CN113583111B - 一种高品质藻蓝蛋白色素的高压二氧化碳非热提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高品质藻蓝蛋白色素的高压二氧化碳非热提取方法，涉及天然产物深加工技术领域。本发明利用高压二氧化碳的高压、无氧、爆破效应使得细胞破碎，提取藻蓝蛋白，分离取上清，获得高品质藻蓝蛋白水溶液，可直接用于后续加工处理。发明人发现高压二氧化碳技术对细胞破壁具有一定选择性，采用该方法得到的藻蓝蛋白水溶液纯度较高。上述方法也可用作其他藻类物质的藻蓝蛋白提取。该藻蓝蛋白水溶液提取方法的优点是：操作简单，提取时间短，重复性好，节能环保，提取品质好，可工业化生产，并且是首次将高压二氧化碳杀菌技术应用于蛋白提取。提取获得的高纯度藻蓝蛋白水溶液为高附加值天然色素的提取研究、工业化生产提供了科学依据。

Description

一种高品质藻蓝蛋白色素的高压二氧化碳非热提取方法
技术领域
本发明涉及天然产物深加工技术领域，具体而言，涉及一种高品质藻蓝蛋白色素的高压二氧化碳非热提取方法。
背景技术
食品“清洁标签”(Clean label)追求“天然、健康、安全”的产品理念，已成为全球食品产业发展新趋势，使用天然色素是未来食品消费的必然要求。“天然无添加，成分简单，过程不复杂”是“清洁标签”产品的核心内容，而合成色素具有潜在的致癌风险，合成色素及其生产过程中带入的铅砷等污染物都会影响消费者健康，因此不少食品生产企业选择使用天然色素取代以往的合成色素，以满足消费者对天然食品的需求，保障消费者健康。三原色中，红黄色调的天然色素居多，而蓝色素则相对罕见。在我国GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定的着色剂中天然蓝色素只有栀子蓝、藻蓝，仅占3％，使其在国内外市场上供不应求，因此研究天然蓝色素具有极大现实意义和诱人前景。
藻蓝蛋白(C-phycocyanin，C-PC)，由开链四吡咯环与脱辅蛋白通过硫醚键连接形成，含有α(18.2kDa)和β(19.3kDa)两条多肽链，3个发色团分别连接在α-84、β-84和β-155位上，α和β亚基通过分子间相互作用力先形成单体(αβ)，再借助连接多肽的作用聚合成(αβ)3和[(αβ)3]2，主要以三聚体和六聚体的形式存在。C-PC是一种高效捕光蛋白，与别藻蓝蛋白(Allophycocyanin,APC)和藻红蛋白(Phycperythrin,PE)共同组成藻类捕获光能的重要装置——藻胆蛋白(Phycobiliprotein,PBP)，C-PC也是一种具有荧光性质的水溶性天然蓝色素，无毒、清亮且对人体有出色的健康裨益。因此它在光合作用的原初反应机理探究、生物体内荧光示踪物质研究以及食品、药品、化妆品等天然色素添加剂开发上均存在重要意义，用途广泛，市场前景广阔。
C-PC主要来源于蓝藻和隐藻。螺旋藻(Spirulina)是目前大规模养殖的一种原核蓝藻物种，具有蛋白质含量高，繁殖快等优点，被联合国粮农组织推荐为“人类明天最理想的食物”，其中C-PC含量高达干重的20％，细胞壁是易消化吸收的多糖类物质，是C-PC生产高效经济的首选，目前C-PC商业化生产主要用钝顶螺旋藻和极大螺旋藻。我国是螺旋藻的生产大国，目前中国共有螺旋藻工厂近70家，养殖总面积约750万平方米，年产量超过9000吨，占国际市场的60％以上，但是我国的螺旋藻开发大多以原料、藻片或胶囊的形式出口，很少有深加工产品，这在一定程度上限制了我国螺旋藻产业的发展。
目前，C-PC分离纯化困难，提取工艺复杂，受光照、温度、微生物等影响容易变性，极大的限制了其工业化生产的发展。目前，螺旋藻中C-PC色素提取的方法包括反复冻融法、自热溶胀法、超声波破碎法、酶溶法、多功能硅胶法等方法，然而反复冻融法需要保持4℃长达4～8h，耗时耗能，得率过低，不适用于工业化生产；自热溶胀法一般需要10-20天，且破壁效率低，溶液导致微生物大量繁殖腐败；超声法需要在特定低浓度的藻细胞溶液中提取，而在高浓度的藻细胞溶液中难以实现超声波的传播，此外，低浓度的藻细胞溶液也带来了干燥难的问题；多功能硅胶材料的制备较为复杂，工艺繁琐，粗提取过程需要耗费4h之久，耗时耗能；低盐絮凝法得到的藻蓝蛋白水溶液纯度较低，纯度为0.4～2.0，纯度在0.7以下的产品不满足食品级要求。
综上，目前藻蓝蛋白的提取方法还处于实验室研究阶段，没有适合工业化生产的较好工艺方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高品质藻蓝蛋白色素的高压二氧化碳非热提取方法以解决上述技术问题。开发简便、快速、高效的C-PC色素非热提取工艺，提高螺旋藻C-PC色素产品纯度等品质是目前螺旋藻C-PC色素的规模化开发利用中亟待解决的关键问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种藻蓝蛋白的提取方法，其包括：将待处理物采用高压二氧化碳进行处理，然后分离上清液即为藻蓝蛋白；高压二氧化碳的处理条件是在二氧化碳反应釜中以2-15MPa压力处理5-45min；待处理物为含有藻蓝蛋白的藻类。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述高压二氧化碳的处理温度为25-35℃。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述高压二氧化碳的处理压力是2-7MPa，处理时间为10-30min。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述含有藻蓝蛋白的藻类选自如下的至少一种藻类：蓝藻纲、红藻纲、隐藻纲和甲藻纲。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述蓝藻纲选自如下至少一种的藻类：螺旋藻、鱼腥藻和水华蓝藻。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待处理物为干粉或湿态物质。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述在采用高压二氧化碳进行处理前，还包括将待处理物置于浸泡液中进行浸泡。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述在柠檬酸盐溶液中进行浸泡；优选地，柠檬酸盐为柠檬酸三钠，柠檬酸盐的质量浓度为0.1～2.0％。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待处理物与浸泡液的混合比为1:10～1:50(g/mL)。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述分离上清液是指通过离心取上清液；
优选地，离心速度为3000-10000rpm，离心时间为10-30min。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种利用高压二氧化碳技术辅助提取藻蓝蛋白的方法，具体利用高压二氧化碳的高压、无氧、爆破效应使得细胞破碎，提取藻蓝蛋白，分离取上清，获得高品质藻蓝蛋白水溶液，可直接用于后续加工处理。发明人发现高压二氧化碳技术对细胞破壁具有一定选择性，因此，采用该方法得到的藻蓝蛋白水溶液纯度较高。上述方法也可用作其他藻类物质的藻蓝蛋白提取。该藻蓝蛋白水溶液提取方法的优点是：操作简单，提取时间短，重复性好，节能环保，提取品质好，可工业化生产，并且是首次将高压二氧化碳杀菌技术应用于蛋白提取。提取获得的高纯度藻蓝蛋白水溶液，为高附加值天然色素的提取研究、工业化生产提供了科学依据。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
1951，Fraser首次发现HPCD(High Pressure Carbon Dioxide，高压二氧化碳)能够非热条件下杀灭细菌细胞的现象，并将结果发表在Nature杂志上：通过突然释放加压的Ar、N2、N2O和CO2等气体(1.7～6.2MPa)，Fraser对液体介质中的大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)细胞进行爆破，并收集其成分后，发现CO2在压强为3.45MPa、温度为37～38℃时E.coli数量降低了95～99％(Fraser,1951)。
近半个世纪来，不少学者陆续展开了在该领域的研究，尽管有不少学者对HPCD的杀菌机理做出研究，目前被广泛认可的是比利时学者Garcia-Gonzalez等(2007)提出的“七步”机理：(1)CO2溶解在细胞外部的液态环境中，导致细胞外部pH值(pHex)降低；(2)细胞膜改性；(3)细胞内部的pH值(pHin)降低；(4)关键酶钝化或者由于pHin降低导致细胞代谢受抑制；(5)CO2和HCO3-对新陈代谢的直接抑制作用；(6)细胞内部电解平衡被扰乱；(7)细胞或细胞膜的关键组分流失。Garcia-Gonzalez同时认为，这些复杂地机理同时发生并非连续地发生。
发明人发现：藻蓝蛋白在固液分离提取工艺上与微生物杀灭具有相似的机理，通过破坏细胞结构、使细胞内物质溢出。因此，本发明拟采用HPCD作为提取藻蓝蛋白的手段。
具体地，藻蓝蛋白的提取方法包括：先将待处理物采用高压二氧化碳进行处理，然后分离上清液即为藻蓝蛋白；而高压二氧化碳的处理条件是在二氧化碳反应釜中以2-15MPa压力处理5-45min；待处理物为含有藻蓝蛋白的藻类。
发明人发现在上述压力条件和处理时间条件下可以实现藻类物质的破壁，同时又可以满足藻蓝蛋白以较高的稳定性溶出，在上述处理条件下可以满足快速破壁，经分离上清液即可制得较高纯度的藻蓝蛋白，可直接用于后续加工处理。发明人发现高压二氧化碳技术对细胞破壁具有一定选择性，因此，采用该方法得到的藻蓝蛋白水溶液纯度较高。
该藻蓝蛋白水溶液提取方法的优点是：操作简单，提取时间短，重复性好，节能环保，提取品质好，可工业化生产，并且是首次将高压二氧化碳杀菌技术应用于蛋白提取。
此外，发明人发现由于藻蓝蛋白由开链四吡咯环和脱辅蛋白通过硫醚键连接形成，稳定性受开链四吡咯环和蛋白的影响，氧、自由基、高温、光照、pH值以及微生物均会影响色素稳定性。上述因素使得藻蓝蛋白提取保存困难，无法满足市场对藻蓝蛋白的需求。而采用本发明提供的提取方法可以获得稳定性较好的藻蓝蛋白。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述高压二氧化碳的处理温度为25-35℃。例如可以是25℃、27℃、28℃、29℃、30℃、32℃、34℃或35℃。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述高压二氧化碳的处理压力是2-7MPa，处理时间为10-30min。
反应釜中的处理压力可以是2MPa、3MPa、4MPa、5MPa、6MPa或7MPa。处理时间可以是10min、15min、18min、20min、25min、28min或30min。在其他实施方式中，上述处理条件也可以根据需要进行自适应调整，并不限于上述列举的处理条件。
上述方法也可用作其他藻类物质的藻蓝蛋白提取。具体地，上述含有藻蓝蛋白的藻类选自如下的至少一种藻类：蓝藻(Cyanophyta)纲、红藻(Rhodophyta)纲、隐藻(Cryptophyta)纲和甲藻(Pyrrophyta)纲。
蓝藻纲选自如下至少一种的藻类：螺旋藻、鱼腥藻和水华蓝藻。
螺旋藻可以是钝顶螺旋藻或极大螺旋藻。
在一种实施方式中上述含有藻蓝蛋白的藻类可以选自钝顶节旋藻、水华束丝藻或克拉马斯藻。
本发明中的藻类物质还涉及藻胆蛋白含量至少等于生物质干重的20％的光合微藻(特别是蓝细菌，更特别是钝顶节旋藻)生物质或生物质混合物。在一种实施方案中，生物质的藻胆蛋白含量至少等于生物质干重的21％、22％、23％、24％或25％。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待处理物为干粉或湿态物质。例如蓝藻的新鲜藻体或干藻粉。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述在采用高压二氧化碳进行处理前，还包括将待处理物置于浸泡液中进行浸泡。通过浸泡处理以使得待处理物悬浮于浸泡液中，以便于后续的高压二氧化碳的破壁处理。在一种实施方式中，若待处理物就是悬浮状态，可以根据需要选择不需要进行浸泡处理。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述在柠檬酸盐溶液中进行浸泡；优选地，柠檬酸盐为柠檬酸三钠，柠檬酸盐的质量浓度为0.1～2.0％。
在其他实施方式中，上述柠檬酸盐可以柠檬酸二价和三价金属盐，例如柠檬酸镁盐、柠檬酸铝盐等。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待处理物与浸泡液的混合比为1:10～1:50(g/mL)。
在一种实施方式中，上述待处理物与浸泡液的混合比为1:20(g/mL)、1:25(g/mL)、1:30(g/mL)、1:35(g/mL)、1:40(g/mL)或1:45(g/mL)。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述分离上清液是指通过离心取上清液；优选地，离心速度为3000-10000rpm，离心时间为10-30min。
在上述离心条件下可以保证上清液中的藻蓝蛋白保持较高的稳定性和活性。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种高品质螺旋藻藻蓝蛋白色素的提取方法。提取方法包括如下依次进行的步骤：
(1)准备待处理样品：螺旋藻干粉(80目，购自江西丹霞生物科技股份有限公司)。
(2)提取：
使用溶剂悬浮螺旋藻干粉：将螺旋藻干粉以1:30(g/mL)的料液比溶解在质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液中，搅拌均匀；
高压二氧化碳辅助破壁：将上述的固液混合物置于高压二氧化碳装置反应釜中，以7MPa压力处理5min，处理温度为25℃；
离心得藻蓝蛋白水溶液：对固液混合物以5000rpm的离心速度处理20min，取上清液即为藻蓝蛋白水溶液。
实施例2
本实施例提供了一种高品质螺旋藻藻蓝蛋白色素的提取方法。提取方法包括如下依次进行的步骤：
(1)准备待处理样品：螺旋藻的柠檬酸三钠悬浮液(螺旋藻与0.5％的柠檬酸三钠的料液比为1:20(g/mL))。
(2)提取：
高压二氧化碳辅助破壁：将上述的悬浮液置于高压二氧化碳装置反应釜中，以5MPa压力处理8min；
离心得藻蓝蛋白水溶液：对固液混合物以8000rpm的离心速度处理10min，取上清液即为藻蓝蛋白水溶液。
实施例3
与实施例1相比，区别仅在于高压二氧化碳辅助破壁条件不同，以2MPa压力处理10min。
实施例4
与实施例1相比，区别仅在于高压二氧化碳辅助破壁条件不同，以5MPa压力处理15min。
实施例5
与实施例1相比，区别仅在于高压二氧化碳辅助破壁条件不同，以7MPa压力处理20min。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于高压二氧化碳辅助破壁条件不同，以0.01MPa压力处理5min。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于高压二氧化碳辅助破壁条件不同，以0.01MPa压力处理20min。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于高压二氧化碳辅助破壁条件不同，以0.01MPa压力处理45min。
实验例1
使用紫外可见分光光度计测定实施例1-14以及对比例1-3的藻蓝蛋白水溶液在620nm和280nm处的吸光值，计算公式为：纯度＝A620 nm/A280 nm。
紫外可见分光光度计测定所得藻蓝蛋白水溶液纯度：A620/A280>2.0，可以达到食品级要求。
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 对比例1 对比例2 对比例3
A280 0.242 0.262 0.241 0.305 0.351 0.248 0.245 0.270
A620 0.555 0.652 0.505 0.745 0.857 0.354 0.383 0.378
纯度 2.293 2.489 2.095 2.443 2.442 1.427 1.563 1.400
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，其包括：将待处理物采用高压二氧化碳进行处理，然后分离上清液即为藻蓝蛋白；所述高压二氧化碳的处理条件是在二氧化碳反应釜中以2-7MPa压力处理5-45min；所述待处理物为含有藻蓝蛋白的藻类；所述高压二氧化碳的处理温度为25-35℃；在采用高压二氧化碳进行处理前，还包括将待处理物置于浸泡液中进行浸泡；
所述浸泡液为柠檬酸盐；柠檬酸盐的质量浓度为0.1~2.0%。
2.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述高压二氧化碳的处理时间为10-30min。
3.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述含有藻蓝蛋白的藻类选自如下的至少一种藻类：蓝藻纲、红藻纲、隐藻纲和甲藻纲。
4.根据权利要求3所述的藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述蓝藻纲选自如下至少一种的藻类：螺旋藻、鱼腥藻和水华蓝藻。
5.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述待处理物为干粉或湿态物质。
6.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠。
7.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，待处理物与浸泡液的混合比为1:10~1:50（g/mL）。
8.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述分离上清液是指通过离心取上清液。
9.根据权利要求8所述的藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，离心速度为3000-10000rpm，离心时间为10-30 min。
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