。基于此，能够得到一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，将电子束辐照作为预处理技术耦合超声波提取技术，达到促进植物细胞中活性物质的有效溶出，显著促进核桃青皮中黄酮物质的提取、提高黄酮物质抑菌活性的技术效果。

实施例二

准确称取1.0g过70目筛的核桃青皮粉末，按照1:20g/mL加入60％、70％、80％、90％、100％5个不同浓度的乙醇溶液进行提取，超声提取120min，超声温度设置为50℃，提取功率为420W，反应结束后离心10min，转速为8000r/min，用甲醇将旋转蒸发浓缩后的上清液干膏定容至100mL，待测。

对实施例二制得的核桃青皮提取物测定以下数据：黄酮得率测定方法：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色比色法测定总黄酮得率，以芦丁标准液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，不同浓度标准液在510nm处的吸光值为纵坐标，得到芦丁标准曲线回归方程为A＝7.1134C-0.0197，其中A为吸光度，C为芦丁质量浓度，mg·mL^-1。R²＝0.9996，测定结果如图2所示。

实施例三

分别准确称取过20、40、60、80、100目筛的干燥核桃青皮粉末各1.0g，按照1:20g/mL加入60％乙醇，超声提取120min，超声温度设置为50℃，提取功率为420W，反应结束后离心10min，转速为8000r/min，用甲醇将旋转蒸发浓缩后的上清液干膏定容至100mL，待测。

对实施例三制得的核桃青皮提取物测定以下数据：黄酮得率测定方法：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色比色法测定总黄酮得率，以芦丁标准液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，不同浓度标准液在510nm处的吸光值为纵坐标，得到芦丁标准曲线回归方程为A＝7.1134C-0.0197，其中A为吸光度，C为芦丁质量浓度，mg·mL^-1。R²＝0.9996，测定结果如图3所示。

实施例四

准确称取1.0g过70目筛的核桃青皮粉末，按照1:10、1:20、1:30、1:40、1:50g/mL加入60％乙醇，超声提取120min，温度设置为50℃，提取功率为420W，反应结束后离心10min，转速为8000r，用甲醇将旋转蒸发浓缩后的上清液干膏定容至100mL，待测。

对实施例四制得的核桃青皮提取物测定以下数据：黄酮得率测定方法：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色比色法测定总黄酮得率，以芦丁标准液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，不同浓度标准液在510nm处的吸光值为纵坐标，得到芦丁标准曲线回归方程为A＝7.1134C-0.0197，其中A为吸光度，C为芦丁质量浓度，mg·mL^-1。R²＝0.9996，测定结果如图4所示。

实施例五

准确称取1.0g过70目筛的核桃青皮粉末，按照1:20g/mL加入60％乙醇，超声提取120min，温度设置为20、30、40、50、60℃，提取功率为420W，反应结束后离心10min，转速为8000r/min，用甲醇将旋转蒸发浓缩后的上清液干膏定容至100mL，待测。

对实施例五制得的核桃青皮提取物测定以下数据：黄酮得率测定方法：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色比色法测定总黄酮得率，以芦丁标准液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，不同浓度标准液在510nm处的吸光值为纵坐标，得到芦丁标准曲线回归方程为A＝7.1134C-0.0197，其中A为吸光度，C为芦丁质量浓度，mg·mL^-1。R²＝0.9996，测定结果如图5所示。

实施例六

准确称取1.0g过70目筛的核桃青皮粉末，按照1:20g/mL加入60％乙醇，超声提取120min，温度设置为50℃，超声波清洗器工作功率分别设定为280、350、420、490、560W，反应结束后离心10min，转速为8000r，用甲醇将旋转蒸发浓缩后的上清液干膏定容至100mL，待测。

对实施例六制得的核桃青皮提取物测定以下数据：黄酮得率测定方法：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色比色法测定总黄酮得率，以芦丁标准液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，不同浓度标准液在510nm处的吸光值为纵坐标，得到芦丁标准曲线回归方程为A＝7.1134C-0.0197，其中A为吸光度，C为芦丁质量浓度，mg·mL^-1。R²＝0.9996，测定结果如图6所示。

实施例七

准确称取1.0g过70目筛的核桃青皮粉末，按照1:20g/mL加入60％乙醇，超声提取80、100、120、140、160min，温度设置为50℃，提取功率为420W，反应结束后离心10min，转速为8000r/min，用甲醇将旋转蒸发浓缩后的上清液干膏定容至100mL，待测。

对实施例七制得的核桃青皮提取物测定以下数据：黄酮得率测定方法：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色比色法测定总黄酮得率，以芦丁标准液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，不同浓度标准液在510nm处的吸光值为纵坐标，得到芦丁标准曲线回归方程为A＝7.1134C-0.0197，其中A为吸光度，C为芦丁质量浓度，mg·mL^-1。R²＝0.9996，测定结果如图7所示。

如图2-7所示，提取的工艺参数不同，核桃青皮提取物中黄酮得率不同，且各因素对其影响差异显著(P＜0.05)；总的趋势是随着乙醇浓度、粉碎度、液料比、温度、超声功率、超声时间的增大，黄酮得率先上升后下降。因此当乙醇浓度70％、粉碎度60目、液料比40:1(mL/g)、温度50℃、超声功率490W、超声时间120min时，提取效果最为显著。

进一步的，通过响应面分析法分析黄酮含量与粉碎度、乙醇浓度、料液比、超声时间之间的回归关系，获得最佳工艺参数条件。

根据显著因子数量设计四个因素三水平29次实验的Box-Behnken试验，建立回归模型方程并利用响应面确定核桃青皮提取物的最佳工艺参数。由表1和图8可知，乙醇浓度(B)、液料比(C)和超声时间(D)是影响提取物的三个主要变量(P<0.0001)。随着乙醇浓度、液料比和超声时间的增加，黄酮得率逐渐增加到峰值，然后随着B、C、D的增加开始下降。AB、AC和BD对黄酮得率具有显著的交互作用。响应面试验优化所得最佳工艺参数条件为粉碎度70目，乙醇浓度75.479％，液料比46:1mL/g，提取时间131.774min，黄酮得率为30.29mg/g。

表1响应面试验结果

实施例八

取新新2品种核桃青皮粉末样品进行电子束辐照预处理，即药用PE封口袋封装核桃青皮粉末，摆放于辐照托盘中，分别进行0(对照)、20、30、40、50、60kGy的辐照处理，以优化出的最佳超声工艺条件进行超声波提取将提取后的料液进行过滤浓缩，制得核桃青皮提取物。

对实施例八制得的核桃青皮提取物测定以下数据：黄酮得率测定方法：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色比色法测定总黄酮得率，以芦丁标准液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，不同浓度标准液在510nm处的吸光值为纵坐标，得到芦丁标准曲线回归方程为A＝7.1134C-0.0197，其中A为吸光度，C为芦丁质量浓度，mg·mL^-1。R²＝0.9996。

由表2可知，随着电子束辐照剂量的增加，核桃青皮黄酮得率先增加后减少，在30kGy时，达到最大值38mg/g。相对于未辐照的核桃青皮，辐照后的核桃青皮经超声辅助提取之后得率提高更多。

表2不同辐照剂量处理对核桃青皮提取物中黄酮得率的影响

进一步的，测定优化后工艺提取不同品种核桃青皮的黄酮物质的得率。由表3可以看出，五个不同品种核桃青皮经优化后的电子束辐预处理，超声提取技术进行提取之后，其提取物黄酮得率大小顺序为：西扶1号>大露仁>西扶2号>香玲>新新2。

表3不同品种核桃青皮中黄酮得率

实施例九

菌种培养：本发明将金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌分别在LB固体平板上进行划线培养，37℃培养箱中静置24h。

菌悬液的制备：从LB平板中分别挑出单菌落受试细菌放入LB液体培养基中，37℃培养18h，吸1mL菌液于离心管内，转速为8000r/min，离心1min，弃去上清液，使用PBS缓冲液清洗菌体3次，用LB肉汤调整菌悬液至OD_600nm＝0.5，分别吸取1mL菌悬液于试管中，加入LB肉汤稀释，控制菌悬液浓度为1×10⁶CFU/mL，待用。

抑菌圈的测定：本发明选用牛津杯法进行核桃青皮粗提物对四种细菌抑菌圈直径的测定。无菌培养皿中加入15mL琼脂，冷却凝固，取150μL不同菌悬液分别均匀涂布在固体培养基上，将无菌牛津杯放入培养皿中，吸取60mg/mL样液150μL于牛津杯中，37℃恒温培养36h，十字交叉法测量抑菌圈直径d(mm)。空白对照为70％乙醇，阳性对照为100μg/mL庆大霉素溶液，每个处理重复三次。抑菌效果判定标准：高度敏感(d>15mm)，中度敏感(10mm<d<15mm)，低度敏感(8mm<d<10mm)。

金属离子对核桃青皮抑菌效果的影响，分别向每个牛津杯中添加30μL 0.1mol/L的CaCl₂、FeCl₂和CuCl₂溶液，平行测定三次。

电子束辐照剂量对抑菌效果的影响，将辐照后核桃青皮提取液黄酮的浓度调整为0.06g/mL，分别测定其抑菌圈直径，平行测定三次。

由图9可知，金属离子对核桃青皮粗提物抑菌效果的提高表现出差异性。铁离子和铜离子对核桃青皮抑菌能力的改善十分明显。与对照组相比，Fe²⁺处理组抑菌圈直径提高了47％～93％，Cu²⁺处理组提高了49％～89％。加入氯化钙溶液后，受试细菌的抑菌圈直径变化不明显。这可能是因为铜离子和锌离子自身对细菌的生长存在一定的抑制作用，且其易与活性化合物中的邻二酚羟基结构反应提高了其抑菌效果。因此，在开发核桃青皮提取物抑菌剂时适当加入铁离子和铜离子可显著提升抑菌效果。

由图10辐照剂量对核桃青皮粗提液抑菌效果的影响可得，随着辐照剂量逐渐增大四种供试细菌抑菌圈直径均呈现先增大后减小的趋势。其中辐照剂量为30kGy时，与未经过辐照处理核桃青皮粗提液抑菌圈直径相比，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到最大值，分别为16.79±0.51，16.32±0.62mm，达到高度敏感，蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径最大，分别为13.27±0.86和11.93±0.89mm，属于中度敏感。这可能是由于核桃青皮粉末经过辐照与超声处理后，黄酮，多酚等活性物质溶出，提高了核桃青皮粗提物对供试细菌的抑菌效果。

表4是对照组的抑菌效果，75％乙醇溶液对四种细菌的抑菌圈直径均小于10mm，无抑制作用，庆大霉素溶液对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的抑菌圈直径均大于15mm，达到高度敏感，庆大霉素溶液对沙门氏菌的抑菌圈直径为14.48mm，属于中度敏感。

表4对照组抑菌效果

抑菌圈直径大小表明核桃青皮粗提物对四种食源性致病菌均有抑菌效果，验证了核桃青皮对革兰氏阳性、阴性菌均有一定程度的抑制效果，表明核桃青皮用于植物源天然抑菌剂或食品级防腐剂具有一定的潜力。

本申请实施例提供一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，其中，所述方法包括：对核桃青皮进行清洗、晾晒至水分得率低于10％；对晾晒后的所述核桃青皮进行研磨，控制核桃青皮粉末到预定目数范围后，进行均匀封装；通过设置不同剂量的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行辐照预处理；对预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，获得核桃青皮溶液；对超声提取后的所述核桃青皮溶液进行冷却、离心、浓缩，干燥，获得核桃青皮中的黄酮提取物。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种提升核桃青皮黄酮提取率及抑菌活性的方法，其中，所述方法包括：

对核桃青皮进行清洗、晾晒至水分得率低于10％；

对晾晒后的所述核桃青皮进行研磨，控制核桃青皮粉末到预定目数范围后，进行均匀封装；

通过设置不同剂量的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行辐照预处理；

对预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，获得核桃青皮溶液；

对超声提取的所述核桃青皮溶液进行冷却、离心、浓缩，干燥，获得核桃青皮中的黄酮提取物。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述通过设置不同剂量的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行辐照预处理，包括：

将加速器频率为50-60Hz，托盘运行速度为5-10m/min，10MeV/20kW电子束直线型加速器产生的电子束对封装后的所述核桃青皮粉末进行电辐照预处理。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述辐照剂量分别设置为20-60kGy。

4.如权利要求1所述的方法，其中，将所述核桃青皮粉末进行均匀封装，包括药用PE封口袋封装，每袋0.3-0.7kg，厚度1-2cm。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述对预处理后的所述核桃青皮粉末按照预定条件进行超声提取，包括：

所述预定条件为料液比1:45-1:50g/mL，乙醇溶液浓度75％-76％，超声波功率480-500W，超声时间110-130min。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述核桃青皮的采收时间为7-8月。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述核桃青皮粉末的所述预定目数范围为60-100目。

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