CN113429972B - 对硫磷荧光探针及其制备方法以及基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法 - Google Patents

对硫磷荧光探针及其制备方法以及基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纳米材料技术及检测方法技术领域，公开了对硫磷荧光探针及其制备方法以及基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法。探针的制备方法，包括：以β‑CD作为主体分子对上转换荧光纳米颗粒进行修饰；将上述荧光颗粒与作为客体分子的染料复合，通过主客体相互作用构建对硫磷荧光探针；染料的吸收光谱与上转换荧光纳米颗粒的发射光谱至少30％重叠。对硫磷荧光探针，采用如前上述的制备方法制得。检测方法，基于荧光探针对对硫磷的仿生识别作用，建立了turn‑on模式的对硫磷荧光共振能量转移检测方法。对硫磷荧光探针，灵敏度高、特异性强，具有优异的抗干扰能力，可实现环境及食品中对硫磷农药的高灵敏、高特异性快速检测。

Description

对硫磷荧光探针及其制备方法以及基于仿生识别的对硫磷荧 光共振能量转移检测方法
技术领域
本发明涉及纳米材料技术及检测方法技术领域，具体而言，涉及对硫磷荧光探针及其制备方法以及基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法。
背景技术
有机磷农药由于其具有高效、广谱等优势，已被广泛应用于农作物生产中病、虫害的防治，在农业生产中发挥着不可或缺的作用。然而其过量或者不合理使用将导致食品、水、土壤等有机磷农药残留超标。残留在食品和环境中的有机磷农药通过食物链、皮肤等途径进入人体后，将对人体造成较大危害。对硫磷是一种广谱性的有机磷杀虫剂和除螨剂，对害虫具有较强的触杀、胃毒、熏蒸等作用，对防治水稻螟虫、棉铃虫、玉米螟、高粱条螟均具有较好的效果。然而其毒性高、具有致癌性和致突变性，进入人体后会引起神经功能的紊乱，导致头痛、意识不清、呼吸困难，甚至引起休克，因此，已被世界卫生组织列为2B类致癌物为保护人民健康，我国已禁止生产、销售和使用对硫磷，且制定了其在粮食、蔬菜、水果以及饮用水中的最大残留限量。因此，开发灵敏、准确、快速的对硫磷检测方法对保障食品安全和人类健康具有重要意义。
目前，基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、气相色谱法(GC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、酶联免疫分析方法、电化学分析法、比色法、荧光法等。尽管色谱、色谱-质谱等仪器确证方法可以提供较为准确的检测结果，但往往需要较为昂贵的仪器、需专业操作人员，且时效性较差，不适用于现场分析；酶联免疫分析方法受限于抗体的稳定性和特异性，易受样品基质干扰，且操作复杂，所需时间相对较长；电化学分析方法的稳定性和重复性有待提高；比色法易受样品基质干扰。与上述方法相比，荧光法由于具有灵敏、分析时间短、时效性强、易于实现现场检测等优点，在农药残留快速检测领域展现了广泛的应用前景。当前，研究者们已开发了基于有机荧光染料、量子点和碳点的有机磷荧光速测方法。尽管这些方法已取得了一定的研究进展，但在实际应用中依然存在一些缺陷，例如，有机荧光染料水溶性差、易发生光漂白和光损伤；量子点、碳点等荧光材料通常在较短波长下激发，易受样品基质自发荧光干扰，并且其合成过程较为复杂，且大多数需要使用有毒试剂；绝大部分方法采用抗体和适配体等生物识别材料作为识别元件，检测结果的稳定性和准确度受样品基质和环境干扰影响较大，且无法实现对硫磷的特异性检测。因此，开发能够克服背景荧光干扰和光漂白的新型荧光探针对实现对硫磷的精准快速检测具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供对硫磷荧光探针的制备方法、对硫磷荧光探针和基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种对硫磷荧光探针的制备方法，包括：
以β-CD作为主体分子通过自组装对上转换荧光纳米颗粒进行修饰；
将修饰有主体分子的荧光颗粒与作为客体分子的染料混合，通过主体- 客体相互作用构建对硫磷荧光探针；
作为客体分子的染料的吸收光谱与上转换荧光纳米颗粒的发射光谱有至少30％的重叠。
在可选的实施方式中，上转换荧光纳米颗粒为NaYF4:Yb/Er颗粒，作为客体分子的染料为罗丹明B。
在可选的实施方式中，上转换荧光纳米颗粒是采用稀土油酸盐为前驱体通过高温裂解法制备得到；
优选地，上转换荧光纳米颗粒的粒径为20～50nm。
在可选的实施方式中，上转换荧光纳米颗粒的制备方法包括：
对溶解有油酸钇配合物、油酸镱配合物、油酸铒配合物以及氟化钠的溶液体系升高温度至110～130℃，加热30～90min；然后将加热后的体系置于惰性气体保护气氛下加热至295～310℃保温45min～2h，冷却后洗涤所得固体物质，干燥固体物质得到上转换荧光纳米颗粒；溶液体系中油酸钇配合物、油酸镱配合物和油酸铒配合物的摩尔比77～79:19～21:1.9～2.1，油酸钇在溶液体系中的浓度为，0.04～0.06mmol/mL，氟化钠的浓度为 0.31～0.48mmol/mL；
优选地，溶液体系中溶剂为油酸和1-十八烯烃；更优选地，油酸和1- 十八烯的用量的体积比为0.2～1.5:1。
在可选的实施方式中，采用β-CD通过自组装对上转换荧光纳米颗粒进行修饰的方法包括：
将NaYF4:Yb/Er颗粒与β-CD在溶液体系中混合，在该溶液体系中，β-CD的质量是NaYF4:Yb/Er颗粒质量的0.5～10倍；
然后搅拌2～48h，搅拌结束后进行固液分离，最后清洗所得固体得到β-CD@NaYF4:Yb/Er；
优选地，将NaYF4:Yb/Er颗粒与β-CD在溶液体系中混合是：将浓度为0.5-10mg/mL的NaYF4:Yb/Er颗粒溶液与浓度为5-20mg/mL的β-CD水溶液等体积混合；更优选地，NaYF4:Yb/Er颗粒溶液的溶剂为醇和水的混合溶剂，醇为甲醇和乙醇中至少一种；进一步地，醇和水的体积比为1.5～3:1；
优选地，搅拌是在室温下避光搅拌；
优选地，固液分离的方式为将溶液离心后去除上清液；
优选地，清洗所得固体的方式为采用超纯水和乙醇交替洗涤3～6次。
在可选的实施方式中，将修饰有主体分子的荧光颗粒与作为客体分子的染料混合是：
将β-CD@NaYF4:Yb/Er和罗丹明B在溶液体系中混合，在该溶液体系中，罗丹明B的质量是β-CD@NaYF4:Yb/Er质量的0.15～5倍；
搅拌2～24h使溶液呈现均匀的粉红色，然后进行固液分离，清洗所得固体，最后去除固体中的水分得到β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB；
优选地，将β-CD@NaYF4:Yb/Er和罗丹明B在溶液体系中混合是：向浓度为0.5～10mg/mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er颗粒溶液中加入罗丹明B；
优选地，搅拌是在室温下避光搅拌；
优选地，固液分离的方式为将溶液离心后去除上清液；
优选地，清洗所得固体的方式为采用超纯水洗涤2～5次。
优选地，去除固体中的水分的方式为冷冻干燥。
第二方面，本发明提供一种对硫磷荧光探针，采用如前述实施方式任一项的制备方法制得。
第三方面，本发明提供一种基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法，采用如前述实施方式的对硫磷荧光探针，利用荧光光谱检测溶液中的对硫磷。
在可选的实施方式中，包括：
利用混合有标准量β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB的不同对硫磷浓度的样品在980nm激发下得到的荧光光谱建立标准曲线；
将含有标准量的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB与含有对硫磷的待测溶液混合，记录混合液在980nm激发下的荧光光谱；
将混合液对应的荧光光谱结果与标准曲线对比，得出待测溶液中对硫磷的浓度。
优选地，将含有标准量的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB与含有对硫磷的待测溶液混合是：
将浓度为1～5mg/mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液与待测溶液混合定容至3mL，β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液与待测溶液的体积比为 1:0.5～2。
本发明具有以下有益效果：
本申请提供的对硫磷荧光探针的制备方法，是基于仿生识别、竞争结合和荧光共振能量转移技术，构建的基于仿生识别的农药荧光共振能量转移速测技术。通过本发明提供的方法所构建荧光探针由于探针负载的染料分子和上转换纳米颗粒的荧光共振能量转移，导致上转换荧光探针的荧光被淬灭，荧光信号减弱；当对硫磷加入检测体系后，由于上转换纳米颗粒表面修饰的β-CD对对硫磷具有仿生识别作用，对硫磷与所负载的客体分子对β-CD腔内发生竞争结合，导致所负载的客体分子脱离上转换荧光探针，荧光共振能量转移过程无法发生，上转换荧光强度得以恢复；根据荧光信号的恢复程度，即可实现对硫磷的精准速测。
本申请提供的对硫磷荧光探针，对硫磷荧光探针敏度高、特异性强，对非对硫磷以外的其它有机磷农药以及食品中的常见干扰物均具有优异的抗干扰能力，可实现环境及食品中对硫磷农药的高灵敏、高特异性快速检测。
本申请提供的基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法，基于仿生识别原理，有效避免了生物识别元件不稳定受环境和基质影响较大的问题；采用上转换荧光信号作为报告信号，有效避免了样品基质颜色以及自发荧光的问题，极大地降低了检测信噪比，提高了检测抗干扰能力和灵敏浓；同时，该法速度快，操作简单，所制备的探针易于合成，具有较好的应用价值。且该检测方法灵敏度高、特异性强，对对硫磷以外的其它有机磷农药以及食品中的常见干扰物均具有优异的抗干扰能力，可实现环境及食品中对硫磷农药的高灵敏、高特异性快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的荧光探针的检测机理示意图；
图2为本发明实施例的上转换荧光纳米材料和β环糊精修饰的上转换荧光纳米材料的扫描电子显微镜图；
图3为本发明实施例的上转换荧光纳米材料和β环糊精修饰的上转换荧光纳米材料的XRD图；
图4为本发明实施例的上转换荧光纳米材料和β环糊精修饰的上转换荧光纳米材料的荧光光谱；
图5为本发明实施例1所建立的对硫磷检测标准曲线；
图6为本发明实施例1所建立的对硫磷上转换荧光探针及速测方法的特异性和抗干扰能力评价结果图；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的对硫磷荧光探针及其制备方法、检测方法进行具体描述。
本申请实施例提供的对硫磷荧光探针的制备方法，包括：
以β环糊精作为主体分子通过自组装对上转换荧光纳米颗粒进行修饰；
将修饰有主体分子的荧光颗粒与作为客体分子的染料混合，通过主体- 客体相互作用构建对硫磷荧光探针；
作为客体分子的染料的吸收光谱与上转换荧光纳米颗粒的发射光谱有至少30％的重叠。
采用内腔疏水、外腔亲水结构的β-CD(β-环糊精)通过简单便捷的自组装方法对上转换荧光纳米材料进行修饰，既改善了上转换荧光纳米材料的亲水性，也赋予了上转换荧光纳米材料分子担载的能力，为实现目标物的检测提供了可能；最后通过β-CD与所负载材料和对硫磷间的主体-客体作用，构建了对对硫磷具有响应的智能上转换荧光探针。该法制备工艺简单、成本低廉、制备过程绿色环保、环境友好度高、更易规模化，可为构建其他目标物的上转换荧光探针提供较好的借鉴。
上述方法是基于仿生识别、竞争结合和荧光共振能量转移技术，构建的基于仿生识别的农药荧光共振能量转移速测技术。通过上述方法所构建荧光探针由于探针负载的染料分子和上转换纳米颗粒的荧光共振能量转移，导致上转换荧光探针荧光被淬灭，荧光信号减弱；当对硫磷加入检测体系后，由于上转换纳米颗粒表面修饰的β-CD对对硫磷具有仿生识别作用，对硫磷与所负载的客体分子对β-CD腔内发生竞争结合，导致所负载的客体分子脱离上转换荧光探针，荧光共振能量转移过程无法发生，上转换荧光强度得以恢复；根据荧光信号的恢复程度，即可实现对硫磷的精准速测。
优选地，上转换荧光纳米颗粒为NaYF4:Yb/Er颗粒，作为客体分子的染料为罗丹明B。
罗丹明B的吸收光谱与NaYF4:Yb/Er颗粒的发射光谱有较大重叠，当罗丹明B和上转换荧光纳米颗粒距离较近时，发生荧光共振能量转移效应，β-CD@NaYF4:Yb/Er激发发射的荧光被罗丹明B吸收，从而荧光被淬灭。
具体地，NaYF4:Yb/Er颗粒的制备方法包括：
S1、上转换荧光纳米颗粒的制备。
采用稀土油酸盐为前驱体通过高温裂解法制备上转换荧光纳米颗粒 (NaYF4:Yb/Er颗粒)。
这种方法制备上转换荧光纳米颗粒避免了采用稀土离子的三氟乙酸盐为前驱体制备上转换荧光纳米材料产生时三氟乙酸对环境和人体的毒性。
优选地，上转换荧光纳米颗粒的粒径为20～50nm。
上转换荧光纳米颗粒的大小会影响对荧光共振能量转移的效果有着巨大影响，当上转换荧光纳米颗粒粒径较大时，由于距离效应(距离越远，荧光共振能量转移效率越低)，罗丹明B对上转换荧光纳米颗粒的淬灭效果显著降低。因此，罗丹明B对粒径为20～50nm的上转换荧光纳米颗粒的淬灭效果好。
具体地，NaYF4:Yb/Er颗粒的制备方法包括：
对溶解有油酸钇配合物、油酸镱配合物、油酸铒配合物以及氟化钠的溶液体系升高温度至110～130℃，加热30～90min；然后将加热后的体系置于惰性气体保护气氛下加热至295～310℃保温45min～2h，冷却后洗涤所得固体物质，干燥固体物质得到上转换荧光纳米颗粒；溶液体系中油酸钇配合物、油酸镱配合物和油酸铒配合物的摩尔比77～79:19～21:1.9～2.1(例如 77:21:1.9、78:20:2、79:19:2.1，通常按照78:20:2配料)，油酸钇在溶液体系中的浓度为0.04～0.06mmol/mL(例如：0.04mmol/mL、0.05mmol/mL以及 0.06mmol/mL)，氟化钠的浓度为0.31～0.48mmol/mL(例如：0.31mmol/mL、 0.35mmol/mL、0.40mmol/mL、0.45mmol/mL以及0.48mmol/mL)；
氟化钠提供NaYF4:Yb/Er颗粒的氟源，油酸钇配合物提供NaYF4:Yb/Er 颗粒的基质，油酸镱配合物提供NaYF4:Yb/Er颗粒的敏化剂，油酸铒配合物提供NaYF4:Yb/Er颗粒的发光中心。
反应温度、反应时间、氟化钠的用量对上转换荧光纳米粒子的晶型、发光强度以及粒径大小均具有较大影响，最终通过调控，获得荧光信号强，且尺寸在20～50nm的上转换荧光纳米颗粒。当温度较低，反应时间短、氟化钠用量相对较低时，上转荧光纳米粒子呈现立方相，其荧光强度显著低于六方相，因此，需选择较高反应温度、较长反应时间和较大氟化钠用量。
本申请中，油酸钇配合物即指油酸钇；油酸镱配合物即指油酸镱；油酸铒配合物即指油酸铒。本申请具体实施例中，油酸钇配合物是由硝酸钇与油酸钠在水、乙醇和环己烷的混合溶液中反应而得，油酸镱配合物是由硝酸镱与油酸钠在水、乙醇和环己烷的混合溶液中反应而得，油酸铒配合物是由硝酸铒与油酸钠在水、乙醇和环己烷的混合溶液中反应而得。
进一步地，惰性气体包括氮气和稀有气体，通常为氩气。
优选地，溶液体系中溶剂为油酸和1-十八烯烃，油酸作为包覆剂和溶剂，1-十八烯烃作为溶剂；更优选地，为保证制得的上转换荧光纳米颗粒具有更好的性能，油酸和1-十八烯的用量的体积比为0.2～1.5:1(例如0.2:1、 0.5:1、1:1或者1.5:1)。
进一步地，洗涤采用去离子水和乙醇按体积比为1:1混合后得到的混合溶剂进行洗涤。
进一步地，干燥方式为冷冻干燥，干燥时间为2～24h(例如:2h、4h、 8h、15h、20h或24h)。
S2、β-CD修饰上转换荧光纳米颗粒。
采用β-CD通过自组装对上转换荧光纳米颗粒进行修饰得到修饰有主体分子的荧光颗粒。
β-CD修饰上转换荧光纳米颗粒，其外腔亲水，内腔疏水，内腔疏水赋予其可以负载(吸附)罗丹明B的能力。
具体为：
将NaYF4:Yb/Er颗粒与β-CD在溶液体系中混合，在该溶液体系中，β-CD的质量是NaYF4:Yb/Er颗粒质量的0.5～10倍(例如0.5倍、1倍、2 倍、5倍或10倍)。
然后搅拌2～48h(例如:2h、4h、8h、15h、20h、24h或48h)，搅拌结束后进行固液分离，最后清洗所得固体得到β-CD@NaYF4:Yb/Er。
优选地，将NaYF4:Yb/Er颗粒与β-CD在溶液体系中混合是：将浓度为 0.5-10mg/mL(例如0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL或者10mg/mL) 的NaYF4:Yb/Er颗粒溶液与浓度为5-20mg/mL(例如5mg/mL、10mg/mL、 15mg/mL或者20mg/mL)的β-CD水溶液等体积混合。
更优选地，为使得颗粒在溶剂中分散均匀，NaYF4:Yb/Er颗粒溶液的溶剂为醇和水的混合溶剂，醇为甲醇和乙醇中至少一种；进一步优选地，醇和水的体积比为1.5～3:1(例如1.5:1、2:1或者3:1)。
具体地，搅拌是在室温下避光搅拌，以免影响制得的上转换荧光纳米颗粒的性能；固液分离的方式为将溶液离心后去除上清液；清洗所得固体的方式为采用超纯水和甲醇交替洗涤3～6次。
S3、负载作为客体分子的染料构建对硫磷荧光探针。
将修饰有主体分子的荧光颗粒与作为客体分子的染料混合，通过主体- 客体相互作用构建对硫磷荧光探针。
具体为：
将β-CD@NaYF4:Yb/Er/Er和罗丹明B在溶液体系中混合，在该溶液体系中，罗丹明B的质量是β-CD@NaYF4:Yb/Er质量的0.15～5倍(例如0.15 倍、1倍、2倍或5倍)；
搅拌2～24h(例如:2h、4h、8h、15h、20h或24h)使溶液呈现均匀的粉红色，然后进行固液分离，清洗所得固体，最后去除固体中的水分得到β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB。
优选地，将β-CD@NaYF4:Yb/Er和罗丹明B在溶液体系中混合是：向浓度为0.5～10mg/mL(例如0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL或者 10mg/mL)的β-CD@NaYF4:Yb/Er颗粒溶液中加入罗丹明B。
具体地，搅拌是在室温下避光搅拌；固液分离的方式为将溶液离心后去除上清液；清洗所得固体的方式为采用超纯水洗涤2～5次；去除固体中的水分的方式为冷冻干燥。
本申请实施例提供的一种对硫磷荧光探针，采用如本申请实施例提供的制备方法制得。
该对硫磷荧光探针敏度高、特异性强，对非对硫磷以外的其它有机磷农药以及食品中的常见干扰物均具有优异的抗干扰能力，可实现环境及食品中对硫磷农药的高灵敏、高特异性快速检测。
本申请实施例提供的一种基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法，采用本申请实施例提供的对硫磷荧光探针，利用荧光光谱检测溶液中的对硫磷。
具体检测方法包括：
S4、利用混合有标准量的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB的不同对硫磷浓度的样品在980nm激发下得到的荧光光谱建立标准曲线。
本申请中提到的“标准量”是指检测时荧光探针β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB的使用量，具体的用量可根据实际使用时进行选择，此步骤的标准量与后续S5步骤的标准量是指相同量。
具体为：
配置浓度为1～5mg/mL(例如1mg/mL、2mg/mL或5mg/mL)的β-CD@ NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液；
分别在离心管中加入不同浓度的对硫磷溶液然后向这些加入有对硫磷溶液的离心管中加入上述配置好的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液，β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液与对硫磷溶液的体积比为1:0.5～2(例如 1:0.5、1:1.5或者1:2)；
然后向这些离心管中加超纯水定容至3mL，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱，制备得到标准曲线。
S5、将含有标准量的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB与含有对硫磷的待测溶液混合，用荧光光谱仪记录混合液在980nm激发下的荧光光谱。
在离心管中加入与S4步骤中对磷硫溶液等量的待测样品溶液，然后再加入与S4步骤中等量的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液，然后定容至 3mL，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱。
S6、将混合液对应的荧光光谱结果与标准曲线对比，得出待测溶液中对硫磷的浓度。
本申请实施例提供的基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法，基于仿生识别原理，有效避免了生物识别元件不稳定受环境和基质影响较大的问题；采用上转换荧光信号作为报告信号，有效避免了样品基质颜色以及自发荧光的问题，极大地降低了检测信噪比，提高了检测抗干扰能力和灵敏浓；同时，该法速度快，操作简单，所制备的探针易于合成，具有较好的应用价值。且该检测方法灵敏度高、特异性强，对对硫磷以外的其它有机磷农药以及食品中的常见干扰物均具有优异的抗干扰能力，可实现环境及食品中对硫磷农药的高灵敏、高特异性快速检测。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的对硫磷荧光探针的制备方法为：
将3.792mL的油酸和11.555mL的1-十八烯注入到50mL双颈圆底烧瓶中，然后向其中加入6mmolNaF、0.78mmol油酸钇配合物、0.2mmol 油酸镱配合物、0.02mmol油酸铒配合物，剧烈搅拌下120℃加热45min。当溶液变澄清时，将其置于氩气保护气氛中300℃保温1h；待溶液自然冷却至室温后，加入10mL乙醇，取沉淀物用去离子水和无水乙醇的体积比为1:1的混合溶剂洗涤3次；所得上转换荧光纳米颗粒(NaYF4:Yb/Er)冷冻干燥5h备用。
称取60mg NaYF4:Yb/Er上转换纳米颗粒加入至12mL乙醇与水的体积比为2:1的混合溶液中，加入浓度为20mg/mL的β-CD水溶液12mL，室温下避光剧烈搅拌24h。待溶液澄清后离心10min，再将所得沉淀用超纯水和乙醇交替洗涤3次。
称取60mgβ-CD@NaYF4:Yb分散于15mL超纯水中，加入15mg罗丹明B，室温下避光剧烈搅拌5h，使溶液呈现均匀的粉红色，离心10min，将所得沉淀用超纯水洗涤3次，冷冻干燥4h后，将所得到的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB荧光探针置于棕色玻璃瓶中避光保存。
本实施例提供的检测方法为：
配置浓度为1mg/mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液。分别在离心管中加入0.75mL不同浓度的对硫磷水溶液(0.1-70ng/mL)和1mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液，加超纯水定容到3mL，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱。利用得到的荧光光谱建立对硫磷检测标准曲线。
在离心管中加入0.75mL的待测样品溶液，然后再加入1mL浓度为1 mg/mL的β-CD@NaYF4:Yb@RhB水溶液，然后定容至3mL，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱。将得到的荧光光谱结果与标准曲线对比得到待测样品浓度。
实施例2
本实施例提供的对硫磷荧光探针的制备方法为：
将6mL的油酸和9mL的1-十八烯注入到50mL双颈圆底烧瓶中，然后向其中加入4.65mmolNaF、0.60mmol油酸钇配合物、0.163mmol油酸镱配合物、0.016mmol油酸铒配合物，剧烈搅拌下110℃加热60min。当溶液变澄清时，将其置于氩气保护气氛中295℃保温45min；待溶液自然冷却至室温后，加入10mL乙醇，取沉淀物用去离子水和无水乙醇的体积比为1:1的混合溶剂洗涤3次；所得上转换荧光纳米颗粒(NaYF4:Yb/Er)冷冻干燥 2h备用。
称取60mg NaYF4:Yb/Er上转换纳米颗粒加入至6mL乙醇与水的体积比为1.8:1的混合溶液中，加入浓度为5mg/mL的β-CD水溶液6mL，室温下避光剧烈搅拌2h。待溶液澄清后离心10min，再将所得沉淀用超纯水和乙醇交替洗涤6次。
称取60mgβ-CD@NaYF4:Yb/Er分散于60mL超纯水中，加入9mg 罗丹明B，室温下避光剧烈搅拌2h，使溶液呈现均匀的粉红色，离心10min，将所得沉淀用超纯水洗涤2次，冷冻干燥2h后，将所得到的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB荧光探针置于棕色玻璃瓶中避光保存。
本实施例提供的检测方法为：
配置浓度为5mg/mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液。分别在离心管中加入1.5mL不同浓度的对硫磷水溶液(0.1-100ng/mL)和1mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液，加超纯水定容到3mL，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱。利用得到的荧光光谱建立对硫磷检测标准曲线。
在离心管中加入1.5mL的待测样品溶液，然后再加入1mL浓度为1 mg/mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液，然后定容至3mL，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱。将得到的荧光光谱结果与标准曲线对比得到待测样品浓度。
实施例3
本实施例提供的对硫磷荧光探针的制备方法为：
将12mL的油酸和9.6mL的1-十八烯注入到50mL双颈圆底烧瓶中，然后向其中加入8.64mmolNaF、1.296mmol油酸钇配合物、0.313mmol油酸镱配合物、0.032mmol油酸铒配合物，剧烈搅拌下130℃加热30min。当溶液变澄清时，将其置于氩气保护气氛中310℃保温2h；待溶液自然冷却至室温后，加入10mL乙醇，取沉淀物用去离子水和无水乙醇的体积比为 1:1的混合溶剂洗涤3次；所得上转换荧光纳米颗粒(NaYF4:Yb/Er)冷冻干燥24h备用。
称取60mg NaYF4:Yb/Er上转换纳米颗粒加入至30mL乙醇与水的体积比为2.5：1的混合溶液中，加入浓度为20mg/mL的β-CD水溶液30mL，室温下避光剧烈搅拌48h。待溶液澄清后离心10min，再将所得沉淀用超纯水和乙醇交替洗涤5次。
称取60mgβ-CD@NaYF4:Yb/Er分散于10mL超纯水中，加入300mg 罗丹明B，室温下避光剧烈搅拌24h，使溶液呈现均匀的粉红色，离心10min，将所得沉淀用超纯水洗涤5次，冷冻干燥24h后，将所得到的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB荧光探针置于棕色玻璃瓶中避光保存。
本实施例提供的检测方法为：
配置浓度为2mg/mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液。分别在离心管中加入2mL不同浓度的对硫磷水溶液(0.1-50ng/mL)和1mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱。利用得到的荧光光谱建立对硫磷检测标准曲线。
在离心管中加入2mL的待测样品溶液，然后再加入1mL浓度为2mg/mL 的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱。将得到的荧光光谱结果与标准曲线对比得到待测样品浓度。
实验例1
根据实施例1得到的标准曲线，依据公式LOD＝3Sb/S(Sb为空白值， N＝10)计算得到方法检出限LOD为0.045ng/mL，优于现有方法，远低于 MRL值(0.01-0.1mg/kg)，证明本发明的所提供的方法灵敏度高，完全可满足实际需求。
实验例2
选取实施例1中所获得上转换荧光探针按照相同的检测流程评价本申请所提供的检测方法的特异性和抗干扰能力评价，方法如下：
将2μg/mL的马拉硫磷、敌敌畏、水胺硫磷、甲胺磷、毒死蜱、倍硫磷、叶绿素、胡萝卜素和谷胱甘肽0.75mL分别加入到含有1mg/mL β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB的1mL的水溶液中，最后用超纯水定容至3mL，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱。
将2μg/mL的马拉硫磷、敌敌畏、水胺硫磷、甲胺磷、毒死蜱、倍硫磷、叶绿素、胡萝卜素和谷胱甘肽0.75mL，1mg/mL β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB的1mL的水溶液和0.2μg/mL的对硫磷溶液0.75 mL加入离心管中，最后用超纯水定容至3mL，避光条件下震荡5min后，用荧光光谱仪记录其在980nm激发下的荧光光谱。
请参照图6，图6为本申请实施例1所建立的对硫磷上转换荧光探针及速测方法的特异性和抗干扰能力评价结果。马拉硫磷、敌敌畏、水胺硫磷、甲胺磷、毒死蜱、倍硫磷等其他有机磷农药以及叶绿素、胡萝卜素和谷胱甘肽等常见干扰物在即使在较高浓度下(2μg/mL)也仅能引起15％荧光的恢复，而体系加入4ng/mL的对硫磷时，荧光强度恢复30％左右，说明所发明的荧光探针和基于该探针构建的对硫磷检测方法具有较好的特异性。当对硫磷和干扰物共同添加至检测体系中时，荧光信号的改变程度几乎没有变化，说明所发明的荧光探针和基于该探针构建的对硫磷检测方法具有较好的抗干扰能力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种基于仿生识别的对硫磷荧光共振能量转移检测方法，其特征在于，采用对硫磷荧光探针，利用荧光光谱检测溶液中的对硫磷；所述对硫磷荧光探针的制备方法包括：
将浓度为0.5-10 mg/mL的NaYF4:Yb/Er颗粒溶液与浓度为5-20 mg/mL的β-CD水溶液等体积混合，在该溶液体系中，β-CD的质量是所述NaYF4:Yb/Er颗粒质量的0.5~10倍，NaYF4:Yb/Er颗粒溶液的溶剂为醇和水的混合溶剂，所述醇为甲醇和乙醇中至少一种，所述醇和所述水的体积比为1.5~3:1；
然后搅拌2~48h，搅拌结束后进行固液分离，最后清洗所得固体得到β-CD@NaYF4:Yb/Er；
向浓度为0.5~10 mg/mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er的荧光颗粒溶液中加入罗丹明B，在该溶液体系中，罗丹明B的质量是所述β-CD@NaYF4:Yb/Er的荧光颗粒质量的0.15~5倍；
搅拌2~24h使溶液呈现均匀的粉红色，然后进行固液分离，清洗所得固体，最后去除固体中的水分得到β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述NaYF4:Yb/Er纳米颗粒是采用稀土油酸盐为前驱体通过高温裂解法制备得到。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述NaYF4:Yb/Er纳米颗粒的粒径为20~50nm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述NaYF4:Yb/Er纳米颗粒的制备方法包括：
对溶解有油酸钇配合物、油酸镱配合物、油酸铒配合物以及氟化钠的溶液体系升高温度至110~130℃，加热30~90 min；然后将加热后的体系置于惰性气体保护气氛下加热至295~310℃保温45 min ~2 h，冷却后洗涤所得固体物质，干燥固体物质得到所述NaYF4:Yb/Er纳米颗粒；溶液体系中油酸钇配合物、油酸镱配合物和油酸铒配合物的摩尔比77~79:19~21:1.9~2.1，所述油酸钇在溶液体系中的浓度为，0.04~0.06 mmol/mL，氟化钠的浓度为0.31~0.48mmol/mL。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述溶液体系中溶剂为油酸和1-十八烯烃。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，油酸和1-十八烯的用量的体积比为0.2~1.5:1。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，搅拌是在室温下避光搅拌。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，固液分离的方式为将溶液离心后去除上清液。
9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，清洗所得固体的方式为采用超纯水和乙醇交替洗涤3~6次。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，搅拌是在室温下避光搅拌。
11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，固液分离的方式为将溶液离心后去除上清液。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，清洗所得固体的方式为采用超纯水洗涤2~5次。
13.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，去除固体中的水分的方式为冷冻干燥。
14.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括：
利用混合有标准量β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB的不同对硫磷浓度的样品在980nm激发下得到的荧光光谱建立标准曲线；
将含有所述标准量的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB与含有对硫磷的待测溶液混合，记录混合液在980nm激发下的荧光光谱；
将所述混合液对应的荧光光谱结果与所述标准曲线对比，得出所述待测溶液中对硫磷的浓度。
15.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于，将含有所述标准量的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB与含有对硫磷的待测溶液混合是：
将浓度为1~5 mg/mL的β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液与所述待测溶液混合定容至3mL，β-CD@NaYF4:Yb/Er@RhB水溶液与所述待测溶液的体积比为1:0.5~2。
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