CN113430206A - 一种mybpc3突变基因及肥厚型心肌病检测试剂盒 - Google Patents

一种mybpc3突变基因及肥厚型心肌病检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域，具体涉及了一种MYBPC3突变基因，在基因组位置chr11:47361293处，插入碱基ACAA；参考基因组版本是GRCh37。本发明还涉及上述MYBPC3突变基因在制备肥厚型心肌病检测试剂盒中的应用，肥厚型心肌病检测试剂盒，包括根据MYBPC3突变基因设计的引物，引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。本发明提供的MYBPC3突变基因可以将肥厚型心肌病患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断肥厚型心肌病的生物标志物；检测该变异的携带者，可以为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生；为人类攻克肥厚型心肌病提供可能的药物靶点，促进创新药物研发。

Description

一种MYBPC3突变基因及肥厚型心肌病检测试剂盒
技术领域
本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域，尤其涉及一种MYBPC3突变基因及肥厚型心肌病检测试剂盒。
背景技术
肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是一种以心肌非对称性肥厚为主要特点的肌节蛋白疾病，具有遗传特征，典型病理改变为心肌细胞异常肥大、排列紊乱及间质纤维化等心肌细胞功能降低，以及室性心律失常、心力衰竭和心源性猝死等，其中心源性猝死是造成青年人猝死的重要原因。
HCM中，心脏型肌球蛋白结合蛋白C(cardiac myosin binding protein C,MYBPC3)基因突变引起的HCM占20-25％，MYBPC3基因编码心脏特异性肌球蛋白结合蛋白，是脊椎动物横纹肌粗肌丝的重要组成部分。目前已鉴定出上百种MYBPC3基因的突变位点，大部分为插入/缺失或剪切位点突变，不仅与HCM相关，还与进行性心脏衰竭、中风和SCD等相关。
在前人的研究基础上，进一步发现新的MYBPC3基因突变位点将有助于进一步研究HCM，都是对HCM分子诊断的重要技术贡献。
发明内容
本发明的目的在于针对上述缺陷，提供一种MYBPC3突变基因及肥厚型心肌病检测试剂盒。
本发明通过对肥厚型心肌病的家系成员进行分析，意料不到地发现了，家系中的肥厚型心肌病患者具有如下突变：
Figure BDA0003212380220000011
其中，在基因组位置chr11:47361254-chr11:47361303处，野生型MYBPC3基因的序列为SEQ ID NO:1，具体序列为CCAGACACCATTGTGGTTGTAGCTGGAAATAAGCTACGTCTGGACGTCCC。
在基因组位置chr11:47361254-chr11:47361303处，MYBPC3突变基因的序列为SEQID NO:2。
具体序列为：
CCAGACACCAACCATTGTGGTTGTAGCTGGAAATAAGCTACGTCTGGACGTCCC，其中ACCA为插入的碱基。
c.1975_1976insACCA表示：在野生型MYBPC3基因CDS区域，第1975和第1976位点之间插入ACCA，第659位的异亮氨酸是首个发生改变的氨基酸，且异亮氨酸(Ile)变为天冬酰胺(Asn)，同时发生移位突变后，终止密码的位置变为第9位。
基于以上发现，本发明提供的技术方案如下：
一、本发明提供一种MYBPC3突变基因，在基因组位置chr11:47361293处，插入碱基ACAA；参考基因组版本是GRCh37。
二、本发明还提供了上述MYBPC3突变基因在制备肥厚型心肌病检测试剂盒中的应用。
三、本发明还提供了一种肥厚型心肌病检测试剂盒，包括根据MYBPC3突变基因设计的引物，引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
五、本发明的有益效果在于：
本发明公开的MYBPC3突变基因可以作为临床辅助诊断肥厚型心肌病的生物标志物，为人类攻克肥厚型心肌病提供可能的药物靶点，促进创新药物研发；基于MYBPC3突变基因开发的肥厚型心肌病检测试剂盒，可以将肥厚型心肌病患者和正常人群区分开，能够为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。
附图说明
图1为肥厚型心肌病家系图；
图2为先证者及先证者哥哥的Sanger测序图；
图3为家系中非患病成员Sanger测序图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1-先证者验证实验
样本来源：阜外医院，在先证者(28岁)及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL全血样本，建立病历资料库，详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
采用Sanger测序法对先证者及其家属的MYBPC3基因进行基因检测，具体步骤如下：
S1、提取基因组DNA；
采用江苏百世诺医疗科技有限公司的磁珠法全血基因组DNA提取试剂对先证者及其家属的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，对DNA的浓度和纯度进行检测。
S2、使用经设计的引物组合对MYBPC3基因进行扩增；
(1)配制PCR扩增试剂，PCR扩增试剂的组成具体参见下表1：
表1PCR扩增试剂的组成
Figure BDA0003212380220000031
2×Taq MasterMix(Dye)中包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2 +、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组份；正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L。
扩增所需的引物信息如下表2所示：
表2引物信息
Figure BDA0003212380220000032
(2)目的片段扩增
将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。
取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考。
S3、采用3730XL Genetic Analyzer全自动测序仪对PCR产物进行测序。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对。
结果表明如图1-图3所示，先证者携带的MYBPC3突变基因遗传自先证者的父亲，并以常染色体显性遗传的方式在家族内传递，遗传概率为50％，先证者母亲、先证者妻子和先证者的女儿均未携带MYBPC3基因c.1975_1976insACCA杂合错义变异，但是先证者妹妹携带了该变异。
实施例2-一种肥厚型心肌病检测试剂盒
本实施例提供用于检测人类MYBPC3基因c.1975_1976insACCA杂合错义变异的试剂盒，包括2×Taq MasterMix(Dye)、能够检测MYBPC3突变基因的引物等，试剂盒的具体组成如下表3所示。
利用本试剂盒筛选肥厚型心肌病的具体步骤为：按照实施例1的步骤提取待测者DNA，然后使用经设计的引物组合(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)对MYBPC3基因进行扩增，得到PCR产物，最后对PCR产物进行测序。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对，判断待测者MYBPC3基因是否携带c.1975_1976insACCA杂合错义变异，协助临床确诊待测者是否患有肥厚型心肌病。
表3试剂盒组成
Figure BDA0003212380220000041
实施例3针对家系外的正常人的突变验证
参照实施例1的方法，对380例同种族无关正常人(即家系外正常人)进行MYBPC3基因c.1975_1976insACCA突变位点检测，结果均未能检测到该突变。
综上结果，并基于MYBPC3基因的c.1975_1976insACCA杂合错义变异会导致MYBPC3基因编码的蛋白质发生p.Ile659Asnfs Ter9的改变，而MYBPC3基因是肥厚型心肌病的已知致病基因，从而再次证明了MYBPC3基因的c.1975_1976insACCA杂合错义变异为肥厚型心肌病的致病突变。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 百世诺（北京）医疗科技有限公司
<120> 一种MYBPC3突变基因及肥厚型心肌病检测试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ccagacacca ttgtggttgt agctggaaat aagctacgtc tggacgtccc 50
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ccagacacca accattgtgg ttgtagctgg aaataagcta cgtctggacg tccc 54
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cctcccagcc aacgtcctg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cccactcatc gctgtcacc 19

Claims (4)

1.一种MYBPC3突变基因，其特征在于，在基因组位置chr11:47361293处，插入碱基ACAA；参考基因组版本是GRCh37。
2.根据权利要求1所述的MYBPC3突变基因，其特征在于，在基因组位置chr11:47361254-chr11:47361303处，序列为SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求1或2所述的MYBPC3突变基因在制备肥厚型心肌病检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的肥厚型心肌病检测试剂盒，其特征在于，包括根据MYBPC3突变基因设计的引物，引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
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