CN113559094A - 一种抗坏血酸钠的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗坏血酸钠的应用，属于抗坏血酸钠应用技术领域。涉及瘤内注射高剂量抗坏血酸钠在抑制肿瘤生长中的应用，特别涉及单独使用高剂量抗坏血酸钠瘤内注射在抑制小鼠黑色素瘤和人咽鳞癌移植瘤生长中的应用。针对目前静脉注射高剂量抗坏血酸抑癌效果显著，但是高剂量抗坏血酸仍会导致正常细胞的凋亡，为临床应用带来隐患，本发明使用瘤内穿刺注射高剂量抗坏血酸钠局部给药的方式，在发挥高剂量抗坏血酸钠抑癌效果同时，降低对整个机体的伤害。
Description
技术领域
本发明属于抗坏血酸钠应用技术领域，具体涉及一种抗坏血酸钠的应用。
背景技术
维生素C(抗坏血酸)是人类生长发育过程中重要的营养物质。作为著名的抗氧化剂，抗坏血酸通过清除细胞中的活性氧和活性氮，保护细胞免受氧化压力的损伤，具有营养、美容、提高机体免疫力等功效。
近几年的研究显示，抗坏血酸在癌症治疗中的效果很大程度上依赖于其给药方式及给药浓度，与口服相比，静脉注射抗坏血酸给药方式大幅度的提高血浆中抗坏血酸的浓度，达到有效抑制效果，静脉注射高剂量的抗坏血酸可以增强黑色素瘤、结肠直肠瘤、胰腺癌和乳腺癌等多种肿瘤模型小鼠肿瘤中的免疫细胞浸润，从而减缓或者停止肿瘤的生长。但是，同时也有细胞试验结果表明，高剂量抗坏血酸同样会导致正常细胞的凋亡，且临床数据表明，使用高浓度抗坏血酸钠静脉注射不仅在注射过程中由于渗透负荷引起恶心头晕，在长期注射后也会有患者产生高钠血症和低钾血症等不良症状。
瘤内穿刺注射作为近几年来新兴的一项给药技术，通过向病灶靶向给药的方式，在治疗的同时，减少药物对机体整体的毒性，降低身体代谢压力。结合前期研究，瘤内穿刺注射高剂量抗坏血酸钠是一种极大程度发挥抗坏血酸抗癌效果的方式。
发明内容
针对现有给药方式中存在的隐患，降低抗坏血酸钠抑制肿瘤过程中的毒副作用的问题，本发明提供了一种瘤内注射高浓度抗坏血酸钠抑制肿瘤生长的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种抗坏血酸钠的应用，用于制备抑制肿瘤生长的药物，其中所述药物仅含有抗坏血酸钠溶液，其浓度为：100-200mg/mL。
进一步，所述药物的使用方法为瘤内穿刺注射。
进一步，所述肿瘤包括小鼠黑色素瘤和人咽鳞癌移植瘤。
进一步，对于小鼠黑色素瘤细胞，抗坏血酸的低浓度定为10μg/mL，高浓度定为500μg/mL；对于人咽鳞癌细胞，抗坏血酸的低浓度定为50μg/mL，高浓度定为1000μg/mL。
进一步，所述抗坏血酸钠是抗坏血酸钠的水溶液，抗坏血酸钠剂量根据不同肿瘤对抗坏血酸钠的敏感度决定。
进一步，不同肿瘤细胞对抗坏血酸钠浓度响应不同，在浓度确定前通过不同细胞内信号通路响应情况确定抗坏血酸钠的使用浓度。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明提供了瘤内穿刺注射高浓度抗坏血酸钠抑制肿瘤生长的方法，不仅极大程度上发挥抗坏血酸钠的抑癌效果，同时减少了其他抑制剂的使用，降低对机体的毒性，起到安全治疗的目的。
附图说明
图1为实施例2中不同浓度抗坏血酸处理对B16-F10细胞增殖的影响；
图2为实施例2中不同浓度抗坏血酸处理对Fadu细胞增殖的影响；
图3为实施例2中不同浓度抗坏血酸处理后B16-F10细胞划线试验结果；
图4为实施例2中不同浓度抗坏血酸处理后FaDu细胞划线试验结果；
图5为实施例2中不同浓度抗坏血酸处理后B16-F10细胞和FaDu细胞Transwell迁移试验结果；
图6为实施例3中经不同浓度抗坏血酸钠瘤内穿刺注射后小鼠黑色素瘤移植瘤生长体积变化；
图7为实施例3中经不同浓度抗坏血酸钠瘤内穿刺注射后人咽癌移植肿瘤生长体积变化；
图8为实施例3中不同浓度抗坏血酸钠瘤内穿刺注射后小鼠黑色素瘤移植瘤重量；
图9为实施例3中不同浓度抗坏血酸钠瘤内穿刺注射后人咽鳞癌移植瘤重量；
图10为实施例3中不同浓度抗坏血酸钠瘤内穿刺注射结束后小鼠黑色素瘤移植瘤图；
图11为实施例3中不同浓度抗坏血酸钠瘤内穿刺注射结束后人咽鳞癌移植瘤图。
具体实施方式
实施例1
使用不同浓度抗坏血酸处理不同肿瘤细胞，检测各种肿瘤细胞系在不同浓度抗坏血酸钠处理情况下，细胞增殖相关信号通路激活情况，筛选能够抑制细胞增殖相关信号通路的抗坏血酸浓度，作为后续细胞学实验及瘤内穿刺注射的依据。根据信号通路对不同浓度抗坏血酸的响应，将能够激活细胞增殖相关信号通路的抗坏血酸浓度为后续试验的低浓度组，抑制细胞增殖相关信号通路的抗坏血酸浓度为后续试验的高浓度组。对于小鼠黑色素瘤细胞，抗坏血酸的低浓度定为10μg/mL，高浓度定为500μg/mL；对于人咽鳞癌细胞，抗坏血酸的低浓度定为50μg/mL，高浓度定为1000μg/mL。
实施例2
检测高浓度抗坏血酸钠对不同肿瘤细胞增殖、迁移的抑制效果。
一、高浓度抗坏血酸处理对不同肿瘤细胞增殖的影响
1、细胞来源
B16-F10细胞系，FaDu细胞系。
2、试验分组
(1)空白组：不给药。
(2)高浓度抗坏血酸组：①对于小鼠黑色素瘤细胞，抗坏血酸在细胞培养液中添加的终浓度为500μg/mL；②对于人咽鳞癌细胞，抗坏血酸在细胞培养液中添加的终浓度为1000μg/mL。
(3)低浓度抗坏血酸组：①对于小鼠黑色素瘤细胞，抗坏血酸在细胞培养液种添加的终浓度为10μg/mL；②对于人咽鳞癌细胞，抗坏血酸在细胞培养液种添加的终浓度为50μg/mL。
3、试验方法
将不同肿瘤细胞分别按照5×104个/mL的密度传入48孔板中，按照试验分组使用不同浓度抗坏血酸钠处理，细胞贴壁后每隔24h计数一次，每组重复计数3次。待其中一组细胞长至接触抑制后，停止计数，并绘制细胞生长曲线。
二、高浓度抗坏血酸处理对不同肿瘤细胞迁移的影响
1、细胞来源
B16-F10细胞系，FaDu细胞系。
2、试验分组
空白组：不给药。
高浓度抗坏血酸组：对于小鼠黑色素瘤细胞，抗坏血酸在细胞培养液中添加的终浓度为500μg/mL；对于人咽鳞癌细胞，抗坏血酸在细胞培养液中添加的终浓度为1000μg/mL。
低浓度抗坏血酸组：对于小鼠黑色素瘤细胞，抗坏血酸在细胞培养液中添加的终浓度为10μg/mL；对于人咽鳞癌细胞，抗坏血酸在细胞培养液中添加的终浓度为50μg/mL。
3、试验方法
细胞划线试验：将不同肿瘤细胞按照3×105个/mL的密度传入6孔板，大约48h细胞汇合度达到90％后开始试验；用200μL枪头在6孔板细胞中划1-2条平直、均匀的伤痕，用PBS清洗细胞一次，去除非贴壁细胞，然后在倒置显微镜下拍照并记录拍摄位置；加入终浓度为1μg/mL的丝裂霉素C(Abmole)处理划线细胞2h，随后按照不同组别更换为新鲜培养基继续培养60-72h，待其中一组细胞迁移至汇合时结束试验，在倒置显微镜下拍摄记录各组细胞迁移情况(此时拍摄位置应与刚划线时的拍摄位置相同)。
Transwell试验：将不同肿瘤细胞按照1×106个/mL的密度传入装载有8μm小孔聚碳酸酯膜的Transwell培养小室内，按照试验分组处理细胞，其中含有细胞的上层加入无血清培养液，无细胞的下室使用含有10％血清的培养液。每36h更换培养液一次；迁移结束后用含有4％多聚甲醛的PBS室温固定30min，随后用镊子夹持小室，依次进行以下步骤：PBS清洗2次、稍蓬松的棉棒轻轻擦除聚碳酸酯膜上层细胞、甲醇固定5min、PBS清洗1次、结晶紫染色液37℃染色30min，最终小室用PBS漂洗3次，去除多余染料，将每个小室于倒置显微镜下拍照。
实施例3
使用荷瘤小鼠模型检测高浓度抗坏血酸钠瘤内穿刺注射对不同肿瘤的抑制效果
一、荷瘤小鼠模型构建：
1、细胞来源
小鼠黑色素瘤荷瘤小鼠模型：B16-F10细胞系；
人咽鳞癌皮下荷瘤小鼠模型：FaDu细胞系。
2、动物来源
小鼠黑色素瘤荷瘤小鼠模型：5-6周龄C57BL/6J小鼠(SPF级)，按照恒定温度23±2℃，湿度50％-60％，遵循12小时光照(7:30-19:30)、12小时黑暗的昼夜节律，自由饮食饮水的饲养条件饲养。
人咽鳞癌皮下荷瘤小鼠模型：BALB/c nude小鼠(SPF级)，4周龄，雌性。购自北京维通利华生物科技股份有限公司，饲养于SPF环境，环境温度及湿度适宜。
3、试验分组
空白组：注射氯化钠溶液。
高剂量抗坏血酸钠组：注射高浓度(小鼠黑色素瘤荷瘤小鼠模型：100mg/mL；人咽鳞癌皮下荷瘤小鼠模型：200mg/mL)抗坏血酸钠溶液。
低剂量抗坏血酸钠组：注射低浓度(小鼠黑色素瘤荷瘤小鼠模型：2.5mg/mL；人咽鳞癌皮下荷瘤小鼠模型：12.5mg/mL)抗坏血酸钠溶液。
注：两种荷瘤小鼠模型的空白组和低剂量抗坏血酸钠组的注射液中，总Na+摩尔浓度均与各自模型的高浓度抗坏血酸钠溶液中的Na+摩尔浓度相同，以排除注射液渗透压的影响。
4、荷瘤小鼠模型构建
小鼠黑色素瘤荷瘤小鼠模型：分别消化并收集生长状态良好的B16-F10细胞，用灭菌的生理盐水清洗两次，再次重悬于生理盐水中并计数；使用0.5％水合氯醛以0.1mL/10g的剂量通过腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠背部右下侧区域的毛发剃除，用医用酒精棉球轻轻擦拭、晾干，使用50μL可换针头式微量进样器注射1×105个肿瘤细胞；将注射后的小鼠放于温床上，待其恢复意识后，放回鼠笼，观察1小时，若无异样即可继续饲养。定期检察小鼠的生活状态及背部肿瘤生长情况，用游标卡尺测量肿瘤大小，并计算肿瘤体积(V＝1/2ab2)。
人咽鳞癌皮下荷瘤小鼠模型：取处于对数生长期FaDu细胞，用PBS清洗后，加入胰酶消化，1000rpm离心5min，弃上清液，加入无血清培养基重悬细胞，通过细胞计数将细胞悬液浓度调整为2×107个/mL。吸取100μl细胞悬液，接种于小鼠腋下，每只小鼠接种约2×106个细胞。
5、瘤内穿刺注射方法
当肿瘤长径长至5mm时进行试验，选择所有肿瘤体积符合条件的荷瘤小鼠，随机分为3组。将各组小鼠麻醉后，用针头直径为0.3mm的一次性注射针进行瘤内穿刺注射(Intra-tumoral Injection，i.t.)，每只小鼠按照50μL/0.5cm3肿瘤体积的量注射相应溶液，每隔2天注射一次，每次注射前用游标卡尺测量每只小鼠的肿瘤长径及短径；待其中一组小鼠肿瘤最大长径到达20mm时，结束试验。各组小鼠(n≥5)安乐死后，测量每只小鼠最终的肿瘤长径及短径，解剖分离每只小鼠的肿瘤并称重。肿瘤体积按照公式V＝1/2ab2计算，其中a为肿瘤长径、b为肿瘤短径。
6、统计学分析
数据以Mean±SD呈现，组间比较使用t检验，P<0.05为显著差异，*P<0.05，**P<0.01。
二、结果
1、不同浓度抗坏血酸对肿瘤细胞增殖迁移的影响
使用不同浓度抗坏血酸处理细胞后检测B16-F10细胞及FaDu细胞内增殖相关信号通路发现，低浓度抗坏血酸激活细胞内增殖相关信号通路，而高浓度起到显著抑制作用。使用高、低浓度抗坏血酸处理细胞的结果显示，只有高浓度抗坏血酸对肿瘤细胞的增殖和迁移具有抑制效果，而低浓度抗坏血酸作用相反，结果如图1-5。因此本发明提出，使用抗坏血酸治疗肿瘤，应根据肿瘤细胞对于抗坏血酸的响应，选择较高浓度。
2、瘤内穿刺注射不同浓度抗坏血酸后肿瘤生长体积变化
在移植瘤最长径达到5mm后，按照分组，使用不同浓度抗坏血酸钠进行瘤内穿刺注射治疗，并测量肿瘤长径(a)和短径(b)，利用公式V＝1/2ab2计算肿瘤体积，结果如图6-7。与空白组比，只有使用高浓度抗坏血酸钠瘤内穿刺注射时，两种小鼠模型中移植瘤的生长才会受到显著抑制，而瘤内穿刺注射低浓度抗坏血酸钠却没有明显抑制效果，甚至会促进肿瘤生长。
3、瘤内穿刺注射高浓度抗坏血酸钠疗效评价标准
评价标准：抑制肿瘤效率＝(1-T/C)×100％其中，T：瘤内穿刺注射抗坏血酸钠组平均瘤重；C：空白组平均瘤重。
使用抗坏血酸钠瘤内穿刺注射至至其中任意一组小鼠肿瘤最大长径到达20mm时终止试验，在此过程中，瘤内穿刺注射高浓度抗坏血酸钠对小鼠黑色素瘤移植瘤及人咽鳞癌移植瘤具有显著抑制效果，如图10-11所示。而瘤内穿刺注射低浓度抗坏血酸钠却具有相反效果。
图8-9为两种移植瘤模型小鼠在抗坏血酸钠注射治疗终点时，各组处理下肿瘤的重量，根据该数据，结合上述公式计算并评价瘤内注射高浓度抗坏血酸钠抑制肿瘤的疗效，数据如表1所示。瘤内穿刺注射高浓度抗坏血酸钠有效抑制肿瘤生长，在对小鼠黑色素瘤移植瘤和人咽鳞癌移植瘤干预治疗中，抑制肿瘤效率分别为44.86％和29.78％，与空白组具有显著的差异(p<0.05)；而瘤内注射低浓度抗坏血酸钠却没有相同抑制效果。
表1肿瘤抑制效率
综上，本发明提出单独使用抗坏血酸钠瘤内穿刺注射来有效抑制小鼠黑色素瘤和人咽鳞癌生长的方法，并提出只有瘤内穿刺注射高浓度抗坏血酸钠才能有效抑制肿瘤生长。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
Claims (6)
1.一种抗坏血酸钠的应用，其特征在于：用于制备抑制肿瘤生长的药物，其中所述药物仅含有抗坏血酸钠溶液，其浓度为：100-200mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种抗坏血酸钠的应用，其特征在于：所述药物的使用方法为瘤内穿刺注射。
3.根据权利要求1所述的一种抗坏血酸钠的应用，其特征在于：所述肿瘤包括小鼠黑色素瘤和人咽鳞癌移植瘤。
4.根据权利要求1所述的一种抗坏血酸钠的应用，其特征在于：对于小鼠黑色素瘤细胞，抗坏血酸的低浓度定为10μg/mL，高浓度定为500μg/mL；对于人咽鳞癌细胞，抗坏血酸的低浓度定为50μg/mL，高浓度定为1000μg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种抗坏血酸钠的应用，其特征在于：所述抗坏血酸钠是抗坏血酸钠的水溶液，抗坏血酸钠剂量根据不同肿瘤对抗坏血酸钠的敏感度决定。
6.根据权利要求1所述的一种抗坏血酸钠的应用，其特征在于：不同肿瘤细胞对抗坏血酸钠浓度响应不同，在浓度确定前通过不同细胞内信号通路响应情况确定抗坏血酸钠的使用浓度。
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