CN113549631B

CN113549631B - 一种野生一粒小麦蓝粒性状主效基因及其分子标记和应用

Info

Publication number: CN113549631B
Application number: CN202111033671.4A
Authority: CN
Inventors: 张连全; 柳欣; 张明虎; 刘宝龙; 郝明; 姜博; 黄林; 甯顺腙; 袁中伟; 刘登才
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2041-09-03
Also published as: CN113549631A

Abstract

本发明公开了一种野生一粒小麦蓝粒性状主效基因及其分子标记和应用，该基因为普通小麦‑野生一粒小麦4A^b(4B)代换系中鉴定的野生一粒小麦基因，所述基因为调控野生一粒小麦蓝粒性状的主效基因，可调控花青素合成。野生一粒小麦蓝粒主效基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明对研究野生一粒小麦花青素合成机制提供了基础，也为基因工程手段改造植物从而提高花青素的含量提供了方向和靶点。

Description

一种野生一粒小麦蓝粒性状主效基因及其分子标记和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种野生一粒小麦蓝粒性状主效基因及其分子标记和应用。

背景技术

花青素已被证明对人类的饮食和健康有效，因为它们具有抗炎、抗氧化和抗癌的特性和改善视力的作用，在蓝粒小麦的糊粉层中发现了一组花青素类色素。在蓝色小麦品系中已鉴定出22种不同的花青素。各种浆果、紫色果皮小麦、蔬菜、红米和黑米以及玉米芯中主要花青素是矢车菊素-3-葡萄糖苷。然而，蓝粒小麦中的主要花青素是飞燕草素-3-葡萄糖苷。飞燕草素-3-葡萄糖苷是花青素中最有效的血管生成抑制剂，这表明它可能在癌症预防和治疗中具有良好的作用。

由于蓝粒小麦中花青素含量高且组成多样，因此对这种小麦的研究特别有意义。一些与小麦相关的种属有蓝粒性状，将外源染色体整合到小麦中可以产生蓝色糊粉层。迄今为止，已经鉴定出三个基因调控小麦中蓝色糊粉层的表达。Ba1，来源于长穗偃麦草，以FL0.75-0.89的片段长度物理定位于4Ag染色体长臂。ThMYC4E是候选Ba1基因。Ba2来自野生一粒小麦和栽培一粒小麦。该基因分别被定位在4A^m和4A^b长臂上的着丝粒附近。BaThb来源于百萨偃麦草，被定位于染色体4J的长臂，在着丝粒和0.52的FL之间。这三个基因都定位于上述物种的同源群4，表明它们有共同的起源。

植物中花青素合成途径为次生代谢通路的分支，在各种植物中较为保守，且在模式作物中已进行了深入研究，花青素合成通路中主要的结构基因有苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)、4-香豆酰CoA连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3羟化酶(F3H)、类黄酮-3'-羟化酶(F3'H)、类黄酮-3',5'-羟化酶(F3'5'H)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花色素苷合成酶(ANS)、类黄酮3-O-糖基转移酶(UFGT)。花青素合成通路中由结构基因编码对应的合成酶或者异构酶等影响花色苷的种类及表达量，而转录因子能通过特异的DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用激活或者抑制结构基因的空间表达，从而调控花青素的合成。目前，研究表明参与花青素合成的转录因子主要有三类即MYB、bHLH和WD40蛋白，大多数植物花青素合成是通过其相互作用形成MBW复合物直接调控结构基因的转录与表达。源于长穗偃麦草的六倍体蓝粒小麦中控制糊粉层花青素生物合成关键基因ThMYC4E已被定位于4E染色体并进行瞬时表达功能验证。而控制野生一粒小麦蓝粒性状的主效基因尚不明确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种野生一粒小麦蓝粒性状主效基因，该基因可用于调控一粒小麦中花青素的合成，对研究野生一粒小麦花青素合成机制提供了基础，也为基因工程手段改造植物从而提高花青素的含量提供了方向和靶点。

为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术方案：

本发明从普通小麦-野生一粒小麦4A^b(4B)代换系Z18-1244的糊粉层进行转录组分析，分析预测出控制野生一粒小麦蓝色糊粉层性状的主效基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的另一方面，提供了一种野生一粒小麦蓝粒的调控蛋白，所述蛋白为SEQID NO.1所示基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的另一方面，提供了包含如SEQ ID NO.1所示基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或宿主细胞。

其中，所述宿主细胞排除人或动物的生殖细胞或胚胎干细胞。

在本发明的另一方面，提供了SEQ ID NO.1所示基因和SEQ ID NO.2所示蛋白的分子标记，包括特异分子标记和特异荧光定量标记。

所述的特异分子标记为TbMYC4Aa1-F和TbMYC4Aa1-R：

TbMYC4Aa1-F：GTTTTCAACCCTCCTTTCTGAAATA

TbMYC4Aa1-R：GCCCATGAAGGGAATGCAAA；

所述的特异荧光定量标记为TbMYC4A-RT-F和TbMYC4A-RT-R：

TbMYC4A-RT-F：ACCCTAATCAAGGGTTGCCAG；

TbMYC4A-RT-R：CAAACGATTGTCTGAATAGAGGC。

在本发明的另一方面，提供了SEQ ID NO.1所示基因和SEQ ID NO.2所示蛋白在调控花青素合成中的应用。通过将所述的基因转染到植物中，使所述基因在所述植物中进行表达。

优选的，包括构建含所述基因的植物表达载体，用所述构建的表达载体转化植物细胞。

本发明的有益效果为：

本发明利用红粒Crocus和普通小麦-野生一粒小麦4A^b(4B)代换系Z18-1244的糊粉层进行转录组分析，分析预测出控制野生一粒小麦蓝色糊粉层性状的主效基因，对研究野生一粒小麦花青素合成机制提供了基础，也为基因工程手段改造植物，从而提高花青素的含量提供了方向和靶点。

附图说明

图1为转录组测序样本红粒Crocus和普通小麦-野生一粒小麦4A^b(4B)代换系Z18-1244籽粒；

图2为样本Crocus和Z18-1244差异基因分布图，红色为上调基因，即基因表达量Z18-1244比Crocus高，绿色为下调基因即基因表达量Crocus比Z18-1244高，黑色为基因表达量在两者直接没有差异；

图3为DEGs的GO分类；所有基因被划分为三类：细胞成分(cellular component)、生物过程(biological process)以及分子功能(molecular function)；

图4为本发明花青素合成途径中结构基因的差异表达及该途径中的转录因子；其中：箭头标明代谢过程途径，缩写字母代表催化这一过程的关键酶基因，热图中绿色越深代表Z18-1244在花青素合成途径中的基因相较于Crocus表达量越低，红色越深代表表达量越高；

图5为本发明TbMYC4A和麦类作物中控制有色籽粒花青素合成主效基因氨基酸序列比对示意图；横线区域分别标注了三个结构功能域：bHLH-MYC_N结构域、HLH结构域和ACT-like结构域；

图6为本发明TbMYC4A基因和其他物种中花青素合成代谢相关的bHLH转录因子的系统发育树；

图7为本发明用不同载体轰击生长2天后的小麦胚芽鞘；从左到右依次分别表示单独使用pBract214：MYB7D，pLGY-02:TbMYC4A，pBract214：TaMYC1和pBract214：TaMYB7D共同作用，pLGY-02:TbMYC4A和pBract214：TaMYB7D共同作用。

图8本发明开发的野生一粒小麦蓝粒基因特异分子标记在小麦近缘属种中的检测情况；1：Crocus；2：G52；3、4、5：蓝粒代换系；6、7：节节麦；8、9：乌拉尔图小麦；10、11、12：四倍体小麦；13：提莫菲维小麦；14：茹可夫斯基小麦；15：栽培一粒小麦；

图9野生一粒小麦蓝粒基因在Crocus与Z18-1244籽粒不同发育时期(花后14D、21D、28D、35D)的表达谱。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

针对目前未发现和研究野生一粒小麦中花青素合成相关的关键基因，本发明人利用小麦糊粉层特异表达的基因进行分析。为此，发明人首次采用新一代高通量测序对野生一粒小麦代换系蓝色糊粉层中花青素合成相关的关键基因进行了研究。

本发明通过红粒Crocus和蓝粒普通小麦-野生一粒小麦4A^b(4B)代换系Z18-1244糊粉层转录组测序，分析预测出控制野生一粒小麦籽粒糊粉层蓝色性状的主效基因：

1)转录组测序共发掘新基因105,787个，利用NR、Swiss-prot、KEGG、COG、GO、KOG、PFAM、eggNOG以及其他蛋白质数据库分析，共有92,072个基因得到注释。

2)通过基因的差异表达分析Crocus和Z18-1244中共有9819个差异表达基因，其中4101个基因上调表达，5718个基因下调表达。

3)所有测序基因可分为三类：细胞成分(cellular component)、生物过程(biological process)以及分子功能(molecular function)。

4)在花青素合成途径中，除了C4H结构基因没有表达，其余大部分晚期生物合成基因上调表达，且由于蓝粒材料为4A^b(4B)代换系，来源于野生一粒小麦的蓝粒基因应位于小麦4同源群，将小麦4同源群中花青素合成相关的基因筛选出来，共有3种4CL、MYB、MYC各一个，其中MYC转录因子与中国春匹配度较低，在Crocus中表达量为0，且从野生一粒小麦中同样克隆出此基因，由此筛选出调控野生一粒小麦蓝粒糊粉层中花青素合成可能性最高的候选基因，并将其命名为TbMYC4A。TbMYC4A具有bHLH转录因子的结构域，通过构建系统发育树，发现TbMYC4A归属于调节花青素生物合成的分支。TbMYC4A在小麦白色胚芽鞘中与MYB转录因子共表达可以诱导花青素的合成。后开发其特异分子标记用于区分小麦同源基因。

实施例1转录组测序分析

测序样品为红粒Crocus和蓝粒普通小麦-野生一粒小麦4A^b(4B)代换系Z18-1244的糊粉层(图1)。

1)测序及序列组装

转录组测序能够高效快捷的获取生物组织的所有转录本。各样品的Clean Data均达到5.97Gb，Q30碱基百分比在93.18％及以上。分别将各样品的Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对，比对效率从84.79％到87.82％不等。基于比对结果，进行可变剪接预测分析、基因结构优化分析以及新基因的发掘，发掘新基因105,787个，其中92,072个得到功能注释。基于比对结果，进行基因表达量分析。根据基因在不同样品中的表达量识别差异表达基因，并对其进行功能注释和富集分析，如表1所示。

表1测序、过滤和组装统计

Samples	Clean reads	Clean bases	GC Content	％≥Q30
					Crocus	27664008	8257973753	53.93％	93.56％
Z18-1244	23288416	6974281448	56.35％	93.91％

2)注释结果

转录组测序共发掘新基因105,787个，利用NR、Swiss-prot、KEGG、COG、GO、KOG、PFAM、eggNOG以及其他蛋白质数据库分析，共有92,072个基因得到注释，如表2所示。

表2注释分类

注释数据库	COG	GO	KEGG	KOG	Pfam	Swiss-Prot	eggNOG	nr	All
										新基因数目	27176	65160	29671	42772	60204	57388	77754	91781	92072

3)差异表达基因分析

根据映射到参考转录体上的读数计算出FPKM值来确定可能的差异表达单基因用于鉴定红粒Crocus和蓝粒Z18-1244。通过FDR≤0.05和|log2Ratio|≥2表达水平的比较，在两者之间共有9819个差异表达基因，其中4101个基因上调表达，即Z18-1244中基因表达量高于Crocus，5718个基因下调表达，即Z18-1244中基因表达量低于Crocus(图2)。

4)差异基因的GO分类

将9819个差异基因分为三个大类细胞成分(cellular component)、生物过程(biological process)以及分子功能(molecular function)。在细胞成分中，差异基因大多数富集在细胞(cell)(2921DEGs)、膜(membrane)(1822DEGs)、细胞器(organelle)(2250DEGs)；生物过程中，大部分差异基因富集在代谢过程(metabolic process)(2413DEGs)、细胞过程(cellular process)(2311DEGs)、生物调节过程(biologicalregulation)(904DEGs)；分子功能中，大部分差异基因富集在催化活性(catalyticactivity)(2416DEGs)、绑定(binding)(2534DEGs)如图3所示。

5)花青素合成转运相关基因的表达

在Crocus与Z18-1244转录组数据中差异基因共有106个基因与花青素合成、转运相关，其中包括PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、ANS、MYB、MYC、GT、AT、GST、MRP(表3)，据此作出花青素合成、转运路线图(图4)。

在差异基因中没有发现C4H基因以及与花青素合成相关的MT基因，在之前的研究中野生一粒小麦的蓝粒基因定位于4A^b染色体，因此将Z18-1244中位于小麦4同源群且上调的花青素合成基因筛选出来，共三个：一个4CL基因、一个MYB转录因子、一个MYC转录因子，其中MYB转录因子与中国春同源性为100％，而MYC转录因子同源性较低，且在Crocus中表达量为0，两者log₂FoldChange达到了6.14(表3)。

表3花青素生物合成途径中结构基因和调控基因的表达差异(红粒/蓝粒)

野生一粒小麦中控制蓝粒糊粉层花青素合成代谢主效基因TbMYC4A，该基因来源于普通小麦-野生一粒小麦4A^b(4B)代换系Z18-1244糊粉层中bHLH转录因子，它具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1719位所示的核苷酸序列组成。

实施例2TbMYC4A的分子特性

1)总RNA和cDNA的准备

使用Tiangen RNAprep纯植物试剂盒(Tiangen公司，中国北京)从约0.5g糊粉层提取总RNA。使用Thermo RevertAid First Strand cDNA试剂盒(Thermo-FisherScientific，中国上海)从总RNA获得cDNA。

2)设计引物分离TbMYC4A转录本

TbMYC4Acds-F：ATGCGGGAAACAGCTACTCAG；

TbMYC4Acds-R：CTATATAGCTTTCTGAAGCGCTTCA。

引物TbMYC4Acds-F、TbMYC4Acds-R用来扩增cDNA从而分离Z18-1244中的野生一粒小麦蓝粒基因。使用veriti96 abi life 2720(Thermo-Fisher Scientific)利用i-Max超高保真DNA聚合酶(Hunan innovagene biotechnology Limited)进行PCR扩增。

PCR扩增程序为95℃变性5分钟，35个循环：95℃30秒,60℃30秒，72℃1分40秒，随后72℃延伸5分钟。使用Tiangen TIANgel Midi纯化试剂盒(Tiangen公司)从1.0％琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。将PCR产物克隆至pEASY-Blunt Zero Cloning Kit载体(TransGenBiotech北京)然后将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞(TaKaRa,中国)中。随机挑取20个单菌落，用引物TbMYC4Acds-F和TbMYC4Acds-R扩增各菌体，得到大小一致的片段。送至擎科生物有限公司进行测序，确定转录本序列，最终得出TbMYC4A编码区序列如SEQ ID NO.1，长度为1719bp。

3)TbMYC4A结构域分析及系统发育树构建

在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上预测保守的功能域。TbMYC4A具有完整的bHLH-MYC_N和HLH结构域。与小麦中控制紫色果皮和蓝色糊粉层花青素合成代谢主效基因TaMYC1和ThMYC4E相比，TbMYC4A具有三个相似的结构功能域：bHLH-MYC_N、HLH和ACT-like。三个结构域对于bHLH蛋白质行使其转录功能十分重要(如图5所示)。

使用MEGA X通过邻接法构建TbMYC4A与其他物种中与花青素合成相关的bHLH转录因子的氨基酸系统发育树，图中TbMYC4A与调节花青素的合成调节蛋白聚为一支，且与同样具有蓝粒性状的长穗偃麦草、大麦中ThMYC4E、HvMYC1亲缘关系最近(图6)。结果表明TbMYC4A很有可能为控制野生一粒小麦中花青素合成代谢的基因。

实施例3TbMYC4A的瞬时表达可以诱导花青素合成

使用同源重组构建瞬时表达载体pLGY-02:TbMYC4A。使用TbMYC4F2和TbMYC4R2从TbMYC4A连接碱基序列正确的pGEM-Teasy载体上进行扩增，通过高质量的试剂盒进行目的片段胶回收，电泳检测无杂带后备用。将pLGY-02线性化载体与TbMYC4A回收片段1:2浓度比例混匀，通过ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒进行链接37℃反应30min后即置于冰上冷却后转化大肠杆菌DH5α，过夜培养，挑取重组反应转化板上的单斑进行PCR菌落检测，阳性单斑送至上海生工生物进行测序备用。pBRACT214：TaMYC1和pBRACT214：TaMYB7D已被验证共同作用能够诱导白色胚芽鞘产生大量红色细胞(Yuan Z,Xi X,Li S,etal.Allelic Variation and Transcriptional Isoforms of Wheat TaMYC1 GeneRegulating Anthocyanin Synthesis in Pericarp[J].Frontiers in Plant Science,2017,8:1645.)。

按照Ahmed(Ahmed,N.,Maekawa,M.,Utsugi,S.,Himi,E.,Ablet,H.,Rikiishi,K.,et al.(2003).Transient expression of anthocyanin in developing wheatcoleoptile by maize Cl and B-peru regulatory genes for anthocyaninsynthesis.Breed.Sci.)中介绍的基因枪轰击技术步骤，分别构建不同载体组合的金粉粒，通过基因枪轰击到白粒小麦Opata的胚芽鞘中，在轰击后光照培养16h，通过体式显微镜观察所有处理的胚芽鞘，拍照并计数。单一TaMYB7D和TbMYC4A进行轰击后胚芽鞘并无法进行花青素合成，平均花青素细胞数为零，说明单基因TbMYC4A无法调控花青素的生物合成。在TaMYB7D的辅助下，TaMYC1在白色胚芽鞘中瞬时表达诱导花青素的合成，每个胚芽鞘中红色细胞平均有35个。TbMYC4A与TaMYB7D相互作用下也能够诱导白色胚芽鞘合成花青素，每个胚芽鞘中红色细胞平均有50个，说明TbMYC4A是具有调控花青素合成代谢的bHLH转录因子。

实施例4TbMYC4A特异分子标记的开发

为区别TbMYC4A于普通小麦中的同源基因，在研究中发现两者在TbMYC4A编码区552-553bp之间的内含子区域存在15bp的缺失。据此，开发跨越插入片段的野生一粒小麦蓝粒基因的特异分子标记(TbMYC4Aa1-F、TbMYC4Aa1-R)，与小麦中同源基因编码区序列相比，在第四，第五外显子之间存在15bp的插入片段，据此开发跨外显子的特异荧光定量标记(TbMYC4A-RT-F、TbMYC4A-RT-R)。

TbMYC4A-RT-F：ACCCTAATCAAGGGTTGCCAG；

TbMYC4A-RT-R：CAAACGATTGTCTGAATAGAGGC：

TbMYC4Aa1-F：GTTTTCAACCCTCCTTTCTGAAATA；

TbMYC4Aa1-R：CCCATGAAGGGAATGCAAA。

使用多种小麦近缘属种对该标记进行检测，结果为仅在一粒小麦中检测到条带(图8)，说明该标记可作为一粒小麦蓝粒基因的检测标记。

实施例5TbMYC4A在不同籽粒发育时期表达量变化情况

取Crocus与Z18-1244花后14天、21天、28天、35天的籽粒提取RNA，使用TbMYC4A-RT-F、TbMYC4A-RT-R作引物来测定表达量水平。

Crocus在四个时期表达量均为0，说明该基因不在Crocus中表达，为野生一粒小麦中特异基因。而Z18-1244中表达量从14天开始随着时间增长而增长，到28天达到顶峰，随后下降(图9)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种野生一粒小麦蓝粒性状主效基因及其分子标记和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1719

<212> DNA

<213> 野生一粒小麦(Triticum boeoticum Boiss)

<400> 1

atgcgggaaa cagctactca gcagtgtggt aatcgatcaa tggcgctatc agctcccagt 60

caggaacagc cgtcggggaa gcaattcggc taccagctcg ctgctgctgt gaggagcatc 120

aactggactt atgccatatt ttggtccgtt tccgccagcc cgcgcccagg ccactcctca 180

gttctggcgt ggaaggatgg gttctacaac ggcgagataa agacaagaaa gattaccggc 240

tcgaccacta cggagcttac agcggacgag cgcgtcatgc acagaagtaa gcaactgagg 300

gagctctacg aatcgctctt ggccggcaac tccaacaacc gggcaaggcg acccgccgcc 360

tcactgtcac cggaggatct cggggacggc gagtggtatt acaccataag catgacttac 420

accttccacc ctaatcaagg gttgccaggc aaaagctttg cgagcaatca acatgtttgg 480

ctgtacaacg ctcaatacgc aaacaccaga gttttccccc aagcgctctt agcaaagtct 540

gcctctattc agacaatcgt ttgcattccc ttcatgggcg gtgtgcttga gctcggaacg 600

tcggatcagg ttttggagga ccccagtatg gtgaagcgga tcagcacgtc tttctgggag 660

ctgcacttgc cgtcatcctt ggagtcgaag gatccgagct ccagcacatc agcaaacgat 720

accagggagg ccacggacat tatcttgttc gaggacttcg accacaacga cacagttgag 780

ggggtgatct ctgagcaaag ggaggtccag tgcccgtcca acgtcaatct ggagcgcctc 840

acaaagcaga tggacgagtt ccacagcctt ctgggtggac tggacgtgca tcctctcgaa 900

gacagatgga tcatggacga gccctttgag tttatgtttt ccccggaagt ggcgccggct 960

atggatatgc tgagcaccga cgatgtcatc gtcactttaa gtaggtccga aggctctcgt 1020

ccatcctgct tcattgcgtg gaagggatcg tccgagtcga aatacgtgtc tggtcaggtc 1080

gttggggagt cacagaagtt gctgaataaa gttgtggctg gtggtgcatg ggcgaggaat 1140

tatggcggtc gcaccacggt gagagctcag gaaattaaca acaacaccca tgtcatgaca 1200

gagagaagac gccgggagaa actcaacgag ttgttcctgg ttctcaagtc actagtcccg 1260

tccattcaca aggtggacaa ggcatccatc ctcacagaaa cgataggcta tcttagagaa 1320

ctgaagcaaa gggtagatca gctagaatcc agccggtcac cgtctcaccc aaaagaaaca 1380

acaggaccga gcagaagcca tgtcgccggc gctaggaaga agatagtctc ggccggatcc 1440

aagaggaagg cgccagggtt ggagagcccg agcaatgtcg tgaacgtgac gatgctggac 1500

aaggtggtgc tgttggaggt gcagtgcccg tggaaggagc tgctgatgac acaagtgttt 1560

gacgccatca agagcctctg tctggatgtt gtctccgtgc aggcatccac atcgggtggc 1620

cgtcttgacc tcaagatacg agctattcag cagcttgcgg tcggttctgc tatcgtggca 1680

cctggggcaa tcactgaagc gcttcagaaa gctatatag 1719

<210> 2

<211> 572

<212> PRT

<213> 野生一粒小麦(Triticum boeoticum Boiss)

<400> 2

Met Arg Glu Thr Ala Thr Gln Gln Cys Gly Asn Arg Ser Met Ala Leu

1 5 10 15

Ser Ala Pro Ser Gln Glu Gln Pro Ser Gly Lys Gln Phe Gly Tyr Gln

20 25 30

Leu Ala Ala Ala Val Arg Ser Ile Asn Trp Thr Tyr Ala Ile Phe Trp

35 40 45

Ser Val Ser Ala Ser Pro Arg Pro Gly His Ser Ser Val Leu Ala Trp

50 55 60

Lys Asp Gly Phe Tyr Asn Gly Glu Ile Lys Thr Arg Lys Ile Thr Gly

65 70 75 80

Ser Thr Thr Thr Glu Leu Thr Ala Asp Glu Arg Val Met His Arg Ser

85 90 95

Lys Gln Leu Arg Glu Leu Tyr Glu Ser Leu Leu Ala Gly Asn Ser Asn

100 105 110

Asn Arg Ala Arg Arg Pro Ala Ala Ser Leu Ser Pro Glu Asp Leu Gly

115 120 125

Asp Gly Glu Trp Tyr Tyr Thr Ile Ser Met Thr Tyr Thr Phe His Pro

130 135 140

Asn Gln Gly Leu Pro Gly Lys Ser Phe Ala Ser Asn Gln His Val Trp

145 150 155 160

Leu Tyr Asn Ala Gln Tyr Ala Asn Thr Arg Val Phe Pro Gln Ala Leu

165 170 175

Leu Ala Lys Ser Ala Ser Ile Gln Thr Ile Val Cys Ile Pro Phe Met

180 185 190

Gly Gly Val Leu Glu Leu Gly Thr Ser Asp Gln Val Leu Glu Asp Pro

195 200 205

Ser Met Val Lys Arg Ile Ser Thr Ser Phe Trp Glu Leu His Leu Pro

210 215 220

Ser Ser Leu Glu Ser Lys Asp Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ala Asn Asp

225 230 235 240

Thr Arg Glu Ala Thr Asp Ile Ile Leu Phe Glu Asp Phe Asp His Asn

245 250 255

Asp Thr Val Glu Gly Val Ile Ser Glu Gln Arg Glu Val Gln Cys Pro

260 265 270

Ser Asn Val Asn Leu Glu Arg Leu Thr Lys Gln Met Asp Glu Phe His

275 280 285

Ser Leu Leu Gly Gly Leu Asp Val His Pro Leu Glu Asp Arg Trp Ile

290 295 300

Met Asp Glu Pro Phe Glu Phe Met Phe Ser Pro Glu Val Ala Pro Ala

305 310 315 320

Met Asp Met Leu Ser Thr Asp Asp Val Ile Val Thr Leu Ser Arg Ser

325 330 335

Glu Gly Ser Arg Pro Ser Cys Phe Ile Ala Trp Lys Gly Ser Ser Glu

340 345 350

Ser Lys Tyr Val Ser Gly Gln Val Val Gly Glu Ser Gln Lys Leu Leu

355 360 365

Asn Lys Val Val Ala Gly Gly Ala Trp Ala Arg Asn Tyr Gly Gly Arg

370 375 380

Thr Thr Val Arg Ala Gln Glu Ile Asn Asn Asn Thr His Val Met Thr

385 390 395 400

Glu Arg Arg Arg Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Phe Leu Val Leu Lys

405 410 415

Ser Leu Val Pro Ser Ile His Lys Val Asp Lys Ala Ser Ile Leu Thr

420 425 430

Glu Thr Ile Gly Tyr Leu Arg Glu Leu Lys Gln Arg Val Asp Gln Leu

435 440 445

Glu Ser Ser Arg Ser Pro Ser His Pro Lys Glu Thr Thr Gly Pro Ser

450 455 460

Arg Ser His Val Ala Gly Ala Arg Lys Lys Ile Val Ser Ala Gly Ser

465 470 475 480

Lys Arg Lys Ala Pro Gly Leu Glu Ser Pro Ser Asn Val Val Asn Val

485 490 495

Thr Met Leu Asp Lys Val Val Leu Leu Glu Val Gln Cys Pro Trp Lys

500 505 510

Glu Leu Leu Met Thr Gln Val Phe Asp Ala Ile Lys Ser Leu Cys Leu

515 520 525

Asp Val Val Ser Val Gln Ala Ser Thr Ser Gly Gly Arg Leu Asp Leu

530 535 540

Lys Ile Arg Ala Ile Gln Gln Leu Ala Val Gly Ser Ala Ile Val Ala

545 550 555 560

Pro Gly Ala Ile Thr Glu Ala Leu Gln Lys Ala Ile

565 570

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttttcaacc ctcctttctg aaata 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcccatgaag ggaatgcaaa 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accctaatca agggttgcca g 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaacgattg tctgaataga ggc 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgcgggaaa cagctactca g 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctatatagct ttctgaagcg cttca 25

Claims

1.一种野生一粒小麦蓝粒性状主效基因TbMYC4A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因TbMYC4A的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述基因TbMYC4A的特异分子标记，其特征在于，所述的特异分子标记为：

TbMYC4Aa1-F：GTTTTCAACCCTCCTTTCTGAAATA；

TbMYC4Aa1-R：GCCCATGAAGGGAATGCAAA。

4.权利要求1所述基因TbMYC4A的特异荧光定量标记，其特征在于，所述特异荧光定量标记为：

TbMYC4A-RT-F：ACCCTAATCAAGGGTTGCCAG；

TbMYC4A-RT-R：CAAACGATTGTCTGAATAGAGGC。

5.权利要求1所述基因TbMYC4A在调控野生一粒小麦花青素合成中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过将所述的基因TbMYC4A转染到野生一粒小麦中，使所述基因TbMYC4A在所述野生一粒小麦中进行表达。