CN113433328B - 病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法、检测卡及应用 - Google Patents

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Abstract

一种病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法、检测卡及其应用，通过病毒受体结合蛋白夹心法原理检测中和抗体，其为通过提前设置病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的作为配体的蛋白所形成的复合物，将靶向受体蛋白的非中和抗体提前捕获，保证后续通过夹心法检测中和抗体的特异性。解决了现有技术中中和抗体检测灵敏度低、特异性差以及不能区分中和抗体与非中和抗体的问题，提供了一种简便、快速、灵敏度高、特异性高的病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法、检测卡及其应用。

Description

病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法、检测卡及应用
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种高灵敏、高特异性的病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法、检测卡及其应用。
背景技术
病毒感染人时，病毒表面的受体结合蛋白会与宿主细胞表面的受体结合，从而进入宿主细胞，导致宿主发烧、感染等症状。人体受到病毒入侵或接种疫苗后会通过免疫应答产生抗体，其中一部分抗体能够特异性的与病毒表面受体结合区域结合，从而阻止病毒进入宿主细胞，是为中和抗体；而产生的其他抗体虽然可以与病毒结合，但不能阻断病毒表面的受体结合蛋白会与宿主细胞表面的受体结合，是为非中和抗体。
传统中和抗体检测的“金标准”是感染抑制试验，主要是先将病毒与待检测抗体进行混合，再将混合物接种到敏感动物、胚胎或细胞，通过敏感动物、胚胎或细胞的病变情况来测定残存的病毒感染力，从而间接确定待检测抗体对病毒的中和效果。其中在体外进行利用活病毒进行蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralizationtest，PRNT）和通过检测细胞病变（cytopathic effct，CPE）量来进行分析的微量细胞中和试验是常用方法。
对于烈性病毒性传染病来讲，即使是体外实验也面临活病毒株来源和需要在高等级生物安全实验室操作的限制，目前多家企业利用酶联免疫法、免疫层析法、化学发光法等方法开发的病毒中和抗体检测方法，有效简化了检测步骤和条件，可以无需在三级生物安全实验室操作。
新型冠状病毒（SARS-Cov-2）表面S蛋白的受体结合区域（RBD）可以与人体细胞受体--血管紧张素转化酶2（ACE2）结合，并使病毒进入细胞。目前，市面上已有基于RBD-ACE2竞争法检测中和抗体的原理开发了侧向层析试纸条，主要方法是将ACE2划到膜上，并用胶体金标记RBD蛋白。当样本中无中和抗体时候，胶体金标记的RBD和ACE2结合形成检测线。样本中有中和抗体时，中和抗体阻断RBD和ACE2的结合，从而降低检测线的显色强度。通过机器判读，或者检测线显色强度的深浅变化来判断中和抗体存在情况。肉眼判读时候需要检测线深浅有较大变化才能做判定，此形式检测卡的灵敏度有待提高。此外，还有基于RBD-中和抗体-RBD夹心法的原理开发的侧向层析试纸条，其方法是利用胶体金标记RBD蛋白，NC膜上包被RBD蛋白，利用形成包被RBD蛋白-中和抗体-标记RBD蛋白来检测中和抗体，此种方法的灵敏度高，但是部分抗RBD蛋白并非中和抗体，会导致检测特异性差。此前，CN112730851B专利公开了一种基于ACE2捕获，RBD检测的阻断夹心原理开发的中和抗体检测方法，这种方法可以一定程度上提高检测中和抗体的特异性，但是ACE2并非特异性的阻断非中和抗体，而是以载体上的RBD作为结合靶点。这种方法不能准确的识别非竞争ACE2的RBD抗体（非中和抗体）。
现有的产品主要是基于RBD-ACE2竞争法检测中和抗体，或者检测RBD结合的总抗体，不能区分出非竞争ACE2的RBD抗体（非中和抗体）。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中中和抗体检测灵敏度低、特异性差以及不能区分中和抗体与非中和抗体的问题，提供一种简便、快速、灵敏度高、特异性高的病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法、检测卡及其应用。本发明的技术方案如下：
本发明的所述病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法，包括：
通过病毒受体结合蛋白夹心法原理检测中和抗体，其为通过提前设置病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的作为配体的蛋白所形成的复合物，将靶向受体蛋白的非中和抗体提前捕获，保证后续通过夹心法检测中和抗体的特异性；
所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体所形成的复合物包括受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体通过专用的反应方法结合而成，以此封闭中和抗体与受体结合蛋白的结合位点；
所述病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法，具体包括：
在标记载体为胶体金或者红色乳胶微球的条件下，进行检测时，收集待检测的血清并滴加15 ul在检测卡的加样孔中，然后向加样孔内滴加稀释液70 ul，反应15分钟；然后通过观察窗直接观测非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线的反应结果，并与配套使用的浓度显色卡进行比对，来判断病毒中和抗体和非中和抗体含量；
在标记载体为时间分辨荧光微球的条件下，进行检测时，收集待检测的血清并滴加15 ul在在检测卡的加样孔中，然后向加样孔内滴加稀释液70 ul，反应15分钟；然后采用相应的仪器读取非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线的反应结果，并通过非中和抗体检测线和中和抗体检测线分别同质控线的比值来判断病毒中和抗体和非中和抗体含量。
进一步的，在病毒受体为埃博拉病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面糖蛋白的受体结合区域，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为人T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1；
在病毒受体为新型冠状病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面S蛋白的受体结合区域，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为血管紧张素转化酶2；
在病毒受体为中东呼吸综合征冠状病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面S蛋白的受体结合区域，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为跨膜二肽基肽酶4；
在病毒受体为亨尼帕病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面糖蛋白的受体结合区域，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为酪氨酸激酶Eph配体B2。
进一步的，所述病毒受体结合蛋白为RBD蛋白，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为ACE2蛋白，所述病毒受体为新型冠状病毒；在此条件下所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体通过专用的反应方法结合而成的方法，包括：
步骤1-1：分别取RBD蛋白以及ACE2蛋白，并用PBS缓冲液分别把RBD蛋白以及ACE2蛋白稀释至1 mg/mL; 将稀释后的RBD蛋白和ACE2蛋白，按照体积比4:1混合；然后在温度为4℃的条件下搅拌10 h并作为RBD与ACE2结合复合物待用；
步骤1-2：结合ACE2的琼脂糖填料制备，即取5 ml NHS-activated Beads用0.2 MNaHCO3溶液清洗后，加入5 ml 1mg/mL ACE2蛋白溶液，然后在温度为4℃的条件下，混匀10h进行反应；反应结束后，静置，去掉上清，然后加入5 ml 0.5 M乙醇胺封闭未反应的NHS，然后在温度为4℃的条件下，混匀10 h进行反应；反应结束后，静置，去掉上清；用去离子水清洗3次，作为结合ACE2的琼脂糖填料待用；
步骤1-3：RBD与ACE2蛋白结合复合物的纯化，即将上述步骤1-2制备的结合ACE2的琼脂糖填料装填于层析柱中，并用1xPBS平衡4个柱体积，其控制流速为0.1 ml/min，再从层析柱上方加入步骤1制备的RBD与ACE2结合复合物，从层析柱下方收集流出的组分，即可去除步骤1-1反应多余的RBD蛋白，所述组分经超滤管浓缩至1 mg/mL，作为纯化后的RBD与ACE2蛋白结合复合物，也就是所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体所形成的复合物待用。
进一步的，受体通过所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体复合物后，还需要继续通过受体结合蛋白标记物，所述受体结合蛋白标记物包括受体结合蛋白和载体，所述受体结合蛋白附着在标记载体上，所述标记载体包括胶体金、乳胶微球、纳米碳、磁微球或时间分辨荧光微球中的一种或多种。
进一步的，所述病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法所使用的设备包括检测卡，所述检测卡包括壳体，壳体内设有检测条，在所述壳体的边壁上且面向检测条的中和抗体检测线和非中和抗体检测线的位置开设有观察窗，在所述壳体的该边壁上且距离所述中和抗体检测线更近的一端开设有加样孔，所述加样孔用于样品或其稀释液的注入。
进一步的，所述检测条上按照远离加样孔的方向依次设有非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线；
所述检测条包括按照远离加样孔的方向依次设有样品垫1、结合垫2、NC膜3与吸水垫4，其中样品垫处在加样孔的正下方；
所述NC膜上设有非中和抗体检测线5、中和抗体检测线6和质控线7；
所述非中和抗体检测线上包被有病毒受体结合蛋白与能阻断中和抗体与其结合的配体复合物，所述中和抗体检测线上包被有病毒受体结合蛋白。
进一步的，所述非中和抗体检测线5包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述检测线6包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物和鸡IgY标记物，所述标记载体为胶体金，所述质控线包被有质控检测物，所述质控检测物为抗鸡IgY。
进一步的，所述非中和抗体检测线包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述中和抗体检测线包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体为红色乳胶微球。所述质控线包被有质控检测物，所述质控检测物为抗RBD抗体。
进一步的，所述非中和抗体检测线包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述中和抗体检测线包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体为时间分辨荧光微球。
进一步的，所述样品垫包括滤血垫或所述样品垫上添加有抗RBC抗体，能够直接检测指尖血和全血样本。
进一步的，所述壳体还可以为：其包括顶端壳体、底端壳体、锁杆以及黏接部，顶端壳体的底端和底端壳体的顶端贴牢，顶端壳体的底端按照其环向等距开有锁接口，底端壳体顶端按照其周向环向等距装配着锁杆，锁杆插接于锁接口中，顶端壳体和底端壳体间相连着黏接部；
顶端壳体底端一边的前部开有稳定口一，顶端壳体底端一边的后部开有搁放口一，底端壳体顶端一边的前部开有稳定口二，底端壳体顶端一边的后部开有搁放口二，稳定口一和稳定口二的所在之处一一相应，搁放口一和搁放口二所在之处一一相应，顶端壳体底端和底端壳体顶端都开有引导口，引导口呈圈状架构。
黏接部包含稳定杆、运动杆和黏接条,稳定口一和稳定口二间装配着稳定杆，一号放置辊和二号放置辊间装配着运动杆，黏接条的一头盘绕于稳定杆上，黏接条的另一头盘绕于运动杆上。
进一步的， 顶端壳体的顶端按照其环向等距开有限位口，顶端壳体的顶端外壁经由螺杆一装配着顶端压圈，顶端壳体的顶端当中处经由螺杆二装配着上顶板，上顶板外壁底端和顶端压圈内壁底端都按照顶端壳体环向等距开有顶端凹口，上顶板和顶端压圈上所在之处相应的顶端凹口间挤压着顶端肋杆，顶端肋杆的底端设有限位突杆，限位突杆底端插接于限位口中；
螺杆一、螺杆二、螺钉一和螺钉二都是PVC材料；
顶端肋杆底端经横向的一头到另一头等距开有顶端嵌接口，顶端嵌接口是1/2圈状架构；
底端肋杆顶端横向从一头到另一头等距开有底端嵌接口，底端嵌接口是1/2圈状架构，底端嵌接口所在之处和顶端嵌接口所在之处一一相应，底端肋杆底端横向从一头到另一头等距开有半圈状豁口，半圈状豁口与底端嵌接口相间布置；
底端壳体底端按照其环向等距开有止位口，底端壳体底端外壁经由螺钉一装配着底端压圈，底端壳体顶端中部经由螺钉二装配着下顶板，下顶板外壁顶端与底端压圈内壁顶端均沿底端壳体环向等距开有底端凹口，底端凹口和顶端凹口所在之处一一相应，下顶板和底端压圈上所在之处相应的底端凹口间贴牢着底端肋杆，底端肋杆底端设有止位突杆，止位突杆底端插接于止位口内。
进一步，所述病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法能够应用到检测新型冠状病毒的中和抗体与非中和抗体的检测。
通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：
（1）本发明通过提前设置病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体复合物的方式，将靶向受体结合蛋白的中和抗体结合位点提前封闭，从而阻断了中和抗体在非中和抗体检测线的截留，而不妨碍非中和抗体的捕获，极大的提高了夹心法检测中和抗体的作为灵敏度的特异性。
（2）病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体复合物和包被受体结合蛋白夹心检测中和抗体，灵敏度较通过阻断式竞争法的更高。
（3）本发明采用免疫层析的方法，操作简单，检测速度快。
（4）本发明还能够兼顾检测非中和抗体，优点在于可以同时检测中和抗体与非中和抗体，区分检测中和抗体与非中和抗体相较于只检测中和抗体或总抗体，可以更准确判断接种疫苗后体内的总的抗体水平以及是否获得了中和抗体免疫效果。对于个体疫苗的接种方案具有指导作用，从而判断是否需要对接种方案进行调整。
附图说明
图1为本发明的所述检测条的结构图。
图2为本发明的所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体通过专用的反应方法结合而成的方法的流程图。
图3为本发明的所述壳体的侧视图。
图4为本发明的所述壳体的侧视截面图。
图5为本发明的所述壳体的向上的投影图。
图6为本发明的所述壳体的向下的投影图。
图7为本发明的所述壳体的部分结构图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
如图1-图7所示，一种病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法，包括：
通过病毒受体结合蛋白夹心法原理检测中和抗体，其为通过提前设置病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的作为配体的蛋白所形成的复合物，将靶向受体蛋白的非中和抗体提前捕获，保证后续通过夹心法检测中和抗体的特异性。
所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体所形成的复合物包括受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体通过专用的反应方法结合而成，以此封闭中和抗体与受体结合蛋白的结合位点。
所述病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法，具体包括：
在标记载体为胶体金或者红色乳胶微球的条件下，进行检测时，收集待检测的血清并滴加15 ul在检测卡的加样孔中，然后向加样孔内滴加稀释液70 ul，反应15分钟；然后通过观察窗直接观测非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线的反应结果，并与配套使用的浓度显色卡进行比对，来判断病毒中和抗体和非中和抗体含量；
在标记载体为时间分辨荧光微球的条件下，进行检测时，收集待检测的血清并滴加15 ul在在检测卡的加样孔中，然后向加样孔内滴加稀释液70 ul，反应15分钟；然后采用相应的仪器读取非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线的反应结果，并通过非中和抗体检测线和中和抗体检测线分别同质控线的比值来判断病毒中和抗体和非中和抗体含量。所述稀释液能够是纯水。
在病毒受体为埃博拉病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面糖蛋白的受体结合区域（RBD），所述能阻断中和抗体与其结合的配体为人T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1(TIM-1)；
在病毒受体为新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面S蛋白的受体结合区域（RBD），所述能阻断中和抗体与其结合的配体为血管紧张素转化酶2（ACE2）；
在病毒受体为中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面S蛋白的受体结合区域（RBD），所述能阻断中和抗体与其结合的配体为跨膜二肽基肽酶4（DPP4）；
在病毒受体为亨尼帕病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面糖蛋白的受体结合区域（RBD），所述能阻断中和抗体与其结合的配体为酪氨酸激酶Eph配体B2（EphrinB2）。
所述病毒受体结合蛋白为RBD蛋白，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为ACE2蛋白，所述病毒受体为新型冠状病毒；在此条件下所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体通过专用的反应方法结合而成的方法，包括：
步骤1-1：分别取市售的RBD蛋白以及ACE2蛋白，并用PBS缓冲液分别把RBD蛋白以及ACE2蛋白稀释至1 mg/mL; 将稀释后的RBD蛋白和ACE2蛋白，按照体积比4:1混合；然后在温度为4℃的条件下搅拌10 h并作为RBD与ACE2结合复合物待用；
步骤1-2：结合ACE2的琼脂糖填料制备，即取5 ml NHS-activated Beads用0.2 MNaHCO3溶液清洗后，加入5 ml 1mg/mL ACE2蛋白溶液，然后在温度为4℃的条件下，混匀10h进行反应；反应结束后，静置，去掉上清，然后加入5 ml 0.5 M乙醇胺封闭未反应的NHS，然后在温度为4℃的条件下，混匀10 h进行反应；反应结束后，静置，去掉上清；用去离子水清洗3次，作为结合ACE2的琼脂糖填料待用；
步骤1-3：RBD与ACE2蛋白结合复合物的纯化，即将上述步骤1-2制备的结合ACE2的琼脂糖填料装填于层析柱中，并用1xPBS平衡4个柱体积，其控制流速为0.1 ml/min，再从层析柱上方加入步骤1制备的RBD与ACE2结合复合物，从层析柱下方收集流出的组分，即可去除步骤1-1反应多余的RBD蛋白，所述组分经超滤管浓缩至1 mg/mL，作为纯化后的RBD与ACE2蛋白结合复合物，也就是所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体所形成的复合物待用。
受体通过所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体复合物后，还需要继续通过受体结合蛋白标记物，所述受体结合蛋白标记物包括受体结合蛋白和载体，所述受体结合蛋白附着在标记载体上，所述标记载体包括胶体金、乳胶微球、纳米碳、磁微球或荧光微球中的一种或多种。
所述病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法所使用的设备包括检测卡，所述检测卡包括壳体，壳体内设有检测条，在所述壳体的边壁上且面向检测条的中和抗体检测线和非中和抗体检测线的位置开设有观察窗，在所述壳体的该边壁上且距离所述中和抗体检测线更近的一端开设有加样孔，所述加样孔用于样品或其稀释液的注入。
所述检测条上按照远离加样孔的方向依次设有非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线；
所述检测条包括按照远离加样孔的方向依次设有样品垫1、结合垫2、NC膜3与吸水垫4，其中样品垫处在加样孔的正下方；
所述NC膜上设有非中和抗体检测线5、中和抗体检测线6和质控线7；
所述非中和抗体检测线上包被有病毒受体结合蛋白与能阻断中和抗体与其结合的配体复合物，所述中和抗体检测线上包被有病毒受体结合蛋白。
所述非中和抗体检测线5包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述检测线6包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物和鸡IgY标记物，所述标记载体为胶体金，所述质控线包被有质控检测物，所述质控检测物为抗鸡IgY。
所述非中和抗体检测线包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述中和抗体检测线包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体为红色乳胶微球。所述质控线包被有质控检测物，所述质控检测物为抗RBD抗体。
所述非中和抗体检测线包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述中和抗体检测线包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体为时间分辨荧光微球。
所述样品垫包括滤血垫或所述样品垫上添加有抗RBC抗体，能够直接检测指尖血和全血样本。
所述病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法能够应用到检测新型冠状病毒的中和抗体与非中和抗体的检测。
通过病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体复合物和受体结合蛋白标记物，利用病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体复合物捕获样品中靶向受体结合蛋白的非中和抗体，从而封闭了这些中和抗体对受体结合蛋白结合位点，从而保证靶向受体结合蛋白的非中和抗体不会被受体结合蛋白标记物捕获。而中和抗体被受体结合蛋白标记物捕获后形成的中和抗体-受体结合蛋白-标记载体复合物被包被受体结合蛋白捕获，从而检测样本中的中和抗体浓度。本发明还能够兼顾检测非中和抗体，优点在于可以同时检测中和抗体与非中和抗体，区分检测中和抗体与非中和抗体相较于只检测中和抗体或总抗体，可以更准确判断接种疫苗后体内的总的抗体水平以及是否获得了中和抗体免疫效果。对于个体疫苗的接种方案具有指导作用，从而判断是否需要对接种方案进行调整。
实施例一：
一种SARS-CoV-2中和抗体与非中和抗体的检测卡，该检测卡包括层析试纸、壳体和样本稀释液，所述层析试纸包括底板、样品垫1、结合垫2、NC膜3和吸水垫4，所述样品垫1、结合垫2、NC膜3和吸水垫4依次黏贴与底板一侧；所述NC膜3上依次设有非中和抗体检测线5、中和抗体检测线6和质控线7，所述非中和抗体检测线5靠近结合垫2，所述质控线7靠近吸水垫4，所述非中和抗体检测线5包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述检测线6包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物和鸡IgY标记物，所述标记载体为胶体金，所述质控线包被有质控检测物，所述质控检测物为抗鸡IgY。
所述检测卡的制备方法包括：
步骤2-1：胶体金标记，即采用万分之一浓度的胶体金分别标记RBD蛋白和鸡IgY，离心去上清，浓缩十倍得到RBD蛋白标记物和鸡IgY标记物；
步骤2-2：结合垫制备，即将步骤2-1得到的RBD蛋白标记物和鸡IgY标记物按照1：1比例混合后，再稀释3倍后均匀涂抹于玻璃纤维垫片上，在温度为35℃的条件下烘干30分钟，然后采用斩切机，切割成5mm宽，得到结合垫；
步骤2-3：NC膜包被，即采用1x PBS+4%蔗糖作为溶剂，分别配制0.2mg/mL的RBD-ACE2蛋白结合复合物浓度的非中和抗体检测线包被液、0.2mg/mL的RBD蛋白浓度的中和抗体检测线包被液以及0.5mg/mL的鸡IgY蛋白浓度质控线包被液，采用喷金划膜仪器将上述配制的包被液划在NC膜上，在温度为35℃的条件下烘干12小时，包被NC膜；
步骤2-4：大板组装，即底板采用PVC材料底板，样品垫1为切割成宽度18mm的玻璃纤维，吸水垫为切割成宽度25mm的吸水纸，将样品垫1、结合垫2、NC膜3和吸水垫4依次重叠，黏贴于底板一侧，得到大板；
步骤2-5：样本稀释液配制，即样本稀释液采用超纯水配制，配方为 0.02moL/L PB+0.3%曲拉通100；
步骤2-6：切条、组装以及封装，即采用切条机将步骤2-4得到的大板切成3mm宽度的试纸条，放置于所述壳体的内部完成组装，然后同干燥剂一起封装于铝箔袋内，再同配套的样本稀释液一起放置于壳体内，完成本发明检测卡的制备。
使用时，收集待检测的血清15ul并滴加在所述壳体的加样孔，然后向加样孔滴加稀释液70ul，反应15分钟；通过观察窗直接观测非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线的反应结果，并与配套使用的浓度显色卡进行比对，来判断SARS-CoV-2中和抗体或非中和抗体含量。
实施例二：
一种SARS-CoV-2中和抗体与非中和抗体的检测卡，包括层析试纸、壳体和样本稀释液，所述层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次黏贴与底板一侧；所述NC膜上依次设有非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线，所述非中和抗体检测线靠近结合垫，所述质控线靠近吸水垫，所述非中和抗体检测线包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述中和抗体检测线包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体为红色乳胶微球。所述质控线包被有质控检测物，所述质控检测物为抗RBD抗体。
本实施例的检测卡的制备方法与实施例一的不同之处在于，所述标记载体为红色乳胶微球，标记蛋白只有RBD蛋白，质控线包被液为0.5mg/mL的抗RBD单克隆抗体，另外，壳体上设置的加样孔和稀释液孔，分别用于添加样本和稀释液。
使用时，收集待检测的血清15ul并滴加在所述壳体的加样孔，然后向稀释液孔滴加稀释液70ul，反应15分钟；通过观察窗直接观测非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线的反应结果，并与配套使用的浓度显色卡进行比对，来判断SARS-CoV-2中和抗体或非中和抗体含量。
实施例三：
一种SARS-CoV-2中和抗体与非中和抗体的检测卡，包括层析试纸、壳体和样本稀释液，所述层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次黏贴与底板一侧；所述NC膜上依次设有非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线，所述非中和抗体检测线靠近结合垫，所述质控线靠近吸水垫，所述非中和抗体检测线包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述中和抗体检测线包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体为时间分辨荧光微球。
本实施例的检测卡的制备方法与实施例一的不同之处在于，所述标记载体为时间分辨荧光微球，标记蛋白只有RBD蛋白，质控线包被液为0.5mg/mL的抗RBD单克隆抗体。
使用时，收集待检测的血清15ul并滴加在所述壳体的加样孔，然后向加样孔滴加稀释液70ul，反应15分钟；然后采用相应的仪器读取非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线的反应结果，并通过检测线和质控线的比值判断SARS-CoV-2中和抗体或非中和抗体含量。
利用现有技术构造两个对照例，该两个对照例分别为对照例1和对照例2，具体如下所示：
对照例1：
一种SARS-CoV-2中和抗体的检测卡，即夹心法中和抗体检测卡，其包括层析试纸、壳体和样本稀释液，所述层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次黏贴与底板一侧；所述NC膜上依次设有检测线和质控线，所述检测线靠近结合垫，所述质控线靠近吸水垫，所述检测线包被有RBD蛋白，质控线包被液为0.5mg/mL的抗RBD单克隆抗体。所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体时间为分辨荧光微球。
使用时，收集待检测的血清15ul并滴加在所述壳体的加样孔，然后向加样孔滴加稀释液70ul，反应15分钟；然后采用仪器读取检测线和质控线的反应结果，并通过检测线和质控线的比值判断SARS-CoV-2中和抗体含量。
对照例2：
一种SARS-CoV-2中和抗体的检测卡，即竞争法中和抗体荧光检测卡，其包括层析试纸、壳体和样本稀释液，所述层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次黏贴与底板一侧；所述NC膜上依次设有检测线和质控线，所述检测线靠近结合垫，所述质控线靠近吸水垫，所述检测线包被有ACE2蛋白，质控线包被液为0.5mg/mL的抗RBD单克隆抗体。所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体时间为分辨荧光微球。
使用时，收集待检测的血清15ul并滴加在所述壳体的加样孔，然后向加样孔滴加稀释液70ul，反应15分钟；然后采用仪器读取检测线和质控线的反应结果，并通过检测线和质控线的比值判断SARS-CoV-2中和抗体含量。
以下进一步通过实验例来说明本发明对比现有技术的检测的优点：
实验例1
将WHO参考物质（NIBSC 20/136）用阴性混合血清进行稀释，分别用实施例4、对照例1、对照例2方法制备的检测卡测试，并在荧光免疫分析仪上读取信号值来执行检测，检测结果如表1所示：
表1
Figure 125241DEST_PATH_IMAGE001
其中，实验例1中，T1/C指非中和抗体检测线与质控线的比值，T2/C指中和抗体检测线与质控线的比值。判断结果：阴性（-）、弱阳性（+）、阳性（++）。
由表1中数据可知，当浓度为7.81 IU/mL时，对照例1仍有区分度，而实施例三，对照例2均无明显区分度；当浓度为15.63时，对照例1、实施例三表现出一定的区分度，而对照例2无明显区分度。这就表明，按照实施例三的方法制备的检测卡，其灵敏度相对于夹心法和竞争法有明显提高。
实验例2
分别取接种过疫苗和未接种过疫苗的血清样本，委托中科院病毒研究所利用假病毒中和实验进行判定，同时分别用实施例三、对照例1、对照例2方法制备的检测卡测试，并在荧光免疫分析仪上读取信号值来执行检测，检测结果如表2所示：
表2
Figure 852501DEST_PATH_IMAGE002
由表2中数据可知，在接种过疫苗的样本中，“金标准”病毒中和试验方法判定的阴性的样本，对照例1判断的结果均为阳性，而实施例三中和抗体检测线的结果均为阴性，非中和抗体检测呈现明显升高趋势。表明实施例三的特异性优于对照例1。因此，实施例三提供的方法既可以检测出非中和抗体，且在中和抗体的检测特异性上也优于夹心法。
而另一方面，为了利于反复使用，很多检测卡的壳体是可以把其上半部分和下半部分分开的，而为了防止从上半部分和下半部分的结合部漏水进去，就要在把检测条搁进检测卡的壳体后，须经由黏接条对壳体的上半部分和下半部分的结合部执行封闭，黏接条的切割、黏接都需要花去一些时长，另外操作者在黏接黏接条时常常不能确保黏接条黏接所在之处的精准度，常常发生黏接条黏接偏移的状况，不光形成了黏接条的耗损，也不利于壳体的封闭性能，加大了传送期间检测条毁损的几率；PVC材料壳体往往厚度小，加上筒状的壳体顶端和底端受挤压比壳体边部受挤压的作用大小往往更大，所以在传送期间壳体顶端与底端发生破损的几率较大，壳体若发生毁损，就不能对壳体里的检测条达到预期的撑持作用，不利于检测条在传送期间的牢靠性和抗损性，会形成成本加大的后果。
于是，本发明就提供了一检测卡的PVC材料壳体，所述壳体还可以包括顶端壳体1-2、底端壳体1-3、锁杆1-4以及黏接部1-5，所述顶端壳体1-2的底端和底端壳体1-3的顶端贴牢，所述顶端壳体1-2的底端按照其环向等距开有锁接口，所述底端壳体1-3顶端按照其周向环向等距装配着锁杆1-4，所述锁杆1-4插接于锁接口中，所述顶端壳体1-2和底端壳体1-3间相连着黏接部1-5；
所述顶端壳体1-2底端一边的前部开有稳定口一，所述顶端壳体1-2底端一边的后部开有搁放口一，所述底端壳体1-3顶端一边的前部开有稳定口二，所述底端壳体1-3顶端一边的后部开有搁放口二，所述稳定口一和稳定口二的所在之处一一相应，所述搁放口一和搁放口二所在之处一一相应，所述顶端壳体1-2底端和底端壳体1-3顶端都开有引导口1-22，所述引导口1-22呈圈状架构。
所述黏接部1-5包含稳定杆1-52、运动杆1-53和黏接条1-54 ,所述稳定口一和稳定口二间装配着稳定杆1-52，所述一号放置辊和二号放置辊间装配着运动杆1-53，所述黏接条1-54的一头盘绕于稳定杆1-52上，所述黏接条1-54的另一头盘绕于运动杆1-53上。
所述稳定口一、稳定口二、搁放口一和搁放口二结构一样，都是一头开有豁口的圈状架构，使用者不必费劲就能把运动杆1-53或者稳定杆1-52拔出，拔出运动杆1-53后能牵引运动杆1-53围着顶端壳体1-2和底端壳体1-3旋动一圈来把黏接条1-54黏接在顶端壳体1-2和底端壳体1-3间，接着把运动杆1-53再度插进搁放口一和搁放口二间就行，不必使用者人工对黏接条1-54执行切割，在引导口1-22的引导下，能够确保黏接条1-54黏接所在之处的精准，拔出稳定杆1-52后能继续在稳定杆1-52上盘绕黏接条1-54，来执行再次运用。
所述顶端壳体1-2的顶端按照其环向等距开有限位口，顶端壳体1-2的顶端外壁经由螺杆一1-2X装配着顶端压圈1-2Z，所述顶端壳体1-2的顶端当中处经由螺杆二1-2W装配着上顶板1-2Y，所述上顶板1-2Y外壁底端和顶端压圈1-2Z内壁底端都按照顶端壳体1-2环向等距开有顶端凹口，所述上顶板1-2Y和顶端压圈1-2Z上所在之处相应的顶端凹口间挤压着顶端肋杆1-2V，所述顶端肋杆1-2V的底端设有限位突杆，所述限位突杆底端插接于限位口中；把顶端肋杆1-2V底端设有的限位突杆插接于限位口中后，接着经由螺杆一1-2X和螺杆二1-2W把顶端压圈1-2Z和上顶板1-2Y装配于壳体顶端，来达成对顶端肋杆1-2V所在之处执行稳定的性能，稳定后顶端肋杆1-2V能够在传送期间改善顶端壳体1-2的抗损性。
所述螺杆一1-2X、螺杆二1-2W、螺钉一1-3X和螺钉二1-3W都是PVC材料；把螺杆一1-2X、螺杆二1-2W、螺钉一1-3X和螺钉二1-3W拧下后就能把顶端压圈1-2Z、上顶板1-2Y、底端压圈1-3Z与下顶板1-3Y经相应的顶端壳体1-2或者底端壳体1-3上拿下，来对没在传送期间受损的元件执行反复运用。
所述顶端肋杆1-2V底端经横向的一头到另一头等距开有顶端嵌接口，顶端嵌接口是1/2圈状架构。
所述底端肋杆1-3V顶端横向从一头到另一头等距开有底端嵌接口，底端嵌接口是1/2圈状架构，底端嵌接口所在之处和顶端嵌接口所在之处一一相应，底端肋杆1-3V底端横向从一头到另一头等距开有半圈状豁口，半圈状豁口与底端嵌接口相间布置；使用者将绳索盘绕于顶端嵌接口与底端嵌接口之间后，即可进一步提高顶端壳体1-2与底端壳体1-3之间的连接紧密性。
所述底端壳体1-3底端按照其环向等距开有止位口，底端壳体1-3底端外壁经由螺钉一1-3X装配着底端压圈1-3Z，底端壳体1-3顶端中部经由螺钉二1-3W装配着下顶板1-3Y，下顶板1-3Y外壁顶端与底端压圈1-3Z内壁顶端均沿底端壳体1-3环向等距开有底端凹口，所述底端凹口和顶端凹口所在之处一一相应，所述下顶板1-3Y和底端压圈1-3Z上所在之处相应的底端凹口间贴牢着底端肋杆1-3V，所述底端肋杆1-3V底端设有止位突杆，所述止位突杆底端插接于止位口内；把底端肋杆1-3V底端设置的止位突杆插接于止位口内后，接着经由螺钉一1-3X和螺钉二1-3W把底端压圈1-3Z和下顶板1-3Y装配于盒体顶端，来达成底端肋杆1-3V所在之处执行稳定的效果的，稳定后底端肋杆1-3V能够在传送期间改善底端壳体1-3的抗损性。
经由设于顶端壳体和底端壳体间的黏接部对顶端壳体和底端壳体执行相连，能够去除仅仅依赖人工运用黏接条执行封闭时具有的速度慢和黏接性能不佳的缺陷，另外由按照顶端壳体和底端壳体环向设有的肋杆对顶端壳体和底端壳体执行撑持，以此达到壳体抗损的性能，改善了检测条和壳体传送期间的抗损性；构造黏接部对顶端壳体与底端壳体执行黏接，不用使用者人工的对黏接条执行切割，在引导口的引导下，能够确保黏接条黏接所在之处的精准，拔出稳定杆后可再度在稳定杆上盘绕黏接条，来执行反复运用；这里构造的顶端壳体和底端壳体上都设有肋杆，能够改善壳体的抗损性能，降低传送期间壳体由于被挤压过甚而毁损状况发生的几率。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的简单修改或变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (10)

1.一种病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法，其特征在于，通过病毒受体结合蛋白夹心法原理检测中和抗体，其为通过提前设置病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的作为配体的蛋白所形成的复合物，将靶向受体蛋白的非中和抗体提前捕获，保证后续通过夹心法检测中和抗体的特异性；
所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体所形成的复合物包括受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体通过专用的反应方法结合而成，以此封闭中和抗体与受体结合蛋白的结合位点；
所述病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法，具体包括：
在标记载体为胶体金或者红色乳胶微球的条件下，进行检测时，收集待检测的血清并滴加15 ul在检测卡的加样孔中，然后向加样孔内滴加稀释液70 ul，反应15分钟；然后通过观察窗直接观测非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线的反应结果，并与配套使用的浓度显色卡进行比对，来判断病毒中和抗体和非中和抗体含量；
在标记载体为时间分辨荧光微球的条件下，进行检测时，收集待检测的血清并滴加15ul在在检测卡的加样孔中，然后向加样孔内滴加稀释液70 ul，反应15分钟；然后采用相应的仪器读取非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线的反应结果，并通过非中和抗体检测线和中和抗体检测线分别同质控线的比值来判断病毒中和抗体和非中和抗体含量。
2.根据权利要求1所述的病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法，其特征在于，在病毒受体为埃博拉病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面糖蛋白的受体结合区域，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为人T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1；
在病毒受体为新型冠状病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面S蛋白的受体结合区域，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为血管紧张素转化酶2；
在病毒受体为中东呼吸综合征冠状病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面S蛋白的受体结合区域，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为跨膜二肽基肽酶4；
在病毒受体为亨尼帕病毒的条件下，所述病毒受体结合蛋白为其表面糖蛋白的受体结合区域，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为酪氨酸激酶Eph配体B2。
3.根据权利要求2所述的病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法，其特征在于，所述病毒受体结合蛋白为RBD蛋白，所述能阻断中和抗体与其结合的配体为ACE2蛋白，所述病毒受体为新型冠状病毒；在此条件下所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体通过专用的反应方法结合而成的方法，包括：
步骤1-1：分别取RBD蛋白以及ACE2蛋白，并用PBS缓冲液分别把RBD蛋白以及ACE2蛋白稀释至1 mg/mL; 将稀释后的RBD蛋白和ACE2蛋白，按照体积比4:1混合；然后在温度为4℃的条件下搅拌10 h并作为RBD与ACE2结合复合物待用；
步骤1-2：结合ACE2的琼脂糖填料制备，即取5 ml NHS-activated Beads用0.2 MNaHCO3溶液清洗后，加入5 ml 1mg/mL ACE2蛋白溶液，然后在温度为4℃的条件下，混匀10h进行反应；反应结束后，静置，去掉上清，然后加入5 ml 0.5 M乙醇胺封闭未反应的NHS，然后在温度为4℃的条件下，混匀10 h进行反应；反应结束后，静置，去掉上清；用去离子水清洗3次，作为结合ACE2的琼脂糖填料待用；
步骤1-3：RBD与ACE2蛋白结合复合物的纯化，即将上述步骤1-2制备的结合ACE2的琼脂糖填料装填于层析柱中，并用1xPBS平衡4个柱体积，其控制流速为0.1 ml/min，再从层析柱上方加入步骤1制备的RBD与ACE2结合复合物，从层析柱下方收集流出的组分，即可去除步骤1-1反应多余的RBD蛋白，所述组分经超滤管浓缩至1 mg/mL，作为纯化后的RBD与ACE2蛋白结合复合物，也就是所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体所形成的复合物待用。
4.根据权利要求2所述的病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法，其特征在于，病毒受体通过所述病毒受体结合蛋白和能阻断中和抗体与其结合的配体复合物后，还需要继续通过受体结合蛋白标记物，所述受体结合蛋白标记物包括受体结合蛋白和载体，所述受体结合蛋白附着在标记载体上，所述标记载体包括胶体金、乳胶微球、纳米碳、磁微球或荧光微球中的一种或多种。
5.一种检测卡，其特征在于，所述权利要求1到权利要求4中任意一个权利要求的病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法所使用的设备包括检测卡，所述检测卡包括壳体，壳体内设有检测条，在所述壳体的边壁上且面向检测条的中和抗体检测线和非中和抗体检测线的位置开设有观察窗，在所述壳体的该边壁上且距离所述中和抗体检测线更近的一端开设有加样孔，所述加样孔用于样品或其稀释液的注入；
所述检测条上按照远离加样孔的方向依次设有非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线；
所述检测条包括按照远离加样孔的方向依次设有样品垫、结合垫、NC膜与吸水垫，其中样品垫处在加样孔的正下方；
所述NC膜上设有非中和抗体检测线、中和抗体检测线和质控线；
所述非中和抗体检测线上包被有病毒受体结合蛋白与能阻断中和抗体与其结合的配体复合物，所述中和抗体检测线上包被有病毒受体结合蛋白。
6.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述非中和抗体检测线包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述检测线包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物和鸡IgY标记物，所述标记载体为胶体金，所述质控线包被有质控检测物，所述质控检测物为抗鸡IgY；
或者，所述非中和抗体检测线包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述中和抗体检测线包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体为红色乳胶微球，所述质控线包被有质控检测物，所述质控检测物为抗RBD抗体；
或者，所述非中和抗体检测线包被有RBD-ACE2蛋白结合复合物，所述中和抗体检测线包被有RBD蛋白；所述结合垫设有RBD蛋白标记物，所述RBD蛋白标记物包括标记载体和结合于标记载体的RBD蛋白，所述标记载体为时间分辨荧光微球。
7.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫包括滤血垫或所述样品垫上添加有抗RBC抗体，能够直接检测指尖血和全血样本。
8.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述壳体还可以为：其包括顶端壳体、底端壳体、锁杆以及黏接部，顶端壳体的底端和底端壳体的顶端贴牢，顶端壳体的底端按照其环向等距开有锁接口，底端壳体顶端按照其周向环向等距装配着锁杆，锁杆插接于锁接口中，顶端壳体和底端壳体间相连着黏接部；
顶端壳体底端一边的前部开有稳定口一，顶端壳体底端一边的后部开有搁放口一，底端壳体顶端一边的前部开有稳定口二，底端壳体顶端一边的后部开有搁放口二，稳定口一和稳定口二的所在之处一一相应，搁放口一和搁放口二所在之处一一相应，顶端壳体底端和底端壳体顶端都开有引导口，引导口呈圈状架构；
黏接部包含稳定杆、运动杆和黏接条,稳定口一和稳定口二间装配着稳定杆，一号放置辊和二号放置辊间装配着运动杆，黏接条的一头盘绕于稳定杆上，黏接条的另一头盘绕于运动杆上。
9.根据权利要求8所述的检测卡，其特征在于， 顶端壳体的顶端按照其环向等距开有限位口，顶端壳体的顶端外壁经由螺杆一装配着顶端压圈，顶端壳体的顶端当中处经由螺杆二装配着上顶板，上顶板外壁底端和顶端压圈内壁底端都按照顶端壳体环向等距开有顶端凹口，上顶板和顶端压圈上所在之处相应的顶端凹口间挤压着顶端肋杆，顶端肋杆的底端设有限位突杆，限位突杆底端插接于限位口中；
螺杆一、螺杆二、螺钉一和螺钉二都是PVC材料；
顶端肋杆底端经横向的一头到另一头等距开有顶端嵌接口，顶端嵌接口是1/2圈状架构；
底端肋杆顶端横向从一头到另一头等距开有底端嵌接口，底端嵌接口是1/2圈状架构，底端嵌接口所在之处和顶端嵌接口所在之处一一相应，底端肋杆底端横向从一头到另一头等距开有半圈状豁口，半圈状豁口与底端嵌接口相间布置；
底端壳体底端按照其环向等距开有止位口，底端壳体底端外壁经由螺钉一装配着底端压圈，底端壳体顶端中部经由螺钉二装配着下顶板，下顶板外壁顶端与底端压圈内壁顶端均沿底端壳体环向等距开有底端凹口，底端凹口和顶端凹口所在之处一一相应，下顶板和底端压圈上所在之处相应的底端凹口间贴牢着底端肋杆，底端肋杆底端设有止位突杆，止位突杆底端插接于止位口内。
10.一种应用，其特征在于，所述权利要求1到权利要求4中任意一个权利要求的病毒中和抗体与非中和抗体联合检测方法能够应用到检测新型冠状病毒的中和抗体与非中和抗体的检测。
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