CN113466450B - 一种多联检免疫层析试剂卡以及多联检免疫层析检测方法 - Google Patents

一种多联检免疫层析试剂卡以及多联检免疫层析检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多联检免疫层析试剂卡，试剂卡内设有样品垫、结合垫、固相载体以及吸水垫，所述样品垫的一端形成为加样端；所述样品垫的另一端与结合垫的一端搭接，所述结合垫的另一端与固相载体搭接，所述固相载体的另一端与吸水垫搭接；所述固相载体上设有检测线；所述检测线上包被有多种第一抗体，所述结合垫上设有多种第二抗体，各种第二抗体上偶联的检测信标物质不同。一种多联检层析检测方法，包括，加样步骤；层析步骤一；检测步骤一；定量步骤。本发明可实现多种目标物同时检测。

Description

一种多联检免疫层析试剂卡以及多联检免疫层析检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种多联检免疫层析试剂卡以及多联检免疫层析检测方法。
背景技术
目前，临床上单一指标检测对相应病症的诊断率往往不高，对临床上的指导意义不大，多项目联合检测能极大提高其诊断率，甚至能知道发病时间，能提供更多的信息给临床医生，而临床上联检的实现形式有多项目分别单检和联检试剂卡。
其中一种实现方式，多项目分别单检即采用多条试剂卡分别对目标样品中的相应标志物进行检测，然后统计分析每条试剂卡的检测结果。但是，多项目分别单检缺点显而易见，多少个项目就要做多少次检测，试剂卡用量大，医护人员的工作量极大提高，患者及其家属要承担的费用大大增加，加剧医患矛盾。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种多联检免疫层析试剂卡，其在一条检测线上包被多种单克隆抗体，实现多种目标物同时检测。
本发明的目的之二在于提供一种多联检免疫层析检测方法，其可同时检测多种目标物。
本发明的目的之一采用以下技术方案实现：
一种多联检免疫层析试剂卡，试剂卡内设有样品垫、结合垫、固相载体以及吸水垫，所述样品垫的一端形成为加样端；所述样品垫的另一端与结合垫的一端搭接，所述结合垫的另一端与固相载体搭接，所述固相载体的另一端与吸水垫搭接；所述固相载体上设有检测线；所述检测线上包被有多种第一抗体，所述结合垫上设有多种第二抗体，各种第二抗体上偶联的检测信标物质不同。
进一步地，所述第一抗体为特异性单抗；所述第二抗体为标记单抗，各种标记单抗上偶联的检测信标物质不同。
进一步地，所述检测线上的多个特异性单抗为鼠抗人D二聚体单抗1、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1、鼠抗人肌红蛋白单抗1、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1；所述结合垫上的标记单抗为鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2－荧光微球偶联物。
进一步地，所述固相载体上设有质控线，所述质控线上设有第三抗体；所述结合垫上设有用于与所述第三抗体偶联的标定信标物质。
进一步地，所述第三抗体为动物的多克隆抗体。
进一步地，所述检测信标物质的激发光波长为190nm－1000nm之间。
进一步地，所述检测信标物质的激发光波长为300nm－600nm之间。
进一步地，所述检测信标物质的激发光波长为365nm。
进一步地，所述检测信标物质产生的发射光波长为190nm－1000nm 之间。
进一步地，所述检测信标物质产生的发射光波长为400nm－800nm 之间。
进一步地，所述检测信标物质为荧光染料、荧光微球、胶乳微球、量子点微球、聚集诱导发光材料、上转换发光材料中的一种或几种。
本方案的目的之二采用以下技术方案来实现：
一种多联检层析检测方法，包括，
加样步骤，向带有不同第一检测信标物质的多种第二抗体中加入待测样品，得到样本混合液一，所述样本混合液中含有由所述第二抗体和目标检测物结合的抗原抗体复合物一；
层析步骤一，对样本混合液进行层析操作，使所述样本混合液一与表面固定有第一抗体的固相载体接触，所述第一抗体通过捕获所述抗原抗体复合物一，以在所述固相载体表面形成抗原抗体复合物二；
检测步骤一，检测所述抗原抗体复合物二中的不同第一检测信标物质的光信号值；
定量步骤，标定其中一种第一检测信标物质的光信号值为标准值，将另外的不同第一检测信标物质的光信号值与所述标准值进行比对，得出待测样品中的目标物的含量。
进一步地，所述加样步骤中，在样本混合液一中加入第二检测信标物质；所述层析步骤一中，对样本混合液进行层析操作，使所述样本混合液一与表面固定有第一抗体的固相载体接触，所述第一抗体通过捕获所述抗原抗体复合物一，以在所述固相载体表面形成抗原抗体复合物二以及混有第二检测信标物质的样本混合液二；在所述层析步骤一之后，还包括层析步骤二，对样本混合液二进行层析操作，使所述样本混合液二与表面固定有第三抗体的固相载体接触，所述第三抗体偶联所述第二检测信标物质，以在所述固相载体表面形成第三抗体－第二检测信标物质的偶联物；
在所述层析步骤二之后，还包括检测步骤二，检测第三抗体－第二检测信标物质的偶联物中第二检测信标物质的光信号值，以用作所述定量步骤中的标准值。
进一步地，所述检测步骤一中，检测器通过更换滤光片或者使用光栅分别检测各个第一检测信标物质在对应发射波长下的光信号值。
需要说明的是，采用本申请的方案来实现联检，是基于申请人发现联检试剂卡采用的方法是在检测区域固相载体上划多条检测线，分别包被不同的单克隆抗体，在结合垫区域检测信标物质分别标记对应的标记单克隆抗体，在侧向层析作用下，分别被对应的检测线截留，通过对每条检测线的信标所带信号进行采集实现多种目标物的联合检测。
上述联检试剂卡完成了一次加样同时检测多个目标物，相对于各项目分别单检有了一定程度的提高，但经仔细分析发现上述原理的多联检试剂卡存在较大的缺陷，多条检测线的检测结果与单独检测结果偏差较大，因为多条检测线在监测区域依次排列，设为T1、T2···Tn，而临床样本从T1开始依次流向Tn，每条检测线都会特异性捕获对应的目标物－抗体－信标复合物，然而T1捕获完特异的目标物－抗体－信标复合物后会形成一道滤网结构，会非特异性拦截部分其他检测线特异性捕获的目标物－抗体－信标复合物，以此类推，每条检测线都会非特异性拦截后面检测线的特异性捕获的目标物－抗体－信标复合物，这里的拦截不是检测线之间的化学干扰，而是物理拦截，最终导致的结果前面检测线的检测结果出现假阳性，而后面检测线的检测结果出现假阴性，同时由于在实际检测过程中每个目标物的浓度都不一样，每条检测线的拦截能力不一样，所以其最终检测结果也难以通过数据处理去修正，因此，这种模式的多联检试剂卡检测结果与其真实结果可能偏差较大。
基于上述缺陷，本申请中的试剂卡上的一条检测线上包被有多种目标检测物的第一抗体，在结合垫上有多种能与不同目标检测物特异性结合的第二抗体，每一种第二抗体上偶联不同的检测信标物质，每一种检测信标物质所带的信号不重叠、无交叉，当临床样本添加到加样区后，在结合垫区域目标物分别与其标记第二抗体－检测信标物质结合，在检测线被对应的第一抗体捕获，在一定条件下，检测信标物质显示不同的信号，通过对这些信号进行转换计算得到目标物的含量，实现对多种目标物的联合检测，且不会出现重叠或者干扰的情况。
附图说明
图1为本发明的试剂卡的结构示意图。
图中：10、试剂卡；11、样品垫；12、结合垫；13、固相载体； 131、检测线；132、质控线；14、吸水垫。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。
实施例1，
如图1所示的一种多联检免疫层析试剂卡10，试剂卡10内设有样品垫11、结合垫12、固相载体13以及吸水垫14，该样品垫11的一端形成为加样端，样品垫11的另一端与结合垫12的一端搭接，结合垫12的另一端与固相载体13搭接，固相载体13的另一端与吸水垫14搭接。
具体在固相载体13上设有检测线131，该检测线131上可包被有多种第一抗体，另外，在结合垫12上设有多种第二抗体，各种第二抗体上偶联的检测信标物质不同。
需要说明的是，本实施例中的固相载体以NC膜为例进行说明。在其他情况下，固相载体可以选用为现有技术中的聚苯乙烯塑料，在此材料中，抗原或抗体以非共价或物理吸附方式结合到此载体上；当然，还可以选用微粒载体，易于抗体(抗原)形成化学偶联，且结合容量大，也可以选用其他膜载体，玻璃纤维素膜及尼龙膜等。
此外，上述结合垫也可选用为上述固相载体材料制成，而吸水垫可以选用吸水材质制成。
申请人发现，如果上述联检试剂卡完成了一次加样同时检测多个目标物，相对于各项目分别单检有了一定程度的提高，但经仔细分析发现上述原理的多联检试剂卡存在较大的缺陷，多条检测线的检测结果与单独检测结果偏差较大，因为多条检测线在监测区域依次排列，设为T1、T2···Tn，而临床样本从T1开始依次流向Tn，每条检测线都会特异性捕获对应的目标物－抗体－信标复合物，然而T1捕获完特异的目标物－抗体－信标复合物后会形成一道滤网结构，会非特异性拦截部分其他检测线特异性捕获的目标物－抗体－信标复合物，以此类推，每条检测线都会非特异性拦截后面检测线的特异性捕获的目标物－抗体－信标复合物，这里的拦截不是检测线之间的化学干扰，而是物理拦截，最终导致的结果前面检测线的检测结果出现假阳性，而后面检测线的检测结果出现假阴性，同时由于在实际检测过程中每个目标物的浓度都不一样，每条检测线的拦截能力不一样，所以其最终检测结果也难以通过数据处理去修正，因此，这种模式的多联检试剂卡检测结果与其真实结果可能偏差较大。
基于上述缺陷，本发明的多联检免疫层析试剂卡10时，可以是在加样垫的加样端加入样品，样品中的目标抗原可以经加样垫层析至结合垫12，与结合垫12上的第二抗体－检测信标物质的耦合物进行结合，形成抗原抗体复合物，且形成的抗原抗体复合物带有检测信标物质。
此后，结合垫12上的抗原抗体复合物可以层析至NC膜13的检测线131上，在检测线131上包被有多种与不同目标抗原结合第一抗体，因而在上述抗原抗体复合物层析至检测线131时可与对应的第一抗体进一步的结合，并在检测线131处被固定，此后，在检测线131被固定的抗原抗体复合物带有不同的检测信标物质，可直接通过外部检测器，检测不同检测信标物质的信号，通过对这些信号进行转换计算得到目标物的含量，实现对多种目标物的联合检测，且不会出现重叠或者干扰的情况。
基于上述方案，申请人实施了以下对比测试：
测试方案
一、实验目的
验证免疫层析试剂卡的多检测线多目标物联检和单检测线多目标物联检以及多目标物分别单检之间的差异性，本方案以心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白三种检测目标物为例。
二、材料与仪器
心肌肌钙蛋白I检测试剂卡(荧光免疫层析法)：本公司自行制备，结合垫上鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体标记微球的最大激发波长为365nm，最大发射波长为615nm。
肌酸激酶同工酶检测试剂卡(荧光免疫层析法)：本公司自行制备，结合垫上鼠抗人肌酸激酶同工酶单克隆抗体标记微球的最大激发波长为365nm，最大发射波长为615nm。
肌红蛋白检测试剂卡(荧光免疫层析法)：本公司自行制备，结合垫上鼠抗人肌红蛋白单克隆抗体标记微球的最大激发波长为 365nm，最大发射波长为615nm。
心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白联合检测试剂卡(荧光免疫层析法)：本公司自行制备，其NC膜上划有三条检测线和一条质控线，分别定义为T1、T2、T3和C线，T1包被鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1，T2包被鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1，T3包被鼠抗人肌红蛋白单抗1，C线包被兔抗鸡IgY，结合垫上分别有鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2、鼠抗人肌红蛋白单抗2以及鸡IgY标记荧光微球偶联物，此四种抗体标记的是同一种荧光微球，微球的最大激发波长为365nm，最大发射波长为615nm。
单检测线心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白联合检测试剂卡(荧光免疫层析法)：本公司自行制备，其NC膜上划有一条检测线和一条质控线，分别定义为T和C线，T线包被鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1和鼠抗人肌红蛋白单抗1，C线包被兔抗鸡IgY，结合垫上分别有鼠抗人心肌肌钙蛋白I 单抗2、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2、鼠抗人肌红蛋白单抗2以及鸡IgY标记荧光微球偶联物，四种抗体标记的荧光微球最大激发波长均为365nm，最大发射波长分别为450、540、630、630nm，其发射峰半峰宽均不超过30nm。
试剂：磷酸盐缓冲液、心肌肌钙蛋白I抗原(1mg/mL)、肌酸激酶同工酶抗原(1mg/mL)、肌红蛋白抗原(1mg/mL)；
仪器：荧光免疫分析仪、日立F7000荧光光谱仪等
三、实验方法
1、分别用磷酸盐缓冲液稀释心肌肌钙蛋白I抗原(1mg/mL)、肌酸激酶同工酶抗原(1mg/mL)、肌红蛋白抗原(1mg/mL)配制标准曲线梯度浓度样本，对三种检测模式的试剂卡分别进行定标，拟定检测标准曲线；
2、使用不同浓度搭配心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白磷酸盐缓冲液混合样本分别采用各项目单检试剂卡、多检测线联检试剂卡、单检测线联检试剂卡检测；
3、各项目单检测及多检测线联检试剂卡均直接采用荧光免疫分析仪分别读取各检测线及质控线的荧光信号值，得到检测结果；单检测线多联检试剂卡加样15min后分别用小刀切割出T和C线区域，分别放入500μL磷酸盐缓冲液中超声5min洗脱，将洗脱液分别在荧光光谱仪固定激发波长为365nm下扫描发射光谱图，扫描范围为 390～700nm，T线洗脱液发射光谱图有三个发射峰，其最高峰位置分别为450、540、630nm处，C线洗脱液发射光谱图有一个发射峰，其最高峰位置在630nm处，通过光谱仪上T线450、540、630nm处荧光强度与C线630nm处荧光强度的比值得出检测信号值，从而得到检测结果。
四、实验结果
1、分别定标：下述表1以及表2中所涉及的蛋白中英文名称对应如下：
表1.各试剂卡分别定标
Figure BDA0003174515840000111
2、不同浓度组合检测结果对比：
表2.不同混合溶液检测结果
Figure BDA0003174515840000112
Figure BDA0003174515840000121
五、实验结果讨论
根据实验方法，配制含三种不同浓度目标物的混合溶液，分别用单一检测试剂卡、多检测线联检试剂卡以及单一检测线联检试剂卡检测混合溶液中各目标物的含量，其检测结果如表2所示，从表2数据可得出，单一检测线联检试剂卡与各项目单独检测试剂卡检测结果的一致性较高，而多检测线联检试剂卡则偏差较大，与真实结果的偏离程度从3.1％到72.8％不等，尤其是心肌肌钙蛋白I浓度过高时对肌酸激酶同工酶以及肌红蛋白的检测结果影响极大，容易产生假阳性及假阴性结果，导致这一现象是由于在层析的过程中，先经过的检测线相对于后经过的检测线形成了一道物理上的屏障，非特异性拦截了标记的荧光微球，导致T1线的检测结果相对于真实结果往往偏高，而后面的检测线由于被前面的检测线非特异性拦截了部分荧光微球，导致其检测结果往往相对于真实结果偏低，然而在临床应用的过程中，样本类型千差万别，对检测结果的影响程度均不一致，几乎不可能通过人为处理数据修正其检测结果。
六、实验结论
综上所述，单一检测线多联检试剂卡相对于目前应用较多的多检测线联检试剂卡有明显的技术进步，解决了多检测线联检试剂卡自身固有缺陷导致假阳/阴性的问题，在医学检验领域有很好的应用前景。具体的是，本实施例中的第一抗体为特异性单抗，对应的第二抗体为标记单抗，且各种标记单抗上偶联的检测信标物质不同。需要说明的是，同一种目标抗原上具有不同的结合位点，因而特异性单抗和标记单抗可以结合在目标抗原的不同位点，用于标记以及固相检测。
实施例2，
本实施例不同于实施例1的是，检测线131上的多个特异性单抗为鼠抗人D二聚体单抗1、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1、鼠抗人肌红蛋白单抗1、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1，对应在结合垫12上的标记单抗为鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2－荧光微球偶联物。
在上述结构基础上，在检测线131上分别包被了鼠抗人D二聚体单抗1、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1、鼠抗人肌红蛋白单抗1、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1，在结合垫12上喷有鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2－荧光微球偶联物，临床样本加到样品垫11上后开始侧向层析，样本中的D二聚体、心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶在结合垫12处因为免疫反应分别特异性结合鼠抗人D二聚体单抗－荧光微球偶联物、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗－荧光微球偶联物、鼠抗人肌红蛋白单抗－荧光微球偶联物、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗－荧光微球偶联物。
如此，目标物均在检测线131被捕获，检测器通过更换滤光片或者使用连续光栅分别检测各个发射波长下的荧光信号值，通过每种目标物的校准品测试建立目标物浓度与检测信号值之间的线性关系，根据未知样检测的信号值分别读出未知样中的D二聚体、心肌肌钙蛋白 I、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的含量。
具体的是，D二聚体在试剂卡10上层析后，在检测线131固定得到，鼠抗人D二聚体单抗1－D二聚体－鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到 450nm的发射光进行检测，如此便可得到在450nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到D二聚体的含量。
心肌肌钙蛋白I在试剂卡10上层析后，在检测线131固定得到，鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1－心肌肌钙蛋白I－鼠抗人心肌肌钙蛋白 I单抗2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到 360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到510nm的发射光进行检测，如此便可得到在510nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到心肌肌钙蛋白I的含量。
肌红蛋白在试剂卡10上层析后，在检测线131固定得到，鼠抗人肌红蛋白单抗1－肌红蛋白－鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到570nm的发射光进行检测，如此便可得到在570nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到肌红蛋白的含量。
肌酸激酶同工酶在试剂卡10上层析后，在检测线131固定得到，鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1－肌酸激酶同工酶－鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到 360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到630nm的发射光进行检测，如此便可得到在630nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到肌酸激酶同工酶的含量。
在上述测试过程中，均采用相同波长的激发光来激发对应的荧光微球，但是，各个荧光微球的发射光波长不同，经过不同的滤光片或者光栅来过滤，得到不同的检测波长即可，从而对应各种荧光微球标定的目标检测物。
当然，针对不同的目标物选用不同的激发光或者发射光即可。
进一步地，为了建立一测试标准，还可以在NC膜13上设有质控线132，所述质控线132上设有第三抗体，具体在结合垫12上设有与第三抗体偶联的标定信标物质。具体的是，样品层析过程中，样品中的目标检测物与对应的第一抗体、第二抗体－检测信标物质结合，而结合垫12上的标定信标物质则可层析至质控线132与对应的第三抗体结合，检测器可以是测量质控线132上的标定信标物质的信号值，将检测线131上得到检测信标物质的信号值与质控线132上的标定信标物质的信号值建立线性关系进行比对即可。
需要说明的是，在没有上述质控线132的情况下，即在实施例1 中的方案基础上，可以是选用检测线131中的其中一种检测信标物质的信号值为标准，建立线性关系，即相当于是在检测线内置用作标准的质控线。
具体的是，第三抗体为动物的多克隆抗体，本实施例中，上述第三抗体可以选用为现有技术中的兔抗鸡IgY，对应的与该兔抗鸡IgY 的标定信标物质为鸡IgY－荧光微球，在进行检测时，结合垫12上的鸡IgY－荧光微球可层析至NC膜13，与质控线132上包被的兔抗鸡 IgY结合而被捕获，检测器可以检测兔抗鸡IgY－IgY－荧光微球复合物中的荧光微球的光信号值。
以目标检测物为上述D二聚体、心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶，在检测时，与对应的鼠抗人D二聚体单抗1、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1、鼠抗人肌红蛋白单抗1、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1，以及结合垫12上喷有鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2－荧光微球偶联物结合，采用的激发光光波均为365nm，对应的检测荧光微球产生的发射光为450nm、510nm、570nm以及630nm，而上述质控线 132上的兔抗鸡IgY－IgY－荧光微球复合物中的荧光微球检测时，选用的激发光也可为365nm，对应的发射光为630nm，即可检测信标荧光微球测得对应的450nm、510nm、570nm以及630nm的荧光信号值与标定信标荧光微球630nm的荧光信号值进行比对。
进一步地，检测信标物质的激发光波长为190nm－1000nm之间，适用于不同的检测信标物质，如为荧光染料、荧光微球、胶乳微球、量子点微球、聚集诱导发光材料、上转换发光材料中的一种或几种。
更具体的是，上述检测信标物质的激发光波长为300nm－600nm之间，如为荧光染料、荧光微球、胶乳微球、量子点微球、聚集诱导发光材料中的一种或几种。
当然，在本实施例中，选用的检测信标物质的激发光波长为 365nm。
同样的是，检测信标物质产生的发射光波长为190nm－1000nm之间。适用于不同的检测信标物质，如为荧光染料、荧光微球、胶乳微球、量子点微球、聚集诱导发光材料、上转换发光材料中的一种或几种。
进一步地，检测信标物质产生的发射光波长为400nm－800nm之间。
进一步地，检测信标物质为荧光染料、荧光微球、胶乳微球、量子点微球、聚集诱导发光材料、上转换发光材料中的一种或几种。
当然，除了上述的荧光信号外，也可以是纳米金的红色，纳米碳的黑褐色，磁性微球的磁信号等用作标定检测信号。
实施例3，
一种多联检层析检测方法，包括，
加样步骤，向带有不同第一检测信标物质的多种第二抗体中加入待测样品，得到样本混合液一，所述样本混合液中含有由所述第二抗体和目标检测物结合的抗原抗体复合物一；
层析步骤一，对样本混合液进行层析操作，使所述样本混合液一与表面固定有第一抗体的固相载体接触，所述第一抗体通过捕获所述抗原抗体复合物一，以在所述固相载体表面形成抗原抗体复合物二；
检测步骤一，检测所述抗原抗体复合物二中的不同第一检测信标物质的光信号值；
定量步骤，标定其中一种第一检测信标物质的光信号值为标准值，将另外的不同第一检测信标物质的光信号值与所述标准值进行比对，得出待测样品中的目标物的含量。
对应上述方案的一种实施方案是：
上述用作多个第一抗体的固相载体为NC膜，混合样本可以是通过滴管与结合垫上进行，结合垫可以与NC膜搭接，进行层析操作。
在检测时，样品可以通过滴管滴在载有鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2－荧光微球偶联物的结合垫上，经过层析操作，均在固相载体NC 膜的检测线被对应的鼠抗人D二聚体单抗1、鼠抗人心肌肌钙蛋白I 单抗1、鼠抗人肌红蛋白单抗1、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1捕获，检测器通过更换滤光片或者使用连续光栅分别检测各个发射波长下的荧光信号值，通过每种目标物的校准品测试建立目标物浓度与检测信号值之间的线性关系，根据未知样检测的信号值分别读出未知样中的D二聚体、心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的含量。
具体过程如下，D二聚体在试剂卡上层析后，在检测线固定得到，鼠抗人D二聚体单抗1－D二聚体－鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到450nm 的发射光进行检测，如此便可得到在450nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到D二聚体的含量。
心肌肌钙蛋白I在试剂卡上层析后，在检测线固定得到，鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1－心肌肌钙蛋白I－鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到510nm的发射光进行检测，如此便可得到在510nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到心肌肌钙蛋白I的含量。
肌红蛋白在试剂卡上层析后，在检测线固定得到，鼠抗人肌红蛋白单抗1－肌红蛋白－鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到570nm的发射光进行检测，如此便可得到在570nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到肌红蛋白的含量。
肌酸激酶同工酶在试剂卡上层析后，在检测线固定得到，鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1－肌酸激酶同工酶－鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗 2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到630nm的发射光进行检测，如此便可得到在630nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到肌酸激酶同工酶的含量。
在上述测试过程中，均采用相同波长的激发光来激发对应的荧光微球，但是，各个荧光微球的发射光波长不同，经过不同的滤光片或者光栅来过滤，得到不同的检测波长即可，从而对应各种荧光微球标定的目标检测物。
当然，针对不同的目标物选用不同的激发光或者发射光即可。
实施例4，
与实施例3不同的是，在实施例3中的加样步骤中，在样本混合液一中加入第二检测信标物质；所述层析步骤一中，对样本混合液进行层析操作，使所述样本混合液一与表面固定有第一抗体的固相载体接触，所述第一抗体通过捕获所述抗原抗体复合物一，以在所述固相载体表面形成抗原抗体复合物二以及混有第二检测信标物质的样本混合液二；在所述层析步骤一之后，还包括层析步骤二，对样本混合液二进行层析操作，使所述样本混合液二与表面固定有第三抗体的固相载体接触，所述第三抗体偶联所述第二检测信标物质，以在所述固相载体表面形成第三抗体－第二检测信标物质的偶联物；
在所述层析步骤二之后，还包括检测步骤二，检测第三抗体－第二检测信标物质的偶联物中第二检测信标物质的光信号值，以用作所述定量步骤中的标准值。
对应上述方案的一种实施方案是，
上述用作多个第一抗体的固相载体为NC膜，混合样本可以是通过滴管与结合垫上进行，结合垫可以与NC膜搭接，进行层析操作。
在检测时，样品可以通过滴管滴在载有鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2－荧光微球偶联物的结合垫上，经过层析操作，均在固相载体NC 膜的检测线被对应的鼠抗人D二聚体单抗1、鼠抗人心肌肌钙蛋白I 单抗1、鼠抗人肌红蛋白单抗1、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1捕获，检测器通过更换滤光片或者使用连续光栅分别检测各个发射波长下的荧光信号值，通过每种目标物的校准品测试建立目标物浓度与检测信号值之间的线性关系，根据未知样检测的信号值分别读出未知样中的D二聚体、心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的含量。
具体过程如下，D二聚体在试剂卡上层析后，在检测线固定得到，鼠抗人D二聚体单抗1－D二聚体－鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到450nm 的发射光进行检测，如此便可得到在450nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到D二聚体的含量。
心肌肌钙蛋白I在试剂卡上层析后，在检测线固定得到，鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1－心肌肌钙蛋白I－鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗 2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到510nm的发射光进行检测，如此便可得到在510nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到心肌肌钙蛋白I的含量。
肌红蛋白在试剂卡上层析后，在检测线固定得到，鼠抗人肌红蛋白单抗1－肌红蛋白－鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到570nm的发射光进行检测，如此便可得到在570nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到肌红蛋白的含量。
肌酸激酶同工酶在试剂卡上层析后，在检测线固定得到，鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1－肌酸激酶同工酶－鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗 2－荧光微球复合物，即检测器可以检测该复合物中的荧光微球光信号值，具体检测器产生的激发光可以透过滤光片或者光栅得到360nm的激发光，荧光微球激发后产生的发射光同样可以透过滤光片或者光栅得到630nm的发射光进行检测，如此便可得到在630nm发射光下的荧光信号值，将其与标准值进行比对转换即可得到肌酸激酶同工酶的含量。
本实施例中，上述第三抗体可以选用为现有技术中的兔抗鸡IgY，对应的与该兔抗鸡IgY的标定信标物质为鸡IgY－荧光微球，在进行检测时，结合垫上的鸡IgY－荧光微球可层析至NC膜，与质控线上包被的兔抗鸡IgY结合而被捕获，检测器可以检测兔抗鸡IgY－IgY－荧光微球复合物中的荧光微球的光信号值。
以目标检测物为上述D二聚体、心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶，在检测时，与对应的鼠抗人D二聚体单抗1、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1、鼠抗人肌红蛋白单抗1、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1，以及结合垫上喷有鼠抗人D二聚体单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌红蛋白单抗2－荧光微球偶联物、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2－荧光微球偶联物结合，采用的激发光光波均为365nm，对应的检测荧光微球产生的发射光为450nm、510nm、570nm以及630nm，而上述质控线上的兔抗鸡IgY－IgY－荧光微球复合物中的荧光微球检测时，选用的激发光也可为365nm，对应的发射光为630nm，即可检测信标荧光微球测得对应的450nm、510nm、570nm以及630nm的荧光信号值与标定信标荧光微球630nm的荧光信号值进行比对。
即为了建立一测试标准，还可以在NC膜上设有第三抗体，具体在结合垫上设有与第三抗体偶联的标定信标物质。具体的是，样品层析过程中，样品中的目标检测物与对应的第一抗体、第二抗体－检测信标物质结合，而结合垫上的标定信标物质则可层析至质控线与对应的第三抗体结合，检测器可以是测量质控线上的标定信标物质的信号值，将检测线上得到检测信标物质的信号值与质控线上的标定信标物质的信号值建立线性关系进行比对即可。
需要说明的是，在没有上述质控线的情况下，即在实施例3中的方案基础上，可以是选用检测线中的其中一种检测信标物质的信号值为标准，建立线性关系，即相当于是在检测线内置用作标准的质控线。在上述测试过程中，均采用相同波长的激发光来激发对应的荧光微球，但是，各个荧光微球的发射光波长不同，经过不同的滤光片或者光栅来过滤，得到不同的检测波长即可，从而对应各种荧光微球标定的目标检测物。
当然，针对不同的目标物选用不同的激发光或者发射光即可。
进一步地，检测步骤一中，检测器通过更换滤光片或者使用光栅分别检测各个第一检测信标物质在对应发射波长下的光信号值。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种无需外加参照物的多联检层析检测方法，其特征在于，包括，
加样步骤，向带有不同第一检测信标物质的多种第二抗体中加入待测样品，得到样本混合液一，所述样本混合液中含有由所述第二抗体和目标检测物结合的抗原抗体复合物一，由此实现所述第一检测信标物质标记所述目标检测物，所述第一检测信标物质为激发波长相同的荧光微球，所述荧光微球包括最大发射波长为450 nm的荧光微球Ⅰ、最大发射波长为510 nm的荧光微球Ⅱ、最大发射波长为540 nm的荧光微球Ⅲ、最大发射波长为570 nm的荧光微球Ⅳ、最大发射波长为630 nm的荧光微球Ⅴ中的至少一种，用于标记不同所述目标检测物的所述第一检测信标物质的最大发射波长不同；
层析步骤一，对样本混合液进行层析操作，使所述样本混合液一与表面混合固定有多种第一抗体的检测线接触，所述第一抗体通过捕获所述抗原抗体复合物一，以在所述检测线的表面形成抗原抗体复合物二；
检测步骤一，检测所述抗原抗体复合物二中的不同第一检测信标物质的最大发射波长光信号值；
定量步骤，标定其中一种第一检测信标物质的最大发射波长光信号值为标准值，将另外的不同第一检测信标物质的最大发射波长光信号值与所述标准值进行比对，得出待测样品中的目标物的含量；
在上述步骤中，每种所述第二抗体均与一种所述目标检测物特异性配对；此外，所述第一检测信标物质同时满足激发光波长为300nm-600nm之间、发射光波长为400nm-800nm之间且发射峰的半峰宽均不超过30 nm。
2.如权利要求1所述的多联检层析检测方法，其特征在于，所述检测步骤一中，检测器通过更换滤光片或者使用光栅分别检测各个第一检测信标物质在对应发射波长下的光信号值。
3.多联检免疫层析试剂卡，其特征在于，试剂卡的一端设有加样区，试剂卡的另一端设有检测区；试剂卡内设有样品垫、结合垫、固相载体以及吸水垫，所述样品垫的一端伸入所述加样区；所述样品垫的另一端与结合垫的一端搭接，所述结合垫的另一端与固相载体搭接，所述固相载体的另一端与吸水垫搭接；其特征在于，所述固相载体上设有检测线；所述检测线上混合包被有多种第一抗体，所述结合垫上设有多种第二抗体，每种所述第二抗体均与一种目标检测物特异性配对，每种所述第二抗体上偶联
用于标记所述目标检测物的第一检测信标物质，所述第一检测信标物质为激发波长相同的荧光微球，所述荧光微球包括最大发射波长为450 nm的荧光微球Ⅰ、最大发射波长为510 nm的荧光微球Ⅱ、最大发射波长为540 nm的荧光微球Ⅲ、最大发射波长为570 nm的荧光微球Ⅳ、最大发射波长为630 nm的荧光微球Ⅴ中的至少一种，用于标记不同所述目标检测物的所述第一检测信标物质的最大发射波长不同，此外，所述第一检测信标物质同时满足激发光波长为300nm-600nm之间、发射光波长为400nm-800nm之间且发射峰的半峰宽均不超过30 nm；
所述多联检免疫层析试剂卡上不设有质控线和参照物，定量时，标定其中一种第一检测信标物质的最大发射波长光信号值为标准值，将另外的不同第一检测信标物质的最大发射波长光信号值与所述标准值进行比对，得出待测样品中的目标物的含量。
4.如权利要求3所述的多联检免疫层析试剂卡，其特征在于，所述检测线上的多个特异性单抗为鼠抗人D二聚体单抗1、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗1、鼠抗人肌红蛋白单抗1、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗1；所述结合垫上的标记单抗为鼠抗人D二聚体单抗2-荧光微球偶联物、鼠抗人心肌肌钙蛋白I单抗2-荧光微球偶联物、鼠抗人肌红蛋白单抗2-荧光微球偶联物、鼠抗人肌酸激酶同工酶单抗2-荧光微球偶联物。
5.如权利要求3所述的多联检免疫层析试剂卡，其特征在于，所述第一检测信标物质的激发光波长为365nm。
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