CN113491685B - 一种抑制巨噬细胞活化的组合物及其在制备抗炎制品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗炎药物技术领域，公开了一种抑制巨噬细胞活化的组合物及其在制备抗炎制品中的应用，所述组合物由肉桂醛和Drp1抑制剂组成。所述肉桂醛和Drp1抑制剂的摩尔比为（0.3~2.3）：（0.5~3.5）。该组合物抗炎效果好，利用肉桂醛和Drp1抑制剂的协同增效作用，能降低单独用药的浓度，从而减少单独药物的毒副作用，减少对人体的伤害。本发明结果表明肉桂醛可以促进线粒体自噬，但对于线粒体分裂没有抑制效果，而Drp1抑制剂可以抑制线粒体的裂变。因此，肉桂醛和Drp1抑制剂两者联用可以通过作用不同的靶点而抑制的炎症反应，有望成为治疗炎症相关疾病的潜在疗法。

Description

一种抑制巨噬细胞活化的组合物及其在制备抗炎制品中的 应用

技术领域

本发明属于抗炎药物技术领域，更具体地，涉及一种抑制巨噬细胞活化的组合物及其在制备抗炎制品中的应用。

背景技术

巨噬细胞作为一种初始免疫细胞，是机体炎症反应的重要参与和调节者。巨噬细胞能够清除入侵的病原体，触发炎症信号并吞噬死亡细胞。越来越多的证据表明，巨噬细胞是基于巨噬细胞吞噬作用和细胞因子信号调节的不同组织生长和维持代谢稳态所必需的。巨噬细胞在损伤和病原体侵袭过程中发挥双重作用。在许多疾病中，如癌症、炎症相关疾病、纤维化等，当炎症巨噬细胞无法被抑制时，巨噬细胞被认为对疾病进展起更大作用。在不同的环境条件下可以分化为经典激活（classically activated）的M1型和替代激活（alternatively activated）的M2型两种功能截然不同的亚型。M1型巨噬细胞主要由LPS、IFN-γ等激活，可诱导Th1细胞反应，主要参与抗感染免疫应答，并引起炎症损伤。M2型巨噬细胞主要由IL-4、IL-13、IL-10等激活，可诱导Th2细胞反应，与过敏性哮喘的发生发展相关。在炎症过程中，所有巨噬细胞在与周围微环境中的致病性和损伤信号相互作用后被激活并极化为M1型巨噬细胞，产生一系列细胞因子和其他炎性因子。这个过程最初是有益的，但当巨噬细胞被过度激活时，则会造成自身免疫性疾病，对身体产生损伤。

炎症发生过程中，促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)等对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的过度刺激，使活性氧ROS过度产生。ROS会直接破坏线粒体，受损的线粒体可通过与溶酶体融合形成自噬溶酶体而水解消化，从而及时清除受损的线粒体来维持细胞的完整性，这一过程称为线粒体自噬。研究发现，线粒体自噬可由PINK1/Parkin通路、线粒体自噬受体及线粒体分裂-融合循环等多方面调控。

线粒体自噬受损会导致活性氧和线粒体 DNA 的积累，进而激活免疫信号通路，最终导致炎性细胞因子的释放，包括 IL-1α、IL-1β、IL-18、I 型干扰素和巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF)，从而引起病理变化。此外，未降解的功能失调线粒体会产生更多的ROS，更容易释放细胞色素c，导致细胞凋亡。

线粒体自噬通过调整线粒体含量来调节免疫细胞功能，还能影响巨噬细胞和T细胞极化的免疫代谢状态，进一步影响炎症的发生和消退。如肠炎中线粒体自噬作用控制IL-1β和IL-6的释放，携带Atg16L1易感等位基因的克罗恩病患者外周血单个核细胞分泌更多的促炎细胞因子。线粒体功能缺陷与脓毒症、急性肺损伤、肾炎和神经炎症等有关。

研究表明阻断线粒体过度裂变具有衰减出血、组织水肿、炎症细胞和肺水浸润等保护作用。此外，Drp1抑制剂不仅能阻断促炎反应，还能降低机体氧化应激(iNOS、MDA和SOD)、MAPK活化(p38、ERK和JNK)和凋亡(cleaved caspase-3)，因此，Drp1抑制剂可对以线粒体分裂升高为特征的线粒体动力功能障碍进行治疗调节。

肉桂醛（化学分子式：C₉H₈O，分子量：132.16，化学结构如下图）为黄色黏稠状液体，是天然存在于斯里兰卡肉桂油、桂皮油、藿香油、风信子油和玫瑰油等精油的化合物，因其较低的生物毒性，主要用作香料、食品添加剂等，目前在抗癌、抗溃疡、抗病毒等方面也有广泛应用。

Drp1（动态蛋白相关蛋白1），一种线粒体分裂的必需的蛋白质。目前发现的Drp1抑制剂有Mdivi-1、P110、Schaftoside、Dynasore。Mdivi-1(化学分子式：C₁₅H₁₀C_l2N₂O₂S，分子量：353.22，化学结构如下图)，为白色或卡其色固体，易溶于DMSO，不溶或难溶于H₂O。

Mdivi-1是线粒体分裂dynamin相关GTP酶(Drp1)和线粒体分裂Dynamin I(Dnm1)的选择性细胞渗透抑制剂，在科学研究中，Mdivi-1的主要用途有两个方面：在体外实验，用Mdivi-1处理细胞后抑制线粒体外膜透化导致细胞色素C释放减少，抑制了细胞凋亡。在体外和体内实验，Mdivi-1被应用于抗中风和保护神经。

目前，药物研究倾向于作用单个靶标的选择性活性分子，这种方法不仅低估了疾病的多因素病因之间相关性，而且低估了疾病在受到药理干扰时表现出来的顽固性和自适应性，因此，对多个靶点的同时部分调控比对单一靶点的完全调控更有效。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，提供一种抑制巨噬细胞活化的组合物。该组合物是由肉桂醛（CMA）和Drp1抑制剂组成，其二者联合使用时，相互之间具有协同增效作用，抗炎效果好，二者联合使用时，可降低药物的使用量，减少不良反应或抗药性的产生。

本发明的另一目的在于提供上述组合物在在制备抗炎制品中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种抑制巨噬细胞活化的组合物，所述组合物由肉桂醛和Drp1抑制剂组成。

优选地，所述肉桂醛和Drp1抑制剂的摩尔比为（0.3~2.3）:（0.5~3.5）。

更为优选地，所述肉桂醛和Drp1抑制剂的摩尔比为（1~2）:（1~3）。

优选地，所述的Drp1抑制剂为Mdivi-1、P110、Schaftoside、Dynasore中的一种以上。

所述的抑制巨噬细胞活化的组合物在制备抗炎制品中的应用。

优选地，所述巨噬细胞为小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1. 本发明的组合物由肉桂醛和Drp1抑制剂按照摩尔比组成；所述肉桂醛为天然活性成分，可促进线粒体自噬，而当肉桂醛与Drp1抑制剂二者联合使用时，能更有效抑制巨噬细胞（如RAW264.7）活化，减少NO产生，具有协同增效作用，可以达到多靶点同时调控巨噬细胞的效果，从而降低给药剂量，减少毒副作用，并有利于降低或延缓抗药性的产生。

2. 本发明的组合物抗炎效果好，利用肉桂醛和Drp1抑制剂的协同增效作用，能降低单独用药的浓度，从而减少单独药物的毒副作用，减少对人体的伤害。结果表明肉桂醛可以促进线粒体自噬，但对于线粒体分裂没有抑制效果，而Drp1抑制剂可以抑制线粒体的裂变。因此，肉桂醛和Drp1抑制剂两者联用可以通过作用不同的靶点而抑制的炎症反应，有望成为治疗炎症相关疾病的潜在疗法。

说明附图

图1为实施例1中不同浓度的肉桂醛和Mdivi-1对RAW264.7细胞的生长影响结果。

图2为实施例2中不同浓度的肉桂醛、Mdivi-1以及两者联用对LPS诱导的RAW264.7产生NO的结果。

图3为实施例2肉桂醛-Mdivi-1联合用药剂量效应曲线。

图4为实施例2肉桂醛-Mdivi-1联合用药CI-Fa曲线。

图5为实施例3肉桂醛对LPS诱导巨噬细胞中p62、LC3B、TOM20和p-Drp1蛋白的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

用MTT实验测定不同浓度的肉桂醛和抑制剂Mdivi-1对RAW264.7细胞的生长影响，具体实施方案如下：

用移液枪将RAW264.7细胞从培养瓶中吹打下来，使用10%FBS的DMEM培养基中制成细胞悬浮液，以接种浓度5×10 ⁴ 个/mL的浓度接种于96孔板(100μL/孔)，置于5% CO₂，37℃培养箱中培养24小时。设置肉桂醛和Mdivi-1浓度为80μM、40μM、20μM、10μM、5μM，每个浓度设置4个复孔。8% CO₂，37 ℃培养24h，吸掉上清液后加入100μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液(用5mg/mL MTT溶液于基础DMEM中稀释10倍得到)；放入培养箱中继续培养3h后，小心吸去孔内上清液。每孔加入100μL DMSO，在培养箱静置十分钟；用酶标仪测量570nm处各孔的吸光值。

图1为实施例1中不同浓度的肉桂醛和Mdivi-1以及两者联用对RAW264.7细胞的生长影响结果。其中，（a）为肉桂醛(CMA)对RAW264.7细胞的生长影响，（b）为Mdivi-1对RAW264.7细胞的生长影响。从图1中可知，CMA在0-40μM浓度范围内，随着药物浓度增加，RAW264.7细胞存活率降低，故取最大安全浓度20μM作为抗炎实验最大浓度。抑制剂Mdivi-1在0-80μM浓度范围内，随着药物浓度增加，RAW264.7细胞存活率降低，该药物具有一定毒性，故取最大安全浓度30μM作为抗炎实验最大浓度。

实施例2

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞外壁的一种成份，具有很强的致炎作用，但对巨噬细胞没有直接毒性作用。其目前已经广泛用于各种炎症反应和氧化应激模型的建立，包括RAW264.7细胞体外炎症模型，因此以下试验采用LPS造模进行试验。基于LPS(脂多糖)诱导，肉桂醛（CMA）20μM、10μM和Mdivi-1 30μM、20μM、10μM进行单独以及两两联合用药对RAW264.7产生NO含量的影响。通过Griess实验，具体实施方案如下：

用移液枪将RAW264.7细胞从培养瓶中吹打下来，使用10%FBS的DMEM培养基中制成细胞悬浮液，以接种浓度1×10⁶个/mL的浓度接种于24孔板(400μL/孔)，置于5%CO₂，37 ℃培养箱中培养。24小时后，吸去培养基，空白组加入400μL DMEM基础培养基，LPS(脂多糖)组加入400μL含100 ng/mL LPS的基础DMEM，实验组CMA(20μM、10μM)，Mdivi-1(30μM、20μM、10μM)、CMA 20μM+ Mdivi-1 30μM，CMA 20μM+ Mdivi-1 20μM，CMA 20μM+ Mdivi-1 10μM，CMA10μM+ Mdivi-1 30μM，CMA 10μM+ Mdivi-1 20μM，CMA 10μM+ Mdivi-1 10μM，使用含100ng/mL LPS的基础DMEM稀释药物浓度，每孔加入4μL，每个浓度设置3个复孔。然后置于37 ℃、5％CO₂培养箱内培养。24h后，每孔取50μL上清液加入另一个96孔培养板中，再往每孔加入50μL Griess ReagentⅠ试剂和50μL Griess ReagentⅡ试剂，轻轻摇动培养板混匀，用酶标光度计检测562nm波长处的吸光光度值，NO的浓度依据NaNO₂标准曲线进行计算。

图2为实施例2中不同浓度的肉桂醛、Mdivi-1以及两者联用对LPS诱导的RAW264.7产生NO的结果。其中，（a）为肉桂醛对LPS诱导的RAW264.7产生NO的结果，（b）为Mdivi-1对LPS诱导的RAW264.7产生NO的结果，（c）为肉桂醛和Mdivi-1两者联用对LPS诱导的RAW264.7产生NO的结果。从图2中可以看出，单独用药时，与LPS模型组相比，2.5μM和5μM的肉桂醛在趋势上呈现出微弱的效果，而10μM和20μM的肉桂醛均显著减少了细胞NO的产生。Drp1抑制剂Mdivi-1单独用药时，2.5μM和5μM的肉桂醛在趋势上呈现出微弱的效果而10μM、20μM和30μM的Mdivi-1均显著减少了细胞NO的产生。因此，本发明分别使用10μM和20μM肉桂醛与10μM、20μM和30μM的Mdivi-1组合，本发明的组合物由肉桂醛和Drp1抑制剂组成，肉桂醛和Drp1抑制剂的摩尔比为（0.3~2.3）:（0.5~3.5），优选摩尔比为（1~2）:（1~3）。当两者进行组合用药时，对LPS诱导的RAW264.7产生NO的抑制效果明显优于单独用药。

图3为实施例2肉桂醛-Mdivi-1联合用药剂量效应曲线。从图3中可知，在同等剂量下，六组联合实验组Fa值均比单独给药组低，表明联合后抗炎效果更加显著。图4为实施例2肉桂醛-Mdivi-1联合用药CI-Fa曲线。从图4中可知，六组联合实验组CI值均小于1，表明具有明显的协同作用。采用Compusyn 2.0软件分析肉桂醛和Mdivi-1的联合效应，将NO实验测定结果导入Compusyn 2.0，生成Fa-Does曲线图(图3)和CI-Fa曲线图(图4)，其中Com代表联合用药组。采用联合作用指数(CombinationIndex，CI)判断两种药物的协同性。Chou-Talalay药物联合方法基于中效方程，为定量测定药物相互作用的联合指数(CI)等线图方程提供了理论基础，其中CI<1表示协同作用，CI＝1表示加性作用，CI>1表示拮抗作用。从剂量效应曲线以及CI-Fa曲线可以看出，六组联合实验组CI值均小于1，表明具有明显的协同作用。

实施例3

用Western Blot实验验证的肉桂醛促进线粒体自噬，具体实施方案如下：

1. 提蛋白前的细胞处理：将RAW264.7细胞以每皿100万个细胞种于35mm培养皿中，加入8ml完全培养基。24小时后，弃去上清液，每皿加入2ml含肉桂醛（20μM）的完全培养基。培养2小时后，加入LPS使其终浓度为1μg/ml，同时设置空白组和LPS模型组。继续培养24小时后，可进行细胞抽提。

2. 细胞总蛋白抽提方法：培养皿中的RAW264.7细胞用PBS轻轻洗涤三遍后吹打下来，转移至1.5ml EP管中，低速离心，弃去PBS。将EP管置于冰上，每管加入100μl细胞裂解液，混匀裂解10分钟。之后于高速低温（4℃/12000rpm）离心10分钟，所得上清液即为细胞总蛋白溶液。

3. 测定蛋白浓度：配制蛋白标准品溶液：称取20 mg BSA，加入800μlPBS配制成25mg/ml作为储备液备用。配制BCA工作液：BCA试剂A和试剂B按50:1的比例配制成BCA工作液。检测蛋白浓度：往96孔板中各加入20μL梯度浓度（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的蛋白标准品溶液和稀释后的待测蛋白溶液，再加入200μl BCA工作液，置于37℃孵育30分钟，最后用酶标仪在562nm波长下测出吸光值。根据标准蛋白曲线计算待测蛋白的浓度。

4. 蛋白电泳与转膜：将提取后的蛋白溶液按照4:1的比例加入5X上样缓冲液，混匀后于沸水浴5分钟，使蛋白变性。分装后用于电泳，多余的放置在-80°C冰箱保存。首先配制电泳凝胶，本实验中用的是8%凝胶，由下层分离胶和上层浓缩胶组成，其中分离胶的配方为：2.3体积去离子水、1.3体积30%聚丙烯酰胺、1.3体积1.5M Tris-HCI(pH=8.8) 、0.05体积10%SDS、0.05体积10%过硫酸铵和0.003体积TEMED；浓缩胶的配方为：3.4体积去离子水、0.83体积30%聚丙烯酰胺、0.63体积1.0M Tris-HCI(pH=6.8) 、0.05体积10%SDS、0.05体积10%过硫酸铵和0.005体积TEMED。注意灌胶的过程中要保证均匀，且不能出现气泡。凝胶凝固后，用电泳槽中的固定夹固定，加入电泳液，并往上样孔中加入蛋白样品。浓缩胶的电泳条件为40V电泳30~60分钟，直至蛋白前沿的溴酚蓝跑到分离胶。分离胶的电泳条件为120V电泳1小时，直到蛋白前沿的溴酚蓝跑到接近凝胶的底部为止。电泳结束后进行转膜。将凝胶从玻璃板中卸下来，切割除去浓缩胶，操作的过程要注意不要磨损或撕裂凝胶。按“海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵”的叠加方式放入转膜夹，过程注意出去缝隙间的气泡。将装置好的转膜夹放入转印槽，加入转膜液，并置于冰中进行电泳，其条件为：300mA电泳70分钟。

5. 封闭与抗体孵育：将NC膜从转印槽中取出，放入5% BSA封闭液（用TBST作溶剂）中摇床室温震荡2小时。根据CST抗体说明书稀释一抗溶液，将封闭结束的NC膜按目的蛋白的分子量大小减下来，放在一抗中4℃孵育过夜。第二天取出蛋白条带，用TBST洗涤三次，每次10分钟。然后放入已稀释的二抗溶液，室温震荡孵育2小时。

二抗孵育结束后，用TBST洗涤三次，每次10分钟。配制好ECL显影液，将洗涤完毕的条带放入显影仪中拍照，以Tiff的格式保存图片。在线粒体损伤时，PINK稳定并招募E3连接酶Parkin以启动自噬。线粒体膜蛋白通过Parkin的多聚泛素化作用导致自噬连接蛋白SQSTM1/p62聚集，并通过LC3-作用区域 (LIR)结合到LC3上。LC3-Ⅰ也是通过泛素样反应，结合到磷脂酰乙醇胺 (PE)。脂质化形式的LC3，也称作LC3-Ⅱ，附着到自噬体的膜上。TOM20是线粒体外膜（TOM）的转位酶的一个组成部分，其数量可以代表线粒体数目的多少。因此，在线粒体自噬过程中，p62蛋白水平会下降，LC3会从LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变，同时TOM20蛋白水平也随之下降。

线粒体的分裂受dynamin-related protein 1 (Drp1), Fis1,或MTP18调控。其中关键的蛋白是Drp1，它转移到线粒体上，与Fis1形成复合体进一步发挥功能。

图5为实施例3肉桂醛对LPS诱导巨噬细胞中p62、LC3B、TOM20和p-Drp1蛋白的影响。如图5所示，加入肉桂醛后，细胞中p62蛋白水平下降，LC3从LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变， TOM20蛋白水平也随之下降，Drp1磷酸化水平没有发生变化，表明肉桂醛可以促进线粒体自噬，但对Drp1的磷酸化水平没有抑制作用，即对于线粒体分裂没有抑制效果。而Mdivi-1为商业化的Drp1抑制剂，可以抑制线粒体的裂变。因此，肉桂醛和Drp1抑制剂两者联用可以通过作用不同的靶点而发挥协同作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种抑制巨噬细胞活化的组合物，其特征在于，所述组合物由肉桂醛和抑制剂Mdivi-1组成；所述肉桂醛和抑制剂Mdivi-1的摩尔比为（0.3~2.3）:（0.5~3.5）。

2.根据权利要求1所述的抑制巨噬细胞活化的组合物，其特征在于，所述肉桂醛和抑制剂Mdivi-1的摩尔比为（1~2）:（1~3）。

3.根据权利要求1或2所述的抑制巨噬细胞活化的组合物在制备抗炎制品中的应用。

4.根据权利要求3所述的抑制巨噬细胞活化的组合物在制备抗炎制品中的应用，其特征在于，所述巨噬细胞为小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7。

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