CN113583085B - 一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及了一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法。本发明首先选择性地清除血清样品中的高丰度干扰蛋白（白蛋白和免疫球蛋白），然后进一步通过特异性标记结合亲和层析方法对血清中的疏亚硝基化蛋白进行富集。本发明特异性好，操作简单，避免了目前巯亚硝基化蛋白富集操作复杂、杂质影响大、富集效率低的问题。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法。
背景技术
蛋白质巯基亚硝基化（protein S-nitrosylation, SNO）是生物体内一种可逆的氧化还原修饰。通常认为，一氧化氮（Nitric Oxide, NO）修饰蛋白质特殊位置上的半胱氨酸巯基（-SH）生成带有巯亚硝基（-SNO）的产物。巯亚硝基化形成的过程仍在探索之中，目前有三种途径：（1）形成阳离子（nitrosoniumcation, NO+）与半胱氨酸巯基反应；（2）活性氧促进形成蛋白质硫自由基（RS·），RS·与NO直接生成巯亚硝基蛋白；（3）转亚硝基化反应，即从相邻巯基亚硝基化蛋白质中获得-SNO。已有研究表明，蛋白质巯基亚硝基化影响蛋白质活性，进而调控细胞功能，例如参与细胞凋亡，调控离子通道，影响酶活性，调节膜受体功能。进一步地，蛋白质巯亚硝基化与疾病的关系也备受关注，研究巯亚硝基化有助于为癌症防治提供新的思路。
目前使用范围最广的检测蛋白质巯亚硝基化的方法是生物素转化法（BiotinSwitch assay，BSA），主要步骤是：首先利用烷基化试剂封闭蛋白质混合物中的巯基（-SH），然后利用还原性物质，如抗坏血酸盐，将巯亚硝基化蛋白质上的-SNO 还原为-SH，最后利用生物素标记试剂Biotin-HPDP标记被还原半胱氨酸上的-SH。该方法使发生巯亚硝基化的蛋白质都被生物素标记，再使用相应的抗体，利用亲和层析的方法纯化富集目的蛋白质，最后利用蛋白免疫印迹试验（Western Blot，WB)检测生物标记即可检测巯亚硝基化修饰的蛋白质。但是血清样品中成分复杂，在WB过程中可能产生假阳性信号，而本实验中的巯亚硝基化检测，使用非生物素化的iodo-TMT试剂代替Biotin-HPDP，从而在WB中减少了背景。
血清是指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体。血清蛋白质组包含多种疾病生物标志物。一般而言，血清是反映生物体生理状态的体液，因此常用于疾病过程的生物标志物研究。由于血清的稳定作用和维持生物体的稳态，所观察到的成分变化相当小。在筛查试验、临床前阶段的早期疾病检测、微转移检测或“非手术”癌症的诊断中，血液蛋白质组分析是必不可少的诊断方法。然而，其组分的复杂性和巨大的动态范围，加上降解和翻译后修饰的多种机制，以及脂质、盐和其他代谢物的存在而进一步复杂化，这对分析灵敏度、分辨率和重现性构成了真正的挑战。最典型的是血清中关于低丰度蛋白的研究，其检测通常受到白蛋白、免疫球蛋白和其他高丰度血清蛋白的影响。据研究，不同类型血清蛋白在总蛋白中的浓度依次为：白蛋白约占60%，球蛋白约占35%，其余为脂蛋白、铁结合/转移蛋白和生长因子等。因此，分析血清样品中的蛋白质通常需要分离它们的成分，因为白蛋白的存在会阻碍其他蛋白质的鉴定，不仅在基于质谱的研究方法中，而且在二维电泳和蛋白免疫印迹实验中也是如此。
目前，没有关于从血清中富集巯亚硝基化蛋白的方法说明，尤其是缺少在富集前清除干扰蛋白，从而提高富集特异性的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法，其采用磷酸钠-氯化钠缓冲液、ProteinA琼脂糖、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ、丙酮、HENS缓冲液、MMTS、iodo TMT标志试剂、抗坏血酸、Anti-TMT树脂、TBS缓冲液Ⅰ、TBS缓冲液Ⅱ、双蒸水、TMT洗脱缓冲液实现对血清中巯亚硝基化蛋白的富集。
上述的血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法，包括以下步骤：
步骤一，免疫球蛋白和白蛋白的去除，具体如下：
①取人血清，离心得第一上清液；
②将115μL第一上清液和230μL磷酸钠-氯化钠缓冲液充分混合，加入至经 200μLProtein A琼脂糖和600μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ清洗后的离心柱中，置于4℃摇床上1-2h，离心得第一滤液和第一沉淀；
③向装有第一沉淀的离心柱中加入2200μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ，离心得第二滤液和第二沉淀；
④合并第一滤液和第二滤液，预冷10min后取500μL混合滤液，向其中加入362μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h，离心得第三沉淀，用400-600μL HENS缓冲液重悬第三沉淀，并调节其浓度为1mg/mL，即得到除去免疫球蛋白和白蛋白的血清蛋白悬液；
步骤二，巯亚硝基化蛋白的特异性标记，具体如下：
①取100μL步骤一得到的血清蛋白悬液，向其中加入2μL MMTS，涡旋震荡1min，避光孵育30min，再加入500μL预冷的丙酮，-20℃静置1h，离心去除丙酮，得第四沉淀；
②用100μL HENS缓冲液重悬第四沉淀，向其中加入2μL iodo TMT标志试剂，涡旋混匀，再加入4μL抗坏血酸，涡旋混匀，避光孵育2h，然后加入500μL预冷的丙酮，-20℃静置1h，离心去除丙酮，得第五沉淀；
③用400-600μL HENS缓冲液重悬第五沉淀，调节其浓度为1mg/mL，即得到特异性标记的巯亚硝基化蛋白的悬液；
步骤三，巯亚硝基化蛋白的洗脱，具体如下：
①以50μLTBS缓冲液Ⅰ清洗装有200μL Anti-TMT树脂的纯化柱，离心得第六沉淀；
②向装有第六沉淀的纯化柱中中加入100μL步骤二得到的巯亚硝基化蛋白悬液，避光孵育2h，离心得第七沉淀；
②向装有第七沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅱ以清洗Anti-TMT树脂，离心得第八沉淀；
③向装有第八沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅰ以清洗Anti-TMT树脂，离心得第九沉淀；
④向装有第九沉淀的纯化柱中加入200μL双蒸水洗树脂以清洗Anti-TMT树脂，离心得第十沉淀；
⑤向装有第十沉淀的纯化柱中加入200μL TMT洗脱缓冲液以洗脱巯亚硝基化蛋白，离心得到的滤液即为从血清中富集的巯亚硝基化蛋白的溶液。
进一步的，上述方法中：
所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ：将50mL 0.2M甘氨酸与3.2mL 0.2M盐酸混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH =5；
所述磷酸钠-氯化钠缓冲液：将2.2g Na2HPO4、0.3g NaH2PO4、5.5g NaCl溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH =7.2；
所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ：将50mL 0.2M甘氨酸与7.3mL 0.2M盐酸混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH=3.3；
所述HENS缓冲液：将59.58g Hepes、0.37g EDTA、0.03g新亚铜试剂溶解于1000ml双蒸水中；将混合液与质量分数为1%的SDS按1:25的体积比混合；调节pH=7.7；
所述TBS缓冲液Ⅰ：将8g NaCl、0.2g KCl、3g Tris base溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH=7.4；
所述TBS缓冲液Ⅱ：将0.12g尿素溶解于1mL TBS缓冲液Ⅰ中；调节pH=7.4；
所述TMT洗脱缓冲液：将0.95g Hepes、1.17g NaOH、0.07g EDTA、1.56g 2-ME溶解于双蒸水并定容至200mL；调节pH=7.7。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明仅需少量的血清样本即能检测疏亚硝基化蛋白，一般50-100μL即可，并且血清样本可保存于-80℃。
（2）本发明所富集的疏亚硝基化蛋白可采用Western Blot，考马斯亮蓝染色，聚丙烯凝胶酰胺电泳等方法进行检测。
（3）本发明特异性好、准确性高、操作简单，避免了目前蛋白富集操作杂质影响大、准确度较低的问题，为从血清中富集巯亚硝基化蛋白质提供了方向。
附图说明
图1为去除白蛋白和免疫球蛋白前后的考马斯亮蓝染色检测结果；其中，泳道M为蛋白marker，泳道1为未去除白蛋白与免疫球蛋白前的血清样品，泳道2为去除白蛋白与免疫球蛋白后的血清样品。
图2为考马斯亮蓝染色检测不同样品中巯亚硝基化蛋白质；其中，泳道1为第七滤液，泳道2为第八滤液，泳道3为第九滤液，泳道4为第十滤液，泳道5为TMT 洗脱缓冲液洗脱得到的从血清中富集的巯亚硝基化蛋白的溶液，泳道6为第六滤液。
图3为Western Blot比较血清中巯亚硝基化蛋白富集前后的含量；其中，去除高丰度干扰蛋白后富集的血清中巯亚硝基化蛋白上样，泳道2为直接富集的血清中巯亚硝基化蛋白上样。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步详细说明。应当理解，以下实施例仅用于说明本发明，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
本发明所用到的缓冲液及其配置方法如下：
甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ：将50mL 0.2M甘氨酸与3.2mL 0.2M盐酸混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH =5。
磷酸钠-氯化钠缓冲液：将2.2g Na2HPO4、0.3g NaH2PO4、5.5g NaCl溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH =7.2。
甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ：将50mL 0.2M甘氨酸与7.3mL 0.2M盐酸混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH=3.3。
所述HENS缓冲液：将59.58g Hepes、0.37g EDTA、0.03g新亚铜试剂溶解于1000ml双蒸水中。将混合液与质量分数为1%的SDS按1:25的体积比混合；调节pH=7.7；
TBS缓冲液Ⅰ：将8g NaCl、0.2g KCl、3g Tris base溶解于双蒸水并定容至1000mL；pH=7.4。
TBS缓冲液Ⅱ：将0.12g尿素溶解于1mL TBS缓冲液Ⅰ中；pH=7.4。
所述TMT洗脱缓冲液：将0.95g Hepes、1.17g NaOH、0.07g EDTA、1.56g 2-ME溶解于双蒸水并定容至200mL；调节pH=7.7。
实施例1
用不含有抗凝剂的真空采血管采集空腹的人或动物的外周血。将所采集的样品于4℃静置6h，待样品充分凝结后小心吸取上清至1.5mL离心管中，2000g离心5min，得第一上清液，将第一上清液转移至新的1.5mL离心管，避免分装过程中使沉淀分散，并将样品以100μL/管分装，并置于-80℃保存，以避免样品的反复冻融。
实施例2
（1）将离心柱放到收集管中，依次向柱中加入200μL Protein A琼脂糖和600μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ，3000rpm离心3min，除去滤液，以清洗离心柱，重复上述操作4次，在新的1.5mL离心管中加入115μL实施例1中得到的第一上清液和230μL 0.1M磷酸钠-氯化钠缓冲液，充分混匀后将混合液加到清洗好的离心柱中，置于4℃摇床上1-2h，3000rpm离心3min，得第一滤液和第一沉淀。
（2）向装有第一沉淀的离心柱中加入2200μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ，3000rpm离心3min，得第二滤液和第二沉淀。
（3）合并第一滤液和第二滤液，预冷10min后取500μL混合滤液于新的离心管中，向其中加入362μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h，在4℃下先20000g离心30min，再20000g离心1min，得第三滤液和第三沉淀，用400-600μL HENS缓冲液重悬第三沉淀，得到除去高丰度干扰蛋白（免疫球蛋白和白蛋白）的血清蛋白悬液。
（4）将第一上清液和去除白蛋白和免疫球蛋白后的血清样品进行SDS-PAGE电泳效果比对。结果如图1所示，去除白蛋白和免疫球蛋白后的血清样品中，蛋白质明显减少。
实施例3
（1）根据BCA法（参考文献：Walker, J.M., The bicinchoninic acid (BCA)assay for protein quantitation. Methods Mol Biol, 1994. 32: p. 5-8.）测出实施例2步骤（3）得到的蛋白悬液的蛋白质浓度，用HENS缓冲液调节其浓度为1mg/mL。
（2）取新的离心管，向其中加入100μL步骤（1）中得到的蛋白质浓度1mg/mL的血清，再向其中加入2μL 1M的MMTS，涡旋震荡1min，避光孵育30min，再管中加入500μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h后取出放入冷冻离心机中，在4℃下1000g离心10min，去除丙酮，得第四滤液和第四沉淀；
（3）向第四沉淀中加入100μL HENS缓冲液重悬，然后加入2μL iodo TMT（赛默飞科技有限公司），涡旋混匀，再加入4μL 1M抗坏血酸，涡旋混匀，避光孵育2h，然后加入500μL预冷的丙酮，于-20℃静置1 h，取出放入冷冻离心机中，在4℃下1000g离心10min，去除丙酮，得第五滤液和第五沉淀；
（4）用400-600μL HENS缓冲液重悬第五沉淀，调节其浓度为1mg/mL，即得到特异性标记的巯亚硝基化蛋白的悬液。
实施例4
（1）取新的纯化柱，向纯化柱中加入200μL Anti-TMT树脂（赛默飞科技有限公司），1000g离心1min，去除滤液，然后向步纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅰ洗树脂3次，每次1000g离心1min，得第六沉淀和第六滤液；
（2）向装有第六沉淀的纯化柱中加入100μL实施例3中得到的浓度为1mg/mL的TMT标记的样品，孵育2h，1000g离心1min，得第七滤液和第七沉淀；
（3）向装有第七沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅱ洗树脂5次，每次5min，1000g离心1min，得第八滤液和第八沉淀；
（4）向装有第八沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅰ洗树脂3次，每次1min，1000g离心1min，得第九滤液和第九沉淀；
（5）向装有第九沉淀的纯化柱中加入200μL双蒸水洗树脂3次，每次1min，1000g离心1min，得第十滤液和第十沉淀；
（6）向装有第十沉淀的纯化柱中加入200μL TMT洗脱缓冲液洗脱样品，1000g离心1min，收集洗脱液于新的1.5mL离心管中，即为富集的血清中巯亚硝基化的蛋白溶液；
（7）将第六滤液、第七滤液、第八滤液、第九滤液、第十滤液和富集的血清中巯亚硝基化的蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳效果比对。结果如图2所示，第七滤液至第十滤液泳道中，条带逐渐变浅，富集的血清中巯亚硝基化的蛋白溶液的泳道中有蛋白条带，说明蛋白样品与抗TMT树脂孵育后离心，又经过缓冲液及双蒸水洗脱，即除去杂蛋白，用TMT 洗脱缓冲液洗脱，可得到标记好的巯亚硝基化蛋白。
实施例5
（1）根据BCA法测出实施例1的血清样品蛋白质浓度，HENS缓冲液调节蛋白质浓度为1mg/mL，取100μL调节浓度后的血清样本于新的离心管中，除无需进行血清中高丰度干扰蛋白的选择性清除，其余操作步骤同实施例3至4。然后分别取3μL本实施例上述步骤所得的富集的血清中巯亚硝基化蛋白和3μL实施例4中步骤（6）所得到的去除高丰度干扰蛋白后富集的血清中巯亚硝基化蛋白进行BCA法蛋白浓度测定，根据如下公式，计算血清中疏亚硝基化蛋白的富集率为6%。
（2）将本实施例步骤（1）所得的富集的血清中巯亚硝基化蛋白和实施例4中步骤（6）所得到的去除高丰度干扰蛋白后富集的血清中巯亚硝基化蛋白进行Western Blot 效果比对。结果如图3所示，去除高丰度干扰蛋白后血清中巯亚硝基化蛋白富集率更高。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，以上所描述的具体的实施例仅为本发明的较佳实施例，并不用于限定本发明，凡依照本发明的精神和原则之内所作的任何的等效的修饰以及变化，均应当包含在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (1)
1.一种血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法，其特征在于：其采用磷酸钠-氯化钠缓冲液、Protein A琼脂糖、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ、甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ、丙酮、HENS缓冲液、MMTS、iodo TMT标志试剂、抗坏血酸、Anti-TMT树脂、TBS缓冲液Ⅰ、TBS缓冲液Ⅱ、双蒸水、TMT洗脱缓冲液实现对血清中巯亚硝基化蛋白的富集；
所述的血清中巯亚硝基化蛋白的富集方法，包括以下步骤：
步骤一，免疫球蛋白和白蛋白的去除，具体如下：
①取人血清，离心得第一上清液；
②将115μL第一上清液和230μL磷酸钠-氯化钠缓冲液充分混合，加入至经 200μLProtein A琼脂糖和600μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ清洗后的离心柱中，置于4℃摇床上1-2h，离心得第一滤液和第一沉淀；
③向装有第一沉淀的离心柱中加入2200μL甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ，离心得第二滤液和第二沉淀；
④合并第一滤液和第二滤液，预冷10min后取500μL混合滤液，向其中加入362μL预冷的丙酮，于-20℃静置1h，离心得第三沉淀，用400-600μL HENS缓冲液重悬第三沉淀，并调节其浓度为1mg/mL，即得到除去免疫球蛋白和白蛋白的血清蛋白悬液；
步骤二，巯亚硝基化蛋白的特异性标记，具体如下：
①取100μL步骤一得到的血清蛋白悬液，向其中加入2μL MMTS，涡旋震荡1min，避光孵育30min，再加入500μL预冷的丙酮，-20℃静置1h，离心去除丙酮，得第四沉淀；
②用100μL HENS缓冲液重悬第四沉淀，向其中加入2μL iodo TMT标志试剂，涡旋混匀，再加入4μL抗坏血酸，涡旋混匀，避光孵育2h，然后加入500μL预冷的丙酮，-20℃静置1h，离心去除丙酮，得第五沉淀；
③用400-600μL HENS缓冲液重悬第五沉淀，调节其浓度为1mg/mL，即得到特异性标记的巯亚硝基化蛋白的悬液；
步骤三，巯亚硝基化蛋白的洗脱，具体如下：
①以50μL TBS缓冲液Ⅰ清洗装有200μL Anti-TMT树脂的纯化柱，离心得第六沉淀；
②向装有第六沉淀的纯化柱中中加入100μL步骤二得到的巯亚硝基化蛋白悬液，避光孵育2h，离心得第七沉淀；
③向装有第七沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅱ以清洗Anti-TMT树脂，离心得第八沉淀；
④向装有第八沉淀的纯化柱中加入200μL TBS缓冲液Ⅰ以清洗Anti-TMT树脂，离心得第九沉淀；
⑤向装有第九沉淀的纯化柱中加入200μL双蒸水洗树脂以清洗Anti-TMT树脂，离心得第十沉淀；
⑥向装有第十沉淀的纯化柱中加入200μL TMT洗脱缓冲液以洗脱巯亚硝基化蛋白，离心得到的滤液即为从血清中富集的巯亚硝基化蛋白的溶液；
所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅰ：将50mL 0.2M甘氨酸与3.2mL 0.2M盐酸混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH =5；
所述磷酸钠-氯化钠缓冲液：将2.2g Na2HPO4、0.3g NaH2PO4、5.5g NaCl溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH =7.2；
所述甘氨酸-盐酸缓冲液Ⅱ：将50mL 0.2M甘氨酸与7.3mL 0.2M盐酸混合，加双蒸水定容至200mL；调节pH=3.3；
所述HENS缓冲液：将59.58g Hepes、0.37g EDTA、0.03g新亚铜试剂溶解于1000ml双蒸水中；将混合液与质量分数为1%的SDS按1:25的体积比混合；调节pH=7.7；
所述TBS缓冲液Ⅰ：将8g NaCl、0.2g KCl、3g Tris base溶解于双蒸水并定容至1000mL；调节pH=7.4；
所述TBS缓冲液Ⅱ：将0.12g尿素溶解于1mL TBS缓冲液Ⅰ中；调节pH=7.4；
所述TMT洗脱缓冲液：将0.95g Hepes、1.17g NaOH、0.07g EDTA、1.56g 2-ME溶解于双蒸水并定容至200mL；调节pH=7.7。
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| CN101575370A (zh) * | 2009-06-19 | 2009-11-11 | 暨南大学 | 一种富集血清中低丰度蛋白的方法 |
| CN103288953A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-09-11 | 大连理工大学 | 一种血浆中功能性蛋白质的分离纯化方法 |
| CN107305172A (zh) * | 2016-04-25 | 2017-10-31 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于疏水基团修饰的蛋白质n-端富集方法 |
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| Proteomic Quantification and Site-Mapping of S Nitrosylated Proteins Using Isobaric iodoTMT Reagents;Zhe Qu;《Journal of Proteome Research》;第13卷(第7期);第3200-3211页 * |
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