CN113564051B

CN113564051B - 促细胞团消化解离液及细胞计数方法

Info

Publication number: CN113564051B
Application number: CN202110768311.2A
Authority: CN
Inventors: 高毅; 李阳; 张贵锋; 彭青
Original assignee: Guangdong Qianhui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Qianhui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-07
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2041-07-07
Also published as: CN113564051A

Abstract

本申请提供一种促细胞团消化解离液及细胞计数方法，所述促细胞消化解离液包括以质量百分比计的以下原料：聚乙二醇辛基苯基醚1％～5％；烷基糖苷0.1％～4％；非表面活性剂型磺基甜菜碱0.1％～1％；两性离子型去垢剂0.1％～1％；pH调节剂1％～10％；其余为水。该促细胞消化解离液可通过破坏细胞的脂质双分子层，溶解胞质和细胞膜，并破坏分子间的微弱结合键，从而实现细胞团的消化解离，对细胞团的解离效率高，使得本申请的细胞计数方法可实现对生物反应器内支架材料上培养细胞数量的快速、低成本测定。

Description

促细胞团消化解离液及细胞计数方法

技术领域

本申请涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种促细胞团消化解离液及细胞计数方法。

背景技术

生物反应器是细胞培养的关键设备，可以实现细胞及其附属生物制品的规模化培养，其中贴壁细胞的规模化培养需要依靠细胞培养支架材料以实现细胞在反应器中的定植。随着培养天数的增加，细胞可实现在反应器内的规模化高密度培养，在支架上形成紧密的细胞团样三维类组织结构。

目前，市面上售卖的通用消化液如胰酶、胶原酶等不仅成本高，还需要依赖细胞培养箱或其他恒温设备以达到酶活最佳温度37℃，并且通常还需要20-40min才能实现对细胞团的完全消化解离。

发明内容

本申请的主要目的旨在提供一种消化解离效果好、解离速度快的促细胞团消化解离液。

本申请的另一目的旨在提供一种采用上述促细胞团消化解离液的细胞技术方法。

为了实现上述目的，本申请提供以下技术方案：

作为第一方面，本申请涉及一种促细胞团消化解离液，包括以质量百分比计的以下原料：

进一步设置：所述聚乙二醇辛基苯基醚以质量百分比计的含量为1％～2％。

进一步设置：所述两性离子型去垢剂为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐或3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸。

进一步设置：所述pH调节剂为正磷酸。

进一步设置：所述pH调节剂以质量百分比计的含量为4％～5％。

作为第二方面，本申请涉及一种细胞计数方法，包括以下步骤：

将载有细胞的载体从生物反应器中转移到离心管内；

添加磷酸缓冲盐溶液至所述离心管内以清洗载体，清洗完毕后除去磷酸缓冲盐溶液；

添加促细胞团消化解离液至所述离心管内处理并促使细胞团解离，所述促细胞团消化液为如上的促细胞团消化解离液；

加入染色剂对细胞核进行染色；

将离心管内样品稀释至计数器的工作范围，通过对细胞核计数以完成细胞的计数。

进一步设置：所述载有细胞的载体为细胞培养支架材料，所述细胞在所述细胞培养支架材料上成细胞团样三维类组织结构设置。

进一步设置：多次添加磷酸缓冲盐溶液至所述离心管内以对细胞的载体进行反复冲洗。

进一步设置：所述添加促细胞团消化解离液至所述离心管内后，对所述离心管内样品涡旋0.8～1.5min或者静置2～3min。

进一步设置：所述染色剂为台盼蓝，且所述台盼蓝的终浓度为0.03～0.05％

相比现有技术，本申请的方案具有以下优点：

1.在本申请的促细胞消化解离液中，聚乙二醇辛基苯基醚能够实现细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞发生抗体与抗原结合的反应，且在本申请中，采用高浓度的聚乙二醇辛基苯基醚不仅可以实现细胞膜穿孔，同时可以完整破坏细胞膜，释放细胞质和细胞核，从而实现细胞团的有效消化解离，对细胞团的解离效率高。细胞核的释放便于后续进行细胞核染色，并且成分简单、毒性低，避免对操作人员造成伤害，有利于提高后续细胞计数的准确性。

2.在本申请的促细胞团消化解离液中，通过加入烷基糖苷可以有效地改善高浓度的聚乙二醇辛基苯基醚的起泡性，避免气泡影响对细胞团的解离效果，同时降低气泡对后续计数的干扰，提高计数的准确性。非表面活性剂型磺基甜菜碱可以增加膜蛋白的溶解，两性离子去污剂如CHAPSO/CHAPS可以跟所有其他类型去污剂复配，联合应用可以增加去污效果。本申请在破膜剂浓度的设置、破膜时间以及各类型破膜剂的合理配置一方面可满足规模化培养细胞团的细胞膜的解离要求，另一方面利于细胞核膜的稳定性以及起泡的稳定性，增加蛋白的溶解度，以最大限度降低破膜对细胞计数的影响。

3.在本申请的细胞计数方法中，支架材料上未见残留细胞，可见解离的效果好。同时镜下观察未见明显杂质和气泡，细胞核通透、完整、分辨度高，可实现对生物反应器内支架材料上培养细胞数量的快速、低成本测定。

本申请附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

本申请上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本申请中载有细胞的载体在扫描电镜下的结构示意图；

图2为本申请中经促细胞团消化解离液解离后在血细胞计数板上可见呈分散状的单个细胞核示意图；

图3为本申请中载体经促细胞团消化解离液解离后经倒置显微镜观察细胞残留的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能解释为对本申请的限制。

本申请涉及一种细胞计数方法，利用促细胞团消化解离液来解离细胞聚团以分解细胞释放细胞核，通过计数细胞核来最终确定细胞的培养数量，本申请的细胞计数方法可提高手动或全自动细胞计数的准确性，实现对生物反应器内支架材料上的培养细胞数量的快速、低成本的测定。

所述促细胞团消化解离液包括聚乙二醇辛基苯基醚、两性离子型去垢剂、pH调节剂和水，其中，聚乙二醇辛基苯基醚以质量百分比计的占比为1％～5％，烷基糖苷0.1％～4％；非表面活性剂型磺基甜菜碱0.1％～1％；两性离子型去垢剂的占比为0.1％～1％，pH调节剂的占比为1％～5％，其余为水。

工业生产中的聚乙二醇辛基苯基醚称为TritonX-100，TritonX-100作为非离子型表面活性剂，其本申请促细胞团消化解离液中TritonX-100的含量范围在1％～5％，高含量的TritonX-100可破坏细胞的脂质双分子层，直接溶解胞质和细胞膜，并破坏分子间的微弱结合键，从而实现细胞团的消化解离。优选地，本实施例的TritonX-100以质量百分比计的占比为1％～2％，在该范围下的TritonX-100能够充分解离细胞团，裂解细胞膜，又避免破坏细胞核核膜，有利于细胞核的染色以及计数。

本申请还加入了烷基糖苷的非离子表面活性剂，本申请采用了含量较高的TritonX-100，易在涡旋裂解细胞的过程中产生大量的泡沫，且稳定性较差，从而影响细胞的裂解效率。在具有高浓度TritonX-100的促细胞团消化解离液中加入烷基糖苷，烷基糖苷能够改善和稳定高浓度TritonX-100引起的泡沫特性。此外，烷基糖苷的糖苷基团会破坏脂质-脂质和脂质-蛋白质相互作用，并且烷基糖苷具有连接至葡萄糖、麦芽糖或蔗糖头部基团的各种烷基链，能够对膜蛋白起到增溶的作用，亦能对细胞团起到裂解的作用。烷基糖苷的成分和结构均匀，稳定性高，能提高本申请促细胞团消化解离液的稳定性。

同时，本申请加入了少量的两性离子型去垢剂和非表面活性剂型磺基甜菜碱(NDSB)，非表面活性剂型磺基甜菜碱是一种具有两性离子性质的非表面活性剂，其可以增加膜蛋白的溶解性。另外，本实施例中的两性离子型去垢剂优选采用3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPSO)或3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸(CHAPS)中的其中一种。所述两性离子型去垢剂能够打破蛋白质-蛋白质相互作用，可加速膜蛋白的溶解，从而可加速细胞的消化解离，缩短细胞消化解离过程所需的时间，提高解离效率，并且，两性离子型去垢剂还可以跟所有其他类型去污剂复配，联合应用可以增加去污效果。优选地，本实施例中的两性离子型去垢剂的以质量百分比计的占比为0.1％～0.5％，采用少量的两性离子型去垢剂在加速膜蛋白溶解，同时可避免过量的两性离子型去垢剂对细胞核核膜造成伤害。

本申请还加入了pH调节剂来调节本申请的促细胞团消化解离液的pH值，优选地，本申请采用正磷酸作为pH调节剂。且在本实施例中，所述正磷酸以质量百分比计的占比优选为4％～5％。

本申请的促细胞团消化解离液成分简单，采用非离子型表面活性剂TritonX-100作为主要解离成分，并通过提高TritonX-100的含量，使得本申请的促细胞团消化解离液可以破坏细胞团的脂质双分子层，完整的溶解细胞膜和胞质，破坏分子间的结合键，继而实现细胞团的消化解离，对细胞团的解离效率高，解离时间仅需1～2min。同时，细胞核的释放便于后续进行细胞核染色，成分简单、毒性低，避免对操作人员造成伤害，有利于提高后续细胞计数的准确性。而且，采用高含量TritonX-100的同时，本申请的促细胞消化解离液中加入了烷基糖苷，可有效地改善TritonX-100的起泡性，避免泡沫影响对细胞团的解离效率，同时降低气泡对后续计数的干扰，提高计数的准确性。此外，还加入了少量的两性离子型去垢剂和非表面活性剂型磺基甜菜碱，可以大大增强对膜蛋白的溶解性，两性离子型去垢剂还可以跟所有其他类型去污剂复配，联合应用可以增加去污效果，使得本申请的促细胞团消化解离液对于细胞聚集的细胞团具有良好的消化解离效果，便于进行细胞计数，计数的准确性高。

本申请的细胞计数方法具体包括以下步骤：

首先，将载有细胞的载体从生物反应器中转移到离心管内。请结合图1，本申请的细胞是利用生物反应器进行培养，其主要依靠作为载体的细胞培养支架材料来实现细胞在反应器中的定植，随着培养天数的增加，细胞会在生物反应器内规模化高密度的培养，并在其细胞培养支架材料上形成紧密的细胞团样三维类组织结构，本申请直接将细胞培养支架及附着在支架上的细胞一同转移到离心管内。

随后，向上述装有载有细胞的载体的所述离心管内添加磷酸缓冲盐溶液，轻晃所述离心管对该细胞的载体进行洗涤以除去培养基。磷酸缓冲盐溶液具有盐的平衡作用，使得经过清洗后的细胞能够在相应的pH值范围内生存。洗涤完毕后，将上述磷酸缓冲盐溶液去除。该清洗步骤可重复多次，以确保将载体上的培养基清洗完全。

接着，向所述离心管中添加促细胞团消化解离液，该促细胞团消化解离液为前文中所述的促细胞消化解离液，在加入所述促细胞消化解离液后，可将所述离心管涡旋0.8～1.5min，或者加入促细胞团消化解离液后静置约2～3min，从而可将附着在载体上的细胞团进行消化解离，所述促细胞消化解离液中的高浓度Triton X-100直接裂解细胞膜，使得细胞核暴露。

具体地，在本实施例中，所述离心管采用1.5ml微量离心管，并且每次往该离心管中加入的磷酸缓冲盐溶液的量为1ml，加入所述离心管内的促细胞消化解离液的量为1ml。

待细胞团消化解离完全后，加入染色剂对细胞核进行染色。优选地，本申请采用的染色剂为台盼蓝，并将台盼蓝加至其终浓度范围为0.03～0.05％，以对细胞核进行充分染色，便于在光学显微镜下突出显示细胞核的位置，提高细胞计数的准确性。

最后，将所述离心管内的样品稀释至细胞计数器的工作范围，通过统计细胞计数器内的细胞核个数以进一步计算整个生物反应器内的细胞密度或细胞个数。

将经过促细胞团消化解离液解离后的样品置于显微镜下可以看到，经促细胞团消化解离液解离后在血细胞计数板上可见呈分散状的细胞核，具体如图2所示，同时如图3所示，经促细胞团消化解离液解离后经倒置显微镜观察，支架材料上未见残留细胞。即采用本申请的细胞技术方法的计数准确性高，避免采用机械破碎对细胞核造成的损伤，并且支架材料上未见残留细胞，可见解离的效果好，可实现对生物反应器内支架材料上培养细胞数量的快速、低成本测定。

以上所述仅是本申请的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims

1.一种细胞计数方法，其特征在于，包括以下步骤：

将载有细胞的载体从生物反应器中转移到离心管内，所述载有细胞的载体为细胞培养支架材料，所述细胞在所述细胞培养支架材料上呈细胞团样三维类组织结构；

多次添加磷酸缓冲盐溶液至所述离心管内以对细胞的载体进行反复冲洗，清洗完毕后除去磷酸缓冲盐溶液；

添加促细胞团消化解离液至所述离心管内处理，对所述离心管内样品涡旋0.8～1.5min或者静置2～3min，促使细胞团解离，所述促细胞团消化解离液，包括以质量百分比计的以下原料：聚乙二醇辛基苯基醚1％～5％，烷基糖苷0.1％～4％，非表面活性剂型磺基甜菜碱0.1％～1％，两性离子型去垢剂0.1％～1％，所述两性离子型去垢剂为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐或3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸，pH调节剂1％～10％，所述pH调节剂为正磷酸，其余为水；

加入染色剂对细胞核进行染色；

2.根据权利要求1所述的细胞计数方法，其特征在于，所述pH调节剂以质量百分比计的含量为4％～5％。

3.根据权利要求1所述的细胞计数方法，其特征在于，所述染色剂为台盼蓝，且所述台盼蓝的终浓度为0.03～0.05％。