CN113528333A - 核酸合成反应装置及核酸合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸合成反应装置，包括：反应主管，反应主管的形状为包括正U型部和倒U型部结构的“N”型镜像结构，两端具有液体进口和液体出口，正U型部更靠近液体进口，液体出口与倒U型部顶端的高度差、液体进口与正U型部底端的高度差均大于正U型部底端与倒U型部顶端的高度差；磁铁；气体供给装置和气体输送管，气体输送管一端与气体供给装置连通，另一端连通至反应主管内。本发明还公开了一种核酸合成方法。

Description

核酸合成反应装置及核酸合成方法

技术领域

本发明涉及核酸合成技术领域，具体涉及一种核酸合成反应装置及核酸合成方法。

背景技术

人工合成DNA是已知的定向改造基因序列的重要途径，广泛应用于蛋白质改造和生命科学等多个领域，如核酸药物、酶工程、基因检测、基因治疗等。

目前市场上最常见，应用最广的就是柱式合成法，该合成方法主要基于可控孔径玻璃球(Controlled Pore Glass，CPG)载体进行化学合成，但是该CPG载体具有局限性。相对于前沿研究的合成效率更加高效的酶合成法而言，CPG载体孔径过大，会造成酶的流失，孔径过小或者柱空间较小，又会造成堵塞；并且，CPG载体在使用时通常有两种方式，第一种是上下装填过滤膜，在过滤膜中间装上CPG粉末，第二种是采用超高分子烧结技术将CPG粉末烧结在过滤膜中；无论何种方式，CPG载体在合成柱中的分散性均不佳，不利于酶与CPG载体的充分接触，导致反应试剂利用率低或反应不充分。因此，急需要提出一种新的合成载体或反应结构，突破目前柱式CPG载体的局限性。

发明内容

基于此，有必要针对传统柱式合成法反应效果不充分或反应试剂利用不充分的问题，提供一种新的核酸合成反应装置及核酸合成方法。

一种核酸合成反应装置，包括：

反应主管，所述反应主管的形状为包括正U型部和倒U型部结构的“N”型镜像结构，两端具有液体进口和液体出口，所述正U型部更靠近所述液体进口，所述液体出口与所述倒U型部顶端的高度差、所述液体进口与所述正U型部底端的高度差均大于所述正U型部底端与所述倒U型部顶端的高度差；

磁铁；

气体供给装置和气体输送管，所述气体输送管一端与所述气体供给装置连通，另一端连通至所述反应主管内。

在其中一个实施例中，还包括废液收集容器，通过废液管与所述反应主管的液体出口相连接。

在其中一个实施例中，还包括升降装置，用于控制所述磁铁与所述正U型部之间的距离。

磁性核酸合成载体在其中一个实施例中，所述气体输送管的内径与所述反应主管的内径的比值小于4:5。

在其中一个实施例中，所述气体输送管的另一端连通至所述反应主管的所述正U型部区域。

在其中一个实施例中，所述气体输送管上设有第一阀门，所述废液管上设有第二阀门。

在其中一个实施例中，还包括真空泵，所述真空泵通过真空连接管与所述废液收集容器连通。

在其中一个实施例中，所述磁铁的靠近所述正U型部的第一表面的形状与所述正U型部的外表面的形状相匹配。

在其中一个实施例中，所述升降装置为电动推杆。

在其中一个实施例中，所述气体输送管上设有调压阀。

一种核酸合成方法，采用所述的核酸合成反应装置，并包括以下步骤：

将磁性核酸合成载体和核酸合成反应液装载在所述反应主管的所述正U型部进行反应，反应过程中通过所述气体供给装置向所述正U型部通入气体，使得所述磁性核酸合成载体和所述核酸合成反应液进行充气震荡；

反应结束后，停止通入气体，使得所述磁铁贴附在所述正U型部的外表面，然后将所述反应主管中反应后的废液排放。

本发明的核酸合成反应装置，是一种全新的核酸合成装置，可用于磁珠法合成DNA或RNA，尤其在依赖于CPG磁珠的核酸人工合成具有优势。将CPG附着于磁性核酸合成载体表面，可形成一种新的CPG载体，该载体具有可分散性，能够更好的与DNA反应液(如酶、辅助试剂、清洗试剂等)充分接触，从而保证高质量的核酸合成。并且，本发明解决了常规分散载体易随试剂的冲洗造成流失的问题，通过调控磁铁与磁性核酸合成载体之间的距离，在磁铁靠近磁性核酸合成载体时将磁性核酸合成载体及其上结合的核酸合成物吸附在反应管的正U型部位置，由于虹吸原理，废液会被抽吸干净，同时磁性核酸合成载体在磁铁的吸附下，不会随废液排走，避免了磁性核酸合成载体及其上的核酸合成中间物或核酸合成产物的流失。并且，本装置设置有气体供给装置，在反应过程中，气体流出，进入反应主管中，对DNA反应液及磁性核酸合成载体进行充气震荡，使磁性核酸合成载体上层与下层进行翻滚，与DNA反应液进行充分的震荡，使得反应更充分。本发明的装置规避了多孔CPG载体的缺点，提高了反应试剂的充分利用度，使反应更充分。同时，本发明可以适用于不依赖CPG的磁珠合成核酸的方法。

附图说明

图1为本发明一实施例的核酸合成反应装置局部示意图；

图2为本发明一实施例的核酸合成反应装置另一局部示意图；

图3为本发明一实施例的核酸合成反应装置的控制流程示意图；

附图标记：

反应主管1，正U型部12，倒U型部14，磁性核酸合成载体2，磁铁3，升降装置4，第一阀门52，第二阀门54，气体输送管6，转接三通7，废液管8，真空泵9，废液收集容器10，调压阀11，气体供给装置12，主控制器13。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系，也不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

请参阅图1和图2，本发明首先提供了一种核酸合成反应装置，包括：

反应主管1，所述反应主管1的形状为包括正U型部12和倒U型部14结构的“N”型镜像结构，两端具有液体进口和液体出口，所述正U型部12更靠近所述液体进口，所述液体出口与所述倒U型部14顶端的高度差、所述液体进口与所述正U型部12底端的高度差均大于所述正U型部12底端与所述倒U型部14顶端的高度差；

磁铁3，位于或者能够位于所述正U型部底端的下部；

气体供给装置12和气体输送管6，所述气体输送管6一端与所述气体供给装置连通，另一端连通至所述反应主管1内。

相应的，本发明还提供一种核酸合成方法，采用本发明任一实施例的核酸合成反应装置，并包括以下步骤：

将磁性核酸合成载体2和核酸合成反应液装载在所述反应主管1的所述正U型部12进行反应，反应过程中通过所述气体供给装置12向所述正U型部12通入气体，使得所述磁性核酸合成载体2和所述核酸合成反应液进行充气震荡；

反应结束后，停止通入气体，使得所述磁铁3贴附在所述正U型部12的外表面，然后将所述反应主管1中反应后的废液排放。

本发明的核酸合成反应装置，是一种全新的核酸合成装置，可用于磁珠法合成DNA或RNA，尤其在依赖于CPG磁珠的核酸人工合成具有优势。将CPG附着于磁性核酸合成载体表面，可形成一种新的CPG载体，该载体具有可分散性，能够更好的与DNA反应液(如酶、辅助试剂、清洗试剂等)充分接触，从而保证高质量的核酸合成。并且，本发明解决了常规分散载体易随试剂的冲洗造成流失的问题，通过调控磁铁3与磁性核酸合成载体之间的距离，在磁铁3靠近磁性核酸合成载体时将磁性核酸合成载体及其上结合的核酸合成物吸附在反应管的正U型部12位置，同时磁性核酸合成载体在磁铁3的吸附下，不会随废液排走，避免了磁性核酸合成载体及其上的核酸合成中间物或核酸合成产物的流失。并且，本装置设置有气体供给装置12，在反应过程中，气体流出，进入反应主管1中，对DNA反应液及磁性核酸合成载体进行充气震荡，使磁性核酸合成载体上层与下层进行翻滚，与DNA反应液进行充分的震荡，使得反应更充分。本发明的装置规避了多孔CPG载体的缺点，提高了反应试剂的充分利用度，使反应更充分。同时，本发明可以适用于不依赖CPG的磁珠合成核酸的方法。

“N”型镜像结构为“N”型的镜像形状。“N”型镜像结构弯折为三段，液体流动顺序为先向下流动再向上流动然后再向下流动的过程。

该“N”型镜像结构中，所述液体出口与所述倒U型部14顶端的高度差大于所述正U型部12底端与所述倒U型部14顶端的高度差，所述液体进口与所述正U型部12底端的高度差大于所述倒U型部14顶端与所述正U型部12底端的高度差。通过该高度的高低设置，使得液体形成虹吸原理，从而能够彻底干净地将该反应主管1中的反应后的废液排除干净，有利于进行后续步骤的反应。

在一些实施方式中，本发明的正U型部12、倒U型部14可以为呈轴对称的标准U字型或者是类U型结构。类U型结构的两上侧边可以为基本平行或者有一定的交叉角。类U型结构的底部可以为弧形或者为弯折角形状。

在一些实施方式中，该反应主管1的材料可以为有机材料，优选为耐腐蚀性的有机材料。优选的，该反应主管1为透明的，便于随时随机观察磁性核酸合成载体2及DNA反应试剂在反应主管1中的位置和状态，如反应液的颜色变化、是否产生气泡、是否反应剧烈等，从而能够及时调整反应条件，达到更适宜的反应条件。在一些实施方式中，该反应主管1的材料可以为聚四氟乙烯。

在一些实施方式中，该装置还包括磁性核酸合成载体2(例如，可以为表面包被有CPG的磁珠)。所述磁性核酸合成载体2分布在所述正U型部12。DNA的合成反应在正U型部12区域进行，DNA反应液、清洗液也主要在正U型部12停留，在磁性核酸合成载体2上合成DNA。CPG在磁性核酸合成载体上的包被不限于传统的任何磁性核酸合成载体包被方法。

本发明的装置针对所有“磁性核酸合成载体”的情况，磁性核酸合成载体2是能够将核酸通过可逆的物理结合吸附的磁性固体，没有特别限制。具体的，优选表面包被有CPG的磁珠；还可以为含有二氧化硅的磁性复合物质，例如与磁性材料、超顺磁性金属氧化物等形成复合物的二氧化硅、玻璃、硅藻土或者将这些物质通过化学修饰实施表面处理的物质。通过化学修饰实施表面处理时，在不妨碍与核酸可逆性结合的范围可以带有适度的阳电荷。

在一些实施方式中，所述气体输送管6的内径与所述反应主管1的内径的比值小于4:5，在该尺寸范围内，能够更好的利用毛细管效应对磁性核酸合成载体和DNA反应液进行充分震荡，并且不至于使得震荡过分剧烈而造成反应失衡或者磁性核酸合成载体、DNA反应液从正U型部12洒出。气体输送管6的内径与反应主管1的内径的比值可以为3.5:5、3:5、1:2等。在一些具体实施例中，反应主管1的内径可以为2.3mm～2.7mm，气体输送管6的内径可以为1.4mm～1.8mm。

在一些实施方式中，所述气体输送管6的另一端连通至所述反应主管1的所述正U型部12区域，优选的，气体输送管6的另一端渗入至正U型部12区域的DNA反应液内，从而能够直接造成DNA反应液至液体的扰动，并影响磁性核酸合成载体的震荡及反应的速度。

在一些实施方式中，气体供给装置12向该反应主管1供给的气体没有特殊限制，可以为空气、氧气、惰性气体，如氩气等，也可以为氢气等。

在一些实施方式中，气体供给装置12没有特殊的限制，可以是蠕动泵、注射器、注射泵、空气泵、柱塞泵、储气罐、空压机等；在本发明一个具体实施例中，采用氩气储气罐作为气体供给装置12。

在一些实施方式中，所述气体输送管6上设有第一阀门52。第一阀门52用于控制气体是否能够进入反应主管1中。第一阀门52可以为两通电磁阀门。

在一些实施方式中，所述气体输送管6上设有调压阀11。调压阀11用于调控流过该气体输送管6而进入反应主管1中的气体的流量。气体的流量对于反应的震荡稳定性有着重要作用。气体的流量过大则可能造成过剧烈震荡，造成反应不稳定或者浪费反应试剂。气体流量过小则可能震荡不足，造成磁性核酸合成载体的堆积，影响反应的充分进行。气体流量的选择与磁性核酸合成载体的重量有关，磁性核酸合成载体越重，引起合适震荡需要的气体流量越大，磁性核酸合成载体越轻则引起合适震荡所需的气体流量越小。在一些具体实施例中，磁性核酸合成载体粒径为0.5μm～100μm，例如可以是0.5μm、5μm、10μm、20μm、50μm、70μm、100μm。

在一些实施方式中，所需的气体流量为1mL/min～20mL/min，例如可以是1mL/min、3mL/min、8mL/min、10mL/min、15mL/min、20mL/min。

在一些实施方式中，该核酸合成反应装置包括废液收集容器10，通过废液管8与所述反应主管1的液体出口相连接。废液管的设置可以使废液在虹吸原理的作用下，被抽吸干净，同时磁性核酸合成载体2在磁铁3的吸附下，不会随废液排走，解决了分散载体易随试剂的冲洗造成流失的问题。

在一些实施方式中，所述废液管8上设有第二阀门54。第二阀门54用于控制反应主管1中的反应废液是否能够进入废液收集容器10中。第二阀门54可以为两通电磁阀门。

在一些实施方式中，该核酸合成反应装置包括真空泵9，所述真空泵9通过真空连接管与所述废液收集容器10连通。在进行反应主管1废液排放时，将真空泵9开启，对废液收集容器10抽真空，可以使得废液收集容器10压力下降，从而能够很快将反应主管1中的废液排放至废液收集容器10中。

在一些实施方式中，所述磁铁3的靠近所述正U型部12的第一表面的形状与所述正U型部12的外表面(底面)的形状相匹配。例如，磁铁3第一表面的形状也为正U型。优选的，磁铁3第一表面完全贴合在所述正U型部12的外表面，从而能够对正U型部12内的磁性核酸合成载体造成较大的吸引力，避免磁性核酸合成载体的流失。

在一些实施方式中，所述磁铁3可以为电磁铁，通过电源控制磁性。在一些实施方式中，所述磁铁3可以为永磁铁。

在一些实施方式中，还包括升降装置4，用于控制所述磁铁3与所述正U型部12之间的距离。

在一些实施方式中，所述升降装置4为电动推杆。该电动推杆可以与反应主管1连接，用于使得反应主管1靠近或远离磁铁3。或者电动推杆可以与磁铁3连接，用于使得磁铁3靠近或远离正U型部12的底部。

在一些实施方式中，该核酸合成反应装置包括转接三通7阀，所述转接三通7阀的三个端口分别与反应主管1的液体出口、气体输送管6的进口、废液管8的进口连接。

请参阅图3，在一些实施方式中，该核酸合成反应装置包括主控制器13，该主控制器13可分别与第一阀门52、第二阀门54、升降装置4及真空泵9电连接，用于对该核酸合成反应装置进行自动化控制。

本发明的核酸合成方法适用于任何人工核酸合成方法，包括但不限于亚磷酰胺三酯法、酶合成法等原理进行合成。相应的合成步骤及核酸合成反应液对应相应的合成原理，这里不再赘述。

以下为一具体实施例。

本实施例为一种磁性核酸合成载体法合成DNA的核酸合成反应装置，包括：反应主管1；位于反应主管1下部的磁铁3；升降装置4；废液收集容器10和废液管8；气体供给装置12(选自惰性气体)和气体输送管6；转接三通7阀；真空泵9；主控制器13。废液收集容器10通过废液管8与所述反应主管1的液体出口相连接。所述气体输送管6一端与所述气体供给装置连通，另一端连通至所述反应主管1的正U型部12区域。所述反应主管1的形状为“N”型镜像结构，两端具有液体进口和液体出口，所述液体进口和所述液体出口之间具有正U型部12和倒U型部14，所述正U型部12更靠近所述液体进口，所述液体出口与所述倒U型部14顶端的高度差大于所述正U型部12底端与所述倒U型部14顶端的高度差，所述液体进口与所述正U型部12底端的高度差大于所述倒U型部14顶端与所述正U型部12底端的高度差。磁铁3的靠近正U型部12的第一表面的形状与所述正U型部12的外表面(底面)的形状相匹配。该核酸合成反应装置包括转接三通7阀，所述转接三通7阀的三个端口分别与反应主管1的液体出口、气体输送管6的进口、废液管8的进口连接。真空泵9通过真空连接管与所述废液收集容器10连通。气体输送管6上设有用于开启或关闭该管路的第一阀门52(两通电磁阀)和调压阀11，废液管8上设有用于开启或关闭该管路的第二阀门54(两通电磁阀)。该核酸合成反应装置包括主控制器13，该主控制器13可分别与第一阀门52、第二阀门54、升降装置4及真空泵9电连接，用于对该核酸合成反应装置进行自动化控制。

反应主管1为透明聚四氟乙烯软管。气体输送管6为聚四氟乙烯毛细管。透明聚四氟乙烯软管入口(液体进口)高度高于第二段弯弧(倒U型部14)高度，液体出口竖直向下。正U型部12中设有包被有CPG的磁性核酸合成载体2。升降装置4为电动推杆，磁铁3呈U型，并安装在电动推杆上，电动推杆可带动磁铁3上下升降，所述磁铁3放置在透明聚四氟乙烯软管第一段弯弧(正U型部12)正下方，包被有CPG的磁性核酸合成载体2放置在透明聚四氟乙烯软管第一段弯弧处，当磁铁3上升至接触到透明聚四氟乙烯软管第一段弯弧下表面时，吸附CPG磁性核酸合成载体沉至第一段弯弧底部，当磁铁3下降至远离透明聚四氟乙烯软管第一段弯弧下表面时，CPG磁性核酸合成载体失去吸附力。

该核酸合成反应装置的使用过程是：将核酸合成反应液注入透明聚四氟乙烯软管入口后会暂存在透明聚四氟乙烯软管第一段弯弧处，与包被有CPG的磁性核酸合成载体2接触，主控制器13控制负责充惰性气体的两通电磁阀开启，惰性气体便从惰性气源中流出，经过调压阀11降压降速后，进入透明聚四氟乙烯软管中，对核酸合成反应液及包被有CPG的磁性核酸合成载体2进行充气震荡，使包被有CPG的磁性核酸合成载体2上层与下层进行翻滚，与核酸合成反应液进行充分的震荡后，主控制器13控制负责充惰性气体的两通电磁阀关闭，停止充气，同时主控制器13控制电动推杆上升，吸附包被有CPG的磁性核酸合成载体2，控制抽废液的两通电磁阀开启，将废液抽至废液收集容器10中，由于虹吸原理，废液会被抽吸干净，同时包被有CPG的磁性核酸合成载体2及其上的核酸合成产物在磁铁3的吸附下，不会随废液排走，然后注入第二种核酸合成反应液或者清洗液，重复上述步骤。

该核酸合成反应装置特点是将用于核酸合成的场所-反应主管1聚四氟乙烯软管弯折三段形成倒“N”型结构，作为反应容器，其具备虹吸原理结构，便于废液排放彻底，同时还增加了充气管路，对试剂进行震荡效果，使CPG载体更好的与试剂充分接触，从而提高效率，与现有的柱式合成柱相比，其可以利用磁性核酸合成载体进行核酸合成，突破了现有合成原理的束缚，同时避免了现有柱式反应结构易堵塞的问题，利用了虹吸原理保证废液排放干净，不至于废液残留，影响下一步骤的试剂反应，同时其增加的充气震荡管路，比柱式合成柱更能够让CPG与试剂充分混合，从而提高合成效率。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种核酸合成反应装置，其特征在于，包括：

反应主管，所述反应主管的形状为包括正U型部和倒U型部结构的“N”型镜像结构，两端具有液体进口和液体出口，所述正U型部更靠近所述液体进口，所述液体出口与所述倒U型部顶端的高度差、所述液体进口与所述正U型部底端的高度差均大于所述正U型部底端与所述倒U型部顶端的高度差；

磁铁；

气体供给装置和气体输送管，所述气体输送管一端与所述气体供给装置连通，另一端连通至所述反应主管内。

2.根据权利要求1所述的核酸合成反应装置，其特征在于，所述气体输送管的内径与所述反应主管的内径的比值小于4:5；优选地，所述气体输送管的另一端连通至所述反应主管的所述正U型部区域。

3.根据权利要求1所述的核酸合成反应装置，其特征在于，还包括废液收集容器，通过废液管与所述反应主管的液体出口相连接。

4.根据权利要求3所述的核酸合成反应装置，其特征在于，还包括真空泵，所述真空泵通过真空连接管与所述废液收集容器连通。

5.根据权利要求3所述的核酸合成反应装置，其特征在于，所述气体输送管上设有第一阀门，所述废液管上设有第二阀门。

6.根据权利1～5中任一项所述的核酸合成反应装置，其特征在于，所述磁铁的靠近所述正U型部的第一表面的形状与所述正U型部的外表面的形状相匹配。

7.根据权利要求1～5中任一项所述的核酸合成反应装置，其特征在于，还包括升降装置，用于控制所述磁铁与所述正U型部之间的距离。

8.根据权利要求要求7所述的核酸合成反应装置，其特征在于，所述升降装置为电动推杆。

9.根据权利要求1～5中任一项所述的核酸合成反应装置，其特征在于，所述气体输送管上设有调压阀。

10.一种核酸合成方法，其特征在于，采用如权利要求1～9中任一项所述的核酸合成反应装置，并包括以下步骤：

将磁性核酸合成载体和核酸合成反应液装载在所述反应主管的所述正U型部进行反应，反应过程中通过所述气体供给装置向所述正U型部通入气体，使得所述磁性核酸合成载体和所述核酸合成反应液进行充气震荡；

反应结束后，停止通入气体，使得所述磁铁贴附在所述正U型部的外表面，然后将所述反应主管中反应后的废液排放。

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