CN113528641A - 基因组合在诊断糖尿病肾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基因组合在诊断糖尿病肾病中的应用，本发明提供的基因组合在糖尿病肾病患者组和健康对照者组之间存在显著的差异表达，可将上述基因组合应用于糖尿病肾病的诊断中，本发明提供的基因组合具有较高的敏感性和特异性，能够将其应用于糖尿病肾病的临床诊断和预防检查中。

Description

基因组合在诊断糖尿病肾病中的应用
技术领域
本发明属于疾病诊断领域，具体而言，本发明涉及基因组合在诊断糖尿病肾病中的应用。
背景技术
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)，是由糖尿病(Diabetes mellitus，DM)引起的肾小球和肾小管微血管病变，是糖尿病最常见和最严重的慢性并发症之一。早期的研究表明，25％-40％的1型糖尿病(Type 1diabetes mellitus，T1DM)患者和5％-40％的2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus，T2DM)患者最终发展为糖尿病肾病。糖尿病病程、高血压、高血糖、性别、年龄、高血脂、肥胖及人种均与糖尿病肾病的进展相关(Jardine mJ,Hata J,Woodward m,et al.Prediction of kidney-related outcomes in patientswith type 2diabetes[J].American Journal of Kidney Diseases,2012,60(5):770-778.)，其中，高血压是糖尿病肾病患者发生心血管事件的主要因素(Gross JL,De AzevedomJ,Silveiro SP,et al.Diabetic nephropathy:diagnosis,prevention,and treatment[J].Diabetes Care,2005,28(1):164-176.)。如果在发病早期，糖尿病肾病患者没有得到早期的诊断和早期的治疗，糖尿病肾病的发生会对患者的眼球、周围血管、心脑血管以及神经均造成严重的伤害，甚至造成慢性肾功能衰竭、尿毒症。
目前，糖尿病肾病鉴别诊断的金标准为肾穿刺活检病理。肾脏病理学会研究委员会于2010年首次提出的糖尿病肾病的病理分级标准中(Tervaert TW,Mooyaart AL,AmannK,et al.Pathologic classification of diabetic nephropathy[J].JAm SocNephrol.2010,21(4):556-563.；Fioretto P,Mauer M.Diabetic nephropathy:diabeticnephropathy-challenges in pathologic classification[J].Nat Rev Nephrol.2010 6(9):508-10.)，专门对肾小管间质病变间质纤维化、肾小管萎缩和间质炎症的程度进行了评分，同时对肾血管损伤按血管透明变性和大血管硬化的程度进行了评分，以辅助糖尿病肾病病情的判断，相关研究还发现肾间质性病变是糖尿病肾病进展的独立危险因素，最新的一项研究显示蛋白尿水平和肾功能恶化的速率都不能准确反映肾脏病理结果，肾穿刺活检病理仍是鉴别诊断糖尿病肾病的最理想的指标(Einbinder Y,Goodman DJ,Haggiag I,et al.The spectrum of renal disease in kidney biopsies of diabetic patients:Asingle center experience[J].Harefuah.2016,155(3):158-162.)。
但是，肾穿刺活检为有创性的检查，患者的接受程度较低，因此，研究与糖尿病肾病相关的能用于糖尿病肾病早期诊断的特异性的、无创性的生物标志物，对揭示糖尿病肾病发生和发展的机制、实现对糖尿病肾病的早期、高效、无创、精准的鉴别诊断具有重要意义。
发明内容
鉴于此，针对当前该领域现有诊断方法存在的上述不足，本发明的目的在于提供基因水平上能够用于糖尿病肾病早期诊断的生物标志物。
本发明中所述的生物标志物包括基因B4GALT5、BASP1、FILIP1L，基因B4GALT5、BASP1、FILIP1L的信息分别如下：
B4GALT5在NCBI中的Gene ID：9334；
BASP1在NCBI中的Gene ID：10409；
FILIP1L在NCBI中的Gene ID：11259。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种糖尿病肾病诊断的生物标志物。
进一步，所述生物标志物选自B4GALT5、BASP1、FILIP1L中的一种或者几种；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、FILIP1L；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1、FILIP1L。
本发明的第二方面提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断糖尿病肾病的产品中的应用。
进一步，所述生物标志物选自B4GALT5、BASP1、FILIP1L中的一种或者几种；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、FILIP1L；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1、FILIP1L；
优选地，所述样本选自血液、组织；
优选地，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
进一步，所述试剂包括检测所述生物标志物的mRNA表达量的试剂、检测所述生物标志物的蛋白表达量的试剂；
优选地，所述试剂包括特异性识别所述生物标志物的探针、特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂；
更优选地，所述结合剂包括肽、肽模拟物、核酸适配体、镜像L-RNA适体、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段；
最优选地，所述结合剂为抗体。
进一步，所述试剂盒包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、电化学发光检测试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包括评估受试者是否患有糖尿病肾病和/或糖尿病肾病的患病风险的说明书。
进一步，所述受试者是指任何动物，包括人类和非人类动物，其中，非人类动物包括所有的脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物，所述的哺乳动物包括非人灵长类动物、小鼠、大鼠、绵羊、狗、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛，所述非哺乳动物包括鸡、两栖类、爬行动物；
优选地，所述受试者为人。
进一步，所述产品还包括处理样本的试剂。
本发明中，可以使用任何合适的方法来分析样本以确定样本中所述生物标志物的水平，这些方法包括(但不限于)：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术；
核酸测序方法的示例性非限制性实例包括(但不限于)链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序，本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此，在测序前通常将RNA逆转录成DNA；核酸测序方法的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理，测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序；
核酸杂交方法包括(但不限于)原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹，原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交，Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列；
核酸扩增方法选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA；
蛋白免疫方法包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点，例如可在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
本发明的第三方面提供了一种诊断糖尿病肾病的产品。
进一步，所述产品包括检测样本中生物标志物的试剂，所述生物标志物选自B4GALT5、BASP1、FILIP1L中的一种或者几种；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、FILIP1L；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1、FILIP1L；
优选地，所述样本选自血液、组织。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台；
优选地，所述试剂盒包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、电化学发光检测试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包括评估受试者是否患有糖尿病肾病和/或糖尿病肾病的患病风险的说明书。
进一步，所述产品还包括处理样本的试剂。
本发明的第四方面提供了一种糖尿病肾病的诊断系统。
进一步，所述诊断系统包括：
(1)检测单元：所述检测单元用于检测本发明第一方面所述生物标志物的表达量；
(2)结果判断单元：所述结果判断单元用于根据检测单元所检测得到的表达量的结果，输出是否患有糖尿病肾病和/或糖尿病肾病的患病风险的结果；
优选地，所述生物标志物的表达量包括所述生物标志物的mRNA表达量、所述生物标志物的蛋白表达量。
进一步，所述检测单元包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、电化学发光检测试剂盒、qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、免疫层析检测装置、免疫组化检测装置、流式细胞分析仪、电化学发光检测装置；
优选地，所述结果判断单元包括输入单元、分析单元和输出单元；
更优选地，所述输入单元用于输入所述生物标志物的表达量；
更优选地，所述分析单元用于根据所述生物标志物的表达量，分析出是否患有糖尿病肾病和/或糖尿病肾病的患病风险；
更优选地，所述输出单元用于输出分析单元的分析结果。
本发明的第五方面提供了一种筛选预防和/或治疗糖尿病肾病的候选药物的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)用待测试物质处理表达或含有B4GALT5、BASP1、FILIP1L的体系；
(2)检测所述体系中B4GALT5、BASP1、FILIP1L的表达；
(3)选择可降低B4GALT5、BASP1、FILIP1L表达水平的测试物质为候选药物。
本发明的第六方面提供了生物标志物B4GALT5、BASP1、FILIP1L的抑制剂在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的药物组合物中的应用。
本发明的第七方面提供了检测生物标志物的试剂在制备糖尿病肾病的诊断系统中的应用；
优选地，所述生物标志物选自B4GALT5、BASP1、FILIP1L中的一种或者几种；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、FILIP1L；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1、FILIP1L。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一组能够用于诊断糖尿病肾病的基因组合标志物B4GALT5+BASP1、B4GALT5+FILIP1L、B4GALT5+BASP1+FILIP1L，所述基因组合标志物与糖尿病肾病具有极高的关联性，敏感性高，特异性好，敏感性和特异性都可高达0.70以上，适用于糖尿病肾病的诊断，尤其是早期诊断。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示B4GALT5基因差异表达的箱线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；
图2显示BASP1基因差异表达的箱线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；
图3显示FILIP1L基因差异表达的箱线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；
图4显示基因组合B4GALT5+BASP1的ROC曲线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；
图5显示基因组合B4GALT5+FILIP1L的ROC曲线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；
图6显示基因组合BASP1+FILIP1L的ROC曲线图，其中，A图：训练集，B图：验证集；
图7显示基因组合B4GALT5+BASP1+FILIP1L的ROC曲线图，其中，A图：训练集，B图：验证集。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1筛选糖尿病肾病中差异表达的基因
1、数据来源
数据来自于GEO数据库，从GEO数据库下载糖尿病肾病数据集GSE142153，作为训练集，样本量为Control：Case＝10：23；从GEO数据库下载糖尿病肾病数据集GSE30122，作为验证集，样本量为Control：Case＝50：19。
2、数据预处理
对上述从GEO数据库下载的训练集和验证集的原始数据进行了标准化处理，对标准化后的基因表达矩阵通过Platform文件进行注释，多个探针对应同一个基因的，取平均值作为该基因的表达量。
3、差异表达分析
采用R语言软件中的“limma”包分别对上述数据集GSE142153和GSE30122中的数据进行差异表达分析，差异表达基因的筛选标准为：P.Value<0.05，|logFC|>0.5。
4、实验结果
结果显示，筛选得到的训练集中的差异表达基因共1391个，验证集中的差异表达基因共740个，两组数据集中差异表达的基因取交集得到84个共有的差异表达基因，其中，筛选出的差异表达基因B4GALT5、BASP1、FILIP1L在训练集和验证集中的差异表达情况分别见图1-3，B4GALT5、BASP1、FILIP1L在糖尿病肾病中表达情况均为上调，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2诊断效能验证
1、实验方法
对实施例1中筛选出的差异表达基因B4GALT5、BASP1、FILIP1L，采用R包“pROC”(版本1.15.0)绘制受试者工作曲线(ROC曲线)，分析其敏感性、特异性、AUC值，以判断其单独和联合时在训练集和验证集中的诊断效能；
在判断单独指标在训练集和验证集中的诊断效能时，直接使用基因的表达量进行分析，选择Youden指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值，AUC在0.5<AUC<0.8的基因被用于联合分析；
在判断指标联合在训练集和验证集中的诊断效能时，对各基因的表达水平进行Logistics回归，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患病与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出联合诊断方案的灵敏度、特异性以及准确性等。
2、实验结果
结果见表1-3和图4-7，结果显示基因组合B4GALT5+BASP1、B4GALT5+FILIP1L、B4GALT5+BASP1+FILIP1L对于糖尿病肾病的诊断效果优于单个标志物，也优于基因组合BASP1+FILIP1L，敏感性和特异性都高达0.70以上，表明了上述基因组合能够应用于糖尿病肾病的诊断中。
表1单个基因的诊断效能统计
基因 训练集AUC 验证集AUC
B4GALT5 0.778 0.728
BASP1 0.761 0.724
FILIP1L 0.761 0.697
表2基因组合在训练集中的诊断效能统计
基因 AUC 敏感性 特异性
B4GALT5+BASP1 0.822 0.913 0.700
B4GALT5+FILIP1L 0.817 0.913 0.700
BASP1+FILIP1L 0.809 0.565 0.900
B4GALT5+BASP1+FILIP1L 0.839 0.783 0.800
表3基因组合在验证集中的诊断效能统计
Figure BDA0003156646110000091
Figure BDA0003156646110000101
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种糖尿病肾病诊断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物选自B4GALT5、BASP1、FILIP1L中的一种或者几种；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、FILIP1L；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1、FILIP1L。
2.检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断糖尿病肾病的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物选自B4GALT5、BASP1、FILIP1L中的一种或者几种；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、FILIP1L；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1、FILIP1L；
优选地，所述样本选自血液、组织；
优选地，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述生物标志物的mRNA表达量的试剂、检测所述生物标志物的蛋白表达量的试剂；
优选地，所述试剂包括特异性识别所述生物标志物的探针、特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂；
更优选地，所述结合剂包括肽、肽模拟物、核酸适配体、镜像L-RNA适体、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段；
最优选地，所述结合剂为抗体。
4.一种诊断糖尿病肾病的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中生物标志物的试剂，所述生物标志物选自B4GALT5、BASP1、FILIP1L中的一种或者几种；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、FILIP1L；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1、FILIP1L；
优选地，所述样本选自血液、组织。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台；
优选地，所述试剂盒包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、电化学发光检测试剂盒。
6.一种糖尿病肾病的诊断系统，其特征在于，所述诊断系统包括：
(1)检测单元：所述检测单元用于检测权利要求1中所述生物标志物的表达量；
(2)结果判断单元：所述结果判断单元用于根据检测单元所检测得到的表达量的结果，输出是否患有糖尿病肾病和/或糖尿病肾病的患病风险的结果；
优选地，所述生物标志物的表达量包括所述生物标志物的mRNA表达量、所述生物标志物的蛋白表达量。
7.根据权利要求6所述的诊断系统，其特征在于，所述检测单元包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、电化学发光检测试剂盒、qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、免疫层析检测装置、免疫组化检测装置、流式细胞分析仪、电化学发光检测装置；
优选地，所述结果判断单元包括输入单元、分析单元和输出单元；
更优选地，所述输入单元用于输入所述生物标志物的表达量；
更优选地，所述分析单元用于根据所述生物标志物的表达量，分析出是否患有糖尿病肾病和/或糖尿病肾病的患病风险；
更优选地，所述输出单元用于输出分析单元的分析结果。
8.一种筛选预防和/或治疗糖尿病肾病的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)用待测试物质处理表达或含有B4GALT5、BASP1、FILIP1L的体系；
(2)检测所述体系中B4GALT5、BASP1、FILIP1L的表达；
(3)选择可降低B4GALT5、BASP1、FILIP1L表达水平的测试物质为候选药物。
9.生物标志物B4GALT5、BASP1、FILIP1L的抑制剂在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的药物组合物中的应用。
10.检测生物标志物的试剂在制备糖尿病肾病的诊断系统中的应用；
优选地，所述生物标志物选自B4GALT5、BASP1、FILIP1L中的一种或者几种；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、FILIP1L；
优选地，所述生物标志物为B4GALT5、BASP1、FILIP1L。
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