CN113476532A - 一种锌硒茶在制备缓解np诱发的心脏毒性的药物中的应用 - Google Patents

一种锌硒茶在制备缓解np诱发的心脏毒性的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种锌硒茶在制备缓解NP诱发的心脏毒性的药物中的应用，属于医药技术领域。通过以锌硒茶为活性成分，改善因NP诱发的心脏毒性，保护心脏。本发明通过实验证明，锌硒茶对NP诱导的心肌纤维化有明显的缓解作用。锌硒茶干预后，能减轻NP诱导的心室壁变薄和心室腔增大程度；能显著降低NP诱导的血清AST、CK、CK‑MB、LDH、a‑HBDH含量水平；能显著减轻NP诱导的心肌纤维紊乱、断裂以及炎细胞的浸润；能显著降低NP诱导的心肌组织collagen Ⅰ、colagen Ⅲ蛋白的异常表达。

Description

一种锌硒茶在制备缓解NP诱发的心脏毒性的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种锌硒茶在制备缓解NP诱发的心脏毒性的药物中的应用。
背景技术
茶作为具有特殊风味，健康药用价值和深厚文化底蕴的一类饮料，在世界各地越来越受到人们的欢迎，广泛应用于世界各地人们的社交和日常生活中，人们对茶品质的要求也日益增长。茶含有许多次生代谢产物，例如黄酮类和生物碱，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降低胆固醇和血脂等重要药用价值。众多研究表明，经常饮茶可有效预防众多慢性疾病，如例如癌症，肥胖症，糖尿病，心血管疾病和神经退行性疾病等。绿茶主要成分没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)已被证明具有抗炎作用，其主要机制是抑制炎症细胞因子和炎症相关酶的基因和(或)蛋白质表达。其中绿茶中EGCG充当了抗氧化剂清除活性氧，导核因子-κB(nuclear factor-κB)活性减弱。
壬基酚(nonylphenol，NP)是一种典型的环境内分泌干扰物，进入人体后可发挥雌激素样作用。它可以存在于水、土壤和空气中，然后进入食物链。大量研究表明NP对内分泌、生殖、免疫和神经系统有损伤作用，并促进多种癌症的发生。NP对人体的影响之一则是其心脏毒性。
锌硒茶可作为天然的锌和硒元素最好的载体，比传统绿茶具有更强的抗衰老和抗氧化的作用。对于锌和硒含量丰富的锌硒茶，能否将其应用于其他领域中，是本领域技术人员需要进一步探索的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种锌硒茶在制备缓解NP诱发的心脏毒性的药物中的应用，通过以锌硒茶为活性成分，改善因NP诱发的心脏毒性，保护心脏，为锌硒茶的产品研发和技术推广提供依据。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
提供一种锌硒茶在制备缓解NP诱发的心脏毒性的药物中的应用。本发明的锌硒茶具体为含有有机锌和有机硒的绿茶，其作为一种中药组分炮制方法可以与普通绿茶的炮制方法相同，也可以是鲜叶直接干燥后得到。但是为了提升药物的口感，本发明优选按照普通绿茶的常规制茶方法进行制备。
优选的，所述锌硒茶中有机锌含量为40-100mg/kg，有机硒含量为0.25-3.50mg/kg。
优选的，所述缓解NP诱发的心脏毒性的药物中的活性成分为锌硒茶。
优选的，所述缓解NP诱发的心脏毒性的药物中还包含可接受的药用辅料。
在本发明中，锌硒茶可以作为一种中药成分与其他药用辅料配合制成中药制剂，也可以单独使用。
单独使用时，可以作为普通绿茶进行冲泡饮用，每天的饮用量2-5g/50kg。也可以进行煎煮，煎煮时，称取一定质量的锌硒茶，剪碎，放入3倍质量沸腾的双蒸水(避免用矿泉水等，引入无机离子)中，煎煮10min，过滤，滤渣继续加入3倍质量沸腾的双蒸水，煎煮10min，连续3次，合并3次所得滤液，减压浓缩至锌硒茶含量为0.2g/mL，2000r/min，常温离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，冷藏备用(-20℃)，作为水煎剂。
本发明的有益技术效果如下：
锌硒茶对NP诱导的心肌纤维化有明显的缓解作用：超声结果显示，锌硒茶干预后，NP诱导的心室壁变薄和心室腔增大程度减轻。血清心肌酶谱显示，锌硒茶能显著降低NP诱导的血清AST、CK、CK-MB、LDH、a-HBDH含量水平。HE、Masson与Sirius Red染色结果显示，锌硒茶干预后显著减轻了NP诱导的心肌纤维紊乱、断裂以及炎细胞的浸润，且锌硒茶干预组的CVF下降显著。Western blot结果显示，锌硒茶的干预显著降低了NP诱导的心肌组织collagenⅠ、colagenⅢ蛋白的异常表达。RT-PCR结果显示，锌硒茶的补充显著降低NP诱导的心肌组织collagenⅠ、collagenⅢ基因mRNA的异常表达，且锌硒茶组的干预效果显著。
饮用锌硒茶可有效干预NP暴露所致的心脏毒性，阻止心肌进一步发生纤维化，并拮抗NP所致的collagenⅠ、collagenⅢ的异常表达及相关基因异常表达。
附图说明
图1为实施例4测定的不同实验处理组间心脏组织中NP的平均含量。
图2为实施例5测定的不同实验处理组间心脏组织中Zn的平均含量。
图3为实施例5测定的不同实验处理组间心脏组织中Se的平均含量。
图4为实施例6中不同实验处理组间心肌HE染色图，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。
图5为实施例6中不同实验处理组间心肌Masson染色图，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。
图6为实施例6中不同实验处理组间心肌Sirius Red染色图，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。
图7为实施例6中不同处理组间心肌胶原纤维容积分数比较图。
图8为实施例6中不同处理组间心肌胶原蛋白容积分数比较图。
图9为实施例7中不同处理组间大鼠心肌纤维化心肌组织中collagenⅠ表达比较图，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。
图10为实施例7中不同处理组间大鼠心肌纤维化心肌组织中collagenⅢ表达比较图，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。
图11为实施例7中不同处理组间大鼠心肌纤维化心肌组织中collagenⅠ的条带总灰度值。
图12为实施例7中不同处理组间大鼠心肌纤维化心肌组织中collagenⅢ的条带总灰度值。
图13为实施例8中对照组大鼠左心室壁和心室腔的多普勒超声图。
图14为实施例8中NP高剂量组大鼠左心室壁和心室腔的多普勒超声图。
图15为实施例8中绿茶干预组大鼠左心室壁和心室腔的多普勒超声图。
图16为实施例8中锌硒茶干预组大鼠左心室壁和心室腔的多普勒超声图。
图17为实施例8中不同处理组间大鼠左心室壁前壁收缩期末期厚度(LVAWs)变化情况比较图。
图18为实施例8中不同处理组间大鼠左心室前壁舒张期末期厚度(LVAWd)变化情况比较图。
图19为实施例8中不同处理组间大鼠左心室壁后壁收缩末期厚度(LVPWs)变化情况比较图。
图20为实施例8中不同处理组间大鼠左心室后壁舒张末期室壁厚度(LVPWd)变化情况比较图。
图21为实施例8中不同处理组间大鼠左心室收缩末期内径(LVIDs)变化情况比较图。
图22为实施例8中不同处理组间大鼠左心室舒张末期内径(LVIDd)变化情况比较图。
图23为实施例8中不同处理组间大鼠左心室排出量(LVCO)变化情况比较图。
图24为实施例9中不同处理组间大鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平比较图。
图25为实施例9中不同处理组间大鼠血清肌酸激酶(CK)水平比较图。
图26为实施例9中不同处理组间大鼠血清肌酸激酶同工酶(CKMB)水平比较图。
图27为实施例9中不同处理组间大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)水平比较图。
图28为实施例9中不同处理组间大鼠血清a-羟丁酸脱氢酶(a-HBDH)水平比较图。
图29为实施例10中不同处理组组间大鼠心脏组织中collagenI基因mRNA表达情况比较图。
图30为实施例10中不同处理组组间大鼠心脏组织中collagenⅢ基因mRNA表达情况比较图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例所用大鼠均饲养于遵义医科大学公共卫生学院动物饲养房，室温(22±3)℃，湿度为50％-60％，通自然风，光照与黑暗时间均为12h，自由啃食、饮水，分笼喂养，每笼饲养5只大鼠，饲料含碳水化合物63.02％，脂肪占12.5％，蛋白质占24.93％，总热量19.41KJ/g。水瓶和鼠笼均采用聚丙烯合成材料从而避免含有NP的水瓶和鼠笼干扰实验结果，饮用净水器直饮水。
本发明实施例所用锌硒茶购自贵州凤岗县万壶缘锌硒茶叶有限公司(有机锌含量：40-100mg/kg，有机硒含量：0.25-3.50mg/kg)；普通绿茶购自贵州味道茶叶有限公司。
本发明实施例使用的锌硒茶和绿茶均为水煎剂。水煎剂制备步骤为：称取一定质量的茶叶，剪碎，放入3倍质量沸腾的双蒸水(避免用矿泉水等，引入无机离子)中，煎煮10min，过滤，滤渣继续加入3倍质量沸腾的双蒸水，煎煮10min，连续3次，合并3次所得滤液，减压浓缩至茶叶含量为0.2g/mL，2000r/min，常温离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，冷藏备用(-20℃)，作为水煎剂。
实施例1
大鼠分组及染毒：
选取4周龄SD实验大鼠共40只，体重：200±10g，供应商(湖南长沙天勤生物技术有限公司)[许可证号：SCXK(湘)2014-0011]。适应性喂养一周，然后随机分4组，分别为对照组(Control)，NP高剂量组(High NP group)，绿茶干预组(Green tea treatment group)和锌硒茶干预组(Ze-Se tea treatment group)，每组10只。每日8：00-9：00空腹灌胃一次，对照组给玉米油5mL/kg/d进行灌胃；NP高剂量组给NP灌胃，剂量为40mg/kg/d；绿茶干预组给绿茶水煎剂和NP灌胃，绿茶剂量为1g/kg/d，NP剂量为40mg/kg/d；锌硒茶干预组给锌硒茶水煎剂和NP灌胃，锌硒茶剂量为1g/kg/d，NP剂量为40mg/kg/d，持续灌胃180天。灌胃染毒期间，严密实时观察大鼠饮食、饮水、活动、被毛等情况，每日在灌胃之前对大鼠进行体重称量并记录，以便观察大鼠体重变化情况，且所有操作均在一小时内完成以便保证灌胃时间。
实施例2
持续灌胃180天后，大鼠心脏重量称量和脏器系数计算：
剖杀前隔夜(12h)禁食后，称取大鼠体重，按大鼠体重用1％戊巴比妥(40mg/kg)进行腹腔注射麻醉动物，待动物麻醉完成，迅速解开胸腔，分离出心脏并剪去心耳，让脏器内残留血液充分流出，生理盐水洗净血污后，用滤纸快速充分吸干组织上水分并立即准确称取心脏湿重，计算心脏系数(心脏系数为心脏湿重与体重比值)，结果见表1。
表1不同实验处理组间大鼠心脏重量、体重、心脏系数与对照组比较(
Figure BDA0003197774560000061
n＝10)
组别 大鼠体重(g) 心脏重量(g) 心脏系数(mg/g)
对照组 459.49±4.08 1.21±0.05 2.68±0.08
NP高剂量组 474.86±31.76 1.26±0.05 2.64±0.07
绿茶干预组 474.95±31.77 1.22±0.05 2.65±0.07
锌硒茶干预组 461.11±19.80 1.22±0.06 2.64±0.07
F值 0.955 1.592 0.595
P值 0.424 0.208 0.623
从表1中可以看出，NP暴露后的SD大鼠进行绿茶和锌硒茶干预后发现，各实验组大鼠体重、心脏重量、心脏脏器系数均无统计学差异，NP高剂量组大鼠体重最大，锌硒茶干预组的体重高于对照组，略低于NP高剂量暴露组与绿茶干预组(F体重＝0.955，F心脏重量＝1.592，F脏器系数＝0.595，P>0.05)。
实施例3
持续灌胃180天后，大鼠尾动脉无创血压(收缩压/舒张压)测定：
(1)动物准备：测血压前，保证大鼠正常并清醒；
(2)仪器准备：测定前开启仪器并预热15min，然后进行压力信号定标；
(3)大鼠固定：按大鼠体重装入固定盒内固定，将加压套紧套鼠尾部至尾根部，此时鼠尾已包裹于加热管内；
(4)测量血压：使鼠尾动脉与脉搏信号传感片紧贴，待脉搏稳定，读取血压值，测定结果见表2。
表2不同处理组间大鼠收缩压与对照组比较(
Figure BDA0003197774560000063
n＝10)
Figure BDA0003197774560000064
Figure BDA0003197774560000071
从表2中可以看出，对照组、NP高剂量组、绿茶干预组、锌硒茶干预组间均无显著差异(P>0.05)。
实施例4
持续灌胃180天后，高效液相色谱法测定大鼠心脏组织中NP含量：
心脏组织样品的制备：
(1)组织准备：取100mg新鲜心脏组织加入已加有4mL正己烷-乙醚混合物(正己烷：乙醚＝7:3)的干净玻璃管中；
(2)匀浆：匀浆机(20000r/min)，匀浆时间为8～10s；
(3)离心：4000r/min离心10min，取上清；
(4)水浴：样品于50℃水浴充分蒸干水分，后加入0.1mL乙腈溶解完全；
(5)上机：将上述溶解完全的样品全部移至上样瓶并上机进行检测。
高效液相色谱仪检测条件：
(1)色谱条件：色谱柱：nertsilODS-34.6mm×250mm5μm；
(2)检测器：荧光检测器(发射波长312nm，激发波长275nm)柱温40℃；
(3)流动相：0.1％冰乙酸:乙腈(15:85)；
(4)上样量：上样体积10μl，洗脱速度1.0mL/min；样品保留时间:6min；
(5)定性分析：采用NP标准品进行测定保留时间，与标准样品的保留时间相对照的方法对样品进行定性分析；
(6)定量分析：用乙腈配制不同浓NP标准品度，上机测得峰面积与浓度制作标准曲线。处理后的样品上机测得峰面积代入标曲从而计算得出样品中NP浓度；
(7)质量控制：本次实验前均用重铬酸浸泡所用器皿数小时，清水洗净，70℃烘箱烘干备用，从而避免塑料制品溶出的NP干扰实验实际结果。
NP暴露后，心脏组织中NP的含量显著升高，对照组NP蓄积水平为10.36±1.31ng/mg，NP高剂量组、绿茶干预组以及锌硒茶干预组的NP蓄积水平分别为58.46±19.14ng/mg、57.93±18.36ng/mg和57.38±18.37ng/mg，均显著高与对照组，差异有统计学意义(F＝21.715,P<0.01)。不同实验处理组间心脏组织中NP的平均含量见图1(n＝6；*表示与对照组比较P<0.01)。
实施例5
持续灌胃180天后，ICP-MS法测定大鼠心脏组织中NP含量：
准确称取0.15g心脏组织于消解罐中，少量水湿润后加入6mLHNO3、2mLH2O2和2mLHF混匀，放置预消解1h左右后置于微波消解仪内，按表1所设置的升温程序进行消解，消解完后赶酸并定容至50mL。稀释一定倍数后用ICP-MS测定，同样方法制备并测定样本空白溶液。微波消解程序步骤见表3。
表3微波消解程序步骤
步骤 功率/W 爬坡时间/min 控制温度/min 保持时间/min
1 1600 5 120 2
2 1600 3 160 3
3 1600 4 180 20
结果显示，各实验处理组间并无显著差异，心脏组织中Zn含量分别为：对照组13.52±1.24mg/kg，NP高剂量组11.76±2.95mg/kg、绿茶干预组12.60±1.04mg/kg、锌硒茶干预组14.44±2.48mg/kg。心脏组织中Se含量：对照组0.22±0.04mg/kg、锌硒茶干预组0.18±0.10mg/kg、绿茶干预组0.18±0.10mg/kg、锌硒茶干预组0.29±0.04mg/kg。锌硒茶干预组Zn、Se两种元素的含量均略高于其他三个实验组(P>0.05)。不同实验处理组间心脏组织中Zn的平均含量见图2(n＝6)；不同实验处理组间心脏组织中Se的平均含量见图3(n＝6)。
实施例6
持续灌胃180天后，大鼠心肌组织石蜡包埋切片、染色处理及心肌胶原容积分数测定：
心肌组织石蜡包埋切片：
取材：迅速取心脏组织于4％多聚甲醛24h以上。固定液取出固定好的心脏组织在通风橱内将目的部位修平整，将处理好的组织写好标签放于脱水盒内；脱水：脱水盒放入吊篮，在脱水机内进行酒精梯度脱水。酒精脱水浓度与时间分别为：75％-4h、85％-2h、90％-2h、95％-1h、无水乙醇脱水两次，每次30min，醇苯10min，二甲苯脱水两次，每次10min，块脱水三次，每次1h；包埋：浸蜡心脏组织块置于包埋机内包埋。先将液态蜡蜡装满包埋框，从脱水盒内取取出心脏组织，按包埋面置于包埋框并贴上相应标签，-20℃冷却，蜡凝固后从包埋框中取并整理好蜡块；切片：将蜡块放在石蜡切片机上，切厚4μm的切片；捞片：切片漂浮于40℃温水摊片机上铺平组织，轻轻用载玻片捞起组织，并至60℃烘箱内烤干。将水分烤干，蜡烤化后取出切片，置于常温储存备用。
心肌HE染色：
切片脱蜡并水洗：将切片经二甲苯处理两次，每次处理20min；无水乙醇处理两次，每次10min；然后依次经酒精分别为95％、90％、80％、70％各处理5min，最后经蒸馏水洗净；细胞核染色：切片放入Harris苏木素染液内染色，染色时间为8min，纯净水水洗，经1％的酒精盐酸分化数秒，纯净水水洗，经0.6％氨水返蓝，洁净流水冲洗；细胞质染色：将切片置入伊红染液中染色，染色时间3min；脱水并封片：将切片经95％酒精脱水两次，每次5min；无水乙醇脱水两次，每次5min；再经二甲苯两次脱水，每次5min，直至透明，然后取出切片晾干，采用中性树胶封片；图像采集：经显微镜镜检，采集图片进行分析；细胞核被染成蓝色，细胞质被染成红色。
实施例6中心肌HE染色图见图4，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。从图4中可以看出，NP高剂量组发生了严重病理改变，心肌组织及血管周围均有大量纤维结缔组织生成，结缔组织紊乱松散呈网格状，肌纤维断裂(箭头)，肌纤维松散，间距增宽(星形)。经绿茶干预后以上病理改变均有所减轻，心肌间纤维结蹄组织生成减少，心肌较紧密，心肌肌束较完整且走向较一致。锌硒茶干预组病变较绿茶干预组减轻，心肌间胶原结蹄组织更少，心肌更加紧密，肌束几乎完整且走向比较一致并逐渐趋向于对照组。
心肌Masson染色：
切片脱蜡至水洗：将切片经二甲苯处理两次，每次20min，再经无水乙醇处理两次，每次10min，最后经浓度梯度分别为95％、90％、80％、70％酒精分别脱水5min，最后用纯净水洗净；细胞核染色：将切片放入masson染色试剂盒，经盒内Weigert氏铁苏木素染色5min，纯净水洗净，再经1％的盐酸酒精分化3-5秒，纯净流水冲洗数分钟后返蓝；细胞质染色：切片放入masson染色试剂盒内，经试剂盒内丽春红酸性品红液染色10min，纯净水快速漂洗；磷钼酸处理：将切片放入masson染色试剂盒内经磷钼酸水溶液处理，处理时间5min；
苯胺蓝染色：直接用试剂盒内苯胺蓝液复染5min；分化：将切片1％冰醋酸处理1min；封片：将切片经5％酒精处理两次，每次5min；再经无水乙醇处理两次；每次5min；然后二甲苯脱水两次，每次5min，直至脱水透明，取出切片，用中性树胶进行封片；镜检与图像采集分析；胶原纤维、粘液、软骨被染成蓝色；肌纤维、红细胞以及纤维素被染成红色；细胞核被染成蓝黑色。
心肌SiriusRed染色：
切片脱蜡至水水：将切片经二甲苯处理两次，每次20min；经无水乙醇处理两次，每次10min；然后经浓度梯度为95％、90％、80％、70％酒各处理5min-纯净水水洗；Sirius Red染色液染色：将切片放入饱和苦味酸天狼猩红染色液内染色，染色时间约8min；漂洗：切片经无水乙醇漂洗几分钟；封片：切片放置于60°烤箱内烤干，然后用二甲苯透明处理5min，最后用中性树胶进行封片；显微镜进行镜检，采集图像并进行分析；显微镜下胶原纤维被染成红色，黄色为背景色。
心肌胶原容积分数测定：
在放大400倍的显微镜下，观察到心肌组织经Masson染色后，胶原蛋白为蓝色，心肌呈红色；经Sirius Red染色的心肌纤维为红色，其他为黄色。图像采集系统(日本康尼NIKON DS-U3)随机选取不同切片，切片分别来自6只不同大鼠，每张切片选取9个不重复的视野进行拍照。Image Pro-plus系统测量CVF。CVF＝胶原面积除以总面积，除去血管周围胶原面积不计。
实施例6中心肌Masson染色图见图5，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。
实施例6中心肌Sirius Red染色图见图6，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。
实施例6中不同处理组间心肌胶原纤维容积分数(CVF1)结果见图7(n＝9；**表示与对照组比较P<0.05；*表示与高剂量组比较P<0.01；#表示与绿茶干预组比较P<0.05)；实施例6中不同处理组间心肌胶原蛋白容积分数(CVF2)结果见图8(n＝9；*表示与高剂量组比较P<0.01；#表示与绿茶干预组比较P<0.01)。
从图5-8中可以看出，在光镜下心肌组织Masson染色中胶原纤维呈现蓝色，心肌纤维呈现红色；NP高剂量组显示心肌排列严重紊乱，疏松，心肌间隙增宽，大量蓝染的纤维组织呈网格状将心肌肌束分隔包绕，且大面积蓝色纤维化组织替代正常心肌组织，与对照组比较，心肌间CVF1增加(P<0.01)；分别经绿茶和锌硒茶干预后，心肌纤维的紊乱、疏松程度均有不同程度所缓解，锌硒茶干预组较绿茶干预组有较大程度缓解，锌硒茶干预组蓝色胶原纤维面积减少程度较绿茶组大，心肌间胶原容积分数(CVF)定量分析显示，绿茶干预组CVF1下降不明显，锌硒茶干预组CVF1略有所下降(P＝0.134)。在普通显微镜下胶原蛋白经SiriusRed染色呈红色，其他染成黄色；NP高剂量组显示心肌排列严重紊乱，疏松，心肌间隙增宽，大量红的纤维组织呈网格状将心肌肌束分隔包绕，且大面积红色纤维化组织替代正常心肌组织，与对照组比较，心肌间CVF2显著增加(P<0.001)；分别经绿茶和锌硒茶干预后，心肌纤维的紊乱、疏松程度均有不同程度所缓解，锌硒茶干预组较绿茶干预组有较大程度缓解，锌硒茶干预组蓝色胶原蛋白面积减少程度较绿茶干预组大，心肌间胶原容积分数(CVF)定量分析显示，绿茶干预组与锌硒茶干预组心肌间CVF2均显著下降，锌硒茶的干预效果优于绿茶干预效果(P<0.001)。
实施例7
持续灌胃180天后，Western Blot检测大鼠心脏组织中Collagen type I和Collagen type Ⅲ表达：
NP染毒结束时，快速解剖心脏，加入预混蛋白裂解液(10μL PMSF+1mL RIPA)(北京索莱宝公司)，经匀浆，离心，取上清，经变性后备用。采用BCA(北京索莱宝公司)定量法检测大鼠心脏组织蛋白浓度。电泳，每个上样孔10μl样品，起始电压80V，待mark充分分离后，调整电压为120V高压电泳致溴酚蓝至凝胶底部。转膜(恒流转膜：300mA，90min)。5％牛血清白蛋白(Albumin Bovine V)封闭2小时。一抗孵育：β-tubulin(1:1000)(美国abcam公司)、Anti-Collagen type I antibody(1:1000)(美国abcam公司)、Anti-Collagen typeⅢantibody(1:1000)(美国abcam公司)4℃孵育12小时。二抗37℃孵育1小时。滴加显影液于条带，fusion凝胶成像分析仪显影。使用image-Proplus6.0分析计算各条带总灰度值。
实施例7中不同处理组间大鼠心肌纤维化心肌组织中collagenⅠ表达比较图见图9，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。
实施例7中不同处理组间大鼠心肌纤维化心肌组织中collagenⅢ表达比较图见图10，其中C为对照组，H为NP高剂量组，G为绿茶干预组，Z为锌硒茶干预组。
实施例7中不同处理组间大鼠心肌纤维化心肌组织中collagenⅠ的条带总灰度值见图11(n＝9；**表示与对照组比较P<0.05；*表示与NP高剂量组比较P<0.01；#表示与绿茶干预组比较P<0.05)。
实施例7中不同处理组间大鼠心肌纤维化心肌组织中collagenⅢ的条带总灰度值见图12(n＝9；**表示与对照组比较P<0.05；*表示与NP高剂量组比较P<0.01；#表示与绿茶干预组比较P<0.05)。
从图9-12中可以看出，NP高剂量组中collagenⅠ、collagenⅢ表达均显著增加(FcollagenⅠ＝138.580，FcollagenⅢ＝149.582，P<0.001)，经茶叶干预后心肌间collagenⅠ、collagenⅢ均有所下降(P绿茶<0.001，P锌硒茶<0.001)，锌硒茶干预效果优于绿茶(P<0.001)。
实施例8
持续灌胃180天后，对大鼠心脏进行多普勒超声检查：
备皮：大鼠称量体重之后，经腹腔注射1％戊巴比妥(40mg/kg)麻醉大鼠，大鼠麻醉后取仰卧位，然后固定在小动物专用手术台上，快速脱去大鼠胸部鼠毛，手术区域备皮并消毒。心功能检测：用线阵探头(频率9.0MHZ)检测心功能，专人将探头放于大鼠左胸，取胸骨旁左心室长轴二维图像后，在乳头肌水平将M型取样线垂直于室间隔和左心室后壁，然后获得M型超声心动图，测量左心室结构包括：LVAWd、LVAWs、LVIDd、LVIDs、LVPWd、LVPWs。以及采用CUBED公式计算EF(％)和FS(％)。质量控制：每组数据均取连续3个心动周期的平均值。多普勒超声检测操作步骤以及数据的整理分析均由专业人士执行完成。
实施例8中对照组大鼠左心室壁和心室腔的多普勒超声图见图13。
实施例8中NP高剂量组大鼠左心室壁和心室腔的多普勒超声图见图14。
实施例8中绿茶干预组大鼠左心室壁和心室腔的多普勒超声图见图15。
实施例8中锌硒茶干预组大鼠左心室壁和心室腔的多普勒超声图见图16。
实施例8中不同处理组间大鼠左心室壁前壁收缩期末期厚度(LVAWs)变化情况比较图见图17(n＝9；*表示与NP高剂量组比较P<0.01；#表示与绿茶干预组比较P＝0.07)。
实施例8中不同处理组间大鼠左心室前壁舒张期末期厚度(LVAWd)变化情况比较图见图18(n＝9；*表示与对照组比较P<0.05)。
实施例8中不同处理组间大鼠左心室壁后壁收缩末期厚度(LVPWs)变化情况比较图见图19(n＝9)。
实施例8中不同处理组间大鼠左心室后壁舒张末期室壁厚度(LVPWd)变化情况比较图见图20(n＝9)。
实施例8中不同处理组间大鼠左心室收缩末期内径(LVIDs)变化情况比较图见图21(n＝9)。
实施例8中不同处理组间大鼠左心室舒张末期内径(LVIDd)变化情况比较图见图22(n＝9；*表示与NP高剂量组比较P<0.01；#表示与绿茶干预组比较P<0.01)。
实施例8中不同处理组间大鼠左心室排出量(LVCO)变化情况比较图见图23(n＝9)。
从图13-23中可以看出，NP高剂量组心室壁有所损伤，表现为左室收缩末期前壁变薄(FLVAWs＝21.200,P<0.001)，左心室舒张末期内径增大(FLVIDd＝16.531,P<0.001)，经绿茶和锌硒茶干预后病变情况均有缓解(P绿茶<0.001,P锌硒茶<0.001)，锌硒茶干预组的效果略高于绿茶干预组(PLVAWs＝0.07,PLVIDd＝0.039)；NP高剂量组左室前壁舒张末期室壁变薄(PLVAWd＝0.018)，经锌硒茶干预后略有缓解(P＝0.054)；其余LVAWd，LVPWd、LVPWs、LVIDs、LVCO尚未观察到明显变化。
实施例9
持续灌胃180天后，大鼠血清心肌酶谱检测：
大鼠采血：1％戊巴比妥(40mg/kg)进行麻醉大鼠，待大鼠全身变软，随即将大鼠固定于手术台上，用常规消毒剪刀迅速打开腹腔，用小镊子细心找到腹主动脉，固定血管，一次性采血针抽取腹主动脉血约5mL，贴上标签并置于碎冰备用；大鼠血清制备：腹主动脉取血后，贴上对应标签并立即4℃低温离心机离(4000r/min)离心，离心时间15min，可见上清为透明淡黄色液体，用精准移液器细心吸取上清液于洁净离心管内，经0.22μm滤器过滤以除菌，封口并置于-20℃保存备用；上机检测心肌酶：
NP染毒结束，各组中随机抽取6只大鼠空腹腹主动脉血3mL，经离心分离血清。全自动生化分析仪(AU5800，Beckman Coulter)检测血清心肌酶：AST、CK、CK-MB、LDH和α-HBDH。
实施例9中不同处理组间大鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平比较图见图24(n＝6；*表示与NP高剂量组比较P<0.05；#表示与绿茶干预组比较P<0.05)。
实施例9中不同处理组间大鼠血清肌酸激酶(CK)水平比较图见图25(n＝6；*表示与NP高剂量组比较P<0.05；#表示与绿茶干预组比较P<0.05)。
实施例9中不同处理组间大鼠血清肌酸激酶同工酶(CKMB)水平比较图见图26(n＝6；*表示与NP高剂量组比较P<0.05；#表示与绿茶干预组比较P<0.05)。
实施例9中不同处理组间大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)水平比较图见图27(n＝6；*表示与NP高剂量组比较P<0.05)。
实施例9中不同处理组间大鼠血清a-羟丁酸脱氢酶(a-HBDH)水平比较图见图28(n＝6；*表示与NP高剂量组比较P<0.05；#表示与绿茶干预组比较P<0.05)。
从图24-24中可以看出，NP高剂量组大鼠血清心肌酶谱AST、CK、CK-MB、LDH、a-HBDH显著升高(FAST＝37.535，P<0.001；FCK＝26.986，P<0.001；FCK-MB＝14.066，P<0.001；FLDH＝107.108，P<0.001；Fa-HBDH＝28.077，P<0.001)。绿茶干预后，与NP高剂量组比较，心肌酶谱下降不显著，差异无统计学意义；与对照组比较，差异有统计学意义，绿茶组血清心肌酶谱均高于对照组。经锌硒茶干预后血清心肌酶谱均显著下降(P<0.001)；与绿茶相比，锌硒茶的干预组血清中AST、CK、LDH、a-HBDH均显著下降(P<0.05)，锌硒茶干预效果优于绿茶。
实施例10
持续灌胃180天后，RT-PCR检测大鼠心肌组织中collegenⅠ、collegenⅢmRNA的表达水平：
取新鲜心脏组织50mg+1mL Trizol，匀浆，然后室温充分裂解5min，然后摇匀并加200μl氯仿，充分震荡15s，静置2min，放于4℃离心机(12000r/min)，离心15min，取适量上清与异丙醇按1:1混匀，静置15min，4℃离心机(12000r/min)离心15min，去上清。酒精清洗2次，沉淀在空气中干燥，后加入50μL DEPC水溶解，取2μL测RNA浓度，根据测得的RNA浓度稀释样品浓度为100μg/μL。进行去除基因组、反转录、RT-PCR检测。引物序列见表4：
表4
Figure BDA0003197774560000151
实施例10中不同处理组组间大鼠心脏组织中collagenI基因mRNA表达情况比较图见图29(n＝9；**表示与对照组比较P<0.05；*表示与NP高剂量组比较P<0.01；#表示与绿茶干预组比较P<0.05)。
实施例10中不同处理组组间大鼠心脏组织中collagenⅢ基因mRNA表达情况比较图见图30(n＝9；**表示与对照组比较P<0.05；*表示与NP高剂量组比较P<0.01；#表示与绿茶干预组比较P<0.05)。
从图29-30中可以看出，NP高剂量组collagenⅠ与collagenⅢ的mRNA表达显著增高(FcollagenⅠ＝138.580，FcollagenⅢ＝149.582，P<0.01)，经茶叶干预后均有所下降(P绿茶<0.001，P锌硒茶<0.001)，锌硒茶的干预效果优于绿茶组干预效果(P<0.001)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种锌硒茶在制备缓解NP诱发的心脏毒性的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述锌硒茶中有机锌含量为40-100mg/kg，有机硒含量为0.25-3.50mg/kg。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓解NP诱发的心脏毒性的药物中的活性成分为锌硒茶。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述缓解NP诱发的心脏毒性的药物中还包含可接受的药用辅料。
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