CN113559034A - 黑老虎提取物在制备美白产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，发现了黑老虎提取物具有抑制α‑葡萄糖苷酶性和酪氨酸酶活性，博落回提取物具有抑制α‑葡萄糖苷酶活性的作用，特别是提供了上述两种物质在制备美白和降血糖的药物方面的应用。

Description

黑老虎提取物在制备美白产品中的应用
本案为分案申请，母案申请号为：2020105974091
申请日为：2020年06月28日申请人为：中南林业科技大学
技术领域
本发明属于化妆品领域，具体涉及黑老虎提取物和博落回提取物在制备美白产品中的应用。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一种因为胰岛素不能满足人体正常需求或者机体对胰岛素的作用产生抵抗而引起的疾病，属于常见的内分泌疾病。糖尿病是一种多病因的代谢性疾病，其特点是慢性高血糖、糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱等。主要的特征是血糖升高。糖尿病患者在全球范围内高达4.63亿，其中2型糖尿病约占90％，仅中国约有1.16亿，占总人口的11.6％。糖尿药物有多种治疗机制，其中延缓肠道吸收葡萄糖是主要的治疗机制之一，以阿卡波糖(Acarbose)和伏格列波糖(Voglibose)等α-葡萄糖苷酶抑制剂为主。α-葡萄糖苷酶能与4-对硝基甲苯-α-吡喃葡萄糖苷(PNPG)反应生成硝基苯，在碱性条件下显黄色，在405nm左右有最大吸收，在一定浓度范围内，最终反应物的OD值与α-葡萄糖苷酶的活性呈正相关。α-葡萄糖苷酶能够将聚合度较低的糖分解成为葡萄糖，通过抑制其活力可以使糖尿病患者的血糖上升得到减缓，从而使血糖平稳，从而达到降血糖的目的。
酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶的功能催化底物，是最终形成棕色黑色素和优黑素的主要原料。酪氨酸酶与黑色素的产生有着密不可分的关系。在黑色素形成的整个过程中，其中最为主的一类要限速酶就是酪氨酸酶。黑色素形成数量的多少由酪氨酸酶的活性决定着。而酪氨酸是酪氨酸酶的功能催化底物，是最终形成棕色黑色素和优黑素的主要原料。酪氨酸酶与酪氨酸反应后的产物在475m有最大吸收，通过紫外仪检测可测出两者产物在475m的吸光度。目前的化妆品市场上，大部分的美白产品都是以酪氨酸酶活性抑制剂为主要成分的，并且随着研究的发展，每年都在以较快的速度接连不断发现新的该类化合物。
天然药物具有安全性高的特点，因此从天然药物中寻找抑制α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性的成分是相关医药化学领域的研究热点。到目前为止，有关于天然α-葡萄糖苷酶活性抑制剂和酪氨酸酶活性抑制剂的文献报道甚少，多种具有降血糖和美白功能的中药材亟待开发研究。
发明内容
针对现有技术的不足，我们进一步研究发现，黑老虎提取物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性和酪氨酸酶活性、博落回提取物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，为降血糖药品及保健品或者美白护肤品的开发提供了新的依据。
本发明的技术方案之一：
本发明提供了黑老虎提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
优选方案，所述黑老虎提取物在制备降糖药物中的应用。
优选方案，所述黑老虎提取物为黑老虎的醇提物和/或黑老虎的水提物，固液比为1：50-200，进一步优选的固液比为1：100。
进一步优选方案，所述黑老虎提取物中黑老虎叶提取物的效果最好，优选黑老虎叶提取物在制备降糖药物中的应用。
本发明的技术方案之二：
本发明提供了黑老虎叶提取物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。
优选方案，所述黑老虎叶提取物在制备美白药药物中的应用。
优选方案，所述黑老虎叶提取物为黑老虎叶的醇提物和/或黑老虎叶的水提物，固液比为1：50-200，进一步优选的固液比为1：100。
本发明所述黑老虎提取物可以为市售的现有产品。进一步优选方案，所述黑老虎醇提物醇提方法为：将药材粉碎，过80-100目筛，于40℃-50℃烘干至恒重，用石油醚在35℃-45℃下回流30-40min，脱去原料中的脂，回收石油醚，得各样品粉末，称取样品粉末1.0000g，加入100mL-200mL 75％-95％乙醇回流提取1-2h，取适量提取液离心，上层的清液即是样品醇提物；
进一步优选方案，所述黑老虎水提物的水提方法为：将药材粉碎，过80-100目筛，于40℃-50℃烘干至恒重，用石油醚在35℃-45℃下回流30-40min，脱去原料中的脂，回收石油醚，得各样品粉末，精准称取样品粉末1.0000g，加入100mL-200mL蒸馏水回流提取1h-2h，取适量提取液离心，上层的清液即是样品水提物。
本发明的技术方案之三：
本发明提供了博落回提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
优选方案，所述博落回提取物在制备降糖药物中的应用。
优选方案，所述博落回提取物为博落回醇提物和/或博落回水提物，固液比为1：50-200，进一步优选的固液比为1：100。
本发明所述博落回提取物可以为市售的现有产品。进一步优选方案，所述博落回醇提物醇的提取方法为：将药材粉碎，过80-100目筛，于40℃-50℃烘干至恒重，用石油醚在35℃-45℃下回流30-40min，脱去原料中的脂，回收石油醚，得各样品粉末，称取样品粉末1.0000g，加入100mL-200mL 75％-95％乙醇回流提取1-2h，取适量提取液离心，上层的清液即是样品醇提物；
进一步优选方案，所述博落回水提物的提取方法为：将药材粉碎，过80-100目筛，于40℃-50℃烘干至恒重，用石油醚在35℃-45℃下回流30-40min，脱去原料中的脂，回收石油醚，得各样品粉末，精准称取样品粉末1.0000g，加入100mL-200mL蒸馏水回流提取1h-2h，取适量提取液离心，上层的清液即是样品水提物。
进一步解释和说明：
本发明所述酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶用PBS溶液配制。
本发明所述提取物以浓度计，酪氨酸酶溶液为0.2-0.8mg/mL ；以活力计，所述α-葡萄糖苷酶溶液为0.5-5U/mL。优选方案，所述酪氨酸酶溶液为0.4mg/mL，所述α-葡萄糖苷酶为1U/mL。
本发明所述提取物，以体积计，醇和/或水提物与酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶溶液的混合比为1：0.5-5。优选方案，以体积计，醇和/或水提物与酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶溶液的混合比为1：1。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
通过做药材的醇提液和水提液对α-葡萄糖苷酶活性抑制实验，得知在固液比为1:100的前提下，黑老虎叶的水提液和果皮的醇提液以及博落回水溶液和醇溶液均对α-葡萄糖苷酶有较高的抑制率，其中黑老虎叶的水提液的抑制率为75.51％，果皮的醇提液的抑制率为64.90％，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最为显著，说明其可能具有良好的降血糖活性。本发明为新降血糖药物的开发提供了方向依据，为天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发研究数据基础。
通过实验，对抑制酪氨酸酶活性实验的方法进行了优化，得出酪氨酸酶活性抑制实验的最佳反应条件为温度37C°，反应时长1h，酪氨酸酶浓度为0.04mg/ml，酪氨酸浓度为0.4mg/ml。在此条件下对不同天然成分对酪氨酸酶抑制效果进行实验，结果发现：黑老虎果皮的醇提液对酪氨酸酶有较高的抑制率，提示有进一步研究开发的意义。本发明为天然美白护肤品的开发提供了方向依据，为天然酪氨酸酶抑制剂的开发研究提供了数据基础。
附图说明
图1是Lineweave-Burkf双倒数图；
图2是斜率对阿卡波糖浓度的二次倒数图；
图3是酪氨酸酶不同反应时长的吸光度曲线；
图4是酪氨酸酶动力学线性方程；
图5是黑老虎叶液相色谱-质谱分析图；
图6是LC-MS鉴定黑老虎叶部分化学成分结构式。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
如无特别说明，本发明中所用到的药材与试剂均可市售获得。
黑老虎醇提物的详细制备过程：将黑老虎的叶、茎、果皮分别置于中药粉碎机中粉碎，过80目筛，并置于烘干箱中在40℃下烘干至恒重，使用石油醚在40℃下回流30min，脱去原料中的脂，回收石油醚，将药材置于通风处，待原料完全干燥后，精确称取样品粉末(叶/茎/果皮)1.0000g，加100mL 95％乙醇，微沸防止糊化，回流提取1h，取适量提取液于离心机中，将转速设为6000r/min，离心3min，取上清液即为样品溶液；由于醇提液中的乙醇会对酶产生抑制作用，故对醇提液进行预处理，具体的操作为：取30mL醇提液于100mL的圆底烧瓶中，在旋蒸仪上旋蒸至冷凝器中无液滴落下时取下烧瓶，分批次加入适量的水荡洗烧瓶，将洗涤液合并，最后加蒸馏水补至30mL，0.45μm滤膜过滤即可。
黑老虎水提物的详细制备过程：将黑老虎的叶、茎、果皮分别置于中药粉碎机中粉碎，过80目筛，并置于烘干箱中在40℃下烘干至恒重，使用石油醚在40℃下回流30min，脱去原料中的脂，回收石油醚，将药材置于通风处，待原料完全干燥后，精确称取样品粉末(叶/茎/果皮)1.0000g，加100mL蒸馏水，微沸防止糊化，回流提取1h，取适量提取液于离心机中，将转速设为6000r/min，离心3min，取上清液即为样品溶液；颜色较深的水提液会对吸光度产生影响，因此要对带颜色的水提液进行定体积冻干，之后加同体积蒸馏水，以排除水提液中的色素干扰。
博落回醇提物的详细制备过程：精确称取市购的博落回提取物1.0000g，加100mL95％乙醇进行溶解，取适量溶解液于离心机中，将转速设为5000r/min，离心3min，取上清液即为样品溶液；由于醇提液中的乙醇会对酶产生抑制作用，故对醇提液进行预处理，具体的操作为：取定量醇提液用旋转蒸发仪将乙醇完全蒸出，置于40℃烘干箱中烘干，再用同体积的蒸馏水溶解，得到醇提样品溶液。
博落回水提物的详细制备过程：精确称取市购的博落回提取物1.0000g，加100mL蒸馏水进行溶解，取适量溶解液于离心机中，将转速设为5000r/min，离心3min，取上清液即为样品溶液。颜色较深的水提液会对吸光度产生影响，因此要对带颜色的水提液进行定体积冻干，之后加同体积蒸馏水，以排除水提液中的色素干扰。
实施例1
1.α-葡萄糖苷酶活性抑制实验
1.1.酶抑制动力学实验
PBS缓冲液的配制:A液(0.1mol/L磷酸二氢钾):磷酸二氢钾1.361g.加双蒸水至100ml。B液(0.1mo/L磷酸氢二钠):酸酸氢二钠1.78g，加双蒸水至100m1。A液和B液1:1混合。
α-葡萄糖苷酶母液的配制：取活力单位100U/mg的α-葡萄糖苷酶粉末1.0mg溶解于1.0mL PBS缓冲液中，得100U/mL的α-葡萄糖苷酶母液。取0.10mL母液溶于10mL PBS缓冲液中，配成2U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。
阳性对照药物阿卡波糖标准溶液的配制：取0.3398g阿卡波糖于10ml容量瓶用PBS溶解定容，配制成50.0mmol/L的母液，梯度稀释为5.0mmol/L、12.5mmol/L、25mmol/L、37.5mmol/L、50mmol/L的标准溶液。
底物4-对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(M：301.25)标准溶液的配制：取0.1505gPNPG溶于1.654ml二甲基亚砜中(移液管移取1.6ml，移液枪移取0.054ml)，再加入2.646ml PH＝6.8的磷酸盐冲液(移液管移取2.6ml，移液枪移取0.046ml)，配成116mmol/L的PNPG母液，使用移液枪按比例将其稀释成浓度为1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、7.5mmol/L的溶液。
抑制动力学分析：以相同底物浓度做不同抑制剂浓度的显色反应，每种抑制剂浓度做三组平行实验。在96孔酶标板中先加入70uL磷酸盐缓冲液，再加入10uL阿卡波糖溶液和10uLα-葡萄糖苷酶溶液，最后加入10uL PNPG溶液，在酶标仪中震荡3min使其混合均匀，在37℃下反应15min，每隔1min测量生成对硝基苯酚的吸光度(前15分钟每分钟生成硝基苯酚速率相同)。反应初速度的值为生成硝基苯酚的吸光度除以对应的生成时间。根据Lineweave-Burkf双倒数作图法，判断阿卡波糖的抑制类型。横坐标为1/[S]，纵坐标为1/v,其中[S]为底物PNPG浓度，v为反应速率，R为抑制剂浓度。
1.2.阳性组实验：
准确称取0.1000g阿卡波糖于100ml容量瓶中使用去离子水定容，配成浓度为1000μg/ml的溶液，使用移液枪按比例将其别稀释为所需要的浓度梯度(0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml)，用该浓度梯度做对α-葡萄糖苷酶活性抑实验。
1.3.实验结果
酶动力学的实验数据见表1：
其中1/[S]各底物浓度的倒数，R为抑制剂浓度，1/v为反应速率的倒数
表1不同组合反应速倒数率表
Table 1 Table of response rate countdown for different combinations
Figure BDA0003262701370000061
由双倒数图可以得出，阿卡波糖的Lineweave-Burkf双倒数图同时具有竞争型抑制和非竞争型双倒数图的特征，由此推断阿卡波糖的抑制类型是由竞争型抑制与非竞争型共同组成。说明阿卡波糖能够对α-葡萄糖苷酶活性起到抑制作用的原因在于阿卡波糖可在α-葡萄糖苷酶的活性点上结合。
再以Lineweave-Burkf双倒数图图中各斜率作为纵坐标，以阿卡波糖浓度为横坐标，进行线性拟合，如图2。
由拟合直线与横轴的交点可得阿卡波糖的抑制常数为44.66。
各浓度的阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率数据及实验结果见表2：
表2阿卡波糖活性抑制结果
Tab2 Acarbose activity inhibition results
Figure BDA0003262701370000071
阿卡波糖作为一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，常被用作糖尿病的治疗。通过以上数据可得知阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用，并且其抑制率与阿卡波糖的浓度呈正相关，到达一定浓度后，随阿卡波糖浓度升高到一定值，抑制率呈现平稳趋势，最终基本保持不变，由此可见以阿卡波糖为阳性对照物建立的抑制α-葡萄糖苷酶的模型作为筛选中药降血糖活性的方法是可行性的。
2.黑老虎提取物和博落回提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的筛选实验
2.1.配制标准浓度实验试剂
4-对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液的配制：准确称取0.1505gPNPG溶解于1.654mL二甲基亚砜中，待完全溶解后，加入2.646mL PBS缓冲液，配成0.116mol/L的底物溶液。α-葡萄糖苷酶母液的配制：取活力单位100U/mg的α-葡萄糖苷酶粉末1.0mg溶解于1.0mL PBS缓冲液中，得100U/mL的α-葡萄糖苷酶母液。取0.10mL母液溶于5mL PBS缓冲液中，配成2U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。
2.2.PNPG显色反应
在酶标仪96孔板中，分别加入水、提取液、PBS溶液和α-葡萄糖苷酶液，在37℃孵育10min后，加入底物PNPG溶液，于37℃反应10min；再加入100μL 1.0mol/L的Na2CO3溶液终止反应；反应终止后，于405nm测定产物的OD值，平行3次，取均值。依据公式1：
Figure BDA0003262701370000081
计算α-葡萄糖苷酶抑制率。其中：
I为α-葡萄糖苷酶抑制率；A1为空白组，A2为试验组，A3为背景组。A1-A3均为测得od值。
加样顺序及体积见表3：
表3实验组加样表
Tab3 Sample addition table of experimental group
Figure BDA0003262701370000082
2.3.1.博落回提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定结果见表4：
表4博落回提取物的活性抑制结果
Tab4 The results of activity inhibition of Macleaya cordata(willd.)R.Br
Figure BDA0003262701370000091
从表4的数据可知，博落回的水溶液和醇溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制率都超过20％，有较高抑制活性，对于降血糖药物的开发具有潜在价值。
2.3.2.黑老虎提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定结果见表5：
表5黑老虎提取液的活性抑制结果
Tab5 The results of activity inhibition of Kadsura coccinea(Lem.)A.C.Smith
Figure BDA0003262701370000092
从表5的数据可知，黑老虎的水提液和醇提液对α-葡萄糖苷酶有较高的抑制作用，黑老虎各部位提取液与α-葡萄糖苷酶抑制率之间的关系为：叶水提>果皮醇提>叶醇提>茎水提>茎醇提>果皮水提。其中黑老虎叶水提液对酶的抑制率高达75.51％，果皮的醇提液对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达64.90％，说明其具有良好的降血糖活性，在新降血糖药物的开发方面具有极高的价值。
实施例2
1.酪氨酸酶活性抑制实验
1.1.酪氨酸酶抑制实验方法的建立
1.1.1.实验试剂配制
PBS缓冲液的配制:A液(0.1mol/L磷酸二氢钾):磷酸二氢钾1.361g.加双蒸水至100ml。B液(0.1mo/L磷酸氢二钠):酸酸氢二钠1.78g，加双蒸水至100m1。A液和B液1:1混合。
L-酪氨酸溶液配制:取0.04g酪氨酸，加PBS缓冲液100ml使其溶解。
酪氨酸酶溶液配制:取0.004g酪氨酸酶，加PBS缓冲液100ml使其溶解。
维生素C溶液配制:取0.08g维生素C，加去离子水100ml使其溶解。
不同浓梯度的维生素C配制:取配置好的0.8mg/ml的维生素C溶液加去离子水，梯度稀释成需要的浓度(0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml)。
1.1.2.紫外分光光度检测法
取取上述PBS2.0ml，L-酪氨酸溶液0.5ml，酪氨酸酶溶液2.0ml于试管摇匀，置于恒温水浴锅保持37C°分别水浴加热0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h，在475nm条件下检测酪氨酸酶反应程度，各浓度梯度条件不变，重复实验，根据酶反应变化确定酶最佳反应条件。通过公式2:
I1＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100％ (2)
计算出抑制率。其中A1(2.0ml PBS+0.5ml L-酪氨酸溶液+2.0ml酪氨酸酶溶液)对照组和A2(2.5ml PBS+2.0ml酪氨酸酶溶液)为空白组，A3和A4为不同浓度梯度的样品和维生素C的吸光度。
1.1.3.酶标仪检测法
为了控制反应时长等变量，减少实验误差，接下来的实验采用酶标仪检测法：
取A1(80uL PBS+50uL L-酪氨酸溶液+80uL酪氨酸酶溶液)和A2(130uL PBS+80uL酪氨酸酶溶液)为空白对照组。A3(60uL PBS+50uL L-酪氨酸溶液+80uL酪氨酸酶溶液+20uL维生素C)和A4(110uL PBS+80uL酪氨酸酶溶液+20uL维生素C)为不同浓度梯度(0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml)的维生素C的吸光度，每组各设三个板孔。将酶标仪孵化条件设置为波长475m，震动模式为单次，温度37C°，反应时长1h，然后进行孵化，并在波长为475m下扫描检测，记录数据，用公式1.计算出抑制率。
1.2.实验结果与分析
1.2.1.吸光度与反应时长数据结果
实验测得酪氨酸酶不同反应时长的吸光度数据如表6所示：
表6酪氨酸酶不同反应时长的吸光度
Tab6Absorbance of tyrosinase at different reaction times
Figure BDA0003262701370000101
根据表6的实验数据绘制出图3的标准曲线。
根据表6和图3可知，反应速率在1h之后明显变慢，在此期间反应物得到充分反应，所以得出实验最佳反应时长为1h。
1.2.2.不同浓度维生素C对酪氨酸酶活性的影响
实验测得不同浓度维生素C对酪氨酸酶抑制率数据如表7所示：
表7不同浓度维生素C对酪氨酸酶活性抑制效果
Tab6 Effects of different concentrations of vitamin C on inhibitionof tyrosinase activity
Figure BDA0003262701370000111
酶动力学线性图见图4。如图4所示，维生素C浓度越大，其对酪氨酸酶活性的抑制率越大。其回归线斜率约为97，与y轴交于5.56处，线性方程为y＝5.66+97x。故酪氨酸酶活性与抑制剂浓度正相关。
2.黑老虎提取物和博落回提取物抑制酪氨酸酶活性的筛选实验
2.1.配制标准浓度实验试剂
PBS缓冲液的配制:A液(0.1mol/L磷酸二氢钾):磷酸二氢钾1.361g.加双蒸水至100ml。B液(0.1mo/L磷酸氢二钠):酸酸氢二钠1.78g，加双蒸水至100m1。A液和B液1:1混合。
L-酪氨酸溶液配制:取0.04g酪氨酸，加PBS缓冲液100ml使其溶解。
酪氨酸酶溶液配制:取0.004g酪氨酸酶，加PBS缓冲液100ml使其溶解。维生素C溶液配制：取0.08g维生素C，加去离子水100ml使其溶解。
2.2.滴板设定
表8实验试剂配比
Tab8Reagent ratio
Figure BDA0003262701370000112
本实验组所需试剂配比见表8，用移液枪按配比将标准试剂滴入多孔版，为减少实验误差，每组设定三个实验项，三个对照项。将酶标仪孵化条件设置为震动模式为单次，温度37C°，反应时长1h，然后进行孵化，并在波长为475m条件下扫描检测，记录数据。不同提取物样品和维生素C(0.8mg/ml)的吸光度，每组各设三个板孔，取平均值；
2.3.反应与检测条件测定
将酶标仪孵化条件设置为波长475m，震动模式为单次，温度37C°，反应时长1h，然后进行孵化，并在波长为475m下扫描检测，记录数据；
2.4.酪氨酸酶抑制率的计算
记录数据并进行处理，通过公式2计算出抑制率。
2.5.实验结果与分析
2.5.1.黑老虎提取物和博落回提取物对酪氨酸酶活性抑制效果见表9：
表9酪氨酸酶抑制活性测定结果
Tab9 Determination results of tyrosinase inhibitory activity
Figure BDA0003262701370000121
2.5.2.实验结果总结
由数据可知：黑老虎叶、茎和果皮的水提物和醇提物对酪氨酸酶活性均有抑制效果，黑老虎各部位提取液与酪氨酸酶抑制率之间的关系为：叶水提>叶醇提>果皮水提>茎水提>茎醇提>果皮醇提。各部位的水提液对酪氨酸酶的抑制率均高于其对应的醇提液，可见水提的方式更加适合这一用途。特别地，黑老虎叶的水提液对酪氨酸酶的抑制率高达77.35％，抑制活性明显，在美白产品的开发方面具有较高的潜力。
实施例3
为确定黑老虎提取物中具有降血糖和美白功能活性的化学成分，我们进一步对其展开分析鉴定。
1.黑老虎叶化学成分分析
根据黑老虎各部位的指纹图谱可知，黑老虎叶在液相条件下的检出峰最多，化学成分可能最复杂，因此用叶醇提液进样LC-MS(液相色谱-质谱联用仪)分析。
1.1.实验方法
运用液相色谱-质谱联用仪，对黑老虎叶的化学成分进行分析。将黑老虎叶的醇提液过0.22μm微孔滤膜，上样LC-MS分析。
色谱条件：采用Eclipse Plus C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱0～5min，12％A；5～10min，12％A→20％A；10～20min，20％A；20～25min，20％A→30％A；25～30min，30％A；30～35min，30％A→80％A；35～60min，80％A→90％A，进样量10uL，流速0.8mL·min-1。质谱条件：HESI离子源，鞘气速率40mL/min，辅助气速率10mL/min，喷雾电压正离子4.0kV、负离子3.2kV，毛细管温度300℃，S-lens50％，扫描模式Fullms/dd-ms2 top5，扫描范围100～1000m/z。
1.2.结果成分
黑老虎叶醇提液液相色谱-质谱分析图如图5所示，通过相对分子质量共鉴定出了8个组分，分别是芦丁、木犀草素4'-O葡萄糖苷、3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基黄酮、尿苷5'-三磷酸酯、BQ-123、(-)-11-9-羧基-Δ-9-四氢大麻酚、3-羟基-6,2',3'-三甲氧基黄酮、(3-甲基丁-2-氧基)-十六烷氧基联苯硅烷。见表10。其中以芦丁和3-羟基-6,2',3'-三甲氧基黄酮的含量最高。8个组分的结构式见图6。
表10质谱分析叶中所含化学成分
Tab10 Mass Spectrometric Analysis of Chemical Components in leaf
Figure BDA0003262701370000131
虽然本申请已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本申请的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本申请的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本申请的权利要求的范围内。

Claims (4)

1.黑老虎叶提取物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，所述黑老虎叶提取物在制备美白产品中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述黑老虎叶提取物为黑老虎叶的醇提物和/或黑老虎叶的水提物，固液比为1：50-200。
4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述醇提的方法为：将药材粉碎，过80-100目筛，于40℃-50℃烘干至恒重，用石油醚在35℃-45℃下回流30-40min，脱去原料中的脂，回收石油醚，得各样品粉末，称取样品粉末1.0000 g，加入100 mL-200mL 75%-95%乙醇回流提取1-2 h，取适量提取液离心，上层的清液即是样品醇提物；
所述水提的提取方法为：将药材粉碎，过80-100目筛，于40℃-50℃烘干至恒重，用石油醚在35℃-45℃下回流30-40min，脱去原料中的脂，回收石油醚，得各样品粉末，精准称取样品粉末1.0000 g，加入100 mL-200mL 蒸馏水回流提取1 h-2 h，取适量提取液离心，上层的清液即是样品水提物。
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