CN113501746A - 一种大孔树脂在分离香叶醇中的应用及提取分离香叶醇的方法 - Google Patents

一种大孔树脂在分离香叶醇中的应用及提取分离香叶醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大孔树脂在分离香叶醇中的应用及提取分离香叶醇的方法,所述大孔树脂为XAD4大孔树脂,利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法,包括,在全细胞催化合成香叶醇的过程中,在发酵液中加入有机溶剂,离心,得到预处理液;将预处理的XAD4大孔树脂加入到预处理液中,吸附处理;将吸附了香叶醇的大孔树脂收集,加入到洗脱液中进行洗脱,得到香叶醇洗脱液;将洗脱液浓缩,干燥,得到香叶醇。本发明从全细胞催化的发酵液中提取纯化获得香叶醇,克服了发酵产物香叶醇原位提取分离的问题,同时具有工艺简单、操作简单、环境友好和纯化效率高等特点,获得的香叶醇纯度高,该方法适用于工业化生产。

Description

一种大孔树脂在分离香叶醇中的应用及提取分离香叶醇的 方法
技术领域
本发明属于生物分离工程技术领域,具体涉及到一种大孔树脂在分离香叶醇中的应用及提取分离香叶醇的方法。
背景技术
香叶醇(trans-3,7-dimethyl-2,6-octadien-1-ol),一种存在于芳香植物挥发性油中的非环状单萜醇,分子式为C10H18O,其结构式为:
Figure BDA0003123333020000011
香叶醇广泛应用于杀虫剂、食品添加剂和化妆品工业中,同时它还具有广泛的药理学作用,例如抗菌、消炎、抗氧化、抗溃疡以及保护神经等。
香叶醇的生产工艺主要有3种:植物提取法、化学合成法和代谢工程改造。植物提取和化学合成法成本高昂、操作复杂且造成了巨大的环境压力;合成生物技术已经成为绿色生物制造产业高速发展的引擎。合成生物技术提供了一种改变传统工业生产的方式,利用微生物经过特定的代谢途径生产得到香叶醇,具有原料成本低廉和环境友好等诸多优点。由于单萜化合物对微生物的毒性巨大,研究发现,75mg/L的香叶醇可以显著抑制大肠杆菌的生长,300mg/L的香叶醇几乎完全抑制了大肠杆菌的生长,使得生物合成香叶醇的产量提高变得极其困难。通过两相发酵技术有效缓解了产物毒性问题,但依然存在有机相中杂质多,香叶醇纯度低的问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题,提出了本发明。
为解决上述技术问题,本发明提供了如下技术方案:一种大孔树脂在分离香叶醇中的应用,所述大孔树脂为XAD4大孔树脂。
作为本发明大孔树脂在分离香叶醇中的应用的一种优选方案,其中:所述分离香叶醇的体系pH为3.0~9.0。
作为本发明大孔树脂在分离香叶醇中的应用的一种优选方案,其中:所述分离香叶醇的体系温度小于50℃。
本发明的另一个目的是提供一种利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法,包括,
在全细胞催化合成香叶醇的过程中,在发酵液中加入有机溶剂,离心,得到预处理液;
将预处理的XAD4大孔树脂加入到预处理液中,吸附处理;
将吸附了香叶醇的大孔树脂收集,加入到洗脱液中进行洗脱,得到香叶醇洗脱液;
将洗脱液浓缩,干燥,得到香叶醇。
作为本发明利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法的一种优选方案,其中:所述有机溶剂包括肉豆蔻酸异丙脂、十二烷、油醇中的一种或多种。
作为本发明利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法的一种优选方案,其中:所述发酵液中,香叶醇及其他萜类化合物的质量浓度为1.0~20.0g/L;
所述预处理液中,香叶醇及其他萜类化合物的质量浓度为10.0~200.0g/L。
作为本发明利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法的一种优选方案,其中:所述吸附处理,吸附温度为25℃,固液比为1:10。
作为本发明利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法的一种优选方案,其中:所述洗脱液为体积百分比为75%的乙醇溶液。
作为本发明利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法的一种优选方案,其中:所述洗脱,洗脱温度为室温,洗脱终点的判定方法为洗脱液中香叶醇的浓度不发生变化。
作为本发明利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法的一种优选方案,其中:所述预处理的XAD4大孔树脂,将XAD4大孔树脂用饱和食盐水浸泡,放尽食盐水后用清水漂洗净,使排出的水不显黄色,再用5%盐酸溶液浸泡,放尽酸液后冲洗树脂直至水接近中性,再用2%~4%氢氧化钠溶液浸泡,放尽碱液后冲洗树脂直至水接近中性。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)利用商业化大孔树脂XAD4高选择性地将微生物合成的香叶醇与发酵液中的萜烯脂类、色素、蛋白质、糖类以及副产物乙酸等小分子物质进行有效分离,进而从香叶醇发酵液中提取分离出高纯度的香叶醇,工艺条件温和、能耗低、操作简便、溶剂消耗量少、流程简单,有效克服了香叶醇合成过程中的产物原位提取分离问题,可以实现连续化生产,易于规模化。
(2)采用特定类型的树脂对发酵液中的产品进行吸附,与树脂结合能力弱的杂质组分(如乙酸香叶酯)可随柱液从吸附柱中流出,树脂中吸附的杂质数量相对较少,另外,选用合适的洗脱剂,选择性地将吸附在树脂上的杂质洗脱下来,而香叶醇仍留在树脂上,达到二次纯化的效果,有效保证了杂质的脱除效果和产品的质量。
(3)本发明在对发酵液中的香叶醇进行提取分离的过程中,还具有一定的浓缩和富集效果,尤其是当发酵液中的香叶醇浓度较低时,洗脱液中的香叶醇浓度可以远远大于吸附前发酵液中的香叶醇浓度,大大降低了后续蒸发浓度过程中所需的能耗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
图1为本发明实施例1中不同大孔树脂对香叶醇的吸附曲线;
图2为本发明实施例2中XAD4大孔树脂在不同pH下对香叶醇的吸附曲线;
图3为本发明实施例3中XAD4大孔树脂在不同温度下对香叶醇的吸附曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
(1)大孔树脂预处理,首先使用饱和食盐水,用量为被处理树脂的3倍,将树脂置于食盐水中浸泡20h,然后放尽食盐水,用清水漂洗净,使排出的水不显黄色,再用5%盐酸溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽酸液后冲洗树脂直至水接近中性,酸洗完成后再用3%氢氧化钠溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽碱液后冲洗树脂直至水接近中性待用;
(2)制备香叶醇肉豆蔻酸异丙酯溶液,以肉豆蔻酸异丙酯作为溶剂,将香叶醇标准品溶于肉豆蔻酸异丙酯,配制浓度为200g/L,其中,香叶醇购于上海源叶生物科技有限公司,肉豆蔻酸异丙酯购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
(3)分别称取预处理过的大孔树脂IRA410-CL、XAD2、XAD4、XAD7HP各5g(湿重)放于锥形瓶中,加入5mL浓度为200g/L的香叶醇肉豆蔻酸异丙酯溶液,同时添加50mL蒸馏水,置于摇床中,以25℃,200rpm/min振摇。
(4)取样测定残留液中香叶醇的含量,计算其吸附量,当吸附量饱和后停止反应。
吸附曲线如图1所示。吸附曲线表明,仅有XAD4大孔树脂展现了最好的吸附性能和吸附选择性,XAD4大孔树脂在吸附4h后达到饱和,1g湿重XAD4大孔树脂可以吸附0.15g香叶醇。
实施例2
(1)大孔树脂预处理,首先使用饱和食盐水,用量为被处理树脂的3倍,将树脂置于食盐水中浸泡20h,然后放尽食盐水,用清水漂洗净,使排出的水不显黄色,再用5%盐酸溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽酸液后冲洗树脂直至水接近中性,酸洗完成后再用3%氢氧化钠溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽碱液后冲洗树脂直至水接近中性待用;
(2)制备香叶醇肉豆蔻酸异丙酯溶液,以肉豆蔻酸异丙酯作为溶剂,将香叶醇标准品溶于肉豆蔻酸异丙酯,配制浓度为200g/L,其中,香叶醇购于上海源叶生物科技有限公司,肉豆蔻酸异丙酯购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
(3)称取预处理过的XAD4大孔树脂5g(湿重)放于锥形瓶中,加入5mL浓度为200g/L的香叶醇肉豆蔻酸异丙酯溶液,同时添加50mL蒸馏水,置于摇床中,以25℃,200rpm/min振摇。
(3)分别调整体系的pH至3.0、5.0、7.0、9.0。取样测定残留液中香叶醇的含量,计算其吸附量,当吸附量饱和后停止反应。
吸附曲线如图2所示。吸附曲线表明,体系的pH对树脂吸附速率和吸附量没有显著影响。不同的pH,树脂均在4h后达到饱和,1g湿重XAD4大孔树脂可以吸附0.15g香叶醇。
实施例3
(1)大孔树脂预处理,首先使用饱和食盐水,用量为被处理树脂的3倍,将树脂置于食盐水中浸泡20h,然后放尽食盐水,用清水漂洗净,使排出的水不显黄色,再用5%盐酸溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽酸液后冲洗树脂直至水接近中性,酸洗完成后再用3%氢氧化钠溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽碱液后冲洗树脂直至水接近中性待用;
(2)制备香叶醇肉豆蔻酸异丙酯溶液,以肉豆蔻酸异丙酯作为溶剂,将香叶醇标准品溶于肉豆蔻酸异丙酯,配制浓度为200g/L,其中,香叶醇购于上海源叶生物科技有限公司,肉豆蔻酸异丙酯购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
(3)称取预处理过的XAD4大孔树脂5g(湿重)放于锥形瓶中,加入5mL浓度为200g/L的香叶醇肉豆蔻酸异丙酯溶液,同时添加50mL蒸馏水,置于摇床中,200rpm/min振摇。
(3)分别于20、30、40、50℃下测试树脂的吸附性能。取样测定残留液中香叶醇的含量,计算其吸附量,当吸附量饱和后停止反应。
吸附曲线如图3所示。吸附曲线表明,体系的温度对树脂吸附速率没有显著影响,但是低温有利于吸附更多的香叶醇。不同的温度,树脂均在4h后达到饱和,1g湿重XAD4大孔树脂在20、30、40、50℃下分别可以吸附0.16、0.15、0.14、0.13g香叶醇。
实施例4
(1)全细胞催化制备香叶醇:大肠杆菌诱导表达乙酰酯酶AES,添加20g/L乙酸香叶酯,35℃催化乙酸香叶酯水解制备香叶醇;
(2)发酵液上层覆盖10%肉豆蔻酸异丙酯用于吸附全细胞催化产物;
(3)大孔树脂预处理,首先使用饱和食盐水,用量为被处理树脂的3倍,将树脂置于食盐水中浸泡20h,然后放尽食盐水,用清水漂洗净,使排出的水不显黄色,再用5%盐酸溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽酸液后冲洗树脂直至水接近中性,酸洗完成后再用3%氢氧化钠溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽碱液后冲洗树脂直至水接近中性待用;
(4)制备香叶醇肉豆蔻酸异丙酯溶液,以肉豆蔻酸异丙酯作为溶剂,将香叶醇标准品溶于肉豆蔻酸异丙酯,配制浓度为200g/L,其中,香叶醇购于上海源叶生物科技有限公司,肉豆蔻酸异丙酯购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
(5)称取预处理过的XAD4大孔树脂5g(湿重)放于锥形瓶中,加入5mL肉豆蔻酸异丙酯溶液,同时添加50mL蒸馏水,置于摇床中,以25℃,200rpm/min振摇。
(6)4h后取样测定残留液中香叶醇的含量,吸附率为98.0%。使用75%乙醇溶液解析,解析温度为25℃,固液比为1:10,解析率为87.2%,纯度为99.9%。
实施例5
(1)全细胞催化制备香叶醇:大肠杆菌诱导表达乙酰酯酶AES,添加20g/L乙酸香叶酯,35℃催化乙酸香叶酯水解制备香叶醇;
(2)发酵液上层分别覆盖10%、20%、40%肉豆蔻酸异丙酯用于吸附全细胞催化产物;
(3)大孔树脂预处理,首先使用饱和食盐水,用量为被处理树脂的3倍,将树脂置于食盐水中浸泡20h,然后放尽食盐水,用清水漂洗净,使排出的水不显黄色,再用5%盐酸溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽酸液后冲洗树脂直至水接近中性,酸洗完成后再用3%氢氧化钠溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽碱液后冲洗树脂直至水接近中性待用;
(4)制备香叶醇肉豆蔻酸异丙酯溶液,以肉豆蔻酸异丙酯作为溶剂,将香叶醇标准品溶于肉豆蔻酸异丙酯,配制浓度为200g/L,其中,香叶醇购于上海源叶生物科技有限公司,肉豆蔻酸异丙酯购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
(5)称取预处理过的XAD4大孔树脂5g(湿重)放于锥形瓶中,加入5mL肉豆蔻酸异丙酯溶液,同时添加50mL蒸馏水,置于摇床中,以25℃,200rpm/min振摇。
(6)4h后取样测定残留液中香叶醇的含量,试验结果表示,使用10%肉豆蔻酸异丙脂吸附组,吸附率为96.8%,解析率为87.2%,纯度为99.9%;使用20%肉豆蔻酸异丙脂吸附组,吸附率为98.0%,解析率为88.4%,纯度为99.9%;使用40%肉豆蔻酸异丙脂吸附组,吸附率为98.0%,解析率为89.1%,纯度为99.9%。
实施例6
(1)全细胞催化制备香叶醇:大肠杆菌诱导表达乙酰酯酶AES,添加20g/L乙酸香叶酯,35℃催化乙酸香叶酯水解制备香叶醇;
(2)发酵液上层分别覆盖10%肉豆蔻酸异丙酯、10%十二烷、10%油醇用于吸附全细胞催化产物;
(3)大孔树脂预处理,首先使用饱和食盐水,用量为被处理树脂的3倍,将树脂置于食盐水中浸泡20h,然后放尽食盐水,用清水漂洗净,使排出的水不显黄色,再用5%盐酸溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽酸液后冲洗树脂直至水接近中性,酸洗完成后再用3%氢氧化钠溶液(其用量为被处理树脂的3倍)浸泡3h,放尽碱液后冲洗树脂直至水接近中性待用;
(4)制备香叶醇肉豆蔻酸异丙酯溶液,以肉豆蔻酸异丙酯作为溶剂,将香叶醇标准品溶于肉豆蔻酸异丙酯,配制浓度为200g/L,其中,香叶醇购于上海源叶生物科技有限公司,肉豆蔻酸异丙酯购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
(5)称取预处理过的XAD4大孔树脂5g(湿重)放于锥形瓶中,加入5mL肉豆蔻酸异丙酯溶液,同时添加50mL蒸馏水,置于摇床中,以25℃,200rpm/min振摇。
(6)4h后取样测定残留液中香叶醇的含量,试验结果表示,使用10%肉豆蔻酸异丙脂吸附组,吸附率为96.8%,解析率为87.2%,纯度为99.9%;使用10%十二烷吸附组,吸附率为95.9%,解析率为86.4%,纯度为99.9%;使用10%油醇吸附组,吸附率为91.8%,解析率为82.7%,纯度为99.9%。
本发明利用商业化大孔树脂XAD4高选择性地将微生物合成的香叶醇与发酵液中的萜烯脂类、色素、蛋白质、糖类以及副产物乙酸等小分子物质进行有效分离,进而从香叶醇发酵液中提取分离出高纯度的香叶醇,工艺条件温和、能耗低、操作简便、溶剂消耗量少、流程简单,有效克服了香叶醇合成过程中的产物原位提取分离问题,可以实现连续化生产,易于规模化。
采用特定类型的树脂对发酵液中的产品进行吸附,与树脂结合能力弱的杂质组分(如乙酸香叶酯)可随柱液从吸附柱中流出,树脂中吸附的杂质数量相对较少,另外,选用合适的洗脱剂,选择性地将吸附在树脂上的杂质洗脱下来,而香叶醇仍留在树脂上,达到二次纯化的效果,有效保证了杂质的脱除效果和产品的质量。
本发明在对发酵液中的香叶醇进行提取分离的过程中,还具有一定的浓缩和富集效果,尤其是当发酵液中的香叶醇浓度较低时,洗脱液中的香叶醇浓度可以远远大于吸附前发酵液中的香叶醇浓度,大大降低了后续蒸发浓度过程中所需的能耗。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种大孔树脂在分离香叶醇中的应用,其特征在于:所述大孔树脂为XAD4大孔树脂。
2.如权利要求1所述的大孔树脂在分离香叶醇中的应用,其特征在于:所述分离香叶醇的体系pH为3.0~9.0。
3.如权利要求1或2所述的大孔树脂在分离香叶醇中的应用,其特征在于:所述分离香叶醇的体系温度小于50℃。
4.一种利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法,其特征在于:包括,
在全细胞催化合成香叶醇的过程中,在发酵液中加入有机溶剂,离心,得到预处理液;
将预处理的XAD4大孔树脂加入到预处理液中,吸附处理;
将吸附了香叶醇的大孔树脂收集,加入到洗脱液中进行洗脱,得到香叶醇洗脱液;
将洗脱液浓缩,干燥,得到香叶醇。
5.如权利要求4所述的利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法,其特征在于:所述有机溶剂包括肉豆蔻酸异丙脂、十二烷、油醇中的一种或多种。
6.如权利要求4或5所述的利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法,其特征在于:所述发酵液中,香叶醇及其他萜类化合物的质量浓度为1.0~20.0g/L;
所述预处理液中,香叶醇及其他萜类化合物的质量浓度为10.0~200.0g/L。
7.如权利要求6所述的利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法,其特征在于:所述吸附处理,吸附温度为25℃,固液比为1:10。
8.如权利要求4、5、7中任一所述的利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法,其特征在于:所述洗脱液为体积百分比为75%的乙醇溶液。
9.如权利要求8所述的利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法,其特征在于:所述洗脱,洗脱温度为室温,洗脱终点的判定方法为洗脱液中香叶醇的浓度不发生变化。
10.如权利要求4、5、7、9中任一所述的利用大孔树脂从发酵液中提取分离香叶醇的方法,其特征在于:所述预处理的XAD4大孔树脂,将XAD4大孔树脂用饱和食盐水浸泡,放尽食盐水后用清水漂洗净,使排出的水不显黄色,再用5%盐酸溶液浸泡,放尽酸液后冲洗树脂直至水接近中性,再用2%~4%氢氧化钠溶液浸泡,放尽碱液后冲洗树脂直至水接近中性。
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