CN113484405A - 一种亚微反应器的制备方法及基于其的血清代谢物检测方法 - Google Patents
一种亚微反应器的制备方法及基于其的血清代谢物检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种亚微反应器的制备方法,包括如下步骤:步骤2.1:将3‑氨基苯酚APF溶解于去离子水中,并加入甲醛溶液和氨水溶液;步骤2.2:将步骤2.1的混合物在30℃条件下,反应30分钟;步骤2.3:将步骤2.2中的反应物进行离心洗涤,得到APF亚微材料。本发明还提供一种基于上述的亚微反应器的血清代谢物检测方法。本发明提供的亚微反应器作为基质材料,可以应用于小分子的检测,如氨基酸和糖醇类,可以克服传统基质的缺陷,快速、高通量、高灵敏度地对血清进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及血清代谢物检测技术领域,尤其涉及一种亚微反应器的制备方法及基于其的血清代谢物检测方法。
背景技术
血液中生物标志物的筛选和检测是其生物医学应用的关键。在治疗监测的应用中,细胞生物标志物由于其固有限制(如循环肿瘤细胞分离方法复杂),因而无法实现在实际临床场景中的应用。此外,对于分子生物标志物(如细胞游离脱氧核糖核酸(cf-DNA)和碳水化合物抗原125(CA-125)等),虽然被广泛应用于癌症诊断和预后,但其反馈滞后、准确性不足60%,因此无法实现在化疗监测中的潜在应用。
值得注意的是,代谢生物标志物作为途径的最终产物,能够及时提供人体的生理状态,已初步应用于癌症治疗的监测。因此,血清小分子代谢物有望表征疾病的病理进展,并进一步应用于治疗检测过程,如化疗监测。
高效的血清代谢小分子检测需要依托于先进的技术平台。与核磁共振技术相比,质谱技术以高分辨率记录代谢物,并通过耦合串联质谱,提供了增强的分子鉴定能力。特别是,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)由于基质材料的引入,将检测灵敏度进一步提升至飞摩尔级。尽管传统有机基质在大分子检测(如蛋白质)方面取得了巨大成功,但由于低分子量端(<1000Da)中不需要的碎片以及与生物样品(如血清)不均匀的共结晶,阻碍了其在小代谢物检测方面的潜在应用。
因此,亟需构建新一代高性能亚微反应器作为基质材料,进而实现先进技术平台的构建。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是开发一种亚微反应器芯片材料用于检测血清中的代谢小分子,其对于实现高疾病治疗监测至关重要。
为实现上述目的,本发明提供了一种亚微反应器的制备方法,包括如下步骤:
步骤2.1:将3-氨基苯酚APF溶解于去离子水中,并加入甲醛溶液和氨水溶液;
步骤2.2:将步骤2.1的混合物在30℃条件下,反应30分钟;
步骤2.3:将步骤2.2中的反应物进行离心洗涤,得到APF亚微材料。
进一步地,直接将步骤2.2中的反应物进行离心,并采用去离子水洗涤,得到球形的APF亚微材料APF-sphere。
进一步地,还包括向步骤2.2中的反应物中加入丙酮溶液,在30℃条件下,反应180分钟;将反应物进行离心,并采用去离子水洗涤,得到碗形的APF亚微材料APF-bowl。
进一步地,将得到的所述APF-sphere分散在去离子水中,并加入氯金酸溶液,反应得到APF-sphere&Au。
进一步地,所述氯金酸溶液的加入量为2ml。
进一步地,将得到的所述APF-bowl分散在去离子水中,制备三份反应液,分别加入1.5、2和2.5ml氯金酸溶液中,反应得到APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2以及APF-bowl&Au-3。
进一步地,反应条件为在70℃条件下,反应10分钟。
本发明还提供一种根据上述的亚微反应器的血清代谢物检测方法,包括如下步骤:
(1)仪器与试剂的准备:将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测模式设置为正离子反射模式;
(2)将得到的APF-sphere&Au、APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2以及APF-bowl&Au-3分散在去离子水中,作为基质使用
(3)对血清样品进行比例稀释;
(4)在质谱靶板上进行样品制备,采用(2)中的所述基质,室温下干燥;
(5)对血清样品中的小分子进行检测;
(6)分析原始质谱图谱,并获得检测结果。
进一步地,检测分子量范围为小于1000Da。
进一步地,检测的物质包括氨基酸和糖醇。
系列亚微反应器芯片材料制备步骤简单,合成过程安全且产量较大,具有优越的成本效益。将优化的亚微反应器芯片材料作为激光解析电离飞行时间质谱的基底材料,相较于传统的有机基质材料,在低分子量段(m/z<400)可实现血清代谢小分子物质的灵敏检测。优化后的亚微反应器芯片材料仅0.1微升的血清样本,即可实现血清的高通量(约120000个数据点,300多个代谢特征)、快速(小于1分钟)检测。基于以上显著优势,亚微反应器芯片材料有望实现临床大范围的血清检测,并应用于治疗检测中并筛选出相应的治疗疗效代谢生物标志物。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的APF-sphere的透射电子显微镜图;
图2是本发明的一个较佳实施例的APF-bowl扫描电子显微镜表征图;
图3是本发明的一个较佳实施例的APF-sphere&Au扫描电子显微镜表征图;
图4是本发明的一个较佳实施例的APF-bowl&Au扫描电子显微镜表征图;
图5是实施例一中采用系列亚微反应器芯片材料(包括APF-sphere&Au、APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2以及APF-bowl&Au-3)用于MALDI-TOF-MS检测亮氨酸标准分子的五次独立实验的统计柱状图结果;
图6是实施例二中采用系列亚微反应器芯片材料(包括APF-sphere&Au、APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2以及APF-bowl&Au-3)用于MALDI-TOF-MS检测甘露醇标准分子的五次独立实验的统计柱状图结果;
图7是实施例三中基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测血清低分子量段的质谱图;
图8是实施例四中基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测不同血清样本的小分子,在MATLAB进行化疗前和化疗后的监测。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
本发明的技术方案如下:
步骤1:仪器与试剂的准备:将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测模式设置为正离子反射模式;
步骤2:制备亚微反应器,包括以下步骤;
步骤2.1:将0.1克3-氨基苯酚(APF)溶解于30毫升去离子水中,加入0.1毫升甲醛溶液和0.1毫升氨水溶液;
步骤2.2:步骤2.1的混合物在30℃条件下,反应30分钟;
步骤2.3:将步骤2.2中的反应物进行离心,并采用去离子水洗涤五次,得到球形的APF亚微材料(APF-sphere);
步骤2.4:向步骤2.2中的反应物中加入40毫升丙酮溶液,在30℃条件下,反应180分钟;
步骤2.5:将步骤2.4中的反应物进行离心,并采用去离子水洗涤五次,得到碗形的APF亚微材料(APF-bowl);
步骤2.6:将步骤2.3得到的APF-sphere,取10毫克分散在10毫升去离子水中,并加入2毫升质量浓度为1%的氯金酸溶液;
步骤2.7:将步骤2.5得到的APF-bowl,取10毫克分散在10毫升去离子水中,制备三份上述反应液,并分别加入1.5、2、2.5毫升质量浓度为1%的氯金酸溶液;
步骤2.8:将步骤2.6和步骤2.7中分别得到的反应物在70℃条件下,反应10分钟,离心水洗,依次得到APF-sphere&Au、APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2以及APF-bowl&Au-3;
步骤2.9:将步骤2.8中得到的APF-sphere&Au、APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2、以及APF-bowl&Au-3分散在去离子水中,作为基质使用;
步骤3:对血清样品进行比例稀释,10倍比例稀释;
步骤4:在质谱靶板上进行样品制备,采用步骤2.9中基质,优选采用APF-bowl&Au-2,室温下干燥;
步骤5:对血清样品中的小分子进行检测;
步骤6:分析原始质谱图谱,并获得检测结果。
进一步地,采用碗形结构、以及2毫升氯金酸反应所得的APF-bowl&Au-2质谱检测性能最佳。
进一步地,检测分子量范围为小于1000Da。
进一步地,检测的物质包括氨基酸和糖醇。
表征所用仪器
采用Hitachi S-4800扫描电子显微镜获取SEM结果。采用JEOL JEM-2100F透射电子显微镜获取TEM结果。
表征结果为:
如图1至图4所示,所制备的APF-sphere、APF-bowl表面光滑,形态均一,而经过氯金酸修饰后的APF-sphere&Au和APF-bowl&Au表面粗糙,可以看到明显的金颗粒。
实施例一:亮氨酸标准品的检测
仪器与试剂的准备:将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测模式设置为正离子反射模式;所制备亚微反应器基质材料,包括APF-sphere&Au、APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2以及APF-bowl&Au-3;配置好亮氨酸标准溶液;
在质谱靶板上进行样本制备,室温下干燥;
在质谱仪下进行检测,并对质谱图像进行分析,如图5所示。
实施例二:甘露醇标准品的检测
仪器与试剂的准备:将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测模式设置为正离子反射模式;所制备亚微反应器基质材料,包括APF-sphere&Au、APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2、以及APF-bowl&Au-3;配置好甘露醇标准溶液;
在质谱靶板上进行样本制备,室温下干燥;
在质谱仪下进行检测,并对质谱图像进行分析,如图6所示;
实施例三:血清样本小分子的检测
仪器与试剂的准备:将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测模式设置为正离子反射模式;所制备优化的亚微反应器APF-bowl&Au-2作为基质材料;
按一定比例稀释血清样本;
在质谱靶板上进行样本制备,室温下干燥;
在质谱仪下进行检测,并对质谱图像进行分析,如图7所示。
实施例四:化疗前后血清样本的检测及监测
仪器与试剂的准备:将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测模式设置为正离子反射模式;所制备优化的亚微反应器APF-bowl&Au-2作为基质材料;MATLAB和Metaboanalyst分析软件;
按一定比例稀释血清样本;
在质谱靶板上进行样本制备,室温下干燥;
在质谱仪下进行检测,收集质谱数据;
对质谱数据进行预处理,并采用MATLAB分析软件进行分析,如图8。
总而言之,本发明提供了一种新型的亚微反应器芯片作为基质,用于辅助将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),提高其检测性能,尤其是针对复杂的血清样本。通过对亚微反应器芯片材料的形态结构(球性、碗形)和组成成分(金负载含量)进行调控,从而克服传统基质的缺陷,实现快速、高通量、高灵敏度的血清代谢小分子检测。
亚微反应器芯片材料制备简易,合成过程安全且产量较高。通过对亚微反应器芯片材料进行优化,优化后负载金纳米颗粒的APF-bowl&Au作为MALDI-TOF-MS检测中的基质材料,可以解决传统有机基质在低分子量段的干扰以及热点效应等固有缺陷,实现血清样本的高效分析。本发明中,亚微反应器芯片材料可以辅助质谱实现血清样本中的小分子代谢物检测,且此方法检测灵敏度高、通量高,有应用于临床的潜力。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种亚微反应器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤2.1:将3-氨基苯酚APF溶解于去离子水中,并加入甲醛溶液和氨水溶液;
步骤2.2:将步骤2.1的混合物在30℃条件下,反应30分钟;
步骤2.3:将步骤2.2中的反应物进行离心洗涤,得到APF亚微材料。
2.如权利要求1所述的亚微反应器的制备方法,其特征在于,直接将步骤2.2中的反应物进行离心,并采用去离子水洗涤,得到球形的APF亚微材料APF-sphere。
3.如权利要求1所述的亚微反应器的制备方法,其特征在于,还包括向步骤2.2中的反应物中加入丙酮溶液,在30℃条件下,反应180分钟;将反应物进行离心,并采用去离子水洗涤,得到碗形的APF亚微材料APF-bowl。
4.如权利要求2所述的亚微反应器的制备方法,其特征在于,将得到的所述APF-sphere分散在去离子水中,并加入氯金酸溶液,反应得到APF-sphere&Au。
5.如权利要求2所述的亚微反应器的制备方法,其特征在于,所述氯金酸溶液的加入量为2ml。
6.如权利要求3所述的亚微反应器的制备方法,其特征在于,将得到的所述APF-bowl分散在去离子水中,制备三份反应液,分别加入1.5、2和2.5ml氯金酸溶液中,反应得到APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2以及APF-bowl&Au-3。
7.如权利要求4和6所述的亚微反应器的制备方法,其特征在于,反应条件为在70℃条件下,反应10分钟。
8.根据权利要求1-7所述的亚微反应器的血清代谢物检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)仪器与试剂的准备:将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测模式设置为正离子反射模式;
(2)将得到的APF-sphere&Au、APF-bowl&Au-1、APF-bowl&Au-2以及APF-bowl&Au-3分散在去离子水中,作为基质使用
(3)对血清样品进行比例稀释;
(4)在质谱靶板上进行样品制备,采用(2)中的所述基质,室温下干燥;
(5)对血清样品中的小分子进行检测;
(6)分析原始质谱图谱,并获得检测结果。
9.根据权利要求8所述的亚微反应器的血清代谢物检测方法,其特征在于,检测分子量范围为小于1000Da。
10.根据权利要求8所述的亚微反应器的血清代谢物检测方法,其特征在于,检测的物质包括氨基酸和糖醇。
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