CN113456640A

CN113456640A - 石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的应用

Info

Publication number: CN113456640A
Application number: CN202110989062.XA
Authority: CN
Inventors: 王天; 张策; 李铭安; 由春娜; 傅风华; 刘万卉
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2021-08-26
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2021-10-01

Abstract

本发明研究了石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的应用，具体地研究了长效胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲微球在心肌缺血损伤预防中的药物用途。以ISO诱导小鼠全心缺血模型，观察提前肌肉注射给予石杉碱甲微球对心肌缺血损伤的影响，明确了石杉碱甲微球一次给药后3‑7日内可明显减轻ISO诱导的心肌缺血损伤，即石杉碱甲微球对心肌缺血损伤具有预防作用。

Description

石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的应用

技术领域

本发明专利涉及胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲的药物用途，具体涉及石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的应用。

背景技术

心肌缺血是指冠状动脉的血液灌注量降低导致的心脏供血供氧减少，影响心肌能量代谢，进而导致心脏不能正常工作的一种病理状态。心肌供氧量与心肌需求的平衡状态被打破导致心肌缺血发生。缺血缺氧可导致心肌细胞功能失常，严重时诱发心肌梗死而危及生命。动脉粥样硬化性心脏病是引发心肌缺血的常见疾病。当冠状动脉动脉粥样硬化过程中发生临界狭窄病变(管腔狭窄50%-70%)时，心肌需氧量增加将导致心肌缺血。

动物心肌缺血模型是进行心肌缺血研究的重要手段。常用的心肌缺血模型有：异丙肾上腺素（ISO）诱导动物全心缺血、冠状动脉左前降支结扎和Langendorff体外灌流三种模型。其中ISO诱导心肌缺血模型操作简单，这种模型既可在应用ISO造模前给予受试药物，观察药物的预防作用；也可在应用ISO造模后给药，研究药物的治疗效果。因此，ISO诱导的心肌缺血模型广泛用于心肌缺血药物的药理学研究。

ISO是非选择性β受体激动剂，具有增强心肌收缩力和加快心率作用，ISO增加心肌耗氧量，导致心脏前后负荷增加，使心肌微循环发生障碍。ISO诱导心肌缺血损伤可引起心肌组织病理以及血清生化指标发生明显变化，肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）水平升高。ISO导致的心肌组织形态学改变包括：心肌纤维肿胀、心肌细胞核皱缩不规则、心肌细胞排列紊乱等，并可出现空泡样变性及炎性细胞浸润，以及心肌灶样坏死等。

石杉碱甲是从石杉科植物蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb. ex Murray)Trev.中分离得到的一种生物碱单体，是一种高效、高选择性的可逆性乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂，对前皮质、海马和纹状体等部位AChE均有抑制作用。与他克林、多奈哌齐和利凡斯的明相比，石杉碱甲更易透过血脑屏障，其口服生物利用度更高，对AChE抑制作用持续时间更长，且外周胆碱能副反应弱于多奈哌齐和他克林。研究发现：石杉碱甲具有多种药理作用，其可以改善多种实验性记忆损害，对多种神经退行性疾病具有潜在治疗作用。石杉碱甲可通过调控神经生长因子的表达与分泌、抗谷氨酸受体等途径发挥神经保护作用，还可通过抗氧化应激、抗细胞凋亡等途径对神经细胞产生保护作用。1994年，石杉碱甲片在国内获准上市，其适应症为“适用于良性记忆障碍，提高患者指向记忆、联想学习、图像回忆、无意义图形再认及人像回忆等能力，对痴呆患者和脑器质性病变引起的记忆障碍亦有改善作用。”

石杉碱甲口服制剂在体内代谢迅速且治疗窗范围狭窄，影响其在临床广泛应用。石杉碱甲乙交酯丙交酯共聚物递药系统体外释放研究和体内试验均显示可长时间缓慢释放石杉碱甲，维持大鼠体内平稳血药浓度，对大鼠皮层、纹状体和海马部位AChE活性的抑制作用至少可持续7天，并可持续改善东莨菪碱诱导的记忆功能障碍。

注射用石杉碱甲缓释微球是以乙交酯丙交酯共聚物为载体的石杉碱甲长效缓释制剂，目的是用于轻度或中度阿尔茨海默病的治疗。胆碱酯酶抑制剂长效制剂是否影响缺血诱导的心肌损伤未见报道。

发明内容

本发明研究证明了胆碱酯酶抑制剂长效制剂在心肌缺血损伤预防中的药物用途，具体地研究了长效胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲微球在心肌缺血损伤预防中的药物用途。以ISO诱导小鼠全心缺血模型，观察提前肌肉注射给予石杉碱甲微球对心肌缺血损伤的影响，明确了石杉碱甲微球一次给药后3-7日内可明显减轻ISO诱导的心肌缺血损伤，即石杉碱甲微球对心肌缺血损伤具有预防作用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的用途。

优选的，所述石杉碱甲的剂型为石杉碱甲微球。

优选的，所述石杉碱甲微球为肌肉注射给药。

优选的，所述石杉碱甲微球肌肉注射的剂量为1.8 mg/次。

优选的，所述石杉碱甲微球每周给药一次。

优选的，所述心肌缺血损伤为ISO诱导的心肌缺血损伤。

优选的，所述肌肉注射石杉碱甲微球3或7日具有预防心肌缺血损伤作用。

有益效果：

本发明提供了石杉碱甲微球在预防心肌缺血中的用途，本发明为心肌缺血损伤提供了新的预防思路和治疗药物。

附图说明

附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的具体实施方式一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

图1：石杉碱甲微球提前3 d给药对ISO诱导的心肌缺血小鼠血清CK-MB的影响；

图2：石杉碱甲微球提前7 d给药对ISO诱导的心肌缺血小鼠血清CK-MB的影响；

图3：石杉碱甲微球提前3 d给药对ISO诱导的心肌缺血小鼠心脏组织病理的影响；

图4：石杉碱甲微球提前7 d给药对ISO诱导的心肌缺血小鼠心脏组织病理的影响。

具体实施方式

本发明人通过实验发现，单次给予石杉碱甲微球3 d或7 d后可降低ISO诱导的心肌缺血小鼠血清CK-MB水平，减轻心脏组织病理损伤，表明石杉碱甲微球具有减轻心肌损伤作用，在此基础上完成了本发明。

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体的实施方法对本发明内容作进一步说明。但在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明保护的内容不局限于以下实施例。

通过ISO诱导小鼠心肌缺血损伤实验，测定血清中CK-MB水平，检测心脏组织病理损伤，明确石杉碱甲微球在预防心肌缺血损伤中的作用，步骤如下：

（1）ISO诱导小鼠心肌缺血损伤模型：BALB/c雄性小鼠，体重22 ~ 25 g，48只，随机分为对照组、模型组、石杉碱甲微球（3 d）组；对照组、模型组、石杉碱甲微球（7 d）组，每组8只。适应性喂养3天后，对照组小鼠肌肉注射等体积的0.5%CMC-Na；模型组小鼠肌肉注射等体积的0.5%CMC-Na；石杉碱甲微球组小鼠肌肉注射石杉碱甲微球0.3 mg/kg。在注射石杉碱甲微球后第1 d或第5 d，对照组小鼠皮下注射等体积生理盐水，模型组和石杉碱甲微球组小鼠皮下注射ISO（40 mg/kg），连续注射3 d，在末次注射1 h后取血和心脏。

（2）血清CK-MB的测定：在末次注射ISO 1 h后，通过小鼠眼内眦静脉取血，室温静置0.5 h，4℃，3500 rpm，离心15 min，分离血清检测CK-MB水平。

（3）心脏组织病理学检测：在末次注射ISO 1 h后，每组随机取3只小鼠，过量水合氯醛安乐死小鼠，取小鼠心脏，置于4%多聚甲醛组织固定液中过夜。酒精梯度脱水，石蜡包埋后切片。苏木精-伊红染色，中性树脂封片，观察心脏组织病理变化。

实施例1：石杉碱甲微球制备

精密称取处方量石杉碱甲和高分子乙交酯丙交酯共聚物，以适量二氯甲烷在磁力搅拌下溶解即得油相。量取处方量聚醋酸乙烯酯（0.5%）于烧杯中，搅拌机慢速（400 rpm）搅拌，冰浴至6℃作为水相备用。将搅拌机转速调至1600 rpm，通过蠕动泵（100 rpm）将油相泵入水相上样；继续搅拌（1600 rpm），持续2 min，调节搅拌转速至400 rpm，持续5 h；挥发结束后以10 μm筛+154 μm筛收集微球，以纯化水洗微球5次，转移至培养皿中，冻干过筛，得石杉碱甲微球。

实施例2：石杉碱甲微球制备

精密称取处方量石杉碱甲和高分子乙交酯丙交酯共聚物，以适量二氯甲烷在磁力搅拌下溶解即得油相。量取处方量聚醋酸乙烯酯（1.0%）于烧杯中，搅拌机慢速（400 rpm）搅拌，冰浴至6℃作为水相备用。将搅拌机转速调至1600 rpm，通过蠕动泵（100 rpm）将油相泵入水相上样；继续搅拌（1600 rpm），持续2 min，调节搅拌转速至400 rpm，持续5 h；挥发结束后以10 μm筛+154 μm筛收集微球，以纯化水洗微球5次，转移至培养皿中，冻干过筛，得石杉碱甲微球。

实施例3：石杉碱甲微球制备

精密称取处方量石杉碱甲和高分子乙交酯丙交酯共聚物，以适量二氯甲烷在磁力搅拌下溶解即得油相。量取处方量聚醋酸乙烯酯（2.0%）于烧杯中，搅拌机慢速（400 rpm）搅拌，冰浴至6℃作为水相备用。将搅拌机转速调至1600 rpm，通过蠕动泵（100 rpm）将油相泵入水相上样；继续搅拌（1600 rpm），持续2 min，调节搅拌转速至400 rpm，持续5 h；挥发结束后以10 μm筛+154 μm筛收集微球，以纯化水洗微球5次，转移至培养皿中，冻干过筛，得石杉碱甲微球。

石杉碱甲微球肌肉注射液配制

取上述石杉碱甲微球，加入相应体积0.5%CMC-Na，混匀，小鼠肌肉注射0.1 ml/ 10g。

实施例4：石杉碱甲微球对ISO诱导心肌缺血小鼠血清CK-MB的影响及结果

材料和试剂

石杉碱甲微球，山东绿叶制药有限公司；ISO，Sigma-Aldrich公司；肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒，南京建成生物工程研究所。

动物：SPF级BALB/c小鼠，雄性，体重22 ~ 25 g，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，合格证号：SCXK（鲁）20190003。

仪器：电子天平，上海Mettler Optiphot公司；低温离心机，Eppendorf公司；恒温箱，上海长流科学仪器有限公司；SpectraMax M3多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司。

BALB/c雄性小鼠，体重22 ~ 25 g， 48只，随机分为对照组、模型组、石杉碱甲微球（3 d）组；对照组、模型组、石杉碱甲微球（7 d）组，每组8只。适应性喂养3天后，对照组小鼠肌肉注射等体积的0.5%CMC-Na；模型组小鼠肌肉注射等体积的0.5%CMC-Na；石杉碱甲微球组小鼠肌肉注射石杉碱甲微球0.3 mg/kg。在注射石杉碱甲微球后第1 d或第5 d后，对照组小鼠皮下注射等体积生理盐水，模型组和石杉碱甲微球组小鼠皮下注射ISO（40 mg/kg），连续注射3 d，在末次注射ISO 1 h后通过小鼠眼内眦静脉取血，室温静置0.5 h，离心，4℃，3500 rpm，15 min，分离血清，检测CK-MB水平。结果用平均值±标准差表示。检测结果（图1）显示，单次注射石杉碱甲微球3 d后，与对照组相比，模型组小鼠血清CK-MB活性显著升高（P < 0.01）；与模型组相比，石杉碱甲微球组小鼠血清CK-MB水平降低（P < 0.05）。（图2）显示，单次注射石杉碱甲微球7 d后，与对照组相比，模型组小鼠血清CK-MB活性显著升高（P <0.01）；与模型组相比，石杉碱甲微球组小鼠血清CK-MB水平降低（P < 0.05）。实验结果表明，提前3 d、7 d肌肉注射石杉碱甲微球可降低心肌缺血小鼠血清CK-MB水平，对心肌缺血损伤具有预防保护作用。

实施例4：石杉碱甲微球对ISO诱导的心肌缺血损伤小鼠心肌组织病理的影响及结果

按实施例2中动物分组及给药，在末次注射ISO1 h后，每组随机取3只小鼠，过量水合氯醛安乐死小鼠，取小鼠心脏，置于4%多聚甲醛组织固定液中过夜。酒精梯度脱水，石蜡包埋后切片。苏木精-伊红染色，中性树脂封片，观察心脏组织的病理变化。检测结果（图3）显示，单次注射石杉碱甲微球3 d后，对照组小鼠心肌组织结构未见异常。模型组小鼠心肌膜内见多处心肌坏死，而石杉碱甲微球组小鼠心肌内膜心肌坏死程度减轻，坏死灶减少，面积降低。（图4）显示，单次注射石杉碱甲微球7 d后，对照组小鼠心肌组织结构未见异常。模型组小鼠心肌膜内见多处心肌坏死、炎性细胞浸润。石杉碱甲微球组小鼠心肌未见明显损伤，心肌结构接近正常。结果表明提前3 d、7 d肌肉注射石杉碱甲微球可减轻ISO诱导的缺血性心肌病理损伤。

通过对ISO诱导的心肌缺血小鼠血清CK-MB检测、心脏组织病理学观察，明确石杉碱甲微球抗心肌缺血作用的关键在于石杉碱甲微球可降低ISO诱导的心肌缺血小鼠血清CK-MB水平，减轻心脏组织病理损伤。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的用途。

2.如权利要求1所述的石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的用途，其特征在于，所述石杉碱甲的剂型为石杉碱甲微球。

3.如权利要求1所述的石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的用途，其特征在于，所述石杉碱甲微球为肌肉注射给药。

4.如权利要求1所述的石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的用途，其特征在于，所述石杉碱甲微球肌肉注射的剂量为1.8 mg/次。

5.如权利要求1所述的石杉碱甲在心肌缺血损伤预防中的用途，其特征在于，所述石杉碱甲微球每周给药一次。