CN113440654A - 一种载药抗菌涂层及其制备方法 - Google Patents

一种载药抗菌涂层及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种载药抗菌涂层及其制备方法。本发明一方面提供一种载药抗菌涂层，包括金属基底，所述金属基底上依次负载有聚多巴胺层、新吲哚菁绿层和抗生素层；所述聚多巴胺层的厚度为20～100nm；所述新吲哚菁绿层的厚度为5～50nm；所述抗生素层的厚度为10～50nm。本发明制备过程简单，成本低廉，制备出的载药抗菌涂层能够首先通过抗生素的局部释放抑制细菌生长，预防手术部位感染发生；而一旦感染发生，在短时接受近红外光照射后，该涂层中的新吲哚菁绿可产生活性氧类分子，与多巴胺涂层产生的热量起到协同抗菌的效果。而且，该涂层还改善了金属植入体的生物相容性，降低了内固定失败的发生率。

Description

一种载药抗菌涂层及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种载药抗菌涂层及其制备方法。
背景技术
手术部位感染(Surgical Site Infection，SSI)是外科医师始终需要面对的棘手问题。对于内固定手术，一旦发生SSI，往往由于细菌在内植物表面形成生物膜使治疗变得非常困难，绝大多数患者都需要进行反复的外科清创治疗，甚至需要手术取出内固定，不仅延长住院时间，大幅增加医疗费用，甚至可能致残致死。目前，研究者大多利用抗菌纳米离子涂层、疏水涂层、纳米酶涂层等对内固定物进行表面修饰，使其具备抑制、杀灭生物膜的性能，但这些方法往往成本较高，且效果有限。因此，本发明旨在制备一种成本低廉的光响应涂层，赋予纯钛内植物优异的抗菌能力，以环保、高效、无创的方式预防和治疗SSI。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种载药抗菌涂层及其制备方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种载药抗菌涂层，包括金属基底，所述金属基底上依次负载有聚多巴胺层、新吲哚菁绿层和抗生素层；所述聚多巴胺层的厚度为20～100nm；所述新吲哚菁绿层的厚度为5～50nm；所述抗生素层的厚度为10～50nm。
在本发明的一些实施方式中，所述金属基底选自钛基底。
在本发明的一些实施方式中，所述抗生素层选自达托霉素、利福平、万古霉素、妥布霉素或者庆大霉素中的一种或多种的组合层。
本发明另一方面提供本发明所述的载药抗菌涂层的制备方法，包括如下步骤；
1)将金属基底浸没于多巴胺缓冲溶液中，干燥后制备获得样品A；所述样品A为负载有聚多巴胺层的金属基底；
2)将步骤1)制备获得的样品A浸没于新吲哚菁绿溶液中，干燥后制备获得样品B；所述样品B为继续在聚多巴胺层上负载有新吲哚菁绿层的金属基底；
3)将步骤2)制备获得的样品B浸没于抗生素溶液中，干燥后制备获得载药抗菌涂层。
本发明所提供的载药抗菌涂层的制备方法中，所述步骤1)中多巴胺的缓冲溶液选自Tris–HCl缓冲液；所述缓冲溶液的pH值为8～8.5。
本发明所提供的载药抗菌涂层的制备方法中，所述步骤1)中多巴胺缓冲溶液的质量-体积浓度为2-4mg/mL。
本发明所提供的载药抗菌涂层的制备方法中，所述步骤1)中金属基底需要前处理，所述前处理包括将金属基底打磨抛光，在溶剂中清洗，干燥。
本发明所提供的载药抗菌涂层的制备方法中，所述步骤1)中，将金属基底上浸没于多巴胺的缓冲溶液中，在温度为20℃～30℃下避光振荡，并洗去未负载的多巴胺。
本发明所提供的载药抗菌涂层的制备方法中，所述步骤2)中新吲哚菁绿溶液的质量-浓度为0.01-0.03mg/mL。
本发明所提供的载药抗菌涂层的制备方法中，所述步骤2)中新吲哚菁绿溶液的溶剂选自二甲基亚砜。
本发明所提供的载药抗菌涂层的制备方法中，所述步骤2)中，将步骤1)制备获得的样品A浸没于新吲哚菁绿溶液中，在温度为20℃～30℃下避光振荡，并洗去未负载的新吲哚菁绿。
本发明所提供的载药抗菌涂层的制备方法中，所述步骤3)中抗生素溶液的质量-体积浓度为50～300μg/mL。
本发明所提供的载药抗菌涂层的制备方法中，所述步骤3)中，将步骤2)制备获得的样品B浸没于抗生素溶液中，在温度为20℃～30℃避光振荡，并洗去未负载的抗生素。
附图说明
图1是实施例1制备的钛片、样品A、样品B、载药抗菌涂层的SEM扫描电镜图。
图2是实施例2的体外样品涂板实验结果。
图3是实施例2的各实验组抗菌率。
图4是实施例3的体内样品涂板实验结果。
图5是实施例3的各实验组菌落计数。
图6是实施例4的体外CCK-8实验及ALP染色结果。
图7是实施例5的Van Gieson染色。
具体实施方式
本发明发明人经过大量探索实验，提供了一种载药抗菌涂层及其制备方法，所述方法首先将金属基底浸泡于入多巴胺缓冲溶液中，待多巴胺在金属基底表面自聚合形成涂层后，利用多巴胺涂层与新吲哚菁绿、抗生素间的π-π堆积与疏水相互作用，将其吸附。
本发明第一方面提供一种载药抗菌涂层，包括金属基底，所述金属基底上依次负载有聚多巴胺层、新吲哚菁绿层和抗生素层。
本申请所提供的载药抗菌涂层中，首先在金属基底上负载多巴胺涂层后，可利用多巴胺与新吲哚菁绿之间的π-π堆积作用，使得新吲哚菁绿与金属基底的结合更为紧密。本发明的载药抗菌涂层，可实现对于钛金属表面生物膜形成超过90％的抑制率，抗菌率可高达97.9％。
本申请所提供的载药抗菌涂层中，负载在金属基底上的聚多巴胺通常情况下是层状结构，所述聚多巴胺层的厚度为20～100nm。在一些具体的实施例中，所述聚多巴胺的厚度例如可以是20～40nm，40～60nm，60～80nm，或80～100nm。
本申请所提供的载药抗菌涂层中，负载在聚多巴胺上的新吲哚菁绿通常情况下是层状结构，所述新吲哚菁绿层的厚度为5～50nm。在一些具体的实施例中，所述新吲哚菁绿层的厚度例如可以是5～10nm，10～20nm，20～30nm，30～40nm，或40～50nm。
本申请所提供的载药抗菌涂层中，负载在新吲哚菁绿上的抗生素绿通常情况下是层状结构，所述抗生素的厚度为10～50nm。
本申请所提供的载药抗菌涂层中，所述金属基底选自钛基底。所述钛基底选自钛片和/或钛棒，所述钛片和/或钛棒例如可以是纯钛。
本申请所提供的载药抗菌涂层中，新吲哚菁绿具有高效的活性氧分子产生效率、优异的体内稳定性及良好的生物相容性。新吲哚菁绿的安全性已得到FDA、EMA等组织的认可，被批准应用于临床。
本申请所提供的载药抗菌涂层中，所述抗生素层选自达托霉素、利福平、万古霉素、妥布霉素或者庆大霉素等中的一种或多种的组合层。负载抗生素，例如达托霉素，可利用抗生素的缓释，赋予该涂层预防感染的能力。达托霉素是一种全新结构的环脂肽类抗生素，能够通过破坏细菌细胞膜，快速抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，消灭革兰氏阳性菌。抗生素耐药性是限制抗生素应用的一大障碍，而目前还没有关于达托霉素耐药的报告，它不仅能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌，还对已呈现甲氧西林、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株具有强力活性，这个特性对于危重感染患者具有非常重要的临床意义。
本申请所提供的载药抗菌涂层中，在金属基底上负载聚多巴胺层，聚多巴胺是由多巴胺在金属基底自聚合形成的。具体的，多巴胺(Polydopamine，PDA)作为广泛分布于人体的黑色素的重要组成成分，具有良好的生物安全性与可降解性，在避光条件下、弱碱性水溶液中可以发生自聚合，从而可以自发沉积在金属基底表面。在基底表面形成的聚多巴胺层作为粘合剂吸附新吲哚菁和抗生素。负载聚多巴胺涂层的内植物在经过短时间的近红外光照射后，能够达到50℃以上的表面温度，满足了光热疗法的需求。
本申请第二方面提供本申请第一方面提供的载药抗菌涂层的制备方法，包括如下步骤：
1)将金属基底浸没于多巴胺缓冲溶液中，干燥后制备获得样品A；所述样品A为负载有聚多巴胺层的金属基底；
2)将步骤1)制备获得的样品A浸没于新吲哚菁绿溶液中，干燥后制备获得样品B；所述样品B为继续在聚多巴胺层上负载有新吲哚菁绿层的金属基底；
3)将步骤2)制备获得的样品B浸没于抗生素溶液中，干燥后制备获得载药抗菌涂层。
本申请提供的载药抗菌涂层的制备方法中，步骤1)是将金属基底浸没于多巴胺缓冲溶液中，干燥后制备获得样品A。所述样品A为负载有聚多巴胺层的金属基底。具体地，所述步骤1)中多巴胺的缓冲溶液选自Tris–HCl缓冲液。Tris–HCl缓冲液中文别名：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。所述缓冲溶液的pH值为8～8.5。优选地，所述多巴胺的缓冲溶液选自Tris–HCl缓冲液。所述Tris–HCl缓冲液的pH值为8～8.5。
进一步的，所述步骤1)中多巴胺缓冲溶液的质量-体积浓度为2-4mg/mL。在一些具体的实施例中，所述多巴胺缓冲溶液的质量-体积浓度为2-3mg/mL或3-4mg/mL。
进一步的，所述步骤1)中金属基底需要前处理，所述前处理包括将金属基底打磨抛光，在溶剂中清洗，干燥。更具体的，所述金属基底采用2000目碳化硅砂纸打磨抛光。所述溶剂选自丙酮、无水乙醇、去离子水中的一种或多种的组合。所述清洗具体选用超声清洗，清洗时间例如15分钟。
进一步的，所述步骤1)中，将金属基底上浸没于多巴胺的缓冲溶液中，在温度为20℃～30℃下避光振荡，并洗去未负载的多巴胺。具体的，振荡时间为20～24小时，20～22小时，或22～24小时等。采用去离子水洗去未负载的多巴胺。
进一步的，所述干燥是在真空下干燥。
本申请提供的载药抗菌涂层的制备方法中，步骤2)是将步骤1)制备获得的样品A浸没于新吲哚菁绿溶液中，干燥后制备获得样品B。所述样品B为继续在聚多巴胺层上负载有新吲哚菁绿层的金属基底。所述金属基底优选选自钛基底，所述钛基底选自钛片和/或钛棒，所述钛片和/或钛棒例如可以是纯钛。
进一步的，所述步骤2)中新吲哚菁绿溶液的质量-浓度为0.01-0.03mg/mL。在一些具体的实施方式中，所述新吲哚菁绿溶液的质量-浓度为0.01-0.02mg/mL或0.02-0.03mg/mL等。
进一步的，所述步骤2)中新吲哚菁绿溶液的溶剂选自二甲基亚砜。
进一步的，所述步骤2)中，将步骤1)制备获得的样品A浸没于新吲哚菁绿溶液中，在温度为20℃～30℃下避光振荡，并洗去未负载的新吲哚菁绿。具体的，振荡时间为20～24小时，20～22小时，或22～24小时等。采用去离子水洗去未负载的新吲哚菁绿。
进一步的，所述干燥是在真空下干燥。
本申请提供的载药抗菌涂层的制备方法中，步骤3)是将步骤2)制备获得的样品B浸没于抗生素溶液中，干燥后制备获得本申请第一方面的载药抗菌涂层。所述步骤3)中抗生素溶液的质量-体积浓度为50～300μg/mL。所述抗生素层选自达托霉素、利福平、万古霉素、妥布霉素或者庆大霉素等中的一种或多种的组合层。
进一步的，所述抗生素溶液的质量-体积浓度为50～100μg/mL，100～150μg/mL，150～200μg/mL，200～250μg/mL，或250～300μg/mL等。
进一步的，所述步骤3)中，将步骤2)制备获得的样品B浸没于抗生素溶液中，在温度为20℃～30℃下避光振荡，并洗去未负载的抗生素。具体的，振荡时间为20～24小时，20～22小时，或22～24小时等。采用去离子水洗去未负载的抗生素。
进一步的，所述干燥是在真空下干燥。
本发明的有益效果：
本发明制备过程简单，成本低廉，制备出的载药抗菌涂层能够首先通过抗生素的局部释放抑制细菌生长，预防手术部位感染发生；而一旦感染发生，在短时接受近红外光照射后，该涂层中的新吲哚菁绿可产生活性氧类分子，与多巴胺涂层产生的热量起到协同抗菌的效果，抗菌率可高达97.9％。而且，该涂层还改善了金属植入体的生物相容性，降低了内固定失败的发生率。
此外，本申请负载过程无需通过水热法负载，省略这一步骤可简化材料制备的步骤，降低成本。
以下结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例进一步详细描述本发明。但是，应当理解的是，本发明的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限制本发明，且本发明的实施例并不局限于说明书中给出的实施例。实施例中未注明具体实验条件或操作条件的按常规条件制作，或按材料供应商推荐的条件制作。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均可商购获得。
所用的原材料有纯钛片、纯钛棒、分析纯的盐酸多巴胺、新吲哚菁绿、达托霉素、Tris-HCL、二甲基亚砜，水为去离子水。使用2000目的碳化硅砂纸将钛片、钛棒表面抛光，依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15分钟，干燥后密封备用(Ti)。配制浓度为10mM的Tris-HCL溶液，调整酸碱度为pH＝8～8.5之间后将盐酸多巴胺粉末倒入，配制浓度为2～4mg/mL的多巴胺溶液。将钛片或钛棒浸没于多巴胺溶液中，于室温下避光缓慢振荡20～24小时。以去离子水洗去钛片表面未吸附的多巴胺后，真空干燥制备获得样品A，样品A为负载多巴胺涂层的钛片。以二甲基亚砜为溶剂配制浓度为0.01～0.03mg/mL的新吲哚菁绿溶液，将负载多巴胺涂层的钛片浸没于新吲哚菁绿溶液中，于室温下避光缓慢振荡20～24小时。以去离子水洗去钛片表面多余的新吲哚菁绿溶液后，将钛片真空干燥，制备获得样品B。配制浓度为50～300μg/mL的达托霉素溶液，将前述样品浸没于其中，于室温下避光缓慢振荡20～24小时。最后，将样品真空干燥后密封备用，即得到基于多巴胺的近红外光响应载药抗菌复合涂层。
实施例1
所用的原材料如上文所述。将钛片(1cm×1cm，厚度2mm)用2000目的碳化硅砂纸打磨，依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15分钟，钛片干燥后密封备用。
配制浓度为10mM的Tris-HCL溶液，调整酸碱度为pH＝8.5之间后将盐酸多巴胺粉末倒入，配制浓度为2mg/mL的多巴胺溶液。将钛片浸没于多巴胺溶液中，于室温下避光缓慢振荡24小时。以去离子水洗去钛片表面未吸附的多巴胺后，真空干燥得到样品A，样品A为载多巴胺涂层的钛片。
以二甲基亚砜为溶剂配制浓度为0.02mg/mL的新吲哚菁绿溶液，将负载多巴胺涂层的钛片浸没于新吲哚菁绿溶液中，于室温下避光缓慢振荡24小时。以去离子水洗去钛片表面多余的新吲哚菁绿后，真空干燥获得样品B，样品B为继续在聚多巴胺层上负载有新吲哚菁绿层的钛片。
配制浓度为100μg/mL的达托霉素溶液，将前述样品B浸没于其中，于室温下避光缓慢振荡20小时。最后，将样品真空干燥后获得本申请的载药抗菌涂层，密封备用。
使用SEM扫描电镜观察上述制备得到的样品表面形态，结果如图1所示，样品A(负载多巴胺涂层后钛片表面)呈疏松的片状结构，最终的载药抗菌涂层在负载新吲哚菁绿、接枝达托霉素后表面形貌发生明显变化，涂层的空隙被新吲哚菁绿和达托霉素所填充。
实施例2
所用的原材料如上文所述。将钛片(1cm×1cm，厚度1mm)用2000目的碳化硅砂纸打磨，依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15分钟，钛片干燥后密封备用。
配制浓度为10mM的Tris-HCL溶液，调整酸碱度为pH＝8.2之间后将盐酸多巴胺粉末倒入，配制浓度为2mg/mL的多巴胺溶液。将钛片浸没于多巴胺溶液中，于室温下避光缓慢振荡20小时。以去离子水洗去钛片表面未吸附的多巴胺后，真空干燥得到样品A，样品A为负载多巴胺涂层的钛片。
以二甲基亚砜为溶剂配制浓度为0.02mg/mL的新吲哚菁绿溶液，将负载多巴胺涂层的钛片浸没于新吲哚菁绿溶液中，于室温下避光缓慢振荡20小时。以去离子水洗去钛片表面多余的新吲哚菁绿后，真空干燥获得样品B，样品B为继续在聚多巴胺层上负载有新吲哚菁绿层的钛片。
配制浓度为150μg/mL的达托霉素溶液，将前述样品B浸没于其中，于室温下避光缓慢振荡20小时。最后，将样品真空干燥后获得本申请的载药抗菌涂层，密封备用。
将浓度为107CFU/mL的金葡菌液种植于上述制备得到的钛片、样品A、样品B和最后获得的载药抗菌涂层表面，并培养20小时后以1.0W的808nm近红外光照射样品，并利用涂板实验评估样品抗菌率。图3中，未接受光照时，钛片、样品A和样品B组并无抗菌能力，而载药抗菌涂层组抗菌率为57.2％。接受光照后，载药抗菌涂层的抗菌率达到97.2％。图3表明与钛片相比，本发明的光敏响应载药抗菌涂层能够显著抑制金葡菌的生长，抗菌率达到97.2％。
实施例3
所用的原材料如上文所述。将钛棒(直径2mm，长度3mm)用2000目的碳化硅砂纸打磨，依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15分钟，钛棒干燥后密封备用。
配制浓度为10mM的Tris-HCL溶液，调整酸碱度为pH＝8.5之间后将盐酸多巴胺粉末倒入，配制浓度为2mg/mL的多巴胺溶液。将钛棒浸没于多巴胺溶液中，于室温下避光缓慢振荡24小时。以去离子水洗去钛棒表面未吸附的多巴胺后，真空干燥得到样品A，样品A为载多巴胺涂层的钛棒。
以二甲基亚砜为溶剂配制浓度为0.02mg/mL的新吲哚菁绿溶液，将负载多巴胺涂层的钛棒浸没于新吲哚菁绿溶液中，于室温下避光缓慢振荡24小时。以去离子水洗去钛棒表面多余的新吲哚菁绿后，真空干燥获得样品B，样品B为继续在聚多巴胺层上负载有新吲哚菁绿层的钛棒。
配制浓度为100μg/mL的达托霉素溶液，将前述样品B浸没于其中，于室温下避光缓慢振荡24小时。最后，将样品真空干燥后获得本申请的载药抗菌涂层，密封备用。
将上述制备得到的钛棒和载药抗菌涂层浸泡于浓度为107CFU/mL的金葡菌液中培养20小时，使其表面形成生物膜。将钛棒植入SD大鼠胫骨缺损模型，以1.5W的808nm近红外光照射大鼠手术部位。处死大鼠后剖出样品，并利用涂板实验评估样品抗菌率。如图5所示，未接受光照时，钛棒组并无抗菌能力，而载药抗菌涂层能够杀灭近半数的金葡菌。接受光照后，载药抗菌涂层的抗菌率达到97.9％。图5表明与钛棒相比，本发明的光敏响应载药抗菌涂层能够显著抑制金葡菌的生长，抗菌率达到97.9％。
实施例4
所用的原材料如上文所述。将钛片(1cm×1cm，厚度1mm)用2000目的碳化硅砂纸打磨，依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15分钟，钛片干燥后密封备用。
配制浓度为10mM的Tris-HCL溶液，调整酸碱度为pH＝8.5之间后将盐酸多巴胺粉末倒入，配制浓度为3mg/mL的多巴胺溶液。将钛片浸没于多巴胺溶液中，于室温下避光缓慢振荡24小时。以去离子水洗去钛片表面未吸附的多巴胺后，真空干燥得到样品A，样品A为载多巴胺涂层的钛片。
以二甲基亚砜为溶剂配制浓度为0.02mg/mL的新吲哚菁绿溶液，将负载多巴胺涂层的钛棒浸没于新吲哚菁绿溶液中，于室温下避光缓慢振荡24小时。以去离子水洗去钛片表面多余的新吲哚菁绿后，真空干燥获得样品B，样品B为继续在聚多巴胺层上负载有新吲哚菁绿层的钛片。
配制浓度为100μg/mL的达托霉素溶液，将前述样品B浸没于其中，于室温下避光缓慢振荡24小时。最后，将样品真空干燥后获得本申请的载药抗菌涂层，密封备用。
将rBMSCs(兔骨髓间充质干细胞)种植于上述制备得到的钛片和载药抗菌涂层样品表面。以CCK-8实验评价细胞增殖情况，以ALP(碱性磷酸酶)染色评价细胞成骨分化水平。如图6A所示，在7天的实验时间内，本身的载药抗菌涂层能够显著促进rBMSCs的增殖；另外，载药抗菌涂层组ALP染色明显加深，证明其具有良好的促成骨分化能力。结果证明与钛片相比，本发明的光敏响应载药抗菌涂层能够显著促进rBMSCs的增殖与成骨分化，具有良好的生物相容性。
实施例5
所用的原材料如上文所述。将钛棒(直径3mm，长度4mm)用2000目的碳化硅砂纸打磨，依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15分钟，钛棒干燥后密封备用。
配制浓度为10mM的Tris-HCL溶液，调整酸碱度为pH＝8.5之间后将盐酸多巴胺粉末倒入，配制浓度为2mg/mL的多巴胺溶液。将钛棒浸没于多巴胺溶液中，于室温下避光缓慢振荡24小时。以去离子水洗去钛棒表面未吸附的多巴胺后，真空干燥得到样品A，样品A为载多巴胺涂层的钛棒。
以二甲基亚砜为溶剂配制浓度为0.02mg/mL的IR820溶液，将负载多巴胺涂层的钛棒浸没于新吲哚菁绿溶液中，于室温下避光缓慢振荡24小时。以去离子水洗去钛棒表面多余的新吲哚菁绿后，真空干燥获得样品B，样品B为继续在聚多巴胺层上负载有新吲哚菁绿层的钛棒。
配制浓度为100μg/mL的达托霉素溶液，将前述样品浸没于其中，于室温下避光缓慢振荡24小时。最后，将样品真空干燥后获得本申请的载药抗菌涂层，密封备用。
将上述制备得到的钛棒和载药抗菌涂层样品植入SD大鼠股骨髁缺损之中，8周之后，以Van Gieson染色(胶原纤维染色的一种)评价样品骨整合情况。如图7所示，本申请载药抗菌涂层组的骨接触面积较钛棒组增多，提示更好的骨整合情况。因此，结果证明与钛棒相比，本发明的光敏响应载药抗菌涂层能够显著促进纯钛内植物的骨整合。
性能评价
1)抗菌性能评价
(1)体外抗菌实验：
本部分采用金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC 25923)评估钛片或钛棒、样品A、样品B、载药抗菌涂层的抗菌能力。将各组样品置于24孔板内，滴加浓度为107CFU/mL的金葡菌液，置于37℃恒温培养箱内培养48小时。以1.0W的808nm近红外光照射各组样品后(对照组不接受光照)，将样品浸没于PBS缓冲液中，以超声洗下样品表面的金葡菌，将适量菌液稀释100倍后接种于固体琼脂培养基中，24小时后观察菌落生长情况，拍照记录，计数各组琼脂培养板上的菌落，以未接受光照的Ti组的菌落数为比对计数，计算其余样品在不接受光照及接受光照后的抗菌效力。
(2)体内抗菌实验：
本部分使用雌性SD大鼠建立胫骨缺损骨感染模型。首先，将样品浸没于金葡菌液(107CFU/mL)24小时使其表面形成生物膜。其次，将大鼠麻醉后，用直径2.5～3mm钻头在大鼠胫骨平台下方圆柱形缺损后，按动物植入实验的标准操作规程，植入钛片或钛棒、载药抗菌涂层样品。2天后，实验组接受手术植入部位光照处理，对照组不接受光照。两周后，处死大鼠，剖出植入的钛棒样品，以超声洗下样品表面的金葡菌，将适量菌液稀释100倍后接种于固体琼脂培养基中，24小时后观察菌落生长情况，拍照记录，计数各组琼脂培养板上的菌落，以未接受光照的钛片或钛棒组的菌落数为比对计数，计算载药抗菌涂层样品在不接受及接受光照后的抗菌效力。
2)生物相容性评价
(1)体外细胞实验：
本部分使用SD大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)，研究载药抗菌涂层样品对细胞增殖、成骨分化的作用。将rBMSCs在载药抗菌涂层与钛片或钛棒表面培养，并以CCK-8法检测细胞增殖情况、以ALP染色评价涂层促成骨分化情况。
(2)体内实验：
本部分使用SD大鼠建立股骨髁缺损模型，研究载药抗菌涂层样品的体内骨整合情况。将大鼠麻醉后，于右侧股骨远端外侧作纵行切口，利用钻头做直径2.5～3mm、长度3～3.5mm的骨缺损；按动物植入实验的标准操作规程，植入钛片或钛棒、载药抗菌涂层样品。处死大鼠后，以Van Gieson染色评估载药抗菌涂层样品的体内骨整合情况。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种载药抗菌涂层，包括金属基底，所述金属基底上依次负载有聚多巴胺层、新吲哚菁绿层和抗生素层；所述聚多巴胺层的厚度为20～100nm；所述新吲哚菁绿层的厚度为5～50nm；所述抗生素层的厚度为10～50nm。
2.如权利要求1所述的载药抗菌涂层，其特征在于，所述金属基底选自钛基底。
3.如权利要求1所述的载药抗菌涂层，其特征在于，所述抗生素层选自达托霉素、利福平、万古霉素、妥布霉素或者庆大霉素中的一种或多种的组合层。
4.如权利要求1～3任一项权利要求所述的载药抗菌涂层的制备方法，包括如下步骤：
1)将金属基底浸没于多巴胺缓冲溶液中，干燥后制备获得样品A；所述样品A为负载有聚多巴胺层的金属基底；
2)将步骤1)制备获得的样品A浸没于新吲哚菁绿溶液中，干燥后制备获得样品B；所述样品B为继续在聚多巴胺层上负载有新吲哚菁绿层的金属基底；
3)将步骤2)制备获得的样品B浸没于抗生素溶液中，干燥后制备获得载药抗菌涂层。
5.如权利要求4所述的载药抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中多巴胺的缓冲溶液选自Tris–HCl缓冲液；所述缓冲溶液的pH值为8～8.5。
6.如权利要求4所述的载药抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中多巴胺缓冲溶液的质量-体积浓度为2-4mg/mL。
7.如权利要求4所述的载药抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中金属基底需要前处理，所述前处理包括将金属基底打磨抛光，在溶剂中清洗，干燥。
8.如权利要求4所述的载药抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，将金属基底上浸没于多巴胺的缓冲溶液中，在温度为20℃～30℃下避光振荡，并洗去未负载的多巴胺。
9.如权利要求4所述的载药抗菌涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中新吲哚菁绿溶液的质量-浓度为0.01-0.03mg/mL。
10.如权利要求4所述的载药抗菌涂层的制备方法，其特征在于，还包括如下技术特征的一项或多项：
A1)所述步骤2)中新吲哚菁绿溶液的溶剂选自二甲基亚砜；
A2)所述步骤2)中，将步骤1)制备获得的样品A浸没于新吲哚菁绿溶液中，在温度为20℃～30℃下避光振荡，并洗去未负载的新吲哚菁绿；
A3)所述步骤3)中抗生素溶液的质量-体积浓度为50～300μg/mL；
A4)所述步骤3)中，将步骤2)制备获得的样品B浸没于抗生素溶液中，在温度为20℃～30℃避光振荡，并洗去未负载的抗生素。
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