CN113504189B - Lpmo裂解纤维素酶活的测定方法和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法和检测试剂盒，其中，该LPMO裂解纤维素酶活的测定方法包括以下步骤：将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；加入抗坏血酸氧化酶终止反应；离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4‑AAP和DHBS；测量溶液的吸光值，检测波长为515nm，通过吸光值得到单位时间内释放的还原糖的浓度，进而得到LPMO的酶活。本发明测定方法的检测过程简单、成本低和准确性高。

Description

LPMO裂解纤维素酶活的测定方法和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法和检测试剂盒。

背景技术

裂解多糖单加氧酶(Lytic Polysaccharide Monooxygenase，LPMO)是由细菌、真菌乃至昆虫等产生的一大类酶，它们可对糖苷键进化氧化裂解。其中，辅助活性家族9(AA9家族)LPMO可直接对结晶纤维素进行氧化裂解，破坏其结晶结构，使之更容易被纤维素酶水解。LPMO以铜离子为辅基，在外源电子供体及氧气的参与下可将结晶纤维素中的β-1,4-糖苷键氧化裂解。

LPMO在真菌中普遍存在，种类繁多。建立高通量的活性分析方法，从中筛选出性能优良的品种，将有利于促进LPMO在二代生物炼制技术中的应用。但是，现有的测定方法，例如高效阴离子色谱技术、液相色谱质谱联用技术、糖凝胶电泳测定方法、采用标记底物测定方法、比色定量方法等，测定的过程繁琐，成本高昂，且准确性不高。

上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，旨在解决现有技术测定LPMO裂解纤维素酶活的过程繁琐、成本高和准确性不高的技术问题。

为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，包括以下步骤：

S1、将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；

S2、加入抗坏血酸氧化酶终止反应；

S3、离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4-AAP和DHBS；

S4、测量溶液的吸光值，检测波长为515nm，通过吸光值得到单位时间内释放的还原糖的浓度，进而得到LPMO的测量酶活力。

可选地，所述LPMO包含C1型LPMO，所述C1型LPMO的实际酶活力为测量计算得到的酶活乘以校正系数4.75。

可选地，所述抗坏血酸的浓度大于或等于0.9mmol/L，且小于或等于1.2mmol/L。

可选地，所述抗坏血酸氧化酶的酶活大于或等于1U，且小于或等于5U。

可选地，所述SsGOOX的浓度大于或等于90nmol/L，且小于或等于110nmol/L。

可选地，所述HRP的酶活力大于或等于5U，且小于或等于10U。

可选地，所述4-AAP的浓度大于或等于0.08mmol/L，且小于或等于0.4mmol/L。

可选地，所述DHBS的浓度大于或等于1.5mmol/L，且小于或等于4mmol/L。

第二方面，本发明还提出一种LPMO裂解纤维素酶活的检测试剂盒，包括：

抗坏血酸，浓度为0.9～1.2mmol/L；

抗坏血酸氧化酶，酶活为1U～5U；

SsGOOX，浓度为90～110nmol/L；

HRP，酶活为5U～10U；

4-AAP，浓度为0.08～0.4mmol/L；

DHBS，浓度为1.5～4mmol/L；以及

pH缓冲液，pH值为7.0～7.2。

本发明LPMO裂解纤维素酶活的测定方法包括：将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；加入抗坏血酸氧化酶终止反应；离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4-AAP和DHBS；如此，所述抗坏血酸为所述LPMO裂解纤维素提供电子，所述LPMO将纤维素氧化裂解成还原糖；所述抗坏血酸氧化酶消除反应液中的所述抗坏血酸，终止所述LPMO裂解纤维素的反应，消除所述抗坏血酸对基于Trinder测定的干扰；所述SsGOOX对可溶性的所述还原糖进行裂解，产生过氧化氢；在所述HRP的存在下，所述过氧化氢与色源物质所述4-AAP和所述DHBS发生所述Trinder反应，将所述4-AAP和所述DHBS转化为红色的醌亚胺染料；通过酶标仪检测所述红色醌亚胺染料的吸光度值，根据获得的吸光度值，使用标准的纤维二糖溶液，计算单位时间内所述LPMO释放的可溶性还原糖的浓度，从而得到所述LPMO裂解纤维素的酶活。这样，本发明LPMO裂解纤维素酶活的测定方法针对所述LPMO的糖苷氧化裂解活性而开发，检测时间短，不需要使用昂贵的检测仪器，且更加准确地表征了所述LPMO裂解纤维素的酶活。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳结果图；

图2为实施例2中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹结果图；

图3为实施例3中温度和pH值对SsGOOX酶活影响的结果图；

图4为实施例3中动力学参数公式；

图5为实施例3中SsGOOX的热稳定性结果；

图6为实施例4中4-AAP和DHBS的浓度对还原糖检测能力的影响；

图7为实施例5中还原糖浓度和检测时间的测定结果图；

图8为实施例6中抗坏血酸氧化酶消除残留抗坏血酸对显色物质形成影响的结果图；

图9为实施例7中LPMO裂解纤维素酶活的测定结果图；

图10为实施例8中酶活力及比活力的测定结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。

本发明提出一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，包括以下步骤：将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；加入抗坏血酸氧化酶终止反应；离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4-AAP和DHBS；S4、测量溶液的吸光值，检测波长为515nm，通过吸光值得到单位时间内释放的还原糖的浓度，进而得到LPMO的测量酶活力。

在本发明中，所述抗坏血酸是LPMO裂解纤维素的电子供体，所述LPMO以铜离子为辅基，在外源电子供体及氧气的参与下可将结晶纤维素中的β-1,4-糖苷键氧化裂解，破坏其结晶结构，使得所述结晶纤维素更容易被纤维素酶水解。所述抗坏血酸氧化酶是一种含铜的酶，可将所述抗坏血酸氧化脱氢，消除所述抗坏血酸的存在。

所述寡糖氧化酶(oligosaccharide oxidase，SsGOOX)是一种新型氧化酶，属于辅助活性家族7(auxiliary activity family 7，AA7)。所述SsGOOX可作用的底物范围较广，能够催化多种寡糖氧化成相应的醛酸，并在反应过程中产生过氧化氢。所述辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)是临床检验中的常用酶，所述HRP由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成，是生化检测中显色体系的关键成分。所述4-氨基安替比林(4-Aminoantipyrine，4-AAP)，是一种有机物，所述4-AAP在碱性条件及氧化剂的存在下，可以与酚类化合物反应生成红色染料。所述3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠(3,5-Dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid sodium salt，DHBS)常用于尿素和胆固醇的比色测定，是过氧化氢酶光度法测定用的显色底物。所述SsGOOX可以裂解所述还原糖生成所述过氧化氢，所述过氧化氢在HRP的存在下，与色源物质所述4-AAP和所述DHBS发生所述Trinder反应，将所述4-AAP和所述DHBS转化为红色的醌亚胺染料。

本发明LPMO裂解纤维素酶活的测定方法包括：将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；加入抗坏血酸氧化酶终止反应；离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4-AAP和DHBS；如此，所述抗坏血酸为所述LPMO裂解纤维素提供电子，所述LPMO将纤维素氧化裂解成还原糖；所述抗坏血酸氧化酶消除反应液中的所述抗坏血酸，终止所述LPMO裂解纤维素的反应，消除所述抗坏血酸对基于Trinder测定的干扰；所述SsGOOX对可溶性的所述还原糖进行裂解，产生过氧化氢；在所述HRP的存在下，所述过氧化氢与色源物质所述4-AAP和所述DHBS发生所述Trinder反应，将所述4-AAP和所述DHBS转化为红色的醌亚胺染料；通过酶标仪检测所述红色醌亚胺染料的吸光度值，根据获得的吸光度值，使用标准的纤维二糖溶液，计算单位时间内所述LPMO释放的可溶性还原糖的浓度，从而得到所述LPMO裂解纤维素的酶活。这样，本发明LPMO裂解纤维素酶活的测定方法针对所述LPMO的糖苷氧化裂解活性而开发，检测时间短，不需要使用昂贵的检测仪器，且更加准确地表征了所述LPMO裂解纤维素的酶活。

可选地，所述LPMO包含C1型LPMO，所述C1型LPMO的实际酶活力为测量计算得到的酶活乘以校正系数4.75。由于Ⅰ型LPMO(C1位点氧化，C1型LPMO)和Ⅱ型LPMO(C4位点氧化，C4型LPMO)的催化机制存在差异。在相同的氧化裂解效果下，两者测定的还原糖的含量占所有可溶性寡糖及寡糖酸中还原糖含量的比例具有差异。根据阴离子色谱总峰面积估算，在相同的氧化裂解效果下，所述C1型LPMO裂解纤维素测定的还原糖的含量仅占所有可溶性寡糖及寡糖酸中还原糖含量的21.07％。但是，所述C4型LPMO裂解纤维素产生的还原糖基本上都是可测量到的。因此，在比较所述C1型LPMO和所述C4型LPMO的氧化裂解活性时，需要将所述C1型LPMO测量得出的酶活进行校正，将测量得到的酶活换算成实际的酶活。所述C1型LPMO的实际酶活为酶活测定值乘以校正系数4.75，所述校正系数4.75由1/0.2107计算得来。

可选地，所述抗坏血酸的浓度大于或等于0.9mmol/L，且小于或等于1.2mmol/L。当所述抗坏血酸的浓度小于0.9mmol/L时，所述抗坏血酸无法提供足够的电子，所述LPMO裂解纤维素的效果不佳。当抗坏血酸的浓度大于1.2mmol/L时，过多的所述抗坏血酸会对后续的显色反应产生影响。

可选地，所述抗坏血酸氧化酶的酶活大于或等于1U，且小于或等于5U。当所述抗坏血酸氧化酶的酶活小于1U时，所述抗坏血酸氧化酶不足以消除全部的所述抗坏血酸，剩余的所述抗坏血酸会对后续的显色反应产生影响。当所述抗坏血酸氧化酶的酶活大于5U时，造成所述抗坏血酸氧化酶的浪费。

可选地，所述SsGOOX的浓度大于或等于90nmol/L，且小于或等于110nmol/L。当所述SsGOOX的浓度小于90nmol/L时，所述SsGOOX对可溶性还原糖的裂解效率低下，显色反应达到稳定所需的时间较长。当SsGOOX的浓度大于110nmol/L时，所述SsGOOX的成本相应提高。

可选地，所述4-AAP的浓度大于或等于0.08mmol/L，且小于或等于0.4mmol/L。可选地，所述DHBS的浓度大于或等于1.5mmol/L，且小于或等于4mmol/L。可选地，所述HRP的酶活力大于或等于5U，且小于或等于10U。当所述4-AAP的浓度位于上述范围内，所述DHBS的浓度位于上述范围内，所述HRP的酶活力位于上述范围内时，HRP不会成为显色反应的限制因素，测定的结果比较准确。

本发明还提出一种LPMO裂解纤维素酶活的检测试剂盒，包括抗坏血酸，浓度为0.9～1.2mmol/L；抗坏血酸氧化酶，酶活为1U～5U；SsGOOX，浓度为90～110nmol/L；HRP，酶活为5U～10U；4-AAP，浓度为0.08～0.4mmol/L；DHBS，浓度为1.5～4mmol/L；以及pH缓冲液，pH缓冲液，pH值为7.0～7.2。

在本发明试剂盒中，所述抗坏血酸为LPMO裂解纤维素的电子供体。所述抗坏血酸氧化酶可以消除反应液中的所述抗坏血酸，从而终止所述LPMO裂解纤维素的反应，并同时消除所述抗坏血酸对基于Trinder测定的干扰。所述SsGOOX将还原糖裂解生成过氧化氢，所述过氧化氢在HRP的存在下，与色源物质所述4-AAP和所述DHBS发生所述Trinder反应，将所述4-AAP和所述DHBS转化为红色的醌亚胺染料。所述pH缓冲液将所述SsGOOX的反应pH值调节至接近中性，这样所述SsGOOX酶解还原糖的效率比较高。所述pH缓冲液可以为100mmol/L的磷酸盐缓冲液。本发明试剂盒针对所述LPMO的糖苷氧化裂解活性而开发，检测时间短，不需要使用昂贵的检测仪器，且更加准确地表征了所述LPMO裂解纤维素的酶活。

接下来通过实施例对本发明方法的具体实施方式进行详细说明，主要包括以下几个方面：

(1)LPMO裂解纤维素：LPMO最适浓度、底物最适浓度、抗坏血酸最适浓度及最适反应条件的测定；

(2)抗坏血酸氧化酶消除抗坏血酸：抗坏血酸氧化酶的最适酶活及最适反应条件的测定；

(3)SsGOOX裂解还原糖：SsGOOX最适浓度、底物最适浓度及酶促反应的动力学参数、最适反应温度、最适反应时间、最适反应pH值、温度稳定性的测定；

(4)Trinder反应：4-AAP最适浓度、DHBS最适浓度、HRP最适酶活及最适检测时间的测定。

可以理解地，所述LPMO裂解纤维素酶活测定的结果通过所述Trinder显色反应的测定结果来计算，所述Trinder显色反应的测定结果若不准确，会影响所述LPMO裂解纤维素酶活测定结果的计算，所以本发明实施例先对所述Trinder显色反应的测定过程进行说明。

实施例1、SsGOOX表达载体的构建

(1)SsGOOX基因片段的获得

在固体PDA平板上接种里氏木霉QM9414菌种，28℃条件下培养一周。用无菌水将平板上的孢子洗下，并接种到50mL液体基本培养基中，接种量为2％。在28℃转速为220r/min恒温摇床进行液体培养48h，减压抽滤获得里氏木霉QM9414菌丝。在预冷的碾钵中加入少量液氮，用干净的药匙将抽滤后的所述菌丝转移到液氮中急速冷冻，并快速碾磨，反复几次直到所述菌丝全部呈现干粉状。将碾磨好的菌粉转移到1.5mL离心管中，按照真菌基因组提取试剂盒的操作说明，进行里氏木霉基因组的提取。以里氏木霉QM9414基因组为模板，扩增组成型基因pdc的启动子区段和pdc终止子区段，扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No：1、SEQID No：2、SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示。参考里氏木霉密码子使用频率表，对来自于紧密帚枝霉的SsGOOX基因序列进行密码子优化，并在C末端添加6×His标签序列，合成相应优化后的DNA序列。以合成的质粒为模板扩增SsGOOX基因片段，扩增引物的核苷酸序列如SEQID No：3和SEQ ID No：4所示。

(2)表达载体的构建

以pUC19质粒为模板，分别在EcoRⅢ和HindⅢ酶切位点进行反向PCR扩增，获得线性化的所述pUC19载体片段。将上述获得的基因片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，按照切胶回收试剂盒的说明书，对跑出的条带产物进行切胶回收。使用NanoDrop2000进行核酸浓度的定量，然后取等摩尔量的所述pdc启动子、所述pdc终止子和所述SsGOOX基因片段进行重叠延伸PCR扩增。然后将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收基因片段融合的产物。扩增所述pdc启动子区段的上游引物，于所述pUC19质粒的所述EcoRⅢ酶切位点上游存在大于20bp的同源区段；并且，扩增所述pdc终止子区段的下游引物，于所述pUC19质粒的所述HindⅢ酶切位点下游存在大于20bp的同源区段。按照ClonExpress Ultra One StepCloning Kit的使用说明构建重组质粒，并按照使用说明中提供的转化步骤，用热激的方式将所述重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中。

(3)重组载体的鉴定

将转化所述重组质粒的大肠杆菌菌株在含有Amp抗性、IPTG和X-gal的LB固体平板上进行涂布，37℃培养12～14h。挑取大小适中的白色单菌落转接到含有Amp抗性的液体LB培养基中进行培养。分别取上述液体培养的大肠杆菌菌液1mL作为PCR反应模板，用验证引物进行菌液PCR验证所选择大肠杆菌转化菌株是否为重组菌株。所述验证引物的核苷酸序列如SEQ ID No：7～10所示。将验证后的所述重组菌株在LB液体培养基中进行培养，取200μl菌液进行测序验证所述重组质粒有无突变。选择目的基因无突变的重组质粒菌株在LB液体培养基中进行扩大培养，准备质粒提取。使用EZ-500柱式质粒大量抽提试剂盒，按照使用说明进行所述重组质粒的提取。保存在所述大肠杆菌DH5α菌株中的pAN7-1质粒也按照相同的方式进行质粒提取。

请参阅图1，图1为构建SsGOOX异源表达载体的琼脂糖凝胶电泳结果图。A图中，M为DL2000 DNA Marker的条带；N1为pdc基因启动子的条带；N2为SsGOOX基因的条带；N3为pdc基因终止子的条带。B图中，M为DL5000 DNA Marker的条带；N1为融合PCR重组pdc基因启动子、SsGOOX基因及pdc基因终止子的条带；N2为线性化pUC19的条带。图1的结果说明，已经成功得到所述pdc基因启动子、所述SsGOOX基因以及所述pdc基因终止子的重组基因片段，及所述线性化的pUC19基因片段。

上述过程中使用的引物序列请参阅表1。其中，小写英文字母的序列为同源区段序列。

表1表达载体构建使用的引物

实施例2、SsGOOX表达载体转化里氏木霉

(1)SsGOOX在里氏木霉中的转化

将提取的所述重组质粒与所述pAN7-1质粒按照摩尔量2：1的比例混合，采用PEG介导的原生质体转化方法转化到所述里氏木霉QM9414菌株中。

具体步骤如下：

步骤1：取所述里氏木霉QM9414孢子接种到PDA固体平板于28℃恒温培养一周，然后用无菌水洗涤菌落表面获得孢子悬浮液，并将其接种到液体基本培养基中进行液体培养12h，离心获得所述里氏木霉刚萌发的菌丝体。

步骤2：用1mol/L的硫酸镁溶液洗涤菌丝两次，然后用相同浓度的硫酸镁配制制备原生质体的酶解液(100mg溶壁酶溶于10mL的MgSO₄溶液中，然后0.22μm过滤除菌)，将洗涤后的所述菌丝与酶解液混合，于28℃恒温条件下轻微摇动酶解2-3h。

步骤3：在酶解后的混合液中加入等体积的STC溶液维持原生质体稳定，用4层擦镜纸过滤除去酶解不充分不彻底的残余菌丝，并将上清液进行离心10min(5000r/min)，收集酶解后获得的原生质体，并用STC洗涤原生质体2次。

步骤4：在获得的所述原生质体沉淀中加入200μl混合好的质粒溶液，包括终浓度为1×STC以及20g质粒，轻弹管壁混匀后并在冰上静置20～30min，使得质粒与原生质体接触充分。

步骤5：将上述离心管置于42℃水浴中进行热激2min，然后立即加入50μl60％的PEG溶液，轻轻吹打混匀后室温静置30min，然后加入2mL 60％的PEG溶液吹打混匀并静置5min。

步骤6：在上述体系中加入10mL的STC溶液混匀并离心，去除PEG溶液收集沉淀，并用STC溶液洗涤一次。

步骤7：将原生质体沉淀与10mL的所述原生质体再生培养基混合，然后再28℃恒温轻轻混匀培养12h。

步骤8：通过离心去除培养基成分的方式进行浓缩菌液，并将其涂布在潮霉素抗性的PDA平板上28℃培养48h。

步骤9：观察是否有里氏木霉菌落生长，若有则进行下一步转化子验证，反之重复上述步骤1～8。

将在抗性PDA平板上生长的转化子菌丝转接到新的抗性平板上，生长一周后收集孢子进行液体培养2天，取2mL菌液接种到40mL发酵培养基中继续培养一周，取培养后的菌液上清，测定其中是否含有所述SsGOOX。取50μl培养液上清，加入到150μl检测体系中，检测体系包括：20μl 1mmol/L的4-AAP、20μl 20mmol/L的DHBS、10U的HRP、20μl 1mmol/L的纤维二糖、80μl 100mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)。若反应30min后出现紫红色则证明菌株中成功转化SsGOOX表达盒。

(2)SsGOOX在里氏木霉中的表达和纯化

将上述成功转化所述SsGOOX表达盒的转化子菌株，接种到含有潮霉素抗性的PDA固体培养基上，28℃培养一周，使用无菌水洗涤孢子并接种到Mandels液体基本培养基中，进行种子培养2天。培养条件：28℃，220r/min。然后以5％的接种量接种到发酵产酶培养基中，按照种子培养相同的培养条件培养6天，发酵产酶培养基成分为：在Mandels液体基本培养基的基础上增加葡萄糖至70g/L，蛋白胨至20g/L，另外添加5g/L酵母提取物。

发酵结束后，抽滤去除菌丝等不溶物。将获得的发酵液经过0.45μm过滤，并装入14kDa规格透析袋中，加入PEG20000干粉，4℃浓缩5～6h，并转入亲和层析上样缓冲液中透析12h，期间更换两次缓冲液，将透析完成的样品溶液经过0.22μm过滤。将处理后的样品试用HisTrap HP预装柱进行亲和层析，获得均质蛋白，并通过Western blot验证。

请参阅图2，A图为经考马斯亮蓝染色的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，B图为重组蛋白表达的蛋白免疫印迹验证。图中，泳道M为蛋白分子量标准，S1和W1为亲本菌株QM9414液体发酵样品，S2和W2为重组菌株液体发酵样品，S3和W3为纯化后的重组蛋白。图2的结果表明，已经成功表达和纯化SsGOOX蛋白。

实施例3、SsGOOX反应条件及酶学参数的测定

(1)SsGOOX酶解最适温度的测定

以纤维二糖作为反应底物，测定所述SsGOOX不同温度下的酶解反应曲线。取20μl纯化至均质的酶液，与180μl检测体系混合，其中检测体系包含20μl 1mmol/L的4-AAP、20μl20mmol/L的DHBS、10U的HRP、100mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)和20μl 1mmol/L的纤维二糖溶液。混合后，将混合体系在515nm吸光值下进行持续检测，直到反应完全吸光值不再增加。为了避免SsGOOX耦联HRP的反应过程中，所述HRP的酶学参数对测定的干扰，可以先混合所述SsGOOX、所述纤维二糖及所述缓冲液，PCR仪中精确控制反应温度反应2min后，立即置于液氮中冷冻，检测前从液氮中取出，并立即混合其他成分，接着在酶标仪中515nm波长下进行检测。

(2)SsGOOX酶解最适pH的测定

以1mmol/L的所述纤维二糖作为反应底物，在pH＝2～12的BR缓冲液(Britton-Robinson buffer)中测定最适pH。将20μl 2mmol/L的所述纤维二糖和20μl 2mol/L的所述SsGOOX混合，在PCR仪上50℃条件下精确反应2min，然后以液氮急速冷冻，然后将20μl反应后体系加入到检测体系中，室温检测。检测体系包括100mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)，以平衡不同浓度BR缓冲液造成的pH值的变化。

请参阅图3，A图为温度对SsGOOX酶活的影响曲线，从图中可以看到，在10～70℃的标准检测条件下，所述SsGOOX在10～50℃时显示出明显的递增趋势，在50℃时发挥最大酶活。B图为pH值对SsGOOX酶活的影响曲线，如图B所示，所述SsGOOX的最佳pH值为9；在pH值为8时，所述SsGOOX仍保持97％的活性；但在pH值为10时，所述SsGOOX酶活开始下降，仅有71％的活性。

(3)SsGOOX的酶学参数测定

根据反应速度对底物浓度的依赖性，确定所述SsGOOX和所述纤维二糖之间酶促反应的动力学参数。采用10nmol/L的SsGOOX和0.02～5mmol/L的纤维二糖进行反应。初始反应速率在pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中，28℃条件下，每30s测量反应产物的吸光值，持续测定2min。

请参阅公式1，公式1为采用修正的Hill方程对SsGOOX催化纤维二糖氧化实验数据的拟合结果图。

公式1

所述SsGOOX的活性在较高的所述纤维二糖浓度下表现出降低趋势，这与底物抑制作用相符。因此使用改良的Hill模型比传统的非竞争性底物抑制模型能更好地描述了实验数据。使用

中的曲线拟合工具进行回归分析，以改进的Hill方程拟合数据，以非线性最小二乘法确定动力学参数(请参阅图4)。拟合方程详细参数及其95％置信区间请参阅表2。

表2拟合方程详细参数及其95％置信区间(CI)。

	<![CDATA[V<sub>max</sub>]]>	<![CDATA[V<sub>i</sub>]]>	<![CDATA[K<sub>i</sub>]]>	<![CDATA[K<sub>s</sub>]]>	<![CDATA[<sup>n</sup>H]]>
						Coefficients	1.416	0.8175	1.262	0.01653	1.024
95％CI	(1.262,1.569)	(0.7393,0.8956)	(0.6801,1.844)	(0.01194,0.02112)	(0.6783,1.369)

(4)SsGOOX的温度稳定性测定

将1mol/L SsGOOX与100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)混合，于50℃、55℃和60℃温度下，分别孵育0、2min、4min、6min、8min、10min、15min、20min和60min，确定酶的热稳定性，并在室温下使用1mmol/L的纤维二糖作为底物测量残留酶活性。

请参阅图5的SsGOOX热稳定性结果。A图为SsGOOX在不同温度下孵育1h后的残留酶活。B图为SsGOOX在60℃下孵育不同时间后的残留酶活。图中的结果表明，所述SsGOOX在50℃和55℃孵育1h后，酶的催化活性基本未变，但在60℃下仅孵育20min，酶的活性降低了约90％。以上结果说明所述SsGOOX的热稳定性在50℃～55℃。

实施例4、Trinder反应中4-AAP和DHBS浓度的测定

在检测高浓度还原糖时，低浓度的色源物质(0.1mmol/L的4-AAP和1mmol/L的DHBS)会出现“平台”现象，即显色产物与还原糖浓度不呈现线性关系，导致检测结果异常，推测原因是所述还原糖被氧化所产生的所述过氧化氢超过了所述色源物质的检测限度。

因此，为确定所述4-AAP和所述DHBS浓度对耦联过氧化物酶显色方法的影响，按照所述Trinde反应的机理，首先确定所述4-AAP浓度：即在10mmol/L的DHBS条件下，确定检测0.1mmol/L纤维二糖作为底物时，所述4-AAP的最适浓度。配置不同浓度的所述4-AAP溶液，然后在160μl体系中混合除了所述4-AAP和所述纤维二糖以外的其他成分，在检测之前分别加入20μl不同浓度的所述4-AAP，然后再加入20μl 1mmol/L的所述纤维二糖，使用SynergyMX酶标仪在室温下连续检测515nm波长下吸光值30min。确定所述AAP的最适浓度后，按照相似流程测定所述DHBS所需要的浓度，只是将所述4-AAP的浓度调整为优化后浓度。

请参阅图6，图6为4-AAP和DHBS的浓度对还原糖检测能力的影响。图A的结果显示，在以0.1mmol/L纤维二糖为底物时，0.1mmol/L的4-AAP可以作为有效的检测浓度，但0.05mmol/L的4-AAP则表现出测定结果失准的情况，同时高浓度的4-AAP并未对检测体系表现出抑制现象。

在0.1mmol/L 4-AAP浓度条件下确定所述DHBS的最适浓度范围。图B中，1mmol/LDHBS能有效的支撑Trinder反应中4-AAP的检测能力，且高浓度的DHBS并未表现出底物抑制状态。为了更有效的提高所述Trinder反应的检测效果，去除所述LPMO、所述抗坏血酸氧化酶等蛋白对检测体系的影响，本发明检测方法选择2mmol/L的所述DHBS作为Trinder反应的底物浓度。

实施例5、还原糖浓度和有效检测时间的测定

确定了Trinder反应的底物浓度后，仍需明确在该检测体系下可检测到的还原糖浓度以及可以有效检测的时间范围。通过分光光度法追踪不同浓度的所述纤维二糖和检测体系中显色产物的生成量。以0.01～0.35mmol/L纤维二糖为底物，分别用酶标仪在515nm处连续跟踪检测70min。首先假定反应化学计量中1mmol/L纤维二糖经过氧化后释放的过氧化氢需要与等分子数的4-AAP发生Trinder反应，即将20μl纤维二糖标准溶液与180μl显色液混合，所述显色液包含0.1mmol/L 4-AAP、2mmol/L DHBS，100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，100nmol/L SsGOOX和10U HRP，每隔30秒在酶标仪中检测并记录515nm波长吸光值。

对实验所获得的结果进行分析，图7中，A图显示了纤维二糖浓度低于0.08mmol/L时的线性回归分析结果，使用浓度为0.01-0.35mmol/L的纤维二糖作为底物，当纤维二糖的浓度小于0.08mmol/L时，其浓度增加与吸光度呈线性关系。

B图为在515nm处连续70min监测不同浓度的纤维二糖所产生的吸光值。在0.1mmol/L 4-AAP和2mmol/L DHBS检测体系中可以有效检测小于0.1mmol/L的纤维二糖浓度。但是，随着所述纤维二糖浓度的增加，线性关系开始出现偏移，可能是高浓度的所述纤维二糖被氧化后释放过量的所述过氧化氢，而检测体系中作为色源物质的所述4-AAP的含量不足导致。同时，通过长时间的持续检测，发现高浓度的纤维二糖在持续检测的后期，会导致显色产物的吸光值开始降低，而小于0.1mmol/L的纤维二糖浓度并未表现出此现象，因此高浓度的纤维二糖在检测前可以进行适当稀释。为了确定检测的有效时间和显色产物的稳定性，以小于0.32mmol/L纤维二糖作为底物，在100nmol/L SsGOOX的作用下进行持续检测，结果显示在25-35min内均反应完成且显色稳定(如B图所示)。同时，低浓度的纤维二糖可以避免SsGOOX产生超过4-AAP负荷的过氧化氢量，从而能够在较长时间内维持显色产物的稳定性。

实施例6、抗坏血酸氧化酶的浓度确定

考虑到所述LPMO发挥作用过程中需要外源电子供体，而所述抗坏血酸为最常用的电子供体，所述抗坏血酸的存在会显著影响所述HRP耦联的色源物质的形成，而所述抗坏血酸氧化酶可以高效氧化所述抗坏血酸为脱氢抗坏血酸和水，消除所述抗坏血酸。

本实施例以最终浓度为1mmol/L的抗坏血酸和1mmol/L纤维二糖的混合液作为待检测样品，分别与0、1U、2U、4U、6U、8U、10U单位的抗坏血酸氧化酶涡旋混合1min和2min。然后取20μl，立即加入到180μl检测体系中，然后在酶标仪中持续检测。设置没有所述抗坏血酸但有所述抗坏血酸氧化酶的对照反应，以验证所述色源物质的形成没有受到其他因素的干扰。如图8所示，结果表明，仅添加1U抗坏血酸氧化酶，并与抗坏血酸涡旋混合1min，即可完全消除所述抗坏血酸对检测结果的影响。

为了使得所述抗坏血酸氧化酶的作用更为彻底，可以选择加入4U的所述抗坏血酸氧化酶，室温震荡混匀5min以确保去除残余的所述抗坏血酸。考虑到所述抗坏血酸氧化酶的作用，残余痕量的所述抗坏血酸可能导致极轻微影响，或者氧化后的所述脱氢抗坏血酸对检测体系产生轻微影响，所述标准纤维二糖溶液中也可以加入等量的所述抗坏血酸和所述抗坏血酸氧化酶，并设置不加入所述抗坏血酸的对照组，从而有效判断所述抗坏血酸是否全部被氧化，并排除氧化后的所述抗坏血酸对检测体系的影响。

实施例7、LPMO裂解纤维素酶活的测定

为了测定所述LPMO裂解纤维素的活性大小，以磷酸溶胀纤维素(PASC)作为底物，1mmol/L的所述抗坏血酸作为电子供体，用所述标准纤维二糖溶液衡量不同浓度所述LPMO裂解纤维素所释放的可溶性纤维寡糖量，并以不加入所述抗坏血酸的反应组作为空白对照。

将总体积为200μl的裂解反应体系装在1.5mL的离心管中，包含100μl30mg/mL的PASC，10μl 20mmol/L的抗坏血酸，100mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)和不同浓度的LPMO，50℃、1200r/min振荡孵育30min。实验对照：相同反应条件、LPMO最高浓度且不加电子供体。考虑到C1位点氧化活性的TtLPMO-2142696仅在靠近纤维素还原端进行氧化才能释放出可溶性纤维寡糖，因此可适当提高所述PASC的浓度至90mg/mL。

反应完成后，立即将离心管置于冰上，并通过添加4U所述抗坏血酸氧化酶涡旋5min来终止反应。然后将反应混合物在4℃以12,000g离心5min，并将上清液转移至新的PCR管中，并再次以最大速度离心2min。将20μl上清液添加到180μl显色分析试剂中，该试剂包含0.1mmol/L 4-AAP、2mmol/L DHBS、100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)、100nmol/LSsGOOX和10U HRP。纤维二糖标准溶液(同样加入抗坏血酸和抗坏血酸氧化酶)作为标准对照添加到其他孔中。在酶标仪中连续检测反应30min，或直到显色反应完成为止。所有实验均设置三个独立的重复实验，以确保可重复性。

请参阅图9，图9为LPMO裂解纤维素酶活的测定结果图。A图为不同浓度的纤维二糖标准品的结果图。B图为将不同浓度的TtLPMO-2142696在50℃温度下反应30min的结果图。C：不同浓度的TtLPMO-170174在50℃温度下反应30min的结果图。D图为TtLPMO-2142696在1mmol/L抗坏血酸作为电子供体的条件下，释放的还原糖随时间的变化图。E图为TtLPMO-170174在1mmol/L抗坏血酸作为电子供体的条件下，释放的还原糖随时间的变化图。B图中，C1型的TtLPMO-2142696所释放的可检测的还原糖的量与酶浓度呈线性相关(R2＝0.9959)。C图中，C4型的TtLPMO-170174可检测的还原糖的量与酶浓度呈现良好的线性关系(R2＝0.9934)。

D图中，在1mmol/L抗坏血酸作为电子供体条件下，线性范围内最高浓度(3.6μmol/L)的TtLPMO-2142696，在60min范围内释放的可检测的还原糖量一直呈现线性趋势。E图中，线性范围内最高浓度(6.3μmol/L)的TtLPMO-170174，反应时间大于30min后不再保持线性趋势，这可能是由于底物或电子供体的耗尽引起的。以上结果说明，我们本发明测定方法可以准确测定所述LPMO裂解纤维素的酶活。

实施例8、酶活力及比活力的测定

为了进一步验证方法的可行性，本实施例选定原始菌株里氏木霉QM9414的发酵液上清、TtLPMO-2142696重组菌的发酵液上清和纯化后的TtLPMO-2142696蛋白进行测定。定义LPMO活力单位：在上述实验方法的反应条件下，每1min释放1nmol还原糖(以纤维二糖计)所需要的酶量为1个活力单位。以不添加所述抗坏血酸作为对照，测定上述样品的酶活力和比活力。

请参阅图10，图10为测定原始菌株里氏木霉QM9414的发酵液上清、TtLPMO-2142696重组菌的发酵液上清和纯化后的TtLPMO-2142696蛋白的酶活力及比活力结果。图10的结果显示，原始菌株里氏木霉QM9414的发酵液上清也具有轻微的酶活力，可能为里氏木霉自身所分泌的微量LPMO产生。纯化前TtLPMO-2142696重组菌的发酵液中比活力为16.03U/mg，纯化后的TtLPMO-2142696蛋白比活力为72.05U/mg，纯化倍数为4.49倍。

实施例9、LPMO裂解纤维素酶活的测定

综合实施例1～8，所述LPMO裂解纤维素酶活的测定包括以下步骤：

步骤1：制备磷酸溶胀的纤维素，将一定量的所述LPMO、所述PASC和1mmol/L所述抗坏血酸，在50℃下孵育30min。如果要测定的所述LPMO具有C1位点氧化特异性(C1型LPMO)，可以增加所述PASC的浓度。

步骤2：孵育完成后，立即将孵育的反应体系置于冰水中，并加入2～5U所述抗坏血酸氧化酶，涡旋混合2min以终止反应。如果由于延长反应时间或者增加了所述LPMO的使用量等因素提高了抗坏血酸的浓度，可以按比例增加所述抗坏血酸氧化酶，并适当延长混合时间。

步骤3：离心除去不溶物，然后将上清液转移至新离心管中。如果难以完全除去不溶性纤维素底物，可以将所述上清液转移到新的离心管中，然后再次离心，以除去在移液过程中引入的微量不溶性纤维。

步骤4：配制显色反应体系，并将其添加到96孔板中。总反应体积为200μL，包括20μL的LPMO反应上清液、终浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)、0.1mmol/L的4-AAP、2mmol/L的DHBS、100nmol/L的SsGOOX。4-AAP和DHBS溶液建议现配现用。若所述LPMO活性较低，可以使用更大体积的样品量，但必须相应调整其他成分的浓度，维持不变的含量比。此外，如果提高了所述抗坏血酸使用量以及延长了所述LPMO裂解反应时间，如前文所述，可以适当增加所述4-AAP和所述DHBS的使用量，这并不会影响检测结果；或者对待检测样品进行适当稀释。

步骤5：在酶标仪上连续测量515nm波长吸光值变化，直到稳定为止(通常小于30min)。使用所述标准纤维二糖溶液，计算单位时间内所述LPMO释放的所述可溶性还原糖的浓度。如需要提高检测速度可以通过增加所述SsGOOX的使用量，从而缩短反应时间。可以以不添加所述抗坏血酸作为供电子体的对照组，所述纤维二糖标准溶液中建议也加入所述抗坏血酸和所述抗坏血酸氧化酶，从而消除痕量所述抗坏血酸或者氧化后的所述脱氢抗坏血酸对吸光值的影响，实现高精确度的测定。

前文提到，所述C1型LPMO测定的还原糖的含量仅占所有可溶性寡糖及寡糖酸中还原糖含量的21.07％。因此所述C1型LPMO的实际酶活为测定值乘以校正系数4.75，从而实现对不同类型所述LPMO裂解纤维素酶活的评估。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> LPMO裂解纤维素酶活的测定方法和检测试剂盒

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aaaacgacgg ccagtgaatt caggacttcc agggctactt gg 42

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgcggtacat gattgtgctg tagctgcgct g 31

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cagcacaatc atgtaccgca agctggctgt 30

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agacttcatg ccgggttagt ggtggtggtg atggtgg 37

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

actaacccgg catgaagtct gacc 24

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gaccatgatt acgccaagct ttggacgcct cgatgtcttc c 41

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

aacaacgtcg cgactatcca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tccggccttc ttcatgatcg 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aggaggactc ggaaggttgg gaca 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ggtcagggtg gtatcggcgt agtt 24

Claims (2)

1.一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；

S2、加入抗坏血酸氧化酶终止反应；

S3、离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4-AAP和DHBS；所述SsGOOX的基因来源于紧密帚枝霉；

S4、测量溶液的吸光值，检测波长为515nm，通过吸光值得到单位时间内释放的还原糖的浓度，进而得到LPMO的酶活；

所述LPMO包含C1型LPMO，所述C1型LPMO的实际酶活力为测量计算得到的酶活乘以校正系数4.75；

所述抗坏血酸的浓度大于或等于0.9mmol/L，且小于或等于1.2mmol/L；

所述抗坏血酸氧化酶的酶活大于或等于1U，且小于或等于5U；

所述SsGOOX的浓度大于或等于90nmol/L，且小于或等于110nmol/L；

所述HRP的酶活力大于或等于5U，且小于或等于10U；

所述4-AAP的浓度大于或等于0.08mmol/L，且小于或等于0.4mmol/L；

所述DHBS的浓度大于或等于1.5mmol/L，且小于或等于4mmol/L ；

步骤S3还包括加入pH值为7.0～7.2的pH缓冲液。

2.一种LPMO裂解纤维素酶活的检测试剂盒，其特征在于，包括：

抗坏血酸，浓度为0.9～1.2mmol/L；

抗坏血酸氧化酶，酶活为1U～5U；

SsGOOX，浓度为90～110nmol/L；

HRP，酶活为5U～10U；

4-AAP，浓度为0.08～0.4mmol/L；

DHBS，浓度为1.5～4mmol/L；以及

pH缓冲液，pH值为7.0～7.2；

所述SsGOOX的基因来源于紧密帚枝霉。

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