CN113588954B - 血清cyr61-sno蛋白作为标志物在制备新型乳腺癌快速检测试剂盒中的应用 - Google Patents

血清cyr61-sno蛋白作为标志物在制备新型乳腺癌快速检测试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及了血清CYR61‑SNO蛋白作为标志物在制备新型乳腺癌快速检测试剂盒中的应用。本发明首次发现乳腺癌病人血清中CYR61‑SNO蛋白含量显著高于正常健康者，提示其在乳腺癌检测中的价值。并提供了一种基于检测血清中CYR61‑SNO蛋白含量的新型乳腺癌快速检测试剂盒，通过选择性地清除血清中的高丰度干扰蛋白，再富集血清中的巯亚硝基化蛋白，然后采用ELISA法测定血清中CYR61‑SNO的含量，进而完成对乳腺癌患者的检测及筛查。该试剂盒检测样品为外周血，取样方便，操作简单，检测灵敏，具有较好的实施意义。

Description

血清CYR61-SNO蛋白作为标志物在制备新型乳腺癌快速检测试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及血清CYR61-SNO蛋白作为标志物在制备新型乳腺癌快速检测试剂盒中的应用。
背景技术
巯亚硝化蛋白就是发生巯基亚硝基化的蛋白质，简单来说，就是NO的亚硝酰基共价结合到某些蛋白的半胱氨酸残基的巯基上，生成巯亚硝基（-SNO）的反应。巯基亚硝基化修饰被认为是机体储存、释放和运输NO的主要方式。大量的实验证明癌症的发生和发展都和体内异常巯基亚硝基化修饰相关，异常的巯基亚硝基化修饰又进一步加快癌症的形成和发展。在人体中，25%的癌症都和慢性炎症相关，慢性炎症通常会有较高的巨噬细胞活动，这种活跃的巨噬细胞会激活体内iNOS的合成，导致NO的大量产生，伴随而来的是大量异常巯基亚硝基化修饰的蛋白质，这些不正常修饰的蛋白质会使癌细胞迅速发展。因此对于巯亚硝基化蛋白的更深入了解，有利于肿瘤细胞相关研究。
CYR61（富含半胱氨酸蛋白61）是一种多功能基质细胞蛋白，在细胞的增殖和迁移、血管生成及炎症反应等生理、病理过程中发挥重要作用。值得一提的是，CYR61在不同的细胞中表达不同，大量研究表明，CYR61在乳腺癌中的表达量明显升高。甚至证明CYR61的过表达促进了裸鼠正常乳腺细胞和乳腺癌细胞的肿瘤生长。总之，CYR61在乳腺癌发展中发挥作用，可用作标志物以区分肿瘤患者与健康人。
验血是较为可靠的检测方式，并且血液样品的获取相对简单，对患者的伤害相对较小，因此可作为检测方法优化的选择。血液样品分析基本分为全血、血浆与血清三种。其中，血清中只含有蛋白质、有机小分子和水，以血清作为检测样品，有助于减少研究过程中的不确定因素，帮助研究机体的病理及生理变化。已有不少研究表明，血清中含有的蛋白质是常见的肿瘤标志物，在进行肿瘤检测、探寻肿瘤发病机制等方面发挥重要作用。血清中的蛋白质成分较为复杂，以其中的高丰度蛋白最具干扰作用，在研究过程中去除高丰度干扰蛋白也是必不可少的步骤。
乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一。根据最新世界卫生组织国际癌症研究机构资料显示，乳腺癌超过肺癌，成为癌症新发病例最多的癌症。乳腺癌初期最常见的表现是乳房出现无痛性肿块或增厚。因为没有与之相关的疼痛，大多数人发现乳房有异常肿块时并不能立即就医，从而错过了最佳治疗时机。进一步地，现有乳腺癌检测仪器精密，价格高昂，执行难度大，故急需一种操作简单方便的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供血清CYR61-SNO蛋白作为标志物在制备新型乳腺癌快速检测试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
血清CYR61-SNO蛋白作为标志物在制备新型乳腺癌快速检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种基于检测血清中CYR61-SNO蛋白含量的新型乳腺癌快速检测试剂盒，其组成包括：
①阴性对照血清：去除高丰度干扰蛋白后且富集了CYR61-SNO蛋白的正常健康者血清；
②用于富集血清中CYR61-SNO蛋白的试剂：Protein A琼脂糖、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ、磷酸钠-氯化钠缓冲液、丙酮、HENS缓冲液、MMTS、iodo-TMT、抗坏血酸、Anti-TMT树脂、TBS溶液Ⅰ、TBS溶液Ⅱ、TMT洗脱缓冲液：
所述磷酸钠-氯化钠缓冲液：将2.2g Na2HPO4、0.3g NaH2PO4、5.5g NaCl溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH =7.2；
所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ：将50mL 0.2M甘氨酸与3.2mL 0.2M HCl混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH =5；
所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ：将50mL 0.2M甘氨酸与7.3mL 0.2M HCl混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH=3.3；
所述HENS缓冲液：将59.58g Hepes、0.37g EDTA、0.03g新亚铜试剂溶解于1000ml双蒸水中。将混合液与质量分数为1%的SDS按1:25的体积比混合；调节pH=7.7；
所述TBS缓冲液Ⅰ：将8g NaCl、0.2g KCl、3g Tris base溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH=7.4；
所述TBS缓冲液Ⅱ：将0.12g尿素溶解于1mL TBS缓冲液Ⅰ中；调节pH=7.4；
所述TMT洗脱缓冲液：将0.95g Hepes、1.17g NaOH、0.07g EDTA、1.56g 2-ME溶解于双蒸水并定容至200mL；调节pH=7.7；
③用于ELISA法测定血清中CYR61-SNO含量的试剂：CBS稀释液、封闭液、PBST缓冲液、CYR61标准品、PBS缓冲液、兔抗CYR61、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔CYR61、PNPP酶标底物、终止液：
所述CBS缓冲液：将0.15g碳酸钠、0.29g碳酸氢钠、0.02g叠氮钠溶解于双蒸水并定容至100ml；调节pH=9.6；
所述封闭液：将2.5g BSA溶解于250mL CBS缓冲液中，加入125μL Tween-20；调节pH=9.6；
所述PBST缓冲液：将0.5mL Tween-20溶解于1000mL PBS缓冲液中；调节pH=7.4；
所述PBS缓冲液：将0.8g NaCl、0.02g KH2PO4、0.29g Na2HPO4·12H2O、0.02g KCl、0.01g叠氮钠溶解于双蒸水并定容至100ml；调节pH=7.4；
所述PNPP酶标底物：将97ml 二乙醇胺、100mg MgCl2溶解于双蒸水并定容至1000mL得到二乙醇胺缓冲液，调节pH=9.8；将10mg PNPP（购自赛默飞科技有限公司）溶于10mL二乙醇胺缓冲液，调节pH=5.5；
所述终止液：将80g NaOH溶解于1L双蒸水中。
所述阴性对照血清的制备方法，包括以下步骤：使用不含抗凝即得真空采血管采集健康者外周血（清晨空腹），于室温下静置2h使血液分层，小心吸取上层黄色透明血清在4℃条件下2000g离心5min，吸取上清；取其中115μL去除白蛋白和免疫球蛋白，得到的蛋白沉淀用HENS缓冲液调节浓度为1mg/mL；取其中100μL蛋白悬液进行巯亚硝基化富集，得到100μL阴性对照血清。。
本发明具备的有益效果：
（1）样品易得且所需样本量少，仅需抽取少量外周血即能进行检测；
（2）灵敏度高，对高丰度干扰蛋白（主要为白蛋白和免疫球蛋白）清除率超过60%，显著减少了Western Blotting中的背景干扰；
（3）判断简单，比较检测样品与对照样品中的CYR61-SNO含量差异即可判断检测人群是否患有乳腺癌。
附图说明
图1为去除高丰度干扰蛋白（白蛋白和免疫球蛋白）前后的乳腺癌患者血清样品比较；其中，泳道1为未去除白蛋白与免疫球蛋白的血清样品；泳道2为去除白蛋白与免疫球蛋白的血清样品。
图2为正常健康者与乳腺癌患者血清中属疏硝基化蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳及银染检测结果；其中，泳道M为Protein Marker；泳道1至5为5例乳腺癌患者样本上样；泳道6至8为3例正常健康者样本上样。
图3为本发明提供试剂盒测定正常健康者与乳腺癌患者血清中CYR61-SNO含量的结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所用到的试剂如下：
磷酸钠-氯化钠缓冲液：将2.2g Na2HPO4、0.3g NaH2PO4、5.5g NaCl溶解于双蒸水并定容至1000mL；pH =7.2；
甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ：将50mL 0.2M甘氨酸与3.2mL 0.2M HCl混合，加双蒸水定容至200mL；pH =5；
甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ：将50mL 0.2M甘氨酸与7.3mL 0.2M HCl混合，加双蒸水定容至200mL；pH=3.3；
HENS缓冲液：将59.58g Hepes、0.37g EDTA、0.03g新亚铜试剂溶解于1000ml双蒸水中，将混合液与质量分数为1%的SDS按1:25的体积比混合；pH=7.7；
iodo-TMT：购自赛默飞科技有限公司；
Anti-TMT树脂：购自赛默飞科技有限公司；
TBS缓冲液Ⅰ：将8g NaCl、0.2g KCl、3g Tris base溶解于双蒸水并定容至1000mL；pH=7.4；
TBS缓冲液Ⅱ：将0.12g尿素溶解于1mL TBS缓冲液Ⅰ中；pH=7.4；
TMT洗脱缓冲液：将0.95g Hepes、1.17g NaOH、0.07g EDTA、1.56g 2-ME溶解于双蒸水并定容至200mL；pH=7.7；
CBS缓冲液：将0.15g碳酸钠、0.29g碳酸氢钠、0.02g叠氮钠溶解于双蒸水并定容至100mL；pH=9.6；
封闭液：将2.5g BSA溶解于250mL CBS缓冲液中，向其中加入125μL Tween-20；pH=9.6；
PBST缓冲液：将0.5mL Tween-20溶解于1000mL PBS缓冲液中；pH=7.4；
CYR61标准品：购自Abcam公司；
PBS缓冲液：将0.8g NaCl、0.02g KH2PO4、0.29g Na2HPO4·12H2O、0.02g KCl、0.01g叠氮钠溶解于双蒸水并定容至100mL；pH=7.4；
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔CYR61：购自Abcam公司；
PNPP酶标底物：将97ml 二乙醇胺、100mg MgCl2溶解于双蒸水并定容至1000mL得到二乙醇胺缓冲液，pH=9.8；将10mg PNPP（购自赛默飞科技有限公司）溶于10mL二乙醇胺缓冲液，pH=5.5；
终止液：将80g NaOH溶解于1L双蒸水中。
实施例1乳腺癌患者与正常健康健康者血清中巯亚硝基化蛋白含量的比较
（1）血清样本的采集及预处理
使用不含抗凝剂的真空采血管采集人外周血（清晨空腹），于室温下静置2h使血液分层，小心吸取上层黄色透明血清在4℃条件下2000g离心5min，得第一上清液，然后分装成100μL/管。
（2）血清中的高丰度干扰蛋白的清除
步骤①：将离心柱放到收集管中，依次向柱中加入200μL Protein A琼脂糖和600μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ，3000rpm离心3min，除去滤液，以清洗离心柱，重复上述操作4次，在新的1.5mL离心管中加入115μL步骤（1）中得到的第一上清液和230μL磷酸钠-氯化钠缓冲液，充分混匀后将混合液加到清洗好的离心柱中，置于4℃摇床上1~2h，3000rpm离心3min，得第一滤液和第一沉淀。
步骤②：向装有第一沉淀的离心柱中加入200μL 甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ，3000rpm离心3min，得第二滤液和第二沉淀。
步骤③：合并第一滤液和第二滤液，预冷10min后取500μL混合滤液于新的离心管中，向其中加入362μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h，在4℃下先20000g离心30min，再20000g离心1min，得第三滤液和第三沉淀，用400-600μL HENS缓冲液重悬第三沉淀，得到除去免疫球蛋白和白蛋白的血清蛋白悬液。
将乳腺癌患者血清样品的第一上清液和去除白蛋白和免疫球蛋白后的血清样品进行Western Blot电泳效果比对。结果如图1所示，除去高丰度干扰蛋白的乳腺癌患者血清蛋白样品在Western Blot中的杂质（背景）干扰更少。
（3）血清中巯亚硝基化蛋白的特异性标记
①根据BCA法（参考文献：Walker, J.M., The bicinchoninic acid (BCA) assayfor protein quantitation. Methods Mol Biol, 1994. 32: p. 5-8.）测出上述步骤（2）得到的除去免疫球蛋白和白蛋白的血清蛋白悬液的浓度，用HENS缓冲液调节其浓度为1mg/mL。
②取新的离心管，向其中加入100μL上述得到的1mg/mL的血清蛋白悬液，再向其中加入2μL 1M的MMTS，涡旋震荡1min，避光孵育30min，再管中加入500μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h后取出放入冷冻离心机中，在4℃下1000g离心10min，去除丙酮，得第四滤液和第四沉淀。
③用100μL HENS缓冲液重悬第四沉淀，然后加入2μL iodo TMT，涡旋混匀，再加入4μL 1M抗坏血酸，涡旋混匀，避光孵育2h，然后加入500μL预冷的丙酮，于-20℃静置 1 h，取出放入冷冻离心机中，在4℃下1000 g离心10 min，去除丙酮，得第五滤液和第五沉淀。
④用适量HENS缓冲液重悬第五沉淀，调节其浓度为1mg/mL，即得到特异性标记的巯亚硝基化蛋白的悬液。
（4）血清中巯亚硝基化蛋白的洗脱
步骤①：取新的纯化柱，向纯化柱中加入200μL Anti-TMT树脂，1000g离心1min，去除滤液，然后向步纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅰ洗树脂3次，每次1000g离心1min，得第六沉淀和第六滤液。
步骤②：向装有第六沉淀的纯化柱中加入100μL实施例3中得到的浓度为1mg/mL的TMT标记的样品，孵育2h，1000g离心1min，得第七滤液和第七沉淀。
步骤③：向装有第七沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅱ洗树脂5次，每次5min，1000g离心1min，得第八滤液和第八沉淀。
步骤④：向装有第八沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅰ洗树脂3次，每次1min，1000g离心1min，得第九滤液和第九沉淀。
步骤⑤：向装有第九沉淀的纯化柱中加入200μL双蒸水洗树脂3次，每次1min，1000g 离心1min，得第十滤液和第十沉淀。
步骤⑥：向装有第十沉淀的纯化柱中加入200μL TMT洗脱缓冲液洗脱样品，1000g离心1min，收集洗脱液于新的1.5mL离心管中，即为富集的血清中巯亚硝基化的蛋白溶液。
利用市售的BCA蛋白定量试剂盒（上海生物工程股份有限公司）对富集后的巯亚硝基化蛋白进行定量，计算出蛋白浓度（表1）。然后进行SDS-PAGE凝胶电泳及银染检测，结果如图2所示，发生巯亚硝基化修饰的蛋白被成功富集，3例正常健康组条带与5例乳腺癌患者条带具有显著差异，说明健康人血清中巯亚硝基化蛋白的含量明显低于乳腺癌患者。
表1巯亚硝基化蛋白检测结果示例（分别随机选自3个来源于正常健康者、5个来源于乳腺癌患者的样本）
实施例2本发明试剂盒对乳腺癌患者血清中CYR61-SNO含量的测定
（1）血清样本的采集及预处理
使用不含抗凝剂的真空采血管采集人外周血（清晨空腹），于室温下静置2h使血液分层，小心吸取上层黄色透明血清在4℃条件下2000g离心5min，得第一上清液，然后分装成100μL/管。
（2）血清中的高丰度干扰蛋白的清除
步骤①：将离心柱放到收集管中，依次向柱中加入200μL Protein A琼脂糖和600μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ，3000rpm离心3min，除去滤液，以清洗离心柱，重复上述操作4次，在新的1.5mL离心管中加入115μL步骤（1）中得到的第一上清液和230μL磷酸钠-氯化钠缓冲液，充分混匀后将混合液加到清洗好的离心柱中，置于4℃摇床上1~2h，3000rpm离心3min，得第一滤液和第一沉淀。
步骤②：向装有第一沉淀的离心柱中加入200μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ，3000rpm离心3min，得第二滤液和第二沉淀。
步骤③：合并第一滤液和第二滤液，预冷10min后取500μL混合滤液于新的离心管中，向其中加入362μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h，在4℃下先20000g离心30min，再20000g离心1min，得第三滤液和第三沉淀，用400-600μL HENS缓冲液重悬第三沉淀，得到除去免疫球蛋白和白蛋白的血清蛋白悬液。
（3）血清中巯亚硝基化蛋白的特异性标记
步骤①：根据BCA法（参考文献：Walker, J.M., The bicinchoninic acid (BCA)assay for protein quantitation. Methods Mol Biol, 1994. 32: p. 5-8.）测出上述步骤（2）得到的除去免疫球蛋白和白蛋白的血清蛋白悬液的浓度，用HENS缓冲液调节其浓度为1mg/mL。
步骤②：取新的离心管，向其中加入100μL上述得到的1 mg/mL的血清蛋白悬液，再向其中加入2μL 1M的MMTS，涡旋震荡1min，避光孵育30min，再管中加入500μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h后取出放入冷冻离心机中，在4℃下1000g离心10min，去除丙酮，得第四滤液和第四沉淀。
步骤③：用100μL HENS缓冲液重悬第四沉淀，然后加入2μL iodo TMT，涡旋混匀，再加入4μL 1M的抗坏血酸，涡旋混匀，避光孵育2h，然后加入500μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h，取出放入冷冻离心机中，在4℃下1000g离心10min，去除丙酮，得第五滤液和第五沉淀。
步骤④：用适量HENS缓冲液重悬第五沉淀，调节其浓度为1mg/mL，即得到特异性标记的巯亚硝基化蛋白的悬液。
（4）血清中巯亚硝基化蛋白的洗脱
步骤①：取新的纯化柱，向纯化柱中加入200μL Anti-TMT树脂，1000g离心1min，去除滤液，然后向步纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅰ洗树脂3次，每次1000g离心1min，得第六沉淀和第六滤液。
步骤②：向装有第六沉淀的纯化柱中加入100μL实施例3中得到的浓度为1mg/mL的TMT标记的样品，孵育2h，1000g离心1min，得第七滤液和第七沉淀。
步骤③：向装有第七沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅱ洗树脂5次，每次5min，1000g离心1min，得第八滤液和第八沉淀。
步骤④：向装有第八沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅰ洗树脂3次，每次1min，1000g离心1min，得第九滤液和第九沉淀。
步骤⑤：向装有第九沉淀的纯化柱中加入200μL双蒸水洗树脂3次，每次1min，1000g 离心1min，得第十滤液和第十沉淀。
步骤⑥：向装有第十沉淀的纯化柱中加入200μL TMT洗脱缓冲液洗脱样品，1000g离心1min，收集洗脱液于新的1.5mL离心管中，即为富集的血清中巯亚硝基化的蛋白溶液。
阴性对照血清样品所采集样品为正常健康者血清，处理方式如上述实施例2中步骤（1）至（4）所述。
（5）ELISA法测定血清中CYR61-SNO蛋白的含量
步骤①：鼠抗CYR61与CBS缓冲液以1:500（v/v）稀释，100μL/孔包被过夜，每孔加入150μLBSA封闭液，37℃孵育1.5h，然后拍板弃去孔中液体，加入PBST缓冲液洗板，静置3min，拍板弃去孔中液体。重复上述操作3次。
步骤②：将5μg CYR61标准品1000rpm离心30s，然后向其中加入1μL PBS缓冲液，上下吹打混匀，配置成5000pg/mL的标准品溶液，然后按比例稀释成2500、1250、625、312、156和78pg/mL的标准品梯度稀释液。
向①中清洗后的酶标板的标准孔加入100μL②配好的标准品梯度稀释液；对照孔加入20μL试剂盒中的阴性对照血清样品（3个重复），再加入70μL PBS缓冲液；样品孔中加入20μL检测人群疏亚硝基化蛋白血清样品（5个重复），再加入70μL PBS缓冲液。37℃孵育2h，然后拍板弃去孔中液体，加入PBST缓冲液洗板，静置3min，拍板弃去孔中液体，操作3次。
步骤③：兔抗CYR61与PBS缓冲液以1:4000（v/v）稀释，辣根过氧化物酶标记羊抗兔CYR61与PBS缓冲液以1:2000（v/v）稀释，向②清洗后的酶标板每孔加入100μL稀释好的兔抗CYR61，37℃孵育2h，然后拍板弃去孔中液体，PBST缓冲液洗板，静置3min，拍板弃去孔中液体。重复上述操作操作3次然后每孔加入100μL稀释好的辣根过氧化物酶标记羊抗兔CYR61，37℃孵育1h后每孔加入100μL PNPP酶标底物，避光放置至显著显色，然后每孔加入50μL终止液终止反应，然后在酶标仪测定A450，根据标准品曲线计算出样品孔的CYR61-SNO含量，所得结果（表2）利用GraphPad绘制。结果如图3所示，样品孔血清中CYR61-SNO含量显著高于对照孔中CYR61-SNO含量，表明样品孔中血清为乳腺癌患者血清。
表2健康人与乳腺癌患者血清CYR61-SNO含量（pg/mL）的比较
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，以上所描述的具体的实施例仅为本发明的较佳实施例，并不用于限定本发明，凡依照本发明的精神和原则之内所作的任何的等效的修饰以及变化，均应当包含在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (2)

1.血清CYR61-SNO蛋白作为标志物在制备新型乳腺癌快速检测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的血清CYR61-SNO蛋白作为标志物在制备新型乳腺癌快速检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述新型乳腺癌快速检测试剂盒包括以下组成：
①阴性对照血清：去除高丰度干扰蛋白后且进行巯亚硝基化富集的健康者血清；
②用于富集血清中CYR61-SNO蛋白的试剂：Protein A琼脂糖、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ、磷酸钠-氯化钠缓冲液、丙酮、HENS缓冲液、MMTS、iodo-TMT、抗坏血酸、Anti-TMT树脂、TBS溶液Ⅰ、TBS溶液Ⅱ、TMT洗脱缓冲液；
所述磷酸钠-氯化钠缓冲液：将2.2g Na2HPO4、0.3g NaH2PO4、5.5g NaCl溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH =7.2；
所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ：将50mL 0.2M甘氨酸与3.2mL 0.2M HCl混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH =5；
所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ：将50mL 0.2M甘氨酸与7.3mL 0.2M HCl混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH=3.3；
所述HENS缓冲液：将59.58g Hepes、0.37g EDTA、0.03g新亚铜试剂溶解于1000ml双蒸水中，将混合液与质量分数为1%的SDS按1:25的体积比混合；调节pH=7.7；
所述TBS缓冲液Ⅰ：将8g NaCl、0.2g KCl、3g Tris base溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH=7.4；
所述TBS缓冲液Ⅱ：将0.12g尿素溶解于1mL TBS缓冲液Ⅰ中；调节pH=7.4；
所述TMT洗脱缓冲液：将0.95g Hepes、1.17g NaOH、0.07g EDTA、1.56g 2-ME溶解于双蒸水并定容至200mL；调节pH=7.7；
③用于ELISA法测定血清中CYR61-SNO含量的试剂：CBS稀释液、封闭液、PBST缓冲液、CYR61标准品、PBS缓冲液、兔抗CYR61、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔CYR61、PNPP酶标底物、终止液：
所述CBS缓冲液：将0.15g碳酸钠、0.29g碳酸氢钠、0.02g叠氮钠溶解于双蒸水并定容至100mL；调节pH=9.6；
所述封闭液：将2.5g BSA溶解于250mL CBS缓冲液中，向其中加入125μL Tween-20；调节pH=9.6；
所述PBST缓冲液：将0.5mL Tween-20溶解于1000mL PBS缓冲液中；调节pH=7.4；
所述PBS缓冲液：将0.8g NaCl、0.02g KH2PO4、0.29g Na2HPO4·12H2O、0.02g KCl、0.01g叠氮钠溶解于双蒸水并定容至100mL；调节pH=7.4；
所述PNPP酶标底物：将97ml二乙醇胺、100mg MgCl2溶解于双蒸水并定容至1000mL得到二乙醇胺缓冲液，调节pH=9.8；将10mg PNPP溶于10mL二乙醇胺缓冲液，调节pH=5.5；
所述终止液：将80g NaOH溶解于1L双蒸水中；
所述阴性对照血清的制备方法，包括以下步骤：于清晨空腹使用不含抗凝即得真空采血管采集健康者外周血，于室温下静置2h使血液分层，小心吸取上层黄色透明血清在4℃条件下2000g离心5min，吸取上清；取其中115μL去除白蛋白和免疫球蛋白，得到的蛋白沉淀用HENS缓冲液调节浓度为1mg/mL；取其中100μL蛋白悬液进行巯亚硝基化富集，得到100μL阴性对照血清。
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