CN113502303A - 一种利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺 - Google Patents

一种利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，所述工艺包括以下步骤：A、配制菌种增殖培养基，通过好氧或厌氧方式培养乳酸生产菌，当菌体浓度不再增加，浓缩收集菌液，并加入菌种活性保护剂；B、将浓缩后菌液与碳源、菌种活性增强剂相混合，通过流加中和剂和碳源进行发酵培养，生产乳酸。本发明将乳酸发酵的菌种增殖和产酸阶段分开，通过专门的菌种增殖培养基，快速获得大量乳酸生产菌，然后浓缩获得高浓度的乳酸生产菌，以高浓度的乳酸生产菌进行发酵生产，具有提高产酸速率，缩短发酵周期，节约能耗的优点。

Description

一种利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺
技术领域
本发明涉及一种生产乳酸的工艺，尤其涉及一种利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺。
背景技术
乳酸不仅是生物体内的一种重要有机酸，在人们的日常生活与生产活动中极具应用价值，而且是合成聚乳酸的的主要原料。业界内公认聚乳酸为新型生物基材料，具有无毒、无刺激性和良好的生物相容性等特点，在服装、建筑、农业、林业、造纸和医疗卫生等多个领域中都具有广泛的应用。随着近年来随着环境友好型聚乳酸生物新材料开发利用，乳酸需求量不断增加。
乳酸可以通过化学合成或碳水化合物发酵得到，而基于发酵法能专一性地得到L或D乳酸，因此发酵法被广泛用于乳酸的生产。现有的发酵法生产乳酸一般是以乳酸杆菌、芽孢杆菌或大肠杆菌等乳酸生产菌在厌氧或微好氧的条件下进行发酵及代谢产酸。中国公开专利CN1332035A根据发酵过程中菌体生长和代谢产酸过程的不同，在发酵培养的中后期补加碳源以为菌体代谢提供能量促进L-乳酸的生成。但由于菌体培养培养基中含水量通常在80％以上，为了兼顾产酸速率和发酵罐容积以及乳酸产物浓度，人们总是尽可能使用高浓度碳源(通常60％以上)和中和剂，而对于淀粉制糖发酵生产乳酸工艺，作为碳源的淀粉糖液的浓度通常不超过40％，为获得高浓度碳源还需要对淀粉糖液进行浓缩，现有工艺通常使用降膜蒸发或MVR对稀糖液进行浓缩，每吨浓糖能耗为0.27t蒸汽或16.39度电，导致乳酸设备投资和生产能耗的增加。
现有的乳酸发酵生产方法生产成本是制约乳酸应用的关键因素之一。因此，寻找能够降低乳酸生产成本的技术成为研究的热点。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提出一种利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺。本发明将乳酸发酵的菌种增殖和产酸阶段分开，通过专门的菌种增殖培养基，快速获得大量乳酸生产菌，然后浓缩获得高浓度的乳酸生产菌，以高浓度的乳酸生产菌进行发酵生产。由于菌体经浓缩，一方面产酸速率显著提高，另一方面使用较低浓度的碳源即可满足生产需求，对于淀粉制糖发酵生产乳酸，可省去糖液浓缩的步骤，降低发酵能耗。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，包括以下步骤：
A、配制菌种增殖培养基，通过好氧或厌氧方式培养乳酸生产菌，当菌体增殖培养完成后浓缩收集菌液，并加入菌种活性保护剂；
步骤A中菌种增殖培养基中接种量5-20％，对于好氧型的乳酸生产菌，培养条件为：温度30-50℃、罐压0.02-0.1Mpa、通气量0.2-5vvm、转速200-1000rpm，控制溶氧50％以上，必要时可通纯氧。对于厌氧型的乳酸生产菌，培养条件为：初始温度30-50℃，罐压0.02-0.05Mpa，转速200-1000rpm。
通过流加补料液使培养液中碳源的浓度维持在5g/L，流加碱性中和剂控制pH为6.5-7.5，培养5-20h后，优选OD600不再增加时停止培养。
B、将浓缩后菌液与碳源、菌种活性增强剂相混合，通过流加中和剂和碳源进行发酵培养，生产乳酸。
步骤B中发酵培养条件为温度30-50℃、转速100-500rpm下进行发酵。
在一项优选的实施方式中，所述菌种增殖培养基的配方为：10-30g/L碳源，2-10g/L酵母提取物，5-20g/L胰蛋白胨，0.2-1g/L K2HPO4·3H2O，0.2-1.1g/L KH2PO4，2-10g/L(NH4)2SO4，0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O，5-10mL/L微量元素储液，以上述配方配制1L培养基时添加余量的水使培养基总量为1L，调pH为6-8；
其中，所述微量元素储液的配方包括：2-6g/L FeSO4·7H2O，0.2-0.8g/L ZnSO4·7H2O，0.5-1.5g/L MnSO4·4H2O，0.05-0.1g/L CuSO4·5H2O，0.05-0.15g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.05-0.1g/L H3BO3，0.05-0.2g/L CoCl2·6H2O，以上述配方配制1L储液时添加余量的水使微量元素储液总量为1L。
本发明通过调整菌种增殖培养基配方，可显著提高菌液OD值，得到浓度更高的培养液，在进行下一步菌液浓缩时有利于降低浓缩成本。
在一项优选的实施方式中，步骤A中菌液浓缩收集可用的方法有：通过陶瓷膜、离心、硅藻土过滤的方式对菌液进行浓缩，优选使菌液浓缩2-20倍。
进一步地，所述陶瓷膜浓缩方式为：使用20-100纳米孔径陶瓷膜，通过离心泵或发酵罐罐压将发酵液送入陶瓷膜系统，收集浓缩后菌液。所述离心浓缩方式为：4℃、5000rpm，离心10min，倒出50-90％上清液，将细胞重悬；若采用碟式离心机过滤，通过离心泵或发酵罐压力将发酵液送入离心泵中，离心泵工作温度10-20℃，收集菌体。
为说明本发明技术方案的先进性，以50L发酵罐为例，乳酸浓度140g/l，转化率90％，如发酵液浓缩2倍，则碳源浓度可由70.71％降低至33.1％，该浓度基本与淀粉制糖所产的稀糖浓度相当，直接使用稀糖即可满足生产需求。
表1、浓缩发酵液对碳源浓度的需求
浓缩倍数 发酵液/L 25％氢氧化钙/L 碳源/g 碳源浓度/％
1 25 14 7777.77 70.71
2 12.5 14 7777.77 33.1
5 5 14 7777.77 25.09
10 2.5 14 7777.77 23.22
在一项优选的实施方式中，步骤A中所述菌种活性保护剂为甜菜碱、脯氨酸、海藻糖、透明质酸、聚乙二醇中的一种或多种；优选上述多个组分协同复配，实现菌种活性保护的功能增强；
优选地，所述菌种活性保护剂相对于浓缩菌液的添加比例为0.1-10g/kg。
在一项优选的实施方式中，步骤B中所述菌种活性增强剂为维生素b6、生物素、烟酸、硫酸镁、柠檬酸及其盐、硫酸亚铁中的一种或多种；优选上述多个组分协同复配，使菌种活性提升程度最大化；
优选地，所述菌种活性增强剂的添加比例为0.1-10g/kg浓缩菌液。
在本发明的另一个设计方案中，本发明创造性的引入了菌种活性保护剂和菌种活性增强剂并分别添加至菌种浓缩和发酵生产工艺步骤中，对保证浓缩后菌液依然保持较高的发酵活性具有重要的协同作用。
在一项优选的实施方式中，步骤B中，与浓缩后菌液初次混合的碳源浓度为10-30％，菌液与碳源的混合体积比为1:(1-200)；
优选地，步骤B中流加的碳源浓度为10-60％，以控制发酵液中碳源含量为10-100g/L。
进一步地，步骤B中可一次性加入浓度为10-30％的碳源，也可以初次少加一些碳源并在发酵过程中随时补加，通过流加碳源控制发酵液中碳源浓度稳定。
在一项优选的实施方式中，步骤B通过添加中和剂控制发酵液中pH为5-10，优选6.5-7.5；
优选地，所述中和剂为碱性钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、氨水中的一种或多种，例如NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、CaO、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、NH4OH、(NH4)2CO3和(NH4)HCO3等，优选氢氧化钠、氨水、氢氧化钙、碳酸钙中的一种或多种。
在一项优选的实施方式中，步骤B中，当发酵液的容积达到发酵罐装液量的80％时停止流加碳源，碳源含量＜1g/L，结束发酵。
在一项优选的实施方式中，所述乳酸生产菌为乳酸杆菌、凝结芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、米根霉、鼠李糖乳杆菌、拟干酪乳酸杆菌或大肠杆菌。
在一项优选的实施方式中，步骤A菌液浓缩后的清液通过补加养分后作为菌种增殖培养基回用。
本发明的有益效果如下：
相比目前的乳酸生产工艺，本发明使用增殖培养基培养菌体，菌种迅速增殖，且增殖阶段几乎没有副产物产生；发酵液经浓缩菌体后，为原体积的1/2到1/20，添加低浓度碳源即可满足发酵生产需求，特别要指出的是，对于淀粉制糖发酵生产乳酸，使用稀糖液作为碳源即可，省去了稀糖液的浓缩步骤，降低乳酸生产能耗。发酵液浓缩除去菌体后，滤液中几乎没有副产物，可继续回用于增殖培养基，极大的降低了废水的产生。菌体经浓缩后，还增加了乳酸生产菌的用量，可提高产酸速率，缩短发酵周期。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，本发明所述实施例只是作为对本发明的说明，不限制本发明的范围。
本发明所用原料说明：
固体LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH＝7.4。
液体LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.4。
PDA斜面琼脂培养基：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。
固曲培养基：麸皮1.5g，1％硫酸铵溶液2.5ml，自然pH。
淀粉糖液：来自万华化学玉米淀粉制糖工艺。
OD600：波长设定为600nm时测定的光密度值。
【实施例1】乳酸杆菌发酵生产乳酸
按照以下步骤生产乳酸：
(1)平板培养：将乳酸杆菌在固体LB培养基中接种活化平板，30℃培养40h；
(2)摇瓶种子培养：将平板培养的乳酸杆菌菌种接种到液体LB培养基中，38℃厌氧培养20h，摇床转速200rpm；
(3)配置增殖培养基：增殖培养基配方为，30g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，1g/L K2HPO4·3H2O，1g/L KH2PO4，8g/L(NH4)2SO4,0.5g/L MgSO4·7H2O，5mL/L微量元素储液，按照培养基总体积为1L进行调配，余量为水，调pH＝7.0；所述微量元素储液含有5g/L FeSO4·7H2O，0.5g/L ZnSO4·7H2O，0.5g/L MnSO4·4H2O，0.1g/L CuSO4·5H2O，0.15g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.1g/L H3BO3，0.1g/L CoCl2·6H2O，按照微量元素储液总体积为1L进行调配，余量为水；
(4)菌种增殖培养：按5％接种量将摇瓶种子接种于增殖培养基中，40℃、200rpm进行厌氧搅拌发酵，培养11h，OD600达到40，停止培养；
(5)菌液浓缩收集：收集发酵液，4℃、8000rpm下离心10分钟，分离出80％的清液回用；使用漩涡振荡器将浓缩后菌液重悬，按每kg浓缩菌液添加1g菌种活性保护剂，菌体活性保护剂组成为甜菜碱：脯氨酸：透明质酸＝2:2:1；
(6)乳酸发酵生产：取浓缩菌液与20％浓度的淀粉糖液按质量比1:9混和，按照每kg浓缩菌液添加1g菌种活性增强剂，活性增强剂组成为维生素b6：生物素：硫酸亚铁＝2:2:1。在40℃、200rpm下进行厌氧发酵，流加20％氢氧化钙控制发酵液pH＝7.0，当碳源含量低于1g/L时，结束发酵。乳酸产量143g/L,转化率90％,发酵周期30h。
【实施例2】凝结芽孢杆菌发酵生产乳酸
按照以下步骤生产乳酸：
(1)平板培养：将凝结芽孢杆菌在固体LB培养基中接种活化平板，50℃过夜培养；
(2)摇瓶种子培养：将平板培养的乳酸菌种接种到液体LB培养基中，50℃厌氧培养12h，摇床转速200rpm；
(3)配置增殖培养基：增殖培养基配方为，20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，0.5g/L K2HPO4·3H2O，1.1g/L KH2PO4，10g/L(NH4)2SO4,0.4g/L MgSO4·7H2O，7mL/L微量元素储液，按照培养基总体积为1L进行调配，余量为水，调pH＝7.0；所述微量元素储液含有4g/L FeSO4·7H2O，0.8g/L ZnSO4·7H2O，1.0g/L MnSO4·4H2O，0.05g/L CuSO4·5H2O，0.10g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.05g/L H3BO3，0.2g/L CoCl2·6H2O，按照微量元素储液总体积为1L进行调配，余量为水；
(4)菌种增殖培养：摇瓶种子按5％接种量接种于细菌增殖培养基，50℃、200rpm，通气量1.0vvm、0.1Mpa，控制溶氧20-40％，进行好氧发酵，氨水调节pH＝7.0，培养8h，OD600达到60，停止培养；
(5)菌液浓缩收集：收集发酵液并输送到陶瓷膜系统进行菌液浓缩，当菌液浓缩5倍后，收集浓缩菌液以及清液(清液留存回用)，按照每kg浓缩菌液加入1g菌种活性保护剂，菌种活性保护剂组成为脯氨酸：透明质酸：海藻糖＝2:1:1；
(6)乳酸发酵生产：将浓缩菌液与20％浓度的淀粉糖液按质量比2:8混和，按照每kg菌种添加菌种活性增强剂5g，活性增强剂组成为维生素b6：生物素：烟酸＝2:2:2。50℃、200rpm条件下进行厌氧发酵，流加25％氢氧化钙以控制pH＝7.0，当碳源含量低于1g/L时，结束发酵，乳酸产量155g/L，转化率95％，发酵周期为15h。
【实施例3】米根霉发酵生产乳酸
按照以下步骤生产乳酸：
(1)斜面菌种制备：接种米根霉于PDA斜面琼脂培养基上，34℃培养14h；
(2)制备孢子液：接种斜面孢子于固曲培养基，34℃培养20h至孢子大量生成，加无菌水，振荡，使孢子悬浮。
(3)配置增殖培养基：增殖培养基配方为，30g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，1g/L K2HPO4·3H2O，0.9g/L KH2PO4，9g/L(NH4)2SO4,0.5g/L MgSO4·7H2O，10mL/L微量元素储液，按照培养基总体积为1L进行调配，余量为水，调pH＝7.0；所述微量元素储液含有4g/L FeSO4·7H2O，0.8g/L ZnSO4·7H2O，1.0g/L MnSO4·4H2O，0.05g/L CuSO4·5H2O，0.10g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.05g/L H3BO3，0.2g/L CoCl2·6H2O，按照微量元素储液总体积为1L进行调配，余量为水；
(3)菌种增殖培养：按5％接种量将孢子悬浮液接种于增殖培养基中，34℃、200rpm，通气量1.0vvm、0.1Mpa，控制溶氧20-40％，进行好氧发酵，调节pH＝6.5，培养20h，OD600达到80，停止培养；
(4)米根霉菌丝体浓缩收集：将发酵液通过离心泵输送到碟式离心机，工作温度12℃，当菌体浓缩2倍后，收集分离出来的湿菌体，按照每kg湿菌体加入1g菌种活性保护剂，菌种活性保护剂组成为：甜菜碱：脯氨酸：透明质酸：海藻糖＝2:1:1:1；
(5)乳酸发酵生产：将米根霉湿菌体与45％淀粉糖液混合，42℃，200rpm，通气量0.5vvm培养，并按照每kg湿菌体加入添加菌种活性增强剂4g，菌种活性增强剂组成为维生素b6：生物素：烟酸＝1:2:2。发酵过程中葡萄糖浓度低于20g/L时开始补加浓度40％淀粉糖液，使发酵液中碳源浓度维持在30g/L，20％碳酸钙溶液调节pH＝6.5，培养25h，乳酸浓度不再增加，结束发酵。乳酸产量154g/L，转化率88％，发酵周期25h。
【实施例4】大肠杆菌发酵生产乳酸
按照以下步骤生产乳酸：
(1)平板培养：将大肠杆菌在固体LB培养基中接种活化平板，37℃培养30h；
(2)摇瓶种子培养：将平板培养的大肠杆菌菌种接种到液体LB培养基中，37℃培养11h，摇床转速200rpm；
(3)配置增殖培养基：增殖培养基配方为，30g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，1g/L K2HPO4·3H2O，1g/L KH2PO4，8g/L(NH4)2SO4,0.5g/L MgSO4·7H2O，5mL/L微量元素储液，按照培养基总体积为1L进行调配，余量为水，调pH＝7.0；所述微量元素储液含有5g/L FeSO4·7H2O，0.5g/L ZnSO4·7H2O，0.5g/L MnSO4·4H2O，0.1g/L CuSO4·5H2O，0.15g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.1g/L H3BO3，0.1g/L CoCl2·6H2O，按照微量元素储液总体积为1L进行调配，余量为水；
(4)菌种增殖培养：按5％接种量将摇瓶种子接种于增殖培养基中，37℃、200rpm，通气量1.0vvm，罐压0.1Mpa搅拌发酵，培养11h，OD600达到70，停止培养；
(5)菌种浓缩收集：收集发酵液并输送到陶瓷膜系统，当菌液浓缩10倍后，收集浓缩菌液，按照每kg浓缩菌液加入5g菌种活性保护剂，菌种活性保护剂组成为：甜菜碱：脯氨酸：透明质酸：海藻糖＝2:2:1:1；
(6)乳酸发酵生产：将浓缩菌液与30％浓度淀粉糖液混合，按照每kg浓缩菌液添加菌种活性增强剂5g，菌种活性增强剂组成为维生素b6：生物素：烟酸＝1:2:2。培养温度升温至42℃，转速200rpm，发酵过程中葡萄糖浓度低于10g/L时开始补加30％淀粉糖液，使发酵液中碳源浓度维持在30g/L，采用20％氢氧化镁调节pH＝7，培养25h，乳酸浓度不再增加，结束发酵。乳酸产量145g/L，转化率95％，发酵周期20h。
【实施例5】大肠杆菌发酵生产乳酸
按照以下步骤生产乳酸：
(1)平板培养：将大肠杆菌在固体LB培养基中接种活化平板，37℃培养30h；
(2)摇瓶种子培养：将平板培养的大肠杆菌菌种接种到液体LB培养基中，37℃培养11h，摇床转速200rpm；
(3)配置增殖培养基：增殖培养基配方为，30g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，1g/L K2HPO4·3H2O，1g/L KH2PO4，8g/L(NH4)2SO4,0.5g/L MgSO4·7H2O，5mL/L微量元素储液，按照培养基总体积为1L进行调配，余量为水，调pH＝7.0；所述微量元素储液含有5g/L FeSO4·7H2O，0.5g/L ZnSO4·7H2O，0.5g/L MnSO4·4H2O，0.1g/L CuSO4·5H2O，0.15g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.1g/L H3BO3，0.1g/L CoCl2·6H2O，按照微量元素储液总体积为1L进行调配，余量为水；
(4)菌种增殖培养：按5％接种量将摇瓶种子接种于增殖培养基中，37℃、200rpm，通气量1.0vvm，罐压0.1Mpa搅拌发酵，培养11h，OD600达到70，停止培养；
(5)菌种浓缩收集：收集发酵液并输送到陶瓷膜系统，当菌液浓缩10倍后，收集浓缩菌液，按照每kg浓缩菌液加入5g菌种活性保护剂，菌种活性保护剂组成为甜菜碱；
(6)乳酸发酵生产：将浓缩菌液与30％浓度淀粉糖液混合，按照每kg浓缩菌液添加菌种活性增强剂5g，菌种活性增强剂组成为维生素b6：生物素：烟酸＝1:2:2。培养温度升温至42℃，转速200rpm进行发酵，发酵过程中葡萄糖浓度低于10g/L时开始补加30％淀粉糖液，使发酵液中碳源浓度维持在30g/L，采用20％氢氧化镁调节pH＝7，乳酸浓度不再增加，结束发酵。乳酸产量130g/L，转化率90％，发酵周期23h。
【实施例6】大肠杆菌发酵生产乳酸
按照以下步骤生产乳酸：
(1)平板培养：将大肠杆菌在固体LB培养基中接种活化平板，37℃培养30h；
(2)摇瓶种子培养：将平板培养的大肠杆菌菌种接种到液体LB培养基中，37℃培养11h，摇床转速200rpm；
(3)配置增殖培养基：增殖培养基配方为，30g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，1g/L K2HPO4·3H2O，1g/L KH2PO4，8g/L(NH4)2SO4,0.5g/L MgSO4·7H2O，5mL/L微量元素储液，按照培养基总体积为1L进行调配，余量为水，调pH＝7.0；所述微量元素储液含有5g/L FeSO4·7H2O，0.5g/L ZnSO4·7H2O，0.5g/L MnSO4·4H2O，0.1g/L CuSO4·5H2O，0.15g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.1g/L H3BO3，0.1g/L CoCl2·6H2O，按照微量元素储液总体积为1L进行调配，余量为水；
(4)菌种增殖培养：按5％接种量将摇瓶种子接种于增殖培养基中，37℃、200rpm，通气量1.0vvm，罐压0.1Mpa搅拌发酵，培养11h，OD600达到70，停止培养；
(5)菌种浓缩收集：收集发酵液并输送到陶瓷膜系统，当菌液浓缩10倍后，收集浓缩菌液，按照每kg浓缩菌液加入5g菌种活性保护剂，菌种活性保护剂组成为：甜菜碱：脯氨酸：透明质酸：海藻糖＝2:2:1:1；
(6)乳酸发酵生产：将浓缩菌液与30％浓度淀粉糖液混合，按照每kg浓缩菌液添加菌种活性增强剂5g，菌种活性增强剂组成为烟酸。培养温度升温至42℃，转速200rpm进行发酵，发酵过程中葡萄糖浓度低于10g/L时开始补加30％浓度的淀粉糖液，使发酵液中碳源浓度维持在30g/L，采用20％氢氧化镁调节pH＝7，乳酸浓度不再增加，结束发酵。乳酸产量130g/L，转化率92％，发酵周期23h。
【对比例1】大肠杆菌发酵生产乳酸
按照以下步骤生产乳酸：
(1)平板培养：将大肠杆菌在固体LB培养基中接种活化平板，37℃培养30h；
(2)摇瓶种子培养：将平板培养的大肠杆菌菌种接种到液体LB培养基中，37℃培养11h，摇床转速200rpm；
(3)配置发酵培养基：增殖培养基配方为，30g/L葡萄糖，1g/L K2HPO4·3H2O，1g/LKH2PO4，8g/L(NH4)2SO4,0.5g/L MgSO4·7H2O，0.2g/L NaCl，5mL/L微量元素储液，按照培养基总体积为1L进行调配，余量为水，调pH＝7.0；所述微量元素储液含有5g/L FeSO4·7H2O，0.5g/L ZnSO4·7H2O，0.5g/L MnSO4·4H2O，0.1g/L CuSO4·5H2O，0.15g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.1g/L H3BO3，0.1g/L CoCl2·6H2O，按照微量元素储液总体积为1L进行调配，余量为水；
(4)乳酸发酵好氧增殖：按5％接种量将摇瓶种子接种于增殖培养基中，37℃、200rpm，通气量1.0vvm，罐压0.1Mpa搅拌发酵，氨水调节pH为7.0，培养7h，OD600达到30，停止培养；
(6)乳酸发酵生产：乳酸生产菌好氧培养结束后，停止通风，培养温度升温至42℃，转速200rpm，使用60％浓度淀粉糖液分批补加，发酵液中糖浓度达到50g/L，停止淀粉糖液补加，使用20％氢氧化钙调节pH为7.0，当葡萄糖浓度降低至5g/L时，再次补加淀粉糖液，当发酵罐装液量达到80％后，不再补加糖液，乳酸浓度不再增加时，结束发酵。乳酸产量135g/L，转化率95％，发酵周期30h。
【对比例2】凝结芽孢杆菌发酵生产乳酸
按照以下步骤生产乳酸：
(1)平板培养：将凝结芽孢杆菌在固体LB培养基中接种活化平板，50℃过夜培养；
(2)摇瓶种子培养：将平板培养的乳酸菌种接种到液体LB培养基中，50℃厌氧培养12h，摇床转速200rpm；
(3)配置发酵培养基：增殖培养基配方为，20g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，2g/L胰蛋白胨，0.5g/L K2HPO4·3H2O，5g/L CH3COONa，50g/L NaCl，10g/L(NH4)2SO4,0.4g/LMgSO4·7H2O，7mL/L微量元素储液，按照培养基总体积为1L进行调配，余量为水，调pH＝7.0；所述微量元素储液含有4g/L FeSO4·7H2O，0.8g/L ZnSO4·7H2O，1.0g/L MnSO4·4H2O，0.05g/L CuSO4·5H2O，0.10g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.05g/L H3BO3，0.2g/L CoCl2·6H2O，按照微量元素储液总体积为1L进行调配，余量为水；
(4)乳酸发酵好氧增殖：按5％接种量将摇瓶种子接种于增殖培养基中，50℃、200rpm，通气量1.0vvm，罐压0.1Mpa搅拌发酵，控制溶氧20-40％，氨水调节pH为7.0，培养8h，OD600达到30，停止培养；
(5)乳酸发酵生产：乳酸生产菌好氧培养结束后，停止通风，培养温度升温至50℃，200rpm条件下进行厌氧发酵，使用60％浓度淀粉糖液(来源同对比例1)分批补加，发酵液中糖浓度达到50g/L，停止淀粉糖液补加，使用20％氢氧化钙调节pH为7.0，当葡萄糖浓度降低至5g/L时，再次补加淀粉糖液，当发酵罐装液量达到80％后，不再补加糖液，乳酸浓度不再增加时，结束发酵。乳酸产量135g/l，转化率95％，发酵周期35h。
【对比例3】
采用与实施例4基本相同的条件通过大肠杆菌发酵生产乳酸，区别仅在于步骤5菌种浓缩收集时不添加菌种活性保护剂。乳酸产量135g/L，转化率90％，发酵周期25h。
【对比例4】
采用与实施例4基本相同的条件通过大肠杆菌发酵生产乳酸，区别仅在于步骤6乳酸发酵生产过程中不添加菌种活性增强剂。乳酸产量135g/L，转化率90％，发酵周期25h。
【对比例5】
采用与实施例4基本相同的条件通过大肠杆菌发酵生产乳酸，区别仅在于步骤5菌种浓缩收集时不添加菌种活性保护剂，同时步骤6乳酸发酵生产过程中不添加菌种活性增强剂。乳酸产量125g/L，转化率85％，发酵周期33h。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技术的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
A、配制菌种增殖培养基，通过好氧或厌氧方式培养乳酸生产菌，当菌体增殖培养完成后浓缩收集菌液，并加入菌种活性保护剂；
B、将浓缩后菌液与碳源、菌种活性增强剂相混合，通过流加中和剂和碳源进行发酵培养，生产乳酸。
2.根据权利要求1所述的利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，所述菌种增殖培养基的配方为：10-30g/L碳源，2-10g/L酵母提取物，5-20g/L胰蛋白胨，0.2-1g/LK2HPO4·3H2O，0.2-1.1g/L KH2PO4，2-10g/L(NH4)2SO4，0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O，5-10mL/L微量元素储液，以上述配方配制1L培养基时添加余量的水使培养基总量为1L，调pH为6-8；
其中，所述微量元素储液的配方包括：2-6g/L FeSO4·7H2O，0.2-0.8g/L ZnSO4·7H2O，0.5-1.5g/L MnSO4·4H2O，0.05-0.1g/L CuSO4·5H2O，0.05-0.15g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.05-0.1g/L H3BO3，0.05-0.2g/L CoCl2·6H2O，以上述配方配制1L储液时添加余量的水使微量元素储液总量为1L。
3.根据权利要求1所述的利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，步骤A中菌液浓缩收集可用的方法有：通过陶瓷膜、离心、硅藻土过滤的方式对菌液进行浓缩，优选使菌液浓缩2-20倍。
4.根据权利要求1-3任一项所述的利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，步骤A中所述菌种活性保护剂为甜菜碱、脯氨酸、海藻糖、透明质酸、聚乙二醇中的一种或多种；
优选地，所述菌种活性保护剂相对于浓缩菌液的添加比例为0.1-10g/kg。
5.根据权利要求4所述的利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，步骤B中所述菌种活性增强剂为维生素b6、生物素、烟酸、硫酸镁、柠檬酸及其盐、硫酸亚铁中的一种或多种；
优选地，所述菌种活性增强剂的添加比例为0.1-10g/kg浓缩菌液。
6.根据权利要求1-3任一项所述的利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，步骤B中，与浓缩后菌液初次混合的碳源浓度为10-30％，菌液与碳源的混合体积比为1:(1-200)；
优选地，步骤B中流加的碳源浓度为10-60％，以控制发酵液中碳源含量为10-100g/L。
7.根据权利要求6所述的利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，步骤B通过添加中和剂控制发酵液中pH为5-10，优选6.5-7.5；
优选地，所述中和剂为碱性钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、氨水中的一种或多种，优选氢氧化钠、氨水、氢氧化钙、碳酸钙中的一种或多种。
8.根据权利要求1-3任一项所述的利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，步骤B中，当发酵液的容积达到发酵罐装液量的80％时停止流加碳源，碳源含量＜1g/L，结束发酵。
9.根据权利要求1-3任一项所述的利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，所述乳酸生产菌为乳酸杆菌、凝结芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、米根霉、鼠李糖乳杆菌、拟干酪乳酸杆菌或大肠杆菌。
10.根据权利要求1-3任一项所述的利用浓缩菌液发酵生产乳酸的工艺，其特征在于，步骤A菌液浓缩后的清液通过补加养分后作为菌种增殖培养基回用。
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