CN113577537B - 一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜及其制备方法 - Google Patents

一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜及其制备方法，所述膜是在P(VDF‑TrFE)膜上形成依次交替分布的正极化条带区域、非极化条带区域、及负极化条带区域，从而形成正负表面电势图案化分布，且所述的正极化条带区域、非极化条带区域、负极化条带区域中各条带的线宽为50‑200μm。其制备方法为：采用所需图案化的微电极，将P(VDF‑TrFE)滴涂于图案化微电极上形成膜，最后通过接触极化，产生表面电势图案化分布。本发明方法最终制得正负表面电势图案化规律分布的P(VDF‑TrFE)膜，可有效改变细胞微环境变化，引导细胞成骨分化和成骨能力的增强，为口腔大缺损的牙槽骨再生提供了新一代辅材。

Description

一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜及其制 备方法
技术领域
本发明属于骨修复材料技术领域，涉及一种骨再生膜及其制备方法，具体涉及一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜及其制备方法。
背景技术
对骨缺损部位采用外科手术植入材料进行骨再生是临床上常用手段之一。植入体表面骨的形成及其快慢主要取决于材料表面合适的干细胞生长微环境。通过表面物理特性运用 (电、磁、光、力)等方式，构建合适细胞生长微环境促进骨再生是当前生物材料研究的重要前沿领域。
有研究表明，具有自发极化特性的铁电聚合物能在极化处理后使得材料表面带电，并增强骨髓间充质干细胞的成骨能力，例如CN 109453431A申请公开了一种表面电势大小可控的带电骨修复薄膜，从而改善骨修复效果受限的问题。但是由于骨再生过程中需要在不同的生理电微环境进行响应，而目前研制出的带电骨修复薄膜，材料表面电势分布无法与骨再生所需的不同生理电微环境相适应，对最终修复效果产生了一定限制。因此，如何能获得不同电活性分布的材料以达到促进骨再生目的成为当下研究的难点以及重点问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出了一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜及其制备方法。本发明采用的技术方案如下：
一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜，其是通过在P(VDF-TrFE)膜上形成依次交替分布的正极化条带区域、非极化条带区域及负极化条带区域，从而形成正负表面电势图案化分布，且所述的正极化条带区域、非极化条带区域、负极化条带区域中各条带的线宽为50-200μm。
优选地，所述的电活性引导骨再生膜是先在P(VDF-TrFE)膜上形成平面叉指型微电极，再分别施加正、负极化电压进行极化所形成的。
优选地，基板为所需图案化的微电极，如光刻氧化铟锡(ITO)平面叉指型微电极。
优选地，所述的正负极化条带均为直线型，二者之间形成直线型的非极化条带。
优选地，所述的正负极化条带均为螺旋型，二者螺旋的方向一致且二者之间形成螺旋型的非极化条带。
优选地，当所述的正负极化条带均为螺旋型时，所述的正极化条带、负极化条带的螺旋是右螺旋，即由外向内按照顺时针方向旋转
本发明同时提供了一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)以所需图案化的微电极为基板，如光刻氧化铟锡(ITO)平面叉指型微电极；
(2)称取P(VDF-TrFE)粉末，加入有机溶剂中，并置于磁力搅拌器上搅拌，使溶液搅拌均匀，得到混合溶液；
(3)将所述步骤(2)所得的混合溶液，使用移液枪吸取一定体积，滴涂至所述步骤(1) 获得的基板上，37℃干燥，得到一种高分子薄膜；
(4)将所述步骤(3)所得高分子薄膜经过退火处理；
(5)将所述步骤(4)所得的高分子薄膜进行所需图案的平面叉指型微电极区域接触极化处理，得到一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜。
优选地，有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，步骤(5)中，极化时间为3min-10min，极化电压为左侧电极接正1.0kV-4.0kV、右侧电极接负1.0kV-4.0kV。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过在P(VDF-TrFE)膜上形成亚毫米宽(200μm-50μm)的正极化条带区域、非极化条带区域及负极化条带区域三种不同电活性条带区域薄膜，引导细胞在同一区域条带内细胞响应状态一致，不同区域条带上的细胞响应状态不同，由此获得不同细胞生长阶段皆具有高细胞成骨响应的电活性引导骨再生膜。
(2)本发明通过调整条带的图案化分布(直线或螺旋)，即所需图案的平面叉指型微电极，在P(VDF-TrFE)膜上构建所需的薄膜表面电势正负以及图案分布(直线或螺旋)，有效引导细胞骨架方向趋向于所需图案化方向分布。
综上所述，本发明的正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜通过控制亚毫米宽(200μm-50μm)的正负极化条带来调控条带内个体细胞响应状态以及不同电活性条带之间不同细胞响应状态；通过控制不同电活性条带的图案化分布来调控细胞骨架方向。由此亚毫米宽正负表面电势图案化分布作用于细胞上，引导细胞响应状态以及细胞骨架方向改变，最终细胞表现出成骨分化的潜能，并且在骨缺损区域植入后具有良好的骨缺损修复能力。通过对比正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜修复大鼠颅骨缺损实验中实验组与无图案极化材料对照组的Micro-CT照片，可以看到本发明相对于现有技术在骨缺损修复能力上的明显优势。
本发明所采用的材料具有良好的稳定性，可以通过二次手术的方式完整取出植入薄膜，在临床应用上具有发展潜能。为口腔大缺损的牙槽骨再生提供了一种新型功能性材料。此外本发明的制备方法工艺简单，易于实现，有利于推广应用。
附图说明
图1是正负表面电势图案化分布的带电骨修复薄膜表面电势分布概念图；
图2是图案化分布的平面叉指微电极显微镜图片；
图3是实施例1中正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜界面处的压电力显微镜图片；
图4是实施例1中正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜上作用大鼠骨髓间充质干细胞24小时后粘附和铺展情况的激光共聚焦显微镜照片；
图5是实施例1中正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜修复大鼠颅骨缺损实验中实验组(右侧)与无图案极化材料对照组(左侧)的Micro-CT照片；
图6是实施例1、实施例5、实施例6以及实施例7中正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜上作用大鼠骨髓间充质干细胞7天后细胞成骨分化能力结果；
图7是实施例1、实施例3以及实施例4中正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜上作用大鼠骨髓间充质干细胞7天后细胞成骨分化能力结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于此。
实施例1
(1)线宽为100μm呈电极区域玻璃区域交替分布的直线型平面叉指型氧化铟锡(ITO)微电极基板；
(2)称取1g P(VDF-TrFE)粉末，加入5.5ml N,N-二甲基甲酰胺中，并置于磁力搅拌器上搅拌2h，使聚合物混合均匀，得到混合溶液；
(3)将所述步骤(2)所得的混合溶液，使用移液枪吸取50μL，滴涂至所述步骤(1)获得的基板上，37℃干燥，得到一种高分子薄膜；
(4)将所述步骤(3)所得高分子薄膜经过退火处理，退火温度为210℃，退火时间为1h；
(5)将所述步骤(4)所得的高分子薄膜进行微电极区域接触极化处理，左侧电极极化电压为正3.3kV，右侧电极极化电压为负3.3kV，极化时间为3min，得到一种正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜。
本例制得的直线型平面叉指微电极如图2(a)所示，图3的压电力显微镜图片，证明正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜呈图案化分布。图4显示正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜可以调控大鼠骨髓间充质干细胞取向呈一定方向铺展。图5显示正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜可以显著提高骨缺损处的骨修复能力。
实施例2
(1)线宽为100μm呈电极区域玻璃区域交替分布的折线型平面叉指型氧化铟锡(ITO)微电极基板；
(2)称取1g P(VDF-TrFE)粉末，加入5.5ml N,N-二甲基甲酰胺中，并置于磁力搅拌器上搅拌2h，使聚合物混合均匀，得到混合溶液；
(3)将所述步骤(2)所得的混合溶液，使用移液枪吸取50μL，滴涂至所述步骤(1)获得的基板上，37℃干燥，得到一种高分子薄膜；
(4)将所述步骤(3)所得高分子薄膜经过退火处理，退火温度为210℃，退火时间为1h；
(5)将所述步骤(4)所得的高分子薄膜进行微电极区域接触极化处理，左侧电极极化电压为正3.3kV，右侧电极极化电压为负3.3kV，极化时间为3min，得到一种正负表面电势折线型分布的电活性引导骨再生膜。
本例制得的折线型平面叉指微电极如图2(b)所示。本实例中的折线型薄膜显示出较差的细胞成骨分化能力，而本发明的直线型和螺旋型高电活性引导骨再生膜则显示出很高的成骨能力。
实施例3
(1)线宽为100μm呈电极区域玻璃区域交替分布的左螺旋型平面叉指型氧化铟锡(ITO) 微电极基板；
(2)称取1g P(VDF-TrFE)粉末，加入5.5ml N,N-二甲基甲酰胺中，并置于磁力搅拌器上搅拌2h，使聚合物混合均匀，得到混合溶液；
(3)将所述步骤(2)所得的混合溶液，使用移液枪吸取50μL，滴涂至所述步骤(1)获得的基板上，37℃干燥，得到一种高分子薄膜；
(4)将所述步骤(3)所得高分子薄膜经过退火处理，退火温度为210℃，退火时间为1h；
(5)将所述步骤(4)所得的高分子薄膜进行微电极区域接触极化处理，左侧电极极化电压为正3.3kV，右侧电极极化电压为负3.3kV，极化时间为3min，得到一种正负表面电势左螺旋型分布的电活性引导骨再生膜。
本例制得的左螺旋型平面叉指微电极如图2(c)所示。
实施例4
(1)线宽为100μm呈电极区域玻璃区域交替分布的右螺旋型平面叉指型氧化铟锡(ITO) 微电极基板；
(2)称取1g P(VDF-TrFE)粉末，加入5.5ml N,N-二甲基甲酰胺中，并置于磁力搅拌器上搅拌2h，使聚合物混合均匀，得到混合溶液；
(3)将所述步骤(2)所得的混合溶液，使用移液枪吸取50μL，滴涂至所述步骤(1)获得的基板上，37℃干燥，得到一种高分子薄膜；
(4)将所述步骤(3)所得高分子薄膜经过退火处理，退火温度为210℃，退火时间为1h；
(5)将所述步骤(4)所得的高分子薄膜进行微电极区域接触极化处理，左侧电极极化电压为正3.3kV，右侧电极极化电压为负3.3kV，极化时间为3min，得到一种正负表面电势右螺旋型分布的电活性引导骨再生膜。
本例制得的右螺旋型平面叉指微电极如图2(d)所示。
实施例5
(1)线宽为50μm呈电极区域玻璃区域交替分布的直线型平面叉指型氧化铟锡(ITO)微电极基板；
(2)称取1g P(VDF-TrFE)粉末，加入5.5ml N,N-二甲基甲酰胺中，并置于磁力搅拌器上搅拌2h，使聚合物混合均匀，得到混合溶液；
(3)将所述步骤(2)所得的混合溶液，使用移液枪吸取50μL，滴涂至所述步骤(1)获得的基板上，37℃干燥，得到一种高分子薄膜；
(4)将所述步骤(3)所得高分子薄膜经过退火处理，退火温度为210℃，退火时间为1h；
(5)将所述步骤(4)所得的高分子薄膜进行微电极区域接触极化处理，左侧电极极化电压为正3.3kV，右侧电极极化电压为负3.3kV，极化时间为3min，得到一种正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜。
实施例6
(1)线宽为200μm呈电极区域玻璃区域交替分布的直线型平面叉指型氧化铟锡(ITO)微电极基板；
(2)称取1g P(VDF-TrFE)粉末，加入5.5ml N,N-二甲基甲酰胺中，并置于磁力搅拌器上搅拌2h，使聚合物混合均匀，得到混合溶液；
(3)将所述步骤(2)所得的混合溶液，使用移液枪吸取50μL，滴涂至所述步骤(1)获得的基板上，37℃干燥，得到一种高分子薄膜；
(4)将所述步骤(3)所得高分子薄膜经过退火处理，退火温度为210℃，退火时间为1h；
(5)将所述步骤(4)所得的高分子薄膜进行微电极区域接触极化处理，左侧电极极化电压为正3.3kV，右侧电极极化电压为负3.3kV，极化时间为3min，得到一种正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜。
实施例7
(1)线宽为500μm呈电极区域玻璃区域交替分布的直线型平面叉指型氧化铟锡(ITO)微电极基板；
(2)称取1g P(VDF-TrFE)粉末，加入5.5ml N,N-二甲基甲酰胺中，并置于磁力搅拌器上搅拌2h，使聚合物混合均匀，得到混合溶液；
(3)将所述步骤(2)所得的混合溶液，使用移液枪吸取50μL，滴涂至所述步骤(1)获得的基板上，37℃干燥，得到一种高分子薄膜；
(4)将所述步骤(3)所得高分子薄膜经过退火处理，退火温度为210℃，退火时间为1h；
(5)将所述步骤(4)所得的高分子薄膜进行微电极区域接触极化处理，左侧电极极化电压为正3.3kV，右侧电极极化电压为负3.3kV，极化时间为3min，得到一种正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜。
产品性能检测：
(1)利用压电力显微镜(PFM)对实施例1制得的正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜的压电力响应分布进行检测，检测结果见图3。
(2)将实施例1制得的正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜经紫外30min 灭菌后，在其上面接种密度为1﹡104/孔的大鼠骨髓间充质干细胞，培养24小时后固定细胞，进行细胞核以及细胞骨架染色，利用激光共聚焦显微镜观察。测试结果见图4。
(3)将实施例1制得的正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜经紫外30min 灭菌后，剪成直径为6mm的圆形薄膜片，覆盖于直径为5mm的大鼠右侧颅骨缺损处，左侧缺损覆盖负极化无图案带电材料作为对照组，术后8周处死动物，分离膜材料后进行Micro-CT扫描观察。测试结果见图5。
(4)将实施例1、实施例5、实施例6以及实施例7制得的正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜经紫外30min灭菌后，在其上面接种密度为1﹡104/孔的大鼠骨髓间充质干细胞，培养7天后测定细胞成骨分化能力。测试结果见图6(无图案对应线宽为0μm 的情况)，由图可知，对于正负表面电势直线型分布的电活性引导骨再生膜，各条带的线宽为100μm时，细胞成骨分化能力更强。
(5)将实施例1、实施例3以及实施例4制得的正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜经紫外30min灭菌后，在其上面接种密度为1﹡104/孔的大鼠骨髓间充质干细胞，培养7天后测定细胞成骨分化能力。测试结果见图7，由图可知，与正负表面电势左螺旋型分布的电活性引导骨再生膜比，正负表面电势图案化分布为右螺旋和直线型的电活性引导骨再生膜具有更好的细胞成骨分化能力。
结论：通过构建正负表面电势直线型以及右螺旋型分布的电活性引导骨再生膜可以有效调控细胞行为。当本材料表面电势为正负表面电势直线型分布时，如图5，在骨缺损的植入实验中表现出优异的骨修复效果。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化，例如本发明采用的叉指型微电极可以为任意分布状态，从而形成任意表面电势分布以调控细胞间连接状态。即凡是依据本发明申请权利要求及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜，其特征在于，所述电活性引导骨再生膜是在P(VDF-TrFE)膜上形成依次交替分布的正极化条带区域、非极化条带区域、及负极化条带区域，从而形成正负表面电势图案化分布，且所述的正极化条带区域、非极化条带区域、负极化条带区域中各条带的线宽为50-200μm。
2.根据权利要求1所述的一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜，其特征在于，所述的电活性引导骨再生膜是先在P(VDF-TrFE)膜上形成平面叉指型微电极，再分别施加正、负极化电压进行极化所形成的。
3.根据权利要求1所述的一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜，其特征在于，所述的正极化条带、负极化条带均为直线型，二者之间形成直线型的非极化条带。
4.根据权利要求1所述的一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜，其特征在于，所述的正极化条带、负极化条带均为螺旋型，二者螺旋的方向一致且二者之间形成螺旋型的非极化条带。
5.根据权利要求4所述的一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜，其特征在于，所述的正极化条带、负极化条带的螺旋是右螺旋，即由外向内按照顺时针方向旋转。
6.一种制备如权利要求1-5任一项所述的正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以所需图案化的平面叉指型微电极为基板；
(2)称取P(VDF-TrFE)粉末，加入有机溶剂中，搅拌均匀，得到混合溶液；
(3)将步骤(2)所得的混合溶液滴涂至步骤(1)获得的基板上，干燥后得到高分子薄膜；
(4)将所得高分子薄膜经过退火处理；
(5)将处理后的高分子薄膜在微电极上施加正、负极化电压进行接触极化处理，得到一种正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜。
7.根据权利要求6所述的正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
8.根据权利要求6所述的正负表面电势图案化分布的电活性引导骨再生膜的制备方法，其特征在于，所述的极化电压为正1.0kV-4.0kV、负1.0kV-4.0kV，极化时间为3min-10min。
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