CN113533491A - 多角星形状Au@ZnO纳米复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料及其制备方法和应用，该多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料在MALDI MS检测中的应用，还可以作为基质材料在小分子代谢物和血清代谢物检测中应用，本发明的Au@ZnO纳米复合材料结合贵金属和半导体材料两者的优势，提高检测效率并降低成本；本发明特殊多角星形状的复合纳米颗粒，与传统核壳纳米材料或者球状纳米材料相比，在尖端和凹陷处增强了电磁场，有助于增强表面等离子共振，提高了激光解吸电离效应，同时有助于提高比表面积增强小分子代谢物的吸附性，故多角星形的Au@ZnO复合纳米材料用于LDI MS中的小分子代谢物和血清代谢物的检测。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和电离质谱技术领域，具体涉及一种基于星形Au@ZnO纳米复合材料及其制备方法，以及在在激光解吸电离质谱中进行小分子和血清代谢物检测的应用。
背景技术
生物标志物(蛋白质、核酸以及代谢物等)检测在体外诊断中发挥着越来越重要的作用。其中代谢物处于生物通路的最末端，与生物体表型关联性最强。因此，代谢物检测分析在生物医学研究以及临床应用中有着巨大前景。目前生物化学分析以及气相/液相色谱-质谱联用技术是代谢物检测的最主要手段，然而，这些方法需要对样品进行脱盐、除蛋白、衍生化、浓缩等复杂的预处理，才能实现代谢物检测。
基质辅助激光解吸电离质谱(matrix-assisted laser desorption/ionizationmass spectrometry,MALDI MS)在代谢物检测中发挥着越来越重要的作用，相比于传统的代谢物检测分析方法，MALDI MS无需样品预处理，在极少量样本前提下，即可实现代谢物快速、灵敏和高通量检测。然而，MALDI MS中常用的传统有机基质因在低分子量区有大量碎裂峰，不适用于小分子代谢物检测。
近年来，新型无机纳米材料，尤其贵金属纳米材料，因其具有较强的紫外吸收、良好的的光电效应、热效应、表面等离激元效应等特点，被证实是一种卓越的基质材料。然而，目前大多数贵金属基质是单金属纳米颗粒(如Au、Pt和Pd)或其双金属合金(如Pd和Au)，成本高，紫外波段吸光度小，辅助电离效果差，导热率高，因此质谱检测效果差；半导体材料价格低，如ZnO等，但是导电性差，激发能垒高。
血清代谢物的检测方法目前主要有生化方法(如免疫荧光)和GC/LC MS，生化方法通常一次只能检测一种物质，且容易受背景信号的干扰，灵敏度和特异性低。GC/LC MS可以做到多种代谢物的同时检测，灵敏度高，特异性强。但GC/LC MS存在样本预处理复杂、检测时间长、价格昂贵等问题。难以实现对血清样本的低成本、高通量检测，用于临床比较困难。相较于以上两种质谱方式，基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI MS)，简化了样本处理步骤，可实现代谢物的快速、灵敏和高通量检测。
基质是MALDI MS的核心组成部分。传统的有机基质在小分子量端(m/z<500)有强烈的背景干扰信号，使得小分子代谢物检测灵敏度降低，并且在实际的生物样本体系中，血浆样品中存在着各种不同的生物大分子，且不同的酸碱度以及高盐度都会对小分子的检测带来阻碍，因此传统的有机基质难以满足小分子的检测需求。无机纳米材料(如碳基、硅基、贵金属材料等)虽然可以用于小分子代谢物的检测，但在对复杂生物样本检测时，仍然存在局限性。因此急需开发一种新的纳米材料用于复杂生物样本(血清)代谢物的检测。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的之一是提供一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料在MALDI MS中的应用。
本发明的目的之二是提供一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料在小分子代谢物中的应用。
本发明的目的之三是提供一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料在血清代谢物中的应用
本发明的目的之四是提供一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备方法。
本发明的目的之五是提供一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料。
为达到上述目的之一，本发明的解决方案是：
一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料在基质辅助激光解吸电离质谱检测中的应用。
为达到上述目的之二，本发明的解决方案是：
一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料在小分子代谢物的基质辅助激光解吸电离质谱检测中的应用。
优选地，小分子代谢物中的小分子选自脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、蔗糖和葡萄糖中的一种以上。
为达到上述目的之三，本发明的解决方案是：
一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料在血清代谢物的基质辅助激光解吸电离质谱检测中的应用。
为达到上述目的之四，本发明的解决方案是：
一种根据上述的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备方法，其包括如下步骤：
(1)、纳米金溶液的制备：水合四氯金酸溶液搅拌加热至120±1℃后，加入二水合柠檬酸钠，恒温下搅拌30±0.1min，冷却至室温备用；
(2)、氧化锌的制备：将醋酸锌溶液加入氢氧化钠溶液中，加热至60±1℃且保温1±0.1h，离心收集沉淀，洗涤，在50±1℃下干燥备用；
(3)、多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备：醋酸锌溶液和纳米金溶液混合，得到混合液，在混合液内加入氢氧化钠溶液，加热至60±1℃且保温1±0.1h，离心收集沉淀，洗涤，在50±1℃下干燥备用。
优选地，步骤(1)中，搅拌的转速为800±10rpm。
优选地，步骤(2)和步骤(3)中，离心的转速为1000±10rpm。
为达到上述目的之五，本发明的解决方案是：
一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料，其由上述的制备方法得到。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明与有机基质相比，Au@ZnO纳米复合材料作为激光解吸电离质谱的基质，可以解决传统有机基质的热点效应以及在低分子量区有干扰的问题。与无机基质相比，本发明的Au@ZnO纳米复合材料却能结合贵金属和半导体材料两者的优势，通过肖特基效应提高热载流子产生效应，具有高度的可调控性，通过两者的协同效应提高检测效率并降低成本。
第二、本发明特殊多角星形状的复合纳米颗粒，与传统核壳纳米材料或者球状纳米材料相比，在尖端和凹陷处增强了电磁场，有助于增强表面等离子共振，提高了激光解吸电离效应，同时有助于提高比表面积增强小分子代谢物的吸附性，故多角星形的Au@ZnO复合纳米材料用于LDI MS中的小分子代谢物和血清代谢物的检测。
附图说明
图1为现有技术中ZnO和本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的表征图(图1a为现有技术中纳米ZnO的扫描电镜图，图1b为本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的扫描电镜图，图1c为本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的线扫能量色散x射线(EDX)分析图，图1d为本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的元素分布图，图1e为ZnO和本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的EDX结果图，图1f为Au、ZnO和本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的紫外可见吸收光谱图，图1g为本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的选区电子衍射图)。
图2为本发明的实施例中多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的MALDI MS检测中4种标准小分子的质谱图(图2a为葡萄糖(Glucose)，图2b为蔗糖(Saccharose)，图2c为脯氨酸(Proline)，图2d为赖氨酸(Lysine))。
图3为本发明的实施例中多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的MALDI MS检测中4种标准小分子和血清代谢物的质谱图(图3a为含有氯化钠的四种代谢物混合溶液，图3b为含有牛血清白蛋白的四种代谢物混合溶液，图3c为含有CHCA的四种代谢物混合溶液，图3d为含有CHCA的四种代谢物混合溶液，图3e是标准血清的质谱检测图)。
具体实施方式
本发明提供了一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料及其制备方法和应用。
<多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的应用>
本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料可以在MALDI MS检测中得以应用。
进一步地，本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料在小分子代谢物的MALDI MS检测中得以应用。
其中，小分子代谢物中的小分子选自脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、蔗糖和葡萄糖中的一种以上。
进一步地，本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料在血清代谢物的MALDI MS检测中得以应用。
<多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备方法>
本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备方法包括如下步骤：
(1)、采用柠檬酸还原法合成纳米金溶液：水合四氯金酸溶液搅拌加热至120±1℃后，加入二水合柠檬酸钠，恒温下搅拌30±0.1min，冷却至室温备用；
(2)、氧化锌的制备：将醋酸锌溶液加入氢氧化钠溶液中，搅拌加热至60±1℃且保温1±0.1h，弃去上清液，再用乙醇和水分别洗涤三次，在50±1℃下干燥备用；
(3)、多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备：醋酸锌溶液和纳米金溶液混合，得到混合液，在混合液内加入氢氧化钠溶液，继续搅拌加热至60±1℃且保温1±0.1h，弃去上清液，再用乙醇和水分别洗涤三次，在50±1℃下干燥备用。
其中，在步骤(1)中，搅拌的转速为800±10rpm。
在步骤(2)和步骤(3)中，离心的转速为1000±10rpm。
<多角星形状Au@ZnO纳米复合材料>
由上述的制备方法得到本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料。
总之，本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质辅助激光解吸电离质谱用于小分子代谢物和血清代谢物的检测。首先，由于其复合了半导体氧化锌和金属金，通过肖特基效应增强了光电效应和热载流子生成效率，有助于待测物的电离；其次，由于其特殊的多角星形状，在尖端和凹陷处增强了电磁场，有助于增强表面等离子共振，同时增加了比表面积，有助于吸附待检测的代谢物小分子；最后该纳米复合材料在355nm波长处有很强的吸收，与基质辅助激光解吸电离质谱的光源波长相匹配，因此通过简单的预处理，简化了样本处理步骤，提高了LDI效率，克服了传统GC/LC MS需要复杂样本预处理的过程，也克服了传统LDI MS基质的缺陷，实现了小分子代谢物和血清代谢物的快速、灵敏和高通量检测。
本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料制备方法简单，形貌均一，该纳米粒子作为LDI MS的基质，可以解决传统基质存在的问题，如低分子量区的背景干扰。本发明中血清样本只需1.5μL血清提取液，就可高效、快速地检测血清中的小分子代谢物。这种检测方法灵敏度高、成本低、检测通量高，满足了临床血清检测的需求，有应用于临床的潜力。
表征所用仪器：
利用AuCy UV1900分光光度计和马尔文Zetasizer NanZS90获得了纳米材料的消光光谱和表面电荷值。
采用Hitachi SU8100获取扫描电子显微镜图片，用JEOL JEM-2100F获得透射电子显微镜图片、线扫能量色散X光谱和选取电子衍射图谱。
表征结果为：
从图1a和图1b可以看出纳米ZnO和纳米Au@ZnO都是多角星形结构，Au@ZnO(图1b)明显角更多，形貌也更均一，从线扫分析(图1c，从上至下依次为Zn、O和Au)和元素分布分析(图1d)来看，得到的Au@ZnO包含Zn、O和Au三种元素，证明了纳米金对氧化锌的形貌影响，由于金属种子粒径较小(30nm)，形成了像花瓣一样的多角星形结构。图1e所示的能量色散x射线光谱进一步记录了金属含量从0％增加到1.51％(按重量计算)，表明结果与其他表征一致。紫外-可见光谱分析显示Au@ZnO在355nm处的吸收最高，与质谱的Nd:YAG激光器的波长一致，有利于质谱检测(图1f)。进一步表征了p-ZnO复合材料的晶体结构，与锌铁矿的[1,0,3]、[1,0,2]和[0,0,2]的晶面相关(图1g)。综上所述，等离子体ZnO复合材料具有独特的结构和成分，有LDI MS检测的潜力。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例：
本实施例的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备方法包括如下步骤：
(1)、纳米金溶液的制备：将10.45mg水合四氯金酸溶解在100mL烧瓶的去离子水中，剧烈搅拌下(800rpm)加热至120℃后，加入2.0mL、1wt％二水合柠檬酸钠，保持120℃搅拌30min，冷却至室温备用。
(2)、ZnO的制备：将醋酸锌溶液(39mL、0.01mol/L)加入氢氧化钠溶液(65mL、0.03mol/L)中，加热至60℃且保温1h，然后以10000rpm下离心10min，收集沉淀，弃去上清液，再用乙醇和水分别洗涤三次，得到的沉淀在50℃烘箱中干燥备用。
(3)、多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备：醋酸锌溶液(39mL、0.01mol/L)和39mL纳米金溶液混合搅拌2min(600rpm)，得到混合液，在混合液内加入氢氧化钠溶液(65mL、0.03mol/L)，继续搅拌并加热至60℃且保温1h，然后以10000rpm下离心10min，收集沉淀，弃去上清液，再用乙醇和水分别洗涤三次，得到的沉淀在50℃烘箱中干燥备用。
<实验>
将实施例得到的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料进行如下实验。
LDI MS检测：
小分子代谢物的检测：将标准品小分子(脯氨酸、赖氨酸、蔗糖和葡萄糖)用超纯水配成1mg/mL的溶液。
耐盐检测样本是在四种标准品小分子(脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和葡萄糖)的混和溶液中加入氯化钠，最终氯化钠以及小分子的终浓度分别是0.2mg/mL和1mg/mL。对于耐蛋白检测，检测样本则是在白蛋白与标准品小分子(脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和葡萄糖)的混合物，白蛋白和小分子的终浓度都是1mg/mL，从而探索不同基质在高盐浓度和蛋白质中的检测效果。
在一个典型的LDI MS实验中，将Au@ZnO纳米复合材料以1mg/mL的浓度分散在水中作为基质。对于Au纳米颗粒和ZnO纳米颗粒作为基质的情况下，同样以1mg/mL的浓度分散在水中。将1.5μL的分析物溶液(标准小分子溶液或标准血清)滴在抛光型的靶板上，室温干燥后覆盖上1.5μL的基质悬浮液，干燥后进行LDI质谱分析。质谱检测采用AutoFlex TOF/TOF质谱仪(Bruker，德国)，装有Nd:YAG激光器(2kHz，355nm)。采集在正反射离子模式下进行，采用延迟提取，重复频率为1000Hz，加速电压为20千伏。本实验的延迟时间优化为250ns。在所有LDI MS实验中，每次分析的激光射击数为2000次。
<实验1>
小分子物质的质谱检测及耐盐耐蛋白测试：
(1)、仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离质谱，采用阳离子反射模式检测；将Au@ZnO纳米复合材料配制成悬浮液，并配制单一的标准品小分子(葡萄糖、蔗糖、脯氨酸、赖氨酸)溶液以及混和标准品(脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和葡萄糖)溶液和高浓度盐和蛋白的混合溶液；
(2)、在质谱靶板上进行样本制备，室温下干燥；
(3)、在质谱仪下进行检测，并对质谱图像进行分析，如图2所示，本实施例的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料，即p-ZnO的四种典型小分子代谢物(葡萄糖、蔗糖、脯氨酸和赖氨酸)的检测效果比纯的氧化锌(ZnO)纳米颗粒效果更好，尤其是蔗糖，质谱信号相差17倍多，因此可以说多角星形状Au@ZnO纳米复合材料(p-ZnO)比氧化锌更适用于LDI质谱检测。
在耐盐耐蛋白实验中，如图3a和3b所示，p-ZnO在高盐和高蛋白浓度下仍能很好地检测这四种代谢物的混合物。
<实验2>
血清代谢物的质谱检测：
(1)、仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离质谱，采用阳离子反射模式检测；将Au@ZnO纳米复合材料配制成悬浮液检测标准血清；
(2)、在质谱靶板上进行样本制备，室温下干燥；
(3)、在质谱仪下进行检测，并对质谱图像进行分析，生理条件下的血浆含有各种无机盐和蛋白质，因此要考虑基质在质谱检测中的耐盐耐蛋白性质，如图3所示，图3a是含有0.2mg/mL氯化钠的四种代谢物混合溶液(脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和葡萄糖均为1mg/mL)的质谱检测结果，由图可知，本实施例的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料能在高盐浓度条件下将四种代谢物全部检测出来，与图3c中CHCA作为基质只检测出了精氨酸的加氢峰，因此四种代谢物混合溶液(脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和葡萄糖均为1mg/mL)具有较好耐盐性。图3b则是加入了1mg/mL的牛血清白蛋白的四种代谢物混合溶液(脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和葡萄糖均为1mg/mL)，由图3b可知，四种代谢物也能被本实施例中的多角星形状Au@ZnO纳米基质检测出来，图3d中CHCA也只检测出了精氨酸的加氢峰，因此多角星形状Au@ZnO纳米复合材料具有较好的耐蛋白性质。
由此可知，CHCA对于高盐和高蛋白混合溶液中的代谢物检测效果较差，只检测出了精氨酸的加氢峰，而本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料能将四种氨基酸都检测出来，证明本发明的多角星形状Au@ZnO纳米复合材料与传统的有机基质CHCA相比更适用于复杂生物样本的检测，背景干扰更低。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料在基质辅助激光解吸电离质谱检测中的应用。
2.一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料在小分子代谢物的基质辅助激光解吸电离质谱检测中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述小分子代谢物中的小分子选自脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、蔗糖和葡萄糖中的一种以上。
4.一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料作为基质材料在血清代谢物的基质辅助激光解吸电离质谱检测中的应用。
5.一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、纳米金溶液的制备：水合四氯金酸溶液搅拌加热至120±1℃后，加入二水合柠檬酸钠，恒温下搅拌30±0.1min，冷却至室温备用；
(2)、氧化锌的制备：将醋酸锌溶液加入氢氧化钠溶液中，加热至60±1℃且保温1±0.1h，离心收集沉淀，洗涤，在50±1℃下干燥备用；
(3)、多角星形状Au@ZnO纳米复合材料的制备：醋酸锌溶液和所述纳米金溶液混合，得到混合液，在所述混合液内加入氢氧化钠溶液，加热至60±1℃且保温1±0.1h，离心收集沉淀，洗涤，在50±1℃下干燥备用。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述搅拌的转速为800±10rpm。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)中，所述离心的转速为1000±10rpm。
8.一种多角星形状Au@ZnO纳米复合材料，其特征在于：其由权利要求5-7任一项所述的制备方法得到。
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