CN113480738A - 一种高分子胶束材料、其靶向药物及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高分子胶束材料、其靶向药物及其制备与应用，其中所述高分子胶束材料具有式(1)所示的化学式，本发明的高分子胶束材料在侧链接枝有硝基咪唑类乏氧响应基团，并在一些具体实施方式中进一步进行了表面葡萄糖靶分子修饰，使其不仅具有主动靶向肿瘤的性能，同时具有乏氧微环境响应，可在乏氧微环境下释放药物，实现高效的药物递送与肿瘤治疗，

Description

一种高分子胶束材料、其靶向药物及其制备与应用

技术领域

本发明涉及医用高分子材料的技术领域，特别涉及靶向药物递送材料的技术领域。

背景技术

癌症，在医学上泛指所有的恶性肿瘤。根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，全球新发癌症病例就有1929万例，而中国的新发病例约占其中的五分之一；全球癌症死亡人数996万例，中国癌症死亡人数就有300万例。癌症是现今社会威胁人类生命健康的一大杀手，也是现代医疗领域面临的巨大挑战之一。目前，传统化疗药物对肿瘤细胞没有选择性，存在疗效差，对正常器官和组织造成毒副作用等缺点。因此寻求对肿瘤治疗的高效、低毒、靶向性药物制剂成为医药学界的研究热点。

自上个世纪以来，以纳米技术为基础发展起来的纳米药物递送系统在肿瘤研究领域得到了广泛的关注。纳米药物利用其特殊的尺寸效应，基于肿瘤组织中高渗透和滞留效应(enhancedpermeability and retention effect，EPR效应)，通过可渗透的脉管系统和有限的淋巴引流，显示出在肿瘤中的选择性积累。与传统的小分子药物相比，纳米药物载体的优势在于可有效避免血液循环中药物的提早释放，降低毒副作用、提高靶向性，进一步增加生物对难溶药物的利用度等。常见的新型纳米药物递送系统有脂质体、无机纳米材料和聚合物类纳米材料等。其中，由亲水性外壳和疏水性内核组成的聚合物胶束，因具有粒径小、稳定性高、滞留时间长、生物相容性好的特性，使其作为目前最有效的递药系统之一，具有良好的发展前景。

如Maeda等于20世纪80年代证明可以利用实体瘤的EPR效应，将聚合物胶束被动靶向至肿瘤部位。人体大部分肿瘤组织由于生长旺盛，其毛细血管有所缺陷，形成200-600nm的有效孔径。大量的研究表明利用EPR效应可以将大分子药物和聚合物纳米粒等制剂可通过选择粒径来选择性滞留在实体瘤部位。过去的几十年里，聚合物胶束作为纳米载体在抗癌药物的递送中得到了非常广泛应用。胶束包载可极大地提升难溶性治疗药物(如喜树碱、紫杉醇和阿霉素等)的溶解度和体内的循环时间并可通过EPR效应实现对肿瘤组织的被动靶向。

或如Kataoka课题组在1980年开始设计的自组装聚合物胶束用于包载具有生物活性的分子用于癌症的诊断和治疗，其设计基于聚乙二醇-b-聚氨基酸(PEG-b-PAA)材料自组装形成的聚合物胶束中，内核的聚氨基酸部分可用于药物的包载和控制释放，而亲水的PEG段则可形成致密柔软的外壳，延长药物在血液中的循环时间，并通过EPR效应富集到肿瘤部位发挥药效。

然而，近年来众多研究表明肿瘤的某些组织学特征，如血管成熟度、血管压迫程度、肿瘤丰富的基质以及肿瘤硬度，均在不同程度上降低了EPR效应的效率，因此，由于被动靶向的低效性，开发主动靶向肿瘤的策略成为了近年来的一个研究热点，它旨在纳米药物的基础上对其进行表面的靶向修饰，连接上针对特定肿瘤生物标志物的配体从而实现更为有效的治疗。

乏氧是多数实体瘤的一大特征，快速生长的肿瘤细胞需要从周围血管中吸收更多的氧气及营养物质以满足其生长繁殖的需要。然而，在实体瘤内部，肿瘤细胞的生长速度远大于其内部血管的产生速度，这样在实体瘤中就产生了无血管的缺氧区域。在缺氧的肿瘤微环境中，肿瘤细胞改变其新陈代谢导致细胞增殖减缓甚至完全抑制。相对静息的细胞状态可以改变细胞对外部辐射及药物的响应，使肿瘤细胞对放疗及治疗药物不敏感，导致药物的细胞毒性降低从而使肿瘤在治疗的过程中产生耐药性。此外，缺氧引起肿瘤细胞适应性地改变其基因和蛋白的表达，最终导致肿瘤细胞代谢异常，这也激化了肿瘤的恶性生长和治疗抵抗。以放疗为例，为了达到相同的治疗效果，在乏氧环境中甚至需要高于正常氧情况下3-4倍的放疗剂量，这也增加了肿瘤细胞发生放疗抵抗的风险。另外，光动力疗法作为一种氧依赖性疗法，其肿瘤杀伤效果依赖于光敏剂催化肿瘤内部的氧气产生具有细胞毒性的单线态氧(ROS)，然而肿瘤的乏氧环境使得光敏剂不能充分发挥作用，进而限制了PDT的疗效。

传统的胶束材料未考虑在乏氧环境下的治疗问题，也难以对乏氧环境产生调控效果。

总的来说，传统的胶束材料型纳米药物具有以下一些缺陷：

(1)传统的纳米药物大多利用肿瘤组织的EPR效应而实现在肿瘤组织的被动靶向富集。然而，不同肿瘤组织的EPR效应大不一样，即使是同一肿瘤在不同的发展阶段也具有不同程度的EPR效应，通过该效应进行治疗的药物整体来看肿瘤靶向效果不足，肿瘤部位药物蓄积量较低；

(2)传统的纳米药物对肿瘤细胞不具有选择性，亲和力较低；

(3)由于肿瘤内部环境复杂，如乏氧环境的存在，传统的药物存在治疗困难，疗效欠佳等问题。

(4)现有技术中缺少能调控肿瘤乏氧微环境，改善乏氧肿瘤治疗效果的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有肿瘤靶向功能，同时又具有响应和调控肿瘤乏氧微环境的新型高分子纳米胶束材料。

本发明的目的还在于提供含有上述新型高分子纳米胶束材料的靶向药物，及两者的制备方法与应用方法。

本发明首先公开了如下的技术方案：

一种高分子胶束材料，其具有以下的化学式：

其中，m为聚乙二醇的重复单元数，其范围为44-273；

n为聚天冬氨酸的重复单元，其范围为60-100；

x为未被2-硝基咪唑(NIDH)基团修饰的重复单元，其范围为20-30；

y为2-硝基咪唑(NIDH)基团修饰的重复单元，其范围为50-75；

R选自巯基葡萄糖或H。

优选的，R为巯基葡萄糖，该高分子胶束材料具有以下化学式：

本发明进一步提供了上述高分子胶束材料的制备方法：其包括：

获得含有聚乙二醇及聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段的原料高聚物的有机溶液；

将所述原料高聚物的有机溶液进行脱苄基反应，获得含有聚乙二醇及聚天冬氨酸嵌段的共聚物；

将所述共聚物通过EDC/NHS反应进行2-硝基咪唑基团接枝，得到所述高分子胶束材料；

其中，所述原料高聚物选自葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物。

根据本发明的一些具体实施方式，所述原料高聚物的有机溶液通过将所述原料高聚物溶于有机溶剂获得，所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜中的一种或多种；优选的，该有机溶剂选自乙腈。

根据本发明的一些具体实施方式，所述脱苄基反应包括：将所述原料高聚物的有机溶液与强碱水溶液进行室温反应1.5-2.5h。

根据本发明的一些具体实施方式，所述的强碱水溶液选自KOH水溶液和/或NaOH水溶液，优选为NaOH水溶液。

根据本发明的一些具体实施方式，所述EDC/NHS反应包括：将所述含有聚乙二醇及聚天冬氨酸嵌段的共聚物溶于pH为5.5-6.5的缓冲液，在室温下反应20-28h。

根据本发明的一些具体实施方式，所述缓冲液选自磷酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中的一种或多种，优选为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。

根据本发明的一些具体实施方式，所述葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物通过在马来酰亚胺-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)的马来酰亚胺端连接巯基葡萄糖的点击反应得到。

本发明进一步提供了一种靶向药物，其含有上述高分子胶束材料，和/或含有通过上述制备方法制备得到的高分子胶束材料，及负载于所述胶束材料内的治疗药物。

在该方案中，所述治疗药物可为亲水性药物和/或疏水性药物，可为化学药物和/或生物药物。

根据本发明的一些具体实施方式，所述治疗药物选自顺式-二氯二氨合铂和/或meso-四(4-磺酰苯基)卟吩氯化锰。

本发明进一步提供了上述靶向药物的一种制备方法，其包括：

获得所述高分子胶束材料的有机溶液和/或有机薄膜；

获得质量浓度为0.5-6.0mg/mL的所述治疗药物的有机和/或无机溶液；

按所述高分子胶束材料与所述治疗药物的质量比为1：(1-2)的配比，获得药物-胶束混合体系；

将所述药物-胶束混合体系进行恒温反应，其后除去游离药物及溶剂，并浓缩得到所述靶向药物。

优选的，所述高分子胶束材料包括通过原料高聚物葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物获得的葡萄糖-聚乙二醇-聚(天冬氨酸-2-硝基咪唑)(Glu-PEG-b-P(Asp-g-NIDH))和通过原料高聚物聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物获得的聚乙二醇-聚(天冬氨酸-2-硝基咪唑)(PEG-b-P(Asp-g-NIDH))。

更优选的，所述聚乙二醇-聚(天冬氨酸-2-硝基咪唑)与所述葡萄糖-聚乙二醇-聚(天冬氨酸-2-硝基咪唑)的质量比为(2.5-3.5):1。

根据本发明的一些具体实施方式，所述高分子胶束材料的有机溶液所用溶剂选自二甲亚砜、二氯甲烷、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

根据本发明的一些具体实施方式，所述治疗药物的有机和/或无机溶液所用溶剂选自水、二甲亚砜、四氢呋喃、甲醇、丙酮、乙二醇中的一种或多种。

根据本发明的一些具体实施方式，在使用所述高分子胶束材料的有机溶液的情况下，所述恒温反应包括在35-39℃、800-1200rpm的条件下反应60-80h。

根据本发明的一些具体实施方式，在使用所述高分子胶束材料的有机薄膜的情况下，所述恒温反应包括在35-39℃、100-200rpm的条件下反应10-24h。

根据本发明的一些具体实施方式，在使用所述治疗药物的有机溶液的情况下，所述恒温反应包括在常温下进行超声混合的过程。

本发明进一步提供了上述高分子胶束材料、上述靶向药物、根据上述高分子胶束材料制备方法制备得到的高分子胶束材料、根据上述靶向药物制备方法制备方法制备得到的靶向药物在乏氧环境下的癌治疗中的应用。

根据本发明的一些优选实施方式，所述应用为在乏氧肿瘤的放治疗联合治疗中的应用。

本发明的高分子胶束材料在高分子侧链接枝硝基咪唑类乏氧响应基团，并在一些具体实施方式中进一步进行了表面葡萄糖靶分子修饰，使得该高分子胶束可以通过肿瘤细胞过表达的葡萄糖转运体1(GLUT1)主动靶向肿瘤并响应乏氧微环境释放药物以实现高效的药物递送与肿瘤治疗。

在一些具体实施方式中，本发明获得了表面修饰有葡萄糖靶分子的、具有乏氧响应性能的胶束材料Glu-PEG-b-P(Asp-g-NIDH)，其可进一步与化疗药物顺铂(CDDP)以及调控肿瘤微环境药物meso-四(4-磺酰苯基)卟吩氯化锰(MnTPPS)在溶液中通过自组装，形成平均水合粒径在60-90nm之间的高分子胶束药物(如说明书附图2所示)。

本发明制备得到靶向药物，不仅具有肿瘤主动靶向功能，同时又具有响应和调控肿瘤乏氧微环境的功能，两者协同后，可进一步提高肿瘤的靶向性，增强肿瘤的治疗效果。

本发明的高分子胶束材料，特别是表面修饰有葡萄糖靶分子的高分子胶束材料及其进一步获得的靶向药物不仅能利用肿瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)将药物递送到肿瘤组织部位，还能利用肿瘤细胞过表达的葡萄糖转运体1(GLUT1)介导的受体-配体转运机制，与高分子胶束表面的葡萄糖结合，使药物高效地运送至肿瘤细胞内部；同时，当高分子胶束进入肿瘤后，在肿瘤乏氧环境下其侧链中2-硝基咪唑基团(NIDH基团)可被生物还原成亲水性2-氨基咪唑(AI)，响应肿瘤乏氧微环境，促进改高分子胶束的在肿瘤组织解离，实现药物的控制释放功能。

在更具体的一些实施方式中，该靶向药物中内部包载有抗肿瘤药物顺铂(CDDP)和调控肿瘤微环境药物meso-四(4-磺酰苯基)卟吩氯化锰(MnTPPS)，在响应乏氧肿瘤微环境释放药物时，MnTPPS可以与肿瘤微环境中的过氧化氢(H₂O₂)发生催化反应并释放出氧气来降低乏氧程度，调控乏氧微环境，从而改善放疗及化疗的抗肿瘤效果。

本发明具备以下有益效果：

本发明制得的高分子胶束材料具有肿瘤主动靶向、肿瘤乏氧响应，以及能调控肿瘤微环境等效果，可进一步改善现有药物抗肿瘤治疗效果，是一种多功能的的新型高分子胶束。

本发明制得的高分子胶束材料能够包载抗肿瘤药物如CDDP以及能调控肿瘤微环境药物如MnTPPS，实现了两者联合应用，能够缓解肿瘤的乏氧环境，提高放化疗的抗肿瘤效果。

本发明制得的高分子胶束材料及靶向药物能通过肿瘤细胞过表达的GLUT1使其被主动摄取，避免了被动靶向的低效性，使药物更加高效的递送至肿瘤部位，解决了现有药物靶向肿瘤细胞困难和向肿瘤细胞内药物递送不足等问题。

本发明制得的高分子胶束材料稳定性良好，药物包封率高，大大提高了药物递送的有效性与安全性。

本发明制得的高分子胶束材料及靶向药物，可与化疗/放疗/光热治疗/免疫治疗等治疗方式联用，并可应用于肿瘤治疗或其他疾病治疗领域，具有巨大的临床能力。

附图说明

图1为实施例所示葡萄糖配体型高分子胶束材料的核磁共振氢谱；

图2为实施例所示非主动靶向型高分子聚合物的核磁共振氢谱；

图3为实施例所述高分子胶束DLS结果，其中a为GluNPs；b为NPs；

图4为实施例所述高分子胶束TEM结果，其中a为GluNPs；b为NPs；

图5为实施例所述高分子胶束放治疗联合治疗细胞毒性评价，其中a为常氧条件下的细胞毒性结果；b为乏氧条件下的细胞毒性结果；

图6为实施例所述高分子胶束在乏氧条件下对乏氧及氧化应激水平影响；

图7为实施例所述高分子胶束在小鼠肿瘤中的积蓄；

图8为实施例所述高分子胶束在小鼠4T1皮下瘤模型的抑瘤实验结果，其中a为肿瘤体积变化曲线；b为小鼠体重变化曲线；

图9为实施例所述高分子胶束对原发性肺转移的抑制效果评价其中a为肺结节数统计，b为肺部H&E染色结果；

图10为实施例所述高分子胶束对肿瘤HIF-1α表达的影响。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明进行详细描述，但需要理解的是，所述实施例和附图仅用于对本发明进行示例性的描述，而并不能对本发明的保护范围构成任何限制。所有包含在本发明的发明宗旨范围内的合理的变换和组合均落入本发明的保护范围。

根据本发明的技术方案，包括所述高分子胶束材料的制备及所述靶向药物的制备在内的一些具体的制备方式包括以下步骤：

高分子材料的合成：

其一：葡萄糖配体型高分子胶束材料的制备，包括：

将葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)(Glu-PEG-b-PBLA)溶于有机溶剂乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜等中的一种或多种，得到混合溶液；

加入NaOH水溶液至所得混合溶液变为澄清，其后于室温下反应1-3h，将反应溶液在去离子水中透析20-25h后冻干，得到葡萄糖-聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG-b-PAsp)；

将所得Glu-PEG-b-PAsp溶于pH为5.5-6.5的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，在室温下反应20-28h，将反应溶液在去离子水中透析40-50h后冻干，得到目标产物葡萄糖配体型高分子胶束材料(Glu-PEG-b-P(Asp-g-NIDH))。

其二：非主动靶向型高分子聚合物的制备，包括：

将聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)(PEG-b-PBLA)溶于乙腈，得到混合溶液；

加入NaOH水溶液至所得混合溶液变为澄清，于室温下反应1.5-2.5h，将反应溶液在去离子水中透析20-25h后冻干，得到聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物PEG-b-PAsp；

将所得PEG-b-PAsp溶于pH5.5-6.5的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，在室温下反应20-28h，将反应溶液在用离子水中透析40-50h后冻干，得到目标产物非主动靶向型高分子聚合物(PEG-b-P(Asp-g-NIDH))。

其三：葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)的制备：

上述过程中所需葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)(Glu-PEG-b-PBLA)可进一步通过在马来酰亚胺-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)(Mal-PEG-b-PBLA)的马来酰亚胺端连接巯基葡萄糖的点击反应得到。

其四：主动靶向型药物的制备，包括：

称取质量配比为(2.5-3.5):1的PEG-b-P(Asp-g-NIDH)及Glu-PEG-b-P(Asp-g-NIDH)溶于二甲亚砜(DMSO)，得到高分子胶束材料的DMSO溶液；

将治疗药物如CDDP和/或MnTPPS溶于超纯水中，得到质量浓度为0.5-3.0mg/mL的药物水溶液；

在超声条件下，按胶束材料与药物的质量比为1：(1-2)的配比，将药物水溶液加入高分子聚合物的DMSO溶液中，并持续超声，得到胶束溶液；

将所得胶束溶液转移至恒温混匀仪中，于35-39℃、800-1200rpm的条件下反应60-80h；

通过截留分子量为35k-100kDa的超滤离心管加入纯水多次洗涤除去游离药物及溶剂DMSO，最后浓缩得到主动靶向型高分子胶束。

其五：非主动靶向型药物的制备，包括：

将PEG-b-P(Asp-g-NIDH)溶于二甲亚砜(DMSO)中，得到高分子胶束材料的DMSO溶液；

将治疗药物如CDDP和/或MnTPPS溶于超纯水中，得到质量浓度为0.5-3.0mg/mL的药物水溶液；

在超声条件下，按胶束材料与药物的质量比为1：(1-2)的配比，将药物水溶液加入高分子胶束材料的DMSO溶液中，并持续超声，得到胶束溶液；

将所得胶束溶液转移至恒温混匀仪中，于35-39℃、800-1200rpm的条件下反应60-80h；

通过截留分子量为35k-100kDa的超滤离心管加入纯水多次洗涤除去游离药物及溶剂DMSO，最后浓缩得到非主动靶向型药物。

其六：主动靶向型药物的另一种制备，包括：

称取质量配比为(2.5-3.5):1的PEG-b-P(Asp-g-NIDH)及Glu-PEG-b-P(Asp-g-NIDH)溶于二氯甲烷中，通过薄膜旋蒸法去除溶剂，得到高分子胶束材料薄膜；

将治疗药物如CDDP和/或MnTPPS溶于超纯水中，得到质量浓度为0.5-3.0mg/mL的药物水溶液；

按胶束材料与药物的质量比为1：(1-2)的配比，将药物水溶液加入高分子胶束材料薄膜中，通过摇床于35-39℃、100-200rpm的条件下反应10-24h，得到反应后的混合体系；

通过功率如150-250W的超声破碎仪处理所得混合体系2-3min，其后通过截留分子量为35k-100kDa的超滤离心管加入超纯水多次洗涤除去游离药物，最后浓缩得到主动靶向型药物。

其六：主动靶向型药物的另一种制备，包括：

称取质量配比为(2.5-3.5):1的PEG-b-P(Asp-g-NIDH)及Glu-PEG-b-P(Asp-g-NIDH)溶于二甲亚砜(DMSO)，得到高分子胶束材料的DMSO溶液；

将治疗药物如CDDP和/或MnTPPS溶于DMSO中，得到质量浓度为1.0-6.0mg/mL的药物溶液；

在超声条件下，按胶束材料与药物的质量比为1：(1-2)的配比，将药物溶液加入高分子聚合物的DMSO溶液中，并补加一些超纯水，持续超声，得到药物混合液；

通过截留分子量35k-100kDa的超滤离心管加入纯水多次洗涤除去药物混合液中的游离药物及溶剂DMSO，最后浓缩得到主动靶向型高分子胶束。

以下结合几个实施例对本发明做进一步描述。应充分说明的是，下述实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。其中以葡萄糖为配体的高分子胶束简称为GluNPs，非主动靶向型高分子胶束简称为NPs。

实施例1

葡萄糖配体型高分子胶束材料(Glu-PEG-b-P(Asp-g-NIDH))的制备：

将巯基化的葡萄糖(Glu-SH)及马来酰亚胺-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)(Mal-PEG-b-PBLA)溶于无水DMSO室温搅拌反应过夜，透析24h后取沉淀冻干得到葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)(Glu-PEG-b-PBLA)。

随后将葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)(Glu-PEG-b-PBLA)以2mg/mL的浓度溶于乙腈，加入5-15倍当量0.5M NaOH溶液至溶液变为澄清，于室温剧烈搅拌2h，将反应溶液在去离子水中透析24h后冻干得到聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG-b-PAsp)；

将Glu-PEG-b-PAsp溶于pH为6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，通过EDC/NHS反应活化羧基、将2-硝基咪唑基团(NIDH)加至Glu-PEG-b-PAsp上，该反应在室温下进行24h，其后收集反应液，在去离子水透析纯化2天并冻干得到目标产物Glu-PEG-b-P(Asp-g-NIDH)，其核磁氢谱表征结果如附图1所示：¹H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：7.69及7.19(s，-CH-ofmidazole)，4.35(m，midazole-CH₂，-CO-CH-)，3.51(m，-O-CH₂CH₂-O-)，3.00(m，-CO-NH-CH₂-CH₂-)，1.72(m，-NH-CO-CH₂-CH-)，1.51(m，midazole-CH₂-CH₂-)，1.36(m，-CO-NH-CH₂-CH₂-)，1.24(m，midazole-CH₂-CH₂-CH₂CH₂-CH₂-CH₂-)。

实施例2

非主动靶向型高分子聚合物(PEG-b-P(Asp-g-NIDH))的制备：

将聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)(PEG-b-PBLA)以2mg/mL的浓度溶于乙腈，然后加入5-10倍当量的0.5M NaOH溶液至溶液变为澄清，于室温剧烈搅拌2h，反应溶液在去离子水中透析24h后冻干得到PEG-b-PAsp；

将PEG-b-PAsp溶于pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，通过EDC/NHS反应活化羧基、将NI加至PEG-b-PAsp上，该反应在室温下进行24h，其后收集反应液，用去离子水透析2天并冻干得到目标产物PEG-b-P(Asp-g-NIDH)，其核磁氢谱表征¹H NMR(DMSO)结果如附图2所示：δ7.69，7.19(s，CH of midazole)，4.35(m，midazole-CH₂，-CO-CH-)，3.51(m，-O-CH₂CH₂-O-)，3.24(s，CH₃-O-)，3.00(m,-CO-NH-CH₂-CH₂-),1.72(m,-NH-CO-CH₂-CH-)，1.51(m，midazole-CH₂-CH₂-)，1.36(m，-CO-NH-CH₂-CH₂-)，1.24(m，midazole-CH₂-CH₂-CH₂CH₂-CH₂-CH₂-)。

实施例3

包载CDDP(顺式-二氯二氨合铂)及MnTPPS的高分子胶束及相关对照品制备：

称取每份1.5mg通过实施例2制得的PEG-b-P(Asp-g-NIDH)及0.5mg通过实施例1制得的Glu-PEG-b-P(Asp-g-NIDH)作为原料溶于二甲亚砜(DMSO)中，同时将0.8mg CDDP及1.6mg MnTPPS溶于1mL Milli-Q超纯水中。在超声条件下，将药物混合溶液迅速推入高分子聚合物的DMSO溶液中，并持续超声5min。随后将得到的胶束溶液转移恒温混匀仪中，置于37℃，1000rpm反应72h。利用超滤离心管(截留分子量：35k Da)加入Milli-Q水多次洗涤除去游离药物及DMSO，最后浓缩得到包载CDDP及MnTPPS的高分子胶束GluNPs。

类似的，取2mg PEG-b-P(Asp-g-NIDH)作为原料，按照其他试剂和过程相同的方式制得非主动靶向型高分子胶束NPs，作为对照。

实施例4

高分子胶束动态光散射(DLS)观察：

用实施例3中的制备方法，得到包载CDDP及MnTPPS的高分子胶束GluNPs，以非主动靶向型高分子胶束NPs作为对照。将两种高分子胶束各取10μL用纯水稀释至100μL，其后用马尔文粒度仪对其流体动力学直径及多分散指数(PDI)进行测定，平衡时间为15s，测量温度25℃，平行测量3次。结果如附图3所示，可以看出，GluNPs(a)的水合粒径为82.66nm，PDI为0.193；非主动靶向型纳米胶束NPs(b)的水合粒径为72.65nm，PDI为0.170。

实施例5

高分子胶束透射电镜(TEM)观察：

用实施例3中的制备方法，得到包载CDDP及MnTPPS的高分子胶束GluNPs，以非主动靶向型高分子胶束NPs作为对照。将两种高分子胶束稀释至一定浓度后分别滴至到200目铜网上，随后用2％(w/v)的醋酸双氧铀染色10s，立即吸去液体，待铜片自然风干后置于透射电子显微镜下观察。结果如附图4所示，可以看出两种纳米胶束类似球状，大小基本一致，单分散性良好。在透射电镜下，两者的粒径分布在35nm～50nm之间。

实施例6

高分子胶束的细胞毒性评价：

用实施例3中的制备方法，得到包载CDDP及MnTPPS的高分子胶束GluNPs，并以非主动靶向型高分子胶束NPs作为对照，利用CCK-8法探究两种高分子胶束在常氧及乏氧条件下联合放疗对小鼠乳腺癌4T1细胞的毒性作用。将4T1细胞接种于96孔板，每孔接种3000个细胞，置于37℃培养箱，待细胞贴壁后，乏氧组放入厌氧包中孵育48h，常氧组则正常培养48h。随后吸走原培养液，在细胞中分别加入含有不同浓度CDDP(2、4、8、15、30、60、90和120μg/mL)为基础的游离药物CDDP溶液及两种纳米胶束溶液，每孔100μL，设4个平行孔，同时设空白培养基及未加药细胞作为对照孔，加药培养4h后洗掉药物并加入新鲜的培养基，随后用4Gy的X-射线进行辐照处理，继续孵育48h。每孔加入10μL CCK-8，37℃孵育2h。最后利用多功能酶标仪在450nm处测定每孔的吸光度值(A)。细胞活率计算公式为：细胞活率％＝(A_加药组-A_空白)/(A_对照-A_空白)×100％，其中：A_加药组为加入不同药物组的吸光度值；A_对照为未加药细胞的吸光度值；A_空白为空白培养基的吸光度值。

常氧条件下细胞毒性结果如图5-a所示，乏氧下的结果如图5-b所示。在相同的低剂量辐照下，无论是常氧还是乏氧条件，4T1细胞的存活率同样随着药物浓度的提高而逐渐降低，说明放治疗毒性同样存在一定的剂量依赖性。并且与相同浓度下的治疗毒性相比，放治疗协同治疗的细胞毒性更强，更能发挥良好的肿瘤治疗效果。同样的，由于GluNPs的主动靶向作用增加肿瘤细胞对药物的摄取，因此能观察到其比NPs更好的协同治疗效果。

实施例7

高分子胶束对肿瘤细胞氧化应激及乏氧水平的影响：

用实施例3中的制备方法，得到包载CDDP及MnTPPS的高分子胶束GluNPs,NPs为不含葡萄糖的非主动靶向型纳米胶束，将4T1细胞接种于共聚焦皿中，每孔1×10⁴个细胞，在37℃孵箱中培育24h。待细胞贴壁后，将细胞置于厌氧包中使其乏氧48h。随后弃去原培养液，用H₂O₂预处理1h后加入药物GluNPs及NPs，置于37℃继续培养6h。然后吸走药物溶液，用氧化应激/乏氧检测试剂盒对细胞进行染色。

结果如图6所示，DFO为缺氧阳性对照，Pyo为氧化应激阳性对照。可以看出经过乏氧处理后，细胞的乏氧水平明显提高，显示乏氧阳性，而通过H₂O₂处理后的细胞氧化应激水平也明显上升。在加入高分子后，由于NPs能通过EPR效应被细胞摄取，响应乏氧环境释放出过氧化氢酶类催化剂MnTPPS它能与H₂O₂反应产生氧气，因此能降低氧化应激并改善乏氧。同时，GluNPs由于主动靶向作用被细胞摄取得更多，因此其效果更显著。

实施例8

高分子胶束在小鼠肿瘤的积蓄：

用实施例3中的制备方法，得到包载CDDP及MnTPPS的高分子载药胶束GluNPs,以非主动靶向型载药胶束NPs及游离CDDP作为对照。取BALB/c雌性荷瘤小鼠，当肿瘤体积约为150mm³时，按CDDP剂量为100μg每只小鼠，从小鼠尾部静脉注射0.2mL CDDP、GluNPs、NPs溶液，每组平行3只。随后分别在给药后的1、4、8、24h时间点，取小鼠肿瘤样本，并记录肿瘤质量。随后将样本加入浓硝酸处理过夜，利用电热板加热至230℃，使组织完全降解并蒸干溶剂，冷却后再加入1％稀硝酸溶解样本并置于37℃恒温摇床振荡过夜。将样品用450μm滤膜过滤后，利用ICP-OES测定样本中离子的浓度含量。药物在肿瘤中的浓度计算：Amount(μg/g)＝C(tumor)×V(稀硝酸)/m(tumor)，Rate％＝Amount(μg/g)/Amount_{(注射剂量)}

肿瘤分布结果如图7所示：游离的CDDP主在给药后的1h，肿瘤部位药物含量达到最高值即平均每克肿瘤含有注射剂量的5.33％，而1h后则逐渐减弱，24h仅为1.16％。注射纳米胶束后，肿瘤部位药物的集聚随着时间的延长而逐渐增加并在24h达到峰值，注射NPs后药物在24h达到平均每克肿瘤含有注射剂量的11.76％，而主动靶向型的GluNPs纳米胶束24h时在肿瘤部位富集为NPs的1.49倍，达到了17.57％。这说明了两种纳米胶束组均显著增加了其在肿瘤中的蓄积，而基于GLUT1的主动靶向纳米胶束显示出更好的肿瘤靶向效果。

实施例9

高分子胶束在小鼠皮下瘤模型的抑瘤实验：

用实施例3中的制备方法，得到包载CDDP及MnTPPS的高分子胶束GluNPs与NPs，并联合X射线(X-ray)放疗评价其抗肿瘤效果。取肿瘤生长状态良好的BALB/c雌性荷瘤小鼠，当肿瘤体积约为80～100mm³时将其随机分成PBS组，CDDP组，NPs组，GluNPs组，CDDP和X-ray联合治疗组，NPs和X-ray联合治疗组，GluNPs和X-ray联合治疗组共7组。每组5只，在第0天与第3天给药，剂量为2mg/kg CDDP，每只小鼠尾静脉注射200μL。对于放疗组，在给药24h后对小鼠肿瘤区域进行X射线辐照，剂量为6Gy。实验中每隔一天记录小鼠肿瘤体积和体重，肿瘤曲线结果如图8-a所示，可见单独的低剂量治疗抗肿瘤效果不佳。而在注射药物的24h后再进行X射线辐照效果优于单独的治疗。而主动靶向型的纳米胶束GluNPs与X射线的联合治疗组，在进行两次药物注射与辐照治疗后，肿瘤生长完全得到抑制，在监测的22天内没有观察到肿瘤有复发的迹象，这体现了基于GLUT1的主动靶向纳米胶束与放疗联合治疗的优越性。肿瘤曲线结果如图8-b所示，从小鼠的体重曲线可以看出，在治疗过程中所有组别的小鼠体重均无明显变化，未出现短期内体重的急剧减少或增加，这说明本研究中采用的药物剂量及辐照剂量合理，各种治疗方法生物安全性较高。

实施例10

高分子胶束对原发性肺转移抑制效果评价：

用实施例3中的制备方法，得到包载CDDP及MnTPPS的高分子胶束GluNPs与NPs，并联合X射线(X-ray)放疗评价其抗肺转移效果，并采用与实施例7相同的分组方法进行对比观测。在治疗22天后，处死所有实验组小鼠，取出小鼠的肺，观察肺部原发性肿瘤转移情况并统计肺结节数，利用H&E染色观察其形态变化。结果如图9所示，可以看出，GluNPs和X-ray联合治疗组没有观察到肺转移结节，其他组染色肺部均能观察到有不同程度透明的肺转移。从H&E也能观察到除GluNPs和X-ray组外不同程度的排列紧密、染色程度深的转移瘤细胞，可见主动靶向纳米胶束与放疗的联合治疗不仅能抑制4T1皮下肿瘤的生长，还能很好的抑制肿瘤的原发性肺转移。

实施例11

高分子胶束对肿瘤HIF-1α水平的影响：

用实施例3中的制备方法，得到包载CDDP及MnTPPS的高分子胶束GluNPs与NPs，检测给药后肿瘤部位HIF-1α的水平。取肿瘤生长状态良好的BALB/c雌性荷瘤小鼠，当肿瘤体积约为100mm³时，分别尾静脉注射PBS，CDDP，包载有CDDP及MnTPPS的NPs，包载有CDDP及MnTPPS的GluNPs，按照MnTPPS浓度为1mg/mL给药，每只小鼠尾静脉注射200μL。给药24h后，将小鼠处死，并取出肿瘤，用OCT包埋后制成冰冻切片并用4％多聚甲醛固定，羊血清封闭20min后进行染色。将组织切片与兔抗鼠HIF-1α抗体于4℃湿盒孵育过夜，用PBS洗涤后，再与AF488标记的山羊抗兔IgG(H+L)抗体于37℃共同孵育45min，之后在室温下用DAPI染色5min。最后，利用激光共聚焦显微镜观察并拍摄肿瘤组织HIF-1α的表达情况。

利用在激光共聚焦下观察经过不同治疗后各组小鼠肿瘤切片HIF-1α的表达情况，如图10所示。蓝色荧光标记肿瘤细胞核，绿色荧光标记HIF-1α。可见,由于没有给药,PBS组表达出强烈的绿色荧光,说明肿瘤中存在乏氧环境因此使得HIF-1α的表达较高，而注射CDDP/MnTPPS后，HIF-1α的绿色荧光面积有些减少，这表明注射游离的MnTPPS能在一定程度上缓解肿瘤的乏氧，但由于其在小鼠体内代谢速度快，能够到达肿瘤部位的药物较少使得效果不佳。注射高分子胶束后，GluNPs组的HIF-1α水平与NPs相比有更为明显的降低，显示出主动靶向型高分子胶束的优越性，由于乏氧诱导GLUT1表达上调，使得GluNPs更多的被肿瘤摄取，并在乏氧下释放出类过氧化氢酶MnTPPS，从而与肿瘤部位过表达的H₂O₂反应产生氧气，下调HIF-1α的表达，改善肿瘤乏氧微环境。

以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高分子胶束材料，其特征在于：其具有以下的化学式：

其中，R选自巯基葡萄糖或H，x＝20-30，y＝50-75，m＝44-273，N＝60-100。

2.权利要求1所述的高分子胶束材料的制备方法：其特征在于：包括：

获得含有聚乙二醇及聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段的原料高聚物的有机溶液；

将所述原料高聚物的有机溶液进行脱苄基反应，获得含有聚乙二醇及聚天冬氨酸嵌段的共聚物；

将所述共聚物通过EDC/NHS反应进行2-硝基咪唑基团接枝，得到所述高分子胶束材料；

其中，所述原料高聚物选自葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物和/或聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述原料高聚物的有机溶液通过将所述原料高聚物溶于有机溶剂获得，所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：其中，所述脱苄基反应包括：将所述原料高聚物的有机溶液与强碱水溶液进行室温反应1.5-2.5h；和/或，所述EDC/NHS反应包括：将所述含有聚乙二醇及聚天冬氨酸嵌段的共聚物溶于pH为5.5-6.5的缓冲液中，在室温下反应20-28h；优选的，所述缓冲液选自2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物通过在马来酰亚胺-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)的马来酰亚胺端连接巯基葡萄糖的点击反应得到。

6.一种靶向药物，其含有权利要求1所述的高分子胶束材料和/或根据权利要求2-5中任一项所述的制备方法制备得到的高分子胶束材料，及负载于所述胶束材料内的治疗药物。

7.根据权利要求6所述的靶向药物，其特征在于：所述治疗药物选自顺式-二氯二氨合铂和/或meso-四(4-磺酰苯基)卟吩氯化锰。

8.权利要求6或7所述的靶向药物的制备方法，其特征在于：包括：

获得所述高分子胶束材料的有机溶液和/或有机薄膜；

获得质量浓度为0.5-6.0mg/mL的所述治疗药物的有机和/或无机溶液；

按所述高分子胶束材料与所述治疗药物的质量比为1：(1-2)的配比，获得药物-胶束混合体系；

将所述药物-胶束混合体系进行恒温反应，其后除去游离药物及溶剂，并浓缩得到所述靶向药物；

优选的，所述高分子胶束材料包括通过原料高聚物葡萄糖-聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物获得的葡萄糖-聚乙二醇-聚(天冬氨酸-2-硝基咪唑)和通过原料高聚物聚乙二醇-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)嵌段共聚物获得的聚乙二醇-聚(天冬氨酸-2-硝基咪唑)；更优选的，所述聚乙二醇-聚(天冬氨酸-2-硝基咪唑)与所述葡萄糖-聚乙二醇-聚(天冬氨酸-2-硝基咪唑)的质量比为(2.5-3.5):1。

9.根据权利要求8所述的靶向药物的制备方法，其特征在于：其中，所述高分子胶束材料的有机溶液所用溶剂选自二甲亚砜、二氯甲烷、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种；和/或所述治疗药物的有机和/或无机溶液所用溶剂选自水、二甲亚砜、四氢呋喃、甲醇、丙酮、乙二醇中的一种或多种；和/或，在使用所述高分子胶束材料的有机溶液的情况下，所述恒温反应包括在35-39℃、800-1200rpm的条件下反应60-80h；和/或，在使用所述高分子胶束材料的有机薄膜的情况下，所述恒温反应包括在35-39℃、100-200rpm的条件下反应10-24h；和/或，在使用所述治疗药物的有机溶液的情况下，所述恒温反应包括在常温下进行超声混合的过程。

10.权利要求1所述的高分子胶束材料、和/或根据权利要求2-5中任一项所述的制备方法制备得到的高分子胶束材料、和/或权利要求6或7所述的靶向药物、和/或根据权利要求8或9所述的制备方法制备得到的靶向药物在乏氧环境下的癌治疗中的应用。

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