CN113543794B

CN113543794B - 包含藿香及甘草提取物的用于预防或治疗由微细粉尘引起的呼吸系统疾病的组合物

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Publication number: CN113543794B
Application number: CN202080001215.9A
Authority: CN
Inventors: 琹正淏; 金惠林; 金镇学; 崔水英
Original assignee: Cosmesis Corp; Cosmesch Newzhili Co ltd
Current assignee: Cosmesis Corp; Cosmesch Newzhili Co ltd
Priority date: 2020-02-19
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: WO2021167168A1; KR102131602B1; US20230210932A1; US11980649B2; CN115887524A; AU2020294219A1; CN113543794A; AU2020294219B2; US20230270811A1; AU2020294219B9

Abstract

本发明涉及一种包含藿香及甘草提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的组合物，更详细地，涉及一种包含藿香以及甘草以1:1至6:1的重量比混合而成的提取物作为有效成分的用于预防或治疗由微细粉尘引起的呼吸系统疾病的组合物。本发明的藿香以及甘草提取物具有通过抑制瞬时受体电位香草酸亚型1的活性来减少咳嗽，通过抑制CXCR1、CXCR2的活性、通过减少GR‑1+CD11b+细胞的比例来减少肺部炎症，以及通过抑制黏蛋白5AC来抑制痰液生成的功效，尤其，确认藿香以及甘草的复合混合物在特定配合比下使功效最大化，因此可以将其有效地用作预防或治疗由微细粉尘引起的呼吸系统疾病的组合物。

Description

包含藿香及甘草提取物的用于预防或治疗由微细粉尘引起的呼吸系统疾病的组合物

技术领域

本发明涉及一种包含藿香及甘草提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的组合物，更详细地，涉及一种包含藿香以及甘草以1:1至6:1的重量比混合而成的提取物作为有效成分的用于预防或治疗由微细粉尘引起的呼吸系统疾病的组合物。

背景技术

近来，随着产业经济的发展，由于环境污染、饮食生活的变化，呼吸系统疾病正迅速增加。大气污染引起的死亡率和患病率的增加是威胁人类健康的最大危险因素之一，据世界卫生组织报告，每年有三百万人死于大气污染(约占所有死亡人数的百分之五)，已知这些对人体的影响主要由燃烧化石燃料时产生的微细粉尘引起的。

微细粉尘是指空气中的总悬浮颗粒(total suspended particles)中直径为10微米以下的颗粒物(particulate matter less than 10um in diameter，PM10)，已知引起呼吸系统疾病以及心血管疾病等疾病并且还与死亡率增加有关。大部分微细粉尘是因化石燃料的燃烧而产生，未被鼻腔和呼吸道的黏膜以及纤毛过滤，而渗入肺泡和支气管，从而阻碍肺功能。长时间暴露在微细粉尘时，不但会引起慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管炎、肺炎、结核、肺癌、肺纤维症、慢性肺疾病、呼吸困难综合征、上呼吸道感染等呼吸系统疾病，还会引起心血管疾病、皮肤疾病等各种疾病。

若微细粉尘通过呼吸系统流入，则不易排出，也没有强制排出的方法，无法确切知道何时会因这种损伤而发生什么样的问题，因此急需开发一种可预防、缓解、治疗或改善由微细粉尘引起的呼吸道和肺部损伤并可治疗由此引起的呼吸系统疾病的新的治疗剂。

为此，在本发明中，在致力于开发有效的微细粉尘引起的呼吸系统疾病治疗剂，结果确认将藿香及甘草提取物在特定配合比下使功效最大化。尤其，确认其有效抑制作为由微细粉尘引起的呼吸系统症状的以中性粒细胞浸润为特征的肺部炎症、咳嗽、痰液，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供一种包含藿香及甘草提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的药学组合物。

本发明的另一目的在于，提供一种包含藿香及甘草提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的保健功能食品组合物。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供一种包含藿香及甘草提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的药学组合物。

并且，本发明提供一种包含藿香及甘草提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的保健功能食品组合物。

根据本发明的优选一实施例，呼吸系统疾病是由吸入微细粉尘引起的，可以是选自由呼吸系统炎症性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive PulmonaryDisease；COPD)、副鼻窦炎、过敏性鼻炎、下呼吸道感染、急慢性支气管炎、肺气肿、肺炎、支气管哮喘、支气管扩张症、肺气肿、肺结核后遗症、急性呼吸窘迫综合征以及肺纤维症组成的组中的一种以上。

根据本发明的再一优选实施例，上述藿香及甘草提取物可以是藿香提取物以及甘草提取物的混合物，或者是藿香以及甘草的复合提取物。

根据本发明的另一优选实施例，在上述藿香以及甘草提取物中，藿香以及甘草可以以1:1至6:1的重量比混合而成。

根据本发明的还有一优选实施例，上述藿香以及甘草提取物可以利用选自由水、酒精、碳数为1至4的醇类、己烷以及乙酸乙酯组成的组中一种以上的溶剂来提取。

根据本发明的又一优选实施例，上述藿香以及甘草符合提取物可通过抑制瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)活性来减少咳嗽。

根据本发明的又一优选实施例，上述藿香以及甘草复合提取物可通过抑制CXCR1或CXCR2活性或者通过减少GR-1+CD11b+细胞比例来抑制肺部炎症。

根据本发明的又一优选实施例，上述藿香及甘草复合提取物可通过抑制黏蛋白5AC(MUC5AC)的活性来抑制痰液的生成。

发明的效果

本发明的藿香以及甘草提取物具有通过抑制瞬时受体电位香草酸亚型1的活性来减少咳嗽，通过抑制CXCR1、CXCR2的活性、通过减少GR-1+CD11b+细胞的比例来减少炎症，以及通过抑制黏蛋白5AC来抑制痰液生成的功效，尤其，确认藿香以及甘草的复合混合物在特定配合比下使功效最大化，因此可以将其有效地用作预防或治疗微细粉尘诱发的呼吸系统疾病的组合物。

附图说明

图1为示出根据甘草以及藿香混合比的瞬时受体电位香草酸亚型1活性抑制程度的数据。其中，(A)部分为瞬时受体电位香草酸亚型1的信使核糖核酸(mRNA)表达抑制率，(B)部分为相对于CFA(微细粉尘混合物)处理组的根据提取物的抑制率，(C)部分为确认根据甘草以及藿香的混合比的协同效果的数据。

图2为示出根据甘草以及藿香混合比的CXCR1的活性抑制程度的数据。其中，(A)部分为CXCR1的信使核糖核酸表达抑制率，(B)部分为相对于CFA处理组的根据提取物的抑制率，(C)部分为确认根据甘草以及藿香的混合比的协同效果的数据。

图3为示出根据甘草以及藿香混合比的CXCR2的活性抑制程度的数据。其中，(A)部分为CXCR2的信使核糖核酸表达抑制率，(B)部分为相对于CFA处理组的根据提取物的抑制率，(C)部分为确认根据甘草以及藿香的混合比的协同效果的数据。

图4为示出根据甘草以及藿香混合比的GR-1+CD11b+细胞的活性抑制程度的数据。其中，(A)部分为GR-1+CD11b+细胞的抑制率，(B)部分为相对于CFA处理组的根据提取物的抑制率，(C)部分为确认根据甘草以及藿香的混合比的协同效果的数据。

图5为示出根据甘草以及藿香混合比的黏蛋白5AC的活性抑制程度的数据。其中，(A)部分为黏蛋白5AC的信使核糖核酸表达抑制率，(B)部分为相对于CFA处理组的根据提取物的抑制率，(C)部分为确认根据甘草以及藿香的混合比的协同效果的数据。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

根据本发明的一实施方式，本发明涉及一种包含藿香以及甘草提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的药学组合物。

上述呼吸系统疾病是由吸入微细粉尘引起的，可以是选自由呼吸系统炎症性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、副鼻窦炎、过敏性鼻炎、下呼吸道感染、急慢性支气管炎、肺气肿、肺炎、支气管哮喘、支气管扩张症、肺气肿、肺结核后遗症、急性呼吸窘迫综合征以及肺纤维症组成的组中的一种以上。

上述藿香以及甘草提取物可以是藿香以及甘草以1:1至6:1的重量比混合而成，优选地，可以以4:1的重量比混合。并且，在本发明中，将藿香以及甘草混合后一同提取(复合提取物)，但根据目的，可以分别制备藿香提取物以及甘草提取物后混合使用。

本发明的用于预防或治疗呼吸系统疾病的药学组合物除包含藿香以及甘草以外，还可包含具有预防、治疗或改善呼吸系统疾病效果的天然提取物、其分馏物或化合物。

用于提取上述藿香或甘草的溶剂可以单独使用或混合使用水、酒精或碳数为1至4的醇类、己烷、乙酸乙酯等有机溶剂，优选地，本发明的藿香以及甘草提取物可以使用酒精来提取。

在本发明的一具体实例中，使用酒精分别制备藿香及甘草提取物，以使藿香及甘草提取物混合比为1:1至6:1，并制备单藿香提取物以及单甘草提取物作为比较例。

在本发明的再一具体实例中，确认了藿香及甘草复合提取物对由微细粉尘引起的多种呼吸系统症状的预防或改善效果。首先，确认了已知为咳嗽受体的瞬时受体电位香草酸亚型1的表达程度，结果确认，与单藿香提取物(比较例1)以及单甘草提取物(比较例2)相比，藿香及甘草复合提取物(实验例1至实验例3)处理组中瞬时受体电位香草酸亚型1抑制活性高，尤其，确认以4:1的比例混合藿香及甘草的复合提取物中咳嗽抑制功效最大化(图1)。

在本发明的另一具体实例中，为了确认对作为由微细粉尘引起的呼吸系统疾病的特征的中性粒细胞浸润的改善功效，确认了作为肺部炎症因子的CXCR1以及CXCR2的表达程度，结果确认，与单藿香提取物(比较例1)以及单甘草提取物(比较例2)相比，藿香及甘草复合提取物(实验例1至实验例3)的处理组中CXCR1以及CXCR2抑制活性高(图2以及图3)。

并且，为了确认藿香及甘草复合提取物是否在生物体内也抑制肺部炎症，确认了在肺组织中Gr-1+CD11b细胞比例，结果确认，与单藿香提取物(比较例1)以及单甘草提取物(比较例2)相比，在藿香及甘草复合提取物(实验例1至实验例3)的处理组中CD11b+/Gr-1+白细胞(leukocyte)比例更低(图4)。

即，确认藿香及甘草复合提取物不仅抑制CXCR1以及CXCR2的表达，而且在肺组织中还显著减少CD11b+/Gr-1+细胞(中性粒细胞)的比例，从而确认具有改善作为由微细粉尘引起的呼吸系统疾病的特征的中性粒细胞浸润的功效。

在本发明的还一具体实例中，为了确认痰液的生成是否通过藿香及甘草复合提取物来受到抑制，确认了肺组织中黏蛋白5AC的信使核糖核酸的表达程度，结果确认，与单藿香提取物(比较例1)以及单甘草提取物(比较例2)相比，藿香及甘草复合提取物(实验例1至实验例3)的处理组中黏蛋白5AC的抑制活性高(图5)。

因此，本发明的藿香及甘草复合提取物可以通过以下功效治疗或改善呼吸系统疾病，即，通过抑制瞬时受体电位香草酸亚型1的活性来减少咳嗽；通过抑制CXCR1或CXCR2的活性或通过减少GR-1+CD11b+细胞比例来抑制肺的炎症；通过抑制黏蛋白5AC的活性来抑制痰液的生成，因此可将本发明的藿香及甘草复合提取物有效地用于预防或治疗呼吸系统疾病中。

本发明的药学组合物可根据常规方法分别剂型化为多种形态来使用。例如，可以剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆等口服剂型，并且可以剂型化为外用剂、佐剂以及灭菌注射溶液的形态来使用。根据各剂型还可包含药学上可接受的载体、赋形剂以及稀释剂。并且，还可以根据常规方法剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气雾剂等外用剂以及灭菌注射溶液的形态来使用。

上述载体、赋形剂以及稀释剂有乳糖、葡萄糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。在对上述药学组合物进行制剂化或剂型化的情况下，通过使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。

用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂通过在上述组合物中混合至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、明胶等来制备。并且，除了简单的赋形剂之外，还使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。用于口服的液体制剂有悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，除常用的作为简单稀释剂的水、液体石蜡之外，还可包括各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保鲜剂等。用于肠胃外给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浊剂、油剂、冻干制剂、佐剂等。非水性溶剂、悬浊剂可使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油；油酸乙酯等可注射的酯等。佐剂的基剂可使用witepsol、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等。

使用于本发明的术语“给药”是指以任何合适的方法向个体提供本发明的药学组合物。在本发明中，可以以在研究人员、兽医、医生或通过其他临床所想到的组织系统、动物或人类中引起生物学或医学反应的有效成分或药学组合物的量，即，治疗有效量来给药药学组合物，所述治疗有效量是缓解待治疗的疾病或障碍的症状的量。对于本领域技术人员而言，本发明的药学组合物治疗有效剂量以及给药次数根据所需的效果而改变，这是显而易见的。因此，给药的最佳剂量可通过本领域技术人员轻松的确定，可根据多种因素来调节，包括疾病的种类、疾病的严重程度、包含在组合物中的有效成分及其他成分的含量、剂型的种类、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别及饮食、给药时间、给药途径以及组合物的分泌率、疗程、同时使用的药物等。本发明的药学组合物可以以1～10000mg/kg/天的量来给药，可以每天给药一次，也可给分为若干次。

根据本发明的再一实施方式，本发明涉及一种包含藿香以及甘草提取物作为有效成分的用于预防或改善呼吸系统疾病的保健功能食品组合物。

本发明的藿香及甘草提取物具有通过抑制咳嗽、抑制中性粒细胞浸润来抑制肺部炎症及抑制痰液的功效，可以在用于预防或改善呼吸系统疾病的保健功能食品组合物中利用，具体如上所述。

本发明的保健功能食品的剂型不仅可以为散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂的形态，还可以为普通食品或饮料的形态。

对于上述食品的种类没有特别限制，可添加上述物质的食品有例如肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、小吃类、饼干类、披萨、拉面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋类在内的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料以及复合维生素等，可以包括通常意义上的所有食品。

通常，当制备食品或饮料时，相对于100重量份的原料，可以添加15重量份以下的上述组合物，优选地，可以添加10重量份以下的量的上述组合物。但在以健康以及卫生为目的或以健康调节为目的而长期摄取的情况下，上述量可以在上述范围以下，并且，由于本发明的组合物没有安全性方面的问题，因此也可以以上述范围以上的量来使用。

本发明的保健功能食品中的饮料可以像普通饮料一样含有多种调味剂或天然碳水化合物等作为额外成分。上述天然碳水化合物可以为单糖，如葡萄糖、果糖；多糖，如麦芽糖、蔗糖；多聚糖，如糊精、环糊精；以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇。甜味剂可使用天然甜味剂，如索马甜、甜叶菊提取物；或者合成甜味剂，如糖精、阿巴斯甜。每100ml的本发明的饮料中上述天然碳水化合物的比例可以为约0.01～0.04g，优选地，可以为0.02～0.03g。

除上述之外，本发明的保健功能食品可包含多种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸化剂。此外，本发明的用于改善睡眠的组合物可包含天然果汁、用来制备果汁饮料以及蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用或混合使用。这些添加剂的比例不受限制，但是，相对于100重量份的本发明的保健功能食品，通常选自0.01～0.1重量份的范围内。

以下，提出优选实施例来帮助对本发明的理解。但是，下述实施例仅为更容易理解本发明而提供，本发明的内容不受实施例的限制。

实施例1：藿香提取物以及甘草提取物的制备

1-1：藿香提取物的制备(比较例1)

将100g的经干燥的藿香加入1.5L的30％的酒精中，在70℃的温度下提取4小时。使用沃特曼(Whatman)2号滤纸对提取的试样进行减压过滤，使用真空旋转浓缩器浓缩过滤的提取液并干燥后制备藿香提取物。

1-2：甘草提取物的制备(比较例2)

除了使用100g的干燥的甘草以外，以与1-1相同的方法来进行，其结果制备了甘草提取物。

1-3：藿香及甘草提取物(重量比1:1)的制备(实验例1)

除了使用50g的经干燥的藿香和50g的经干燥的甘草以外，以与1-1相同的方法来进行，其结果制备了藿香及甘草提取物(比例1:1)。

1-4：藿香及甘草提取物(重量比4:1)的制备(实验例2)

除了使用80g的经干燥的藿香和20g的经干燥的甘草以外，以与1-1相同的方法来进行，其结果制备了藿香及甘草提取物(比例4:1)。

1-5：藿香及甘草提取物(重量比6:1)的制备(实验例3)

除了使用86g的经干燥的藿香和14g的经干燥的甘草以外，以与1-1相同的方法来进行，其结果制备了藿香及甘草提取物(比例6:1)。

实施例2：藿香及甘草提取物的咳嗽减少效果的确认

在本发明中，为了确认藿香及甘草提取物的咳嗽减少功效，确认了已知为咳嗽受体的瞬时受体电位香草酸亚型1的表达程度。

首先，在含有10％的胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素以及100μg/ml的链霉素(streptomycin)的RPMI1640培养基中，在37℃的温度、5％的CO₂的条件下培养作为肺泡巨噬细胞的MH-S细胞。将细胞加入6孔培养板以达到5×10⁵个细胞/ml，通过将作为微细粉尘的组分的50mg/ml的煤(coal)以及50mg/ml的飞尘(fly ash)溶解于二甲基亚砜(DMSO)来制备的混合物(CFA)以200μg/ml的浓度处理后，诱导由微细粉引起的反应1小时后，对以1:1混合二甲基亚砜以及胎牛血清的溶液，以60μg/ml的浓度处理各个在上述实施例1中制备的单藿香提取物(比较例1)、单甘草提取物(比较例2)、藿香及甘草提取物(实验例1至实验例3)，在37℃的温度、5％的CO₂的条件下培养6小时。

培养6小时后，通过处理TRIzol试剂(Ambion

reagent；美国Grand Island公司)来分离总核糖核酸(RNA)后，使用互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成试剂盒(ReverTraAcecDNA Synthesis kit；Toyobo公司，日本)来合成互补脱氧核糖核酸，使用100ng的互补脱氧核糖核酸进行实时定量聚合酶链式反应(qPCR)，条件如下：在50℃的温度下进行2分钟，在95℃的温度下进行2分钟，在95℃的温度下进行15秒并重复40次，在60℃的温度下进行1分钟。荧光标记探针-瞬时受体电位香草酸亚型1(TaqMan-TRPV1)(Mm01246302_m1，FAM-MGBdye-labeled)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Mm99999915_g1，FAM-MGB dye-labeled)购自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，以进行实时定量聚合酶链式反应。

表1根据藿香及甘草提取物的混合比例的协同效果(瞬时受体电位香草酸亚型1抑制活性)

根据下述数学式1来测定上述藿香及甘草提取物的预期抑制率。

数学式1：预期抑制率(％)＝[(单藿香提取物的测定抑制率(％))×藿香混合量(g)/100]+[(单甘草提取物的测定抑制率(％))×甘草混合量(g)/100]

如图1所示，其结果确认，与CFA处理组相比，单藿香提取物、单甘草提取物以及藿香和甘草的提取物处理组的瞬时受体电位香草酸亚型1的活性均下降，尤其确认与单藿香提取物(比较例1)以及单甘草提取物(比较例2)相比，在藿香及甘草的提取物(实验例1至实验例3)处理组中瞬时受体电位香草酸亚型1的抑制活性高。这意味着本发明的藿香及甘的草提取物通过减少瞬时受体电位香草酸亚型1的活性来减少由微细粉尘引起的咳嗽的效果优秀。

并且，如表1所示，随着藿香提取物及甘草提取物的混合，确认瞬时受体电位香草酸亚型1的抑制活性增加，尤其，当以4:1的重量比混合藿香及甘草提取物时，确认瞬时受体电位香草酸亚型1的抑制活性最优秀。

实施例3：藿香及甘草复合提取物的肺部炎症抑制效果的确认

在本发明中，为了确认藿香及甘草复合提取物是否抑制肺部炎症，确认了CXCR1以及CXCR2的表达程度。

首先，在含有10％的胎牛血清、100U/ml的青霉素以及100μg/ml的链霉素的RPMI1640培养基中，在37℃的温度、5％的CO₂的条件下培养作为肺泡巨噬细胞的MH-S细胞。将细胞加入6孔培养板以达到5×10⁵个细胞/ml，通过将作为微细粉尘的组分的50mg/ml的煤以及50mg/ml的飞尘溶解于二甲基亚砜来制备的混合物(CFA)以200μg/ml的浓度处理后，诱导由微细粉尘引起的反应1小时后，对以1:1混合二甲基亚砜以及胎牛血清的溶液，以60μg/ml的浓度处理各个在上述实施例1中制备的单藿香提取物(比较例1)、单甘草提取物(比较例2)、藿香及甘草提取物(实验例1至实验例3)，在37℃的温度、5％的CO₂的条件下培养6小时。

培养6小时后，通过处理TRIzol试剂(Ambion

reagent；Grand Island公司，美国)来分离总核糖核酸后，使用互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(ReverTraAce cDNASynthesis kit；日本Toyobo公司)来合成互补脱氧核糖核酸，使用100ng的互补脱氧核糖核酸以及下述表2的引物进行实时定量聚合酶链式反应，条件如下：在50℃的温度下进行2分钟，在95℃的温度下进行2分钟，在95℃的温度下进行15秒并重复40次，在60℃的温度下进行1分钟。

表2引物序列

表3根据藿香及甘草提取物的混合比例的CXCR1活性抑制

表4根据藿香及甘草提取物的混合比例的CXCR2活性抑制

如图2、图3、表3以及表4所示，其结果确认，与CFA处理组相比，单藿香提取物、单甘草提取物以及藿香和甘草的提取物处理组的CXCR1以及CXCR2的活性均下降，尤其确认与单藿香提取物(比较例1)以及单甘草提取物(比较例2)相比，在藿香及甘草提取物(实验例1至实验例3)处理组中CXCR1以及CXCR2的抑制活性高。这意味着本发明的藿香及甘草的提取物通过抑制CXCR1以及CXCR2的活性来降低中性粒细胞的趋化作用，从而减少肺部炎症的效果优秀。

实施例4：藿香及甘草复合提取物的在肺组织中的Gr-1+CD11b+细胞比例的减少效果的确认

在本发明中，为了确认藿香及甘草复合提取物是否在生物体内也能抑制肺部炎症，在肺组织中确认了Gr-1+CD11b+细胞比例。

首先，将Balb/c雄性小鼠以每组8只的数量进行分组，在除了正常组以外的所有组中，在作为微细粉尘的组分的10mg/ml的煤、10mg/ml的飞尘以及5mg/ml的汽油废气颗粒(diesel exhaust particle；DEP)混合物中混合明矾来制备微细粉尘混合物(CFA)，以使其最终浓度达到1％。利用经鼻气管内注射方法(Intra Nasal Tracheal injection)在实验开始的第3天、第6天、第9天将100μl的制备的微细粉尘混合物直接注入实验动物的呼吸道以及鼻子中。

将比较例1、比较例2以及实验例1至实验例3以100mg/kg的浓度稀释于0.5％的羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose；CMC，419273，西格玛奥德里奇公司)溶液，向各组每天口服给药，共11天。在实验开始后第12天进行尸检以分析肺组织。

利用结合有荧光标记的CD11b抗体(553310，美国BD生物科学公司)以及Gr-1抗体(553128，美国BD生物科学公司)对肺组织进行了特异性荧光抗体染色法(specificfluorescence fluorescent antibody stainingmethod)，利用流式细胞仪(FACS，Fluorescence-activated cell sorting，美国BD生物科学公司)来测定总白细胞(leukotcyte)中表达CD11b以及Gr-1的白细胞(CD11b+/Gr-1+leukocyte)的比例。

表5根据藿香及甘草提取物的混合比的CD11b+/Gr-1+细胞比例的抑制活性

如图4以及表5所示，其结果确认，与CFA处理组相比，单藿香提取物、单甘草提取物以及藿香和甘草的提取物处理组的CD11b+/Gr-1+白细胞的比例均下降，尤其确认与单藿香提取物(比较例1)以及单甘草提取物(比较例2)相比，确认在藿香及甘草提取物(实验例1至实验例3)处理组的CD11b+/Gr-1+白细胞比例更低。即，确认藿香及甘草的复合提取物表现出显著的支气管炎症抑制活性。

实施例5：藿香及甘草复合提取物的痰液生成抑制效果的确认

在本发明中，为了确认藿香及甘草复合提取物是否能抑制痰液的生成，确认了在肺组织中黏蛋白5AC的信使核糖核酸的表达程度。

首先，将500ml的RNAzol B(Tel-Test，Friendswood公司，美国)加入实施例4中提取的肺组织并行粉碎至溶解。在上述悬浮液中加入50ml的CHCl₃后，再次混合15秒钟。在冰上放置15分钟后，以13000rpm的转速离心。回收约200ml的上清液，与等量的2-丙醇(2-propanol；I9516，美国西格玛奥德里奇公司)混合后，缓摇晃后在冰中放置15分钟。将其再次以13000rpm的转速离心后，使用80％的乙醇冲洗并真空中干燥3分钟后，提取核糖核酸。将提取的核糖核酸溶解于20ml的使用焦炭酸二乙酯(DEPC，diethyl pyrocarbonate，750023，美国赛默飞公司)处理的蒸馏水中，在75℃的温度下灭活后用于互补脱氧核糖核酸的合成。

在准备好的2μg的总(total)核糖核酸中加入2U/管的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)(AB0620，美国赛默飞公司)，在37℃的温度下反应30分钟后，在75℃的温度下变性10分钟，向其中加入2.5ml的10mM的dNTPs mix(4030，日本TaKaRa公司)、1ml的随机序列六核苷酸(random sequence hexanucleotides)(N8080127，美国赛默飞公司)、1ml的核糖核酸酶(RNase)抑制剂(2313A，日本TaKaRa公司)、1ml的100mM的二硫苏糖醇(DTT)(4029，日本TaKaRa公司)、4.5ml的5×RTbuffer(M5313，美国普洛麦格公司)后，再加入用焦炭酸二乙酯处理的蒸馏水使其最终体积达到20ml。充分混合混合液后，以2000rpm的转速离心沉降5秒钟后，在37℃的加热块(heating block；Multi-blok heater，美国TRIPUNITHURA公司)中反应60分钟来合成互补脱氧核糖核酸。然后，在95℃的温度下放置5分钟使莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RT)失活而合成的互补脱氧核糖核酸用在聚合酶链式反应中。使用Sper-Taqman PCR Master mix(4304437，美国应用生物系统公司)进行反应，以使引物(参照表6)的最终浓度达到200nM。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的条件如下：预变性(predenaturation)在50℃的温度下进行2分钟，94℃的温度下进行10分钟，在95℃的温度下进行0.15分钟并重复40次，在60℃的温度下进行1分钟。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(4352339E，Thermo Scientific公司，美国)用作内标(Internal standard)。

表6引物序列

表7根据藿香及甘草提取物的混合比例的黏蛋白5AC活性抑制

如图5以及表7所示，其结果确认，与CFA处理组相比，单藿香提取物、单甘草提取物以及藿香和甘草的提取物处理组的黏蛋白5AC的表达水平下降，尤其确认与单藿香提取物(比较例1)以及单甘草提取物(比较例2)相比，藿香及甘草提取物(实验例1至实验例3)处理组中黏蛋白5AC的抑制活性高。即，确认藿香及甘草复合提取物抑制痰液的生成。

产业上的可利用性

本发明的藿香以及甘草提取物具有减少咳嗽、减少肺部炎症以及抑制痰液生成的功效，尤其确认藿香以及甘草的复合混合物在特定配合比下使功效最大化，从而可以有效地用作预防或治疗微细粉尘诱发的呼吸系统疾病的组合物。

<110> 科丝美诗纽芝丽株式会社（COSMAX NBT, INC.）

科丝美诗奈斯株式会社（COSMAX NS, INC.）

<120> 包含藿香及甘草提取物作为有效成分的用于预防或治疗由微细粉尘引起的呼吸系统疾病的组合物

<130> 1066702

<160> 9

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 21

<212> 脱氧核糖核酸

<213> 人工序列

<220>

<223> CXCR1_F

<400> 1

aatctgttgt ggcttcaccc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> 脱氧核糖核酸

<213> 人工序列

<220>

<223> CXCR1_R

<400> 2

gctatcttcc gccaggcata t 21

<210> 3

<211> 24

<212> 脱氧核糖核酸

<213> 人工序列

<220>

<223> CXCR2_F

<400> 3

agcaaacacc tctactaccc tcta 24

<210> 4

<211> 23

<212> 脱氧核糖核酸

<213> 人工序列

<220>

<223> CXCR2_R

<400> 4

gggctgcatc aattcaaata cca 23

<210> 5

<211> 19

<212> 脱氧核糖核酸

<213> 人工序列

<220>

<223> 甘油醛-3-磷酸脱氢酶_F

<400> 5

tgaagcaggc atctgaggg 19

<210> 6

<211> 20

<212> 脱氧核糖核酸

<213> 人工序列

<220>

<223> 甘油醛-3-磷酸脱氢酶_R

<400> 6

cgaaggtgga agagtgggag 20

<210> 7

<211> 24

<212> 脱氧核糖核酸

<213> 人工序列

<220>

<223> 黏蛋白5AC_F

<400> 7

agaatatctt tcaggacccc tgct 24

<210> 8

<211> 23

<212> 脱氧核糖核酸

<213> 人工序列

<220>

<223> 黏蛋白5AC_R

<400> 8

acaccagtgc tgagcatact ttt 23

<210> 9

<211> 26

<212> 脱氧核糖核酸

<213> 人工序列

<220>

<223> 甘油醛-3-磷酸脱氢酶-VIC探针

<400> 9

catgttccag tatgactcca ctcacg 26

Claims

1.由藿香提取物和甘草提取物作为有效成分组成的药学组合物用于制备预防或治疗呼吸系统疾病的药物的用途，其中所述呼吸系统疾病是由吸入微细粉尘引起的，是选自由呼吸系统炎症性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、副鼻窦炎、过敏性鼻炎、下呼吸道感染、肺气肿、支气管哮喘、支气管扩张症以及肺结核后遗症组成的组中的一种以上；在藿香提取物以及甘草提取物中，藿香以及甘草以1:1至6:1的重量比混合而成；提取藿香提取物和甘草提取物的溶剂是选自由水和乙醇组成的组中的一种或多种溶剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，呼吸系统炎症性肺疾病为肺炎，下呼吸道感染为急慢性支气管炎。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，上述藿香提取物以及甘草提取物通过抑制瞬时受体电位香草酸亚型1的活性来减少咳嗽，通过抑制CXCR1或CXCR2的活性或通过减少GR-1+CD11b+细胞比例来抑制肺部炎症，通过抑制黏蛋白5AC活性来抑制痰液的生成。

4.由藿香提取物和甘草提取物作为有效成分组成的组合物用于制备止咳、抑痰的保健功能食品的用途，其中在藿香提取物以及甘草提取物中，藿香以及甘草以1:1至6:1的重量比混合而成；提取藿香提取物和甘草提取物的溶剂是选自由水和乙醇组成的组中的一种或多种溶剂。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，上述藿香提取物以及甘草提取物通过抑制瞬时受体电位香草酸亚型1的活性来减少咳嗽，通过抑制CXCR1或CXCR2的活性或通过减少GR-1+CD11b+细胞比例来抑制肺部炎症，通过抑制黏蛋白5AC的活性来抑制痰液的生成。