CN113504376B - 一种能够检测新冠病毒并同时鉴别变异体的试剂盒及鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够检测新冠病毒并同时鉴别变异体的试剂盒及鉴别方法，包括采集管、酶解管、缓冲液瓶和用于检测新冠病毒并同时鉴别变异体的标准多肽，所述标准多肽的序列包括以下四条多肽：DIADTTDAVR，DIDDTTDAVR，FDNPVLPFNDGVYFASTEK，FANPVLPFNDGVYFASTEK。本发明不但能够检测受试者是否感染新冠病毒，同时能够鉴定感染的是否是变异新冠病毒，更方便对症治疗和进行防护措施。
Description
技术领域
本发明涉及新冠病毒检测技术领域，特别涉及一种能够检测新冠病毒并同时鉴别变异体的试剂盒及鉴别方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是近百年来人类遭遇的影响范围最广的全球性大流行病，对全世界是一次严重危机和严峻考验。人类生命安全和健康面临重大威胁。
新型冠状病毒肺炎主要由新型冠状病毒(2019-nCoV)引起，它属于β属的冠状病毒，具有囊膜的单股正链RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径60-140nm。具有5个必需基因，分别编码翻译核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)4种结构蛋白以及RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)。核蛋白(N)包裹RNA基因组构成稳定的核衣壳，核衣壳外面围绕着一层病毒包膜(E)起着保护作用，在病毒包膜里有基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)等蛋白。
其中刺突蛋白(S)即能够结合细胞表面血管紧张素转化酶2而进入正常细胞中。截止2020年12月31日，世界卫生组织通报了四种新变异体，其中传播最广泛，危害最大的是在英国首次发现的B.1.1.7和在南非首次发现的501Y.V2。
目前检测方法主要是基于基因检测的方法。由于新型冠状病毒是RNA病毒，试剂盒检测基本都采用反转录加实时聚合酶链式反应法(RT-PCR)，扩增病原体的核酸(RNA)，同时通过荧光探针实时检测扩增产物。该方法能够检测到处于窗口期的患者，及早发现感染者，是新型冠状病毒检测的“金标准”。然而，RNA的结构不稳定，非常容易降解，导致检测结果的假阴性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够检测新冠病毒并同时鉴别变异体的试剂盒及鉴别方法，本发明的试剂盒不但能够检测受试者是否感染新冠病毒，同时能够鉴定感染的是否是变异新冠病毒，更方便对症治疗和进行防护措施。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种能够检测新冠病毒并同时鉴别变异体的试剂盒，包括采集管、酶解管、缓冲液瓶和用于检测新冠病毒并同时鉴别变异体的标准多肽，所述标准多肽的序列包括以下四条多肽：DIADTTDAVR，DIDDTTDAVR，FDNPVLPFNDGVYFASTEK，FANPVLPFNDGVYFASTEK。
作为优选，所述采集管内装保存液，保存液组成及规格为：100mmol/l的二硫苏糖醇溶液和100mmol/l的碳酸氢铵；200μL/管。
作为优选，所述酶解管内装冻干粉，制备方法为：配制碘代乙酰胺300mmol/l与碱性胰蛋白酶1mg/ml的混合液，取100μL混合液分装在EP管中，冷冻干燥。
作为优选，所述缓冲液瓶的组成及规格为：100mmol/l的碳酸氢铵，10ml/瓶。
一种非医学用途的鉴别新冠病毒变异体的方法，包括以下步骤：
(1)试样保存：将试样投入含有200μL保存液的采集管中保存；
(2)液相色谱串联质谱检测：将采集管在50℃水浴锅中孵育30分钟后离心，取上清液100μl加入复溶后的酶解管中，在37℃水浴锅中孵育30分钟后，用5μl甲酸终止反应，上机检测，以标准多肽作为阳性对照与试样采用相同的上机检测参数检测，所述标准多肽包括以下四条多肽：DIADTTDAVR，DIDDTTDAVR，FDNPVLPFNDGVYFASTEK，FANPVLPFNDGVYFASTEK；
(3)结果分析：
若DIADTTDAVR阴性，DIDDTTDAVR阳性，FDNPVLPFNDGVYFASTEK阳性，FANPVLPFNDGVYFASTEK阴性，则鉴定为未变异新冠病毒；
若DIADTTDAVR阳性，DIDDTTDAVR阴性，FDNPVLPFNDGVYFASTEK阳性，FANPVLPFNDGVYFASTEK阴性，则鉴定为B.1.1.7变异新冠病毒；
若DIADTTDAVR阳性，DIDDTTDAVR阴性，FDNPVLPFNDGVYFASTEK阴性，FANPVLPFNDGVYFASTEK阳性，则鉴定为501Y.V2变异新冠病毒。
作为优选，液相色谱条件：
色谱柱：Waters BEH 300C18，规格100mm×2.1mm，粒径1.7μm；
柱温：40℃；样品温度：室温；
流动相：流动相A：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
色谱分离梯度条件：在5分钟内将流动相B含量从3％提升至32％；
流速：0.3mL/min；
进样体积：5μL。
作为优选，质谱条件：
ESI+离子源，毛细管电压：3.0kv，锥孔电压：15V，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：150L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5eV；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V；监测模式采用多反应检测模式MRM。
作为优选，保存液组成为：100mmol/l的二硫苏糖醇溶液和100mmol/l的碳酸氢铵。
作为优选，复溶后的酶解管为将100μl缓冲液加入到酶解管中，使酶解管中的冻干粉复溶；冻干粉制备方法为：配制碘代乙酰胺300mmol/l与碱性胰蛋白酶1mg/ml的混合液，取100μL混合液分装在EP管中，冷冻干燥。
作为优选，所述缓冲液为100mmol/l的碳酸氢铵。
本发明采用碱性胰蛋白酶对样本进行酶解后，选择新冠病毒S蛋白特异酶解序列作为标准多肽，特异性高，准确度高，稳定性强，采用液相色谱串联三重四极杆质谱进行检测，检测准确。
本发明的有益效果是：
本发明与RT-PCR相比，大大提高了样本稳定性，样本在采集后不需要在特殊条件下保存，可稳定长期存放，不影响检测结果。
此外，本发明采用多种标准特异肽，能够用于鉴别新冠病毒及其两种主要的变异体(英国首次发现的B.1.1.7和在南非首次发现的501Y.V2)，更方便对症治疗和进行防护措施。
附图说明
图1是DIADTTDAVR验证结果；
图2是DIDDTTDAVR验证结果；
图3是FDNPVLPFNDGVYFASTEK验证结果；
图4是FANPVLPFNDGVYFASTEK验证结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
一种能够检测新冠病毒并同时鉴别变异体的试剂盒，包括：
1、采集管：所述采集管内装保存液，保存液组成及规格为：100mmol/l的二硫苏糖醇溶液和
100mmol/l的碳酸氢铵；200μL/管。
2、酶解管：所述酶解管内装冻干粉，制备方法为：配制碘代乙酰胺300mmol/l与碱性胰蛋白酶1mg/ml的混合液，取100μL混合液分装在EP管中，冷冻干燥。
3、缓冲液瓶：组成及规格为：100mmol/l的碳酸氢铵，10ml/瓶。
4、用于检测新冠病毒并同时鉴别变异体的标准多肽，包括以下四条多肽：DIADTTDAVR(SEQ ID No.1)，DIDDTTDAVR(SEQ ID No.2)，FDNPVLPFNDGVYFASTEK(SEQ IDNo.3)，FANPVLPFNDGVYFASTEK(SEQ ID No.4)。
实施例2：
一种非医学用途的鉴别新冠病毒变异体的方法，包括以下步骤：
(1)试样保存：将试样投入含有200μL保存液(见实施例1)的采集管中保存。
(2)液相色谱串联质谱检测：将采集管在50℃水浴锅中孵育30分钟后离心，取上清液100μl加入复溶后的酶解管中，在37℃水浴锅中孵育30分钟后，用5μl甲酸终止反应，上机检测，以标准多肽作为阳性对照与试样采用相同的上机检测参数检测，所述标准多肽的包括以下四条多肽：DIADTTDAVR，DIDDTTDAVR，FDNPVLPFNDGVYFASTEK，FANPVLPFNDGVYFASTEK。复溶后的酶解管为将100μl缓冲液(100mmol/l的碳酸氢铵)加入到酶解管中，使酶解管中的冻干粉复溶。酶解管参见实施例1。
液相色谱条件：
色谱柱：Waters BEH 300C18，规格100mm×2.1mm，粒径1.7μm；
柱温：40℃；样品温度：室温；
流动相：流动相A：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
色谱分离梯度条件：在5分钟内将流动相B含量从3％提升至32％；
流速：0.3mL/min；
进样体积：5μL。
质谱条件：
ESI+离子源，毛细管电压：3.0kv，锥孔电压：15V，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：150L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5eV；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V；监测模式采用多反应检测模式MRM。
MRM反应参数
(3)结果分析：
若DIADTTDAVR阴性，DIDDTTDAVR阳性，FDNPVLPFNDGVYFASTEK阳性，FANPVLPFNDGVYFASTEK阴性，则鉴定为未变异新冠病毒(2019-nCoV)；
若DIADTTDAVR阳性，DIDDTTDAVR阴性，FDNPVLPFNDGVYFASTEK阳性，FANPVLPFNDGVYFASTEK阴性，则鉴定为英国B.1.1.7变异新冠病毒；
若DIADTTDAVR阳性，DIDDTTDAVR阴性，FDNPVLPFNDGVYFASTEK阴性，FANPVLPFNDGVYFASTEK阳性，则鉴定为南非501Y.V2变异新冠病毒。
复溶后的酶解管为将100μl加入到酶解管中，使酶解管中的冻干粉复溶；冻干粉制备方法为：配制碘代乙酰胺300mmol/l与碱性胰蛋白酶1mg/ml的混合液，取100μL混合液分装在EP管中，冷冻干燥。
实施例3：
采样方法
采用常用的方法采集咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液。其中咽拭子、鼻拭子直接投入采集管，痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液取50μL加入到采集管中混合均匀。
采集管中含有200μl保存液。样本采集后可常温保存，稳定性至少1周。若需要长期保存，则在80℃水浴锅中孵育30分钟，在不开盖的前提下，可在常温环境中至少稳定6个月。
检测方法
将采集管转运到实验室后，在50℃水浴锅中孵育30分钟后离心，取上清液100μl于复溶后的酶解管中，在37℃水浴锅中孵育30分钟后，用5μl甲酸终止反应，上机检测，液相色谱和质谱条件同实施例2。DIADTTDAVR，DIDDTTDAVR，FDNPVLPFNDGVYFASTEK，FANPVLPFNDGVYFASTEK作为阳性对照。
一、多肽筛选
本发明在Uniprot数据库的新冠S蛋白序列(编号P0DTC2)为模板，用计算机模拟酶解结果。共获得83个分子量大于500Da的理论酶解多肽。考虑到含半胱氨酸的多肽稳定性较低、序列短于7个氨基酸的多肽特异性较低，而长于20个氨基酸的多肽灵敏度较低，因此删除上述多肽，剩余35个理论多肽。
对照B.1.1.7和501Y.V2两种变异体的变异位点，最终筛选确定了两组多肽，每组多肽含有两条多肽，用于鉴定原型和各个变异体。
| 原型 | B.1.1.7 | 501Y.V2 | |
| DIADTTDAVR | + | - | + |
| DIDDTTDAVR | - | + | - |
| FDNPVLPFNDGVYFASTEK | + | + | - |
| FANPVLPFNDGVYFASTEK | - | - | + |
+代表应检出、-代表应不检出。
二、标准多肽特异性
为了验证上述多肽的特异性，本发明采用Uniprot数据库采用BLAST功能对上述四条多肽进行验证，结果如图1-图4。
由图可知，仅有少数序列在其他物种中以100％的相似度(Identity)的方式检出。但是这些物种与新冠病毒的同时检出的可能性极小，因此，不会对新冠检测产生影响。
三、准确性
本发明从采集阴性咽拭子样本置于采集管中，其中50管作为阴性样本进行检测，另50管中加入灭活新冠病毒(2019-nCoV)模拟阳性样本进行检测。上述样本采用本发明方法进行检测，对比检测结果如表1。对比结果显示，阳性一致率为98％，阴性一致率为100％，总一致率为99％。
表1：质谱法与RT-PCR方法结果对比
此外，本发明对新冠病毒原型、B.1.1.7和501Y.V2三种标准菌株进行检测，检测结果见表2。检测结果显示，本发明的符合率高，适宜用于新冠及其变异体的实际检测。
表2：标准病毒株检测结果
| DIADTTDAVR | DIDDTTDAVR | FDNPVLPFNDGVYFASTEK | FANPVLPFNDGVYFASTEK | |
| 原型 | √ | √ | ||
| B.1.1.7 | √ | √ | ||
| 501Y.V2 | √ | √ |
√：表示测得。
四、稳定性
本发明从一例阳性患者取2份咽拭子样本，其中一份按照RT-PCR的方法进行保存，另一份按照本方法配套试剂盒所述的方法进行储存。分别在第0天、第3天、第7天和第14天进行检测，检测结果如表3。
| 储存方式 | 0天 | 3天 | 7天 | 14天 |
| RT-PCR配套样本保存液 | + | - | - | - |
| 本发明配套样本 | + | + | + | + |
+：表示测得；-：表示无法测得。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江树人学院（浙江树人大学）
<120> 一种能够检测新冠病毒并同时鉴别变异体的试剂盒及鉴别方法
<130> 2021.7
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Asp Ile Asp Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser
1 5 10 15
Thr Glu Lys
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Phe Ala Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser
1 5 10 15
Thr Glu Lys
Claims (4)
1.一种非诊断用途的鉴别新冠病毒变异体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）试样保存：将试样投入含有200 μL保存液的采集管中保存；
（2）液相色谱串联质谱检测：将采集管在50℃水浴锅中孵育30分钟后离心，取上清液100 μl加入复溶后的酶解管中，在37℃水浴锅中孵育30分钟后，用5 μl甲酸终止反应，上机检测，以标准多肽作为阳性对照与试样采用相同的上机检测参数检测，所述标准多肽的包括以下四条多肽：DIADTTDAVR， DIDDTTDAVR，FDNPVLPFNDGVYFASTEK，FANPVLPFNDGVYFASTEK；
（3）结果分析：
若DIADTTDAVR阴性， DIDDTTDAVR阳性，FDNPVLPFNDGVYFASTEK阳性，FANPVLPFNDGVYFASTEK阴性，则鉴定为未变异新冠病毒；
若DIADTTDAVR阳性， DIDDTTDAVR阴性，FDNPVLPFNDGVYFASTEK阳性，FANPVLPFNDGVYFASTEK阴性，则鉴定为B.1.1.7变异新冠病毒；
若DIADTTDAVR阳性， DIDDTTDAVR阴性，FDNPVLPFNDGVYFASTEK阴性，FANPVLPFNDGVYFASTEK阳性，则鉴定为501Y.V2变异新冠病毒；
液相色谱条件：
色谱柱：Waters BEH 300C18，规格100mm×2 .1mm，粒径1 .7μm；
柱温：40℃；样品温度：室温；
流动相：流动相A：含0 .1％甲酸的水溶液；流动相B：含0 .1％甲酸的乙腈溶液；
色谱分离梯度条件：在5分钟内将流动相B含量从3％提升至32％；
流速：0 .3mL/min；
进样体积：5μL；
质谱条件：
ESI+离子源，毛细管电压：3 .0kv，锥孔电压：15V，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：150L/hr，碰撞室压力：3 .0×10-3mbar；低端分辨率1：2 .5V，高端分辨率1：15 .0V，离子能量1：0 .5eV；低端分辨率2：2 .8V，高端分辨率2：15 .0V，离子能量2：1 .0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：3 .0V；监测模式采用多反应检测模式MRM。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，保存液组成为：100 mmol/l的二硫苏糖醇溶液和100 mmol/l的碳酸氢铵。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，复溶后的酶解管为将100 μl缓冲液加入到酶解管中，使酶解管中的冻干粉复溶；冻干粉制备方法为：配制碘代乙酰胺300 mmol/l与碱性胰蛋白酶1 mg/ml的混合液，取100 μL混合液分装在EP管中，冷冻干燥。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，缓冲液为100 mmol/l的碳酸氢铵。
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|---|---|---|---|---|
| CN111323511A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-06-23 | 浙江大学医学院附属第四医院(浙江省义乌医院、浙江大学医学院附属第四医院医共体) | 一种用于灭活新冠病毒的快速检测试剂盒及方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| In silico approach toward the identification of unique peptides from viral protein infection: Application to COVID-19;Benjamin C. Orsburn等，;bioRxiv;第1-23页 * |
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