CN113413413A - 通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物的制备方法及其质量检测方法 - Google Patents

通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物的制备方法及其质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物的制备方法及其质量检测方法。本发明在原有提取工艺的基础上增加了滤渣酶解、分离纯化等步骤，弥补了原有提取工艺的不足，减少了生物活性物质的损失，提高了产品的功效。采用超滤、离子交换层析等生物制药技术对样品进行纯化，从而得到纯度高、生物活性强的水蛭提取物，提高了药材利用率。以本发明的中药组合物为主，辅以其他产品，再结合“高压氧舱”的物理疗法，对治疗脑血管病恢复期及后遗症期的肢体麻木、半身不遂、口眼歪斜、语言不清、呛水呛食，能起到很好的治疗效果，对于改善患者神经功能、行动能力的恢复有较好的疗效，同时还可起到预防脑血管病复发的作用。

Description

通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物的制备方法及其 质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种以经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物及其工艺和质量检测方法，属于医药技术领域。
背景技术
中风是中医学病名，现代医学称为脑卒中或脑血管病，是指由各种原因引起的脑血管受损而导致的脑部损害的一种疾病。由于本病的起病与病情发展特点如风性，故类比为中风。在所有死亡原因中脑血管病位列恶性肿瘤和心脏病之后，位列死因第3位。
脑血管病(中风)类型中缺血性脑卒中最为常见，占患病人群的 69.6％—70.8％。目前，脑血管的发病率逐年增加，发病年龄日益年轻化。患了脑血管病(中风)即使是应用目前最先进、最完善的治疗手段，仍有50％以上的幸存者留有不同程度的后遗症。
脑血管病(中风)的主要病因为脑部经络受损，气血运行功能障碍，脑组织缺血缺氧、坏死或软化，进而出现相应的神经系统功能缺损。传统治疗方法在短期内可以缓解脑血管病(中风)患者病情、适用于重度、急性中风，挽救患者的生命，但在治疗过程中存在脑出血风险，且在恢复期和后遗症期，改善神经功能缺损程度方面作用不大。
中成药在我国广泛用于治疗缺血性脑卒中已有多年，具有改善神经功能缺损等功效。神经保护可改善缺血性脑卒中患者预后，神经保护药物可改善神经功能的缺损程度。经络康复法(简称：康络法)以采用本发明的治疗脑血管病(中风) 的中药组合物为主，辅助加以其他产品(如维生素E、硒维生素C维生素E、消栓口服液及B族维生素、辅酶Q10、鱼油、降脂袋泡茶等)，再结合“高压氧舱”的物理疗法，对治疗脑血管病(中风)恢复期及后遗症期的肢体麻木、半身不遂、口眼歪斜、语言不清、呛水呛食，能起到很好的治疗效果，对于改善患者神经功能、行动能力的恢复有较好的疗效，同时还可起到预防脑血管病(中风)复发的作用。
“一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物”处方由水蛭和丹参二味药组成，具有活血通络，保护脑组织的功效，可用于治疗脑血管病(中风)恢复期及后遗症期的肢体麻木、半身不遂、口眼歪斜、语言不清、呛水呛食等症。
水蛭为水蛭科动物蚂蝗(Whitmania pigra Whit-man)、水蛭(Hirudo nipponicaWhitman)或柳叶蚂蝗(Whitmania acranulata Whitman)的干燥全体。水蛭始载于《神农本草经》，历代本草均有记载。《神农本草经》谓水蛭：“味咸，平”。《本草纲目》日其：“入肝经血分”。综合各家所述，水蛭味苦咸而腥，性微寒，入肝，膀胱两经，功能破血瘀、散积聚、通经脉、利水道。现代研究发现，水蛭主含蛋白质，此外还含17种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸，以及Zn、M n、 Fe、Co、Cr、Se、Mo、Ni等l4种元素。临床上口服水蛭粉(片、液)在防治脑出血、脑血栓形成，治疗脑中风、冠心病、高脂血症、糖尿病肾病等方面，均有较好的效果。
水蛭具有抗血栓作用，吴氏通过实验研究，发现水蛭醇提物对胶原蛋白—肾上腺素诱导的小鼠体内血栓和大鼠动—静脉旁路血栓形成有明显的抑制作用，并能提高红细胞和血小板膜脂流动性，表明水蛭提取物有抗血栓形成的作用。另据袁氏报道，水蛭有直接溶解血栓的作用，它既可以与血浆中游离的凝血酶结合，又可以中和与纤维蛋白结合的凝血酶，可以防止血栓的形成和延伸。
丹参为唇形科鼠尾草植物丹参Salvia miltiorrhiz aBunge的干燥根及根茎，是最常用的活血化瘀中药之一，首载于《神农本草经》，被列为草部上品。丹参，味苦，性微寒，入心、肝经，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神的功效。古有“一味丹参，功同四物”的说法：补血生血，功过归地；调血敛血，力堪芍药；逐瘀生新，性倍川芎。丹参主要通过“养血”的作用来达到活血化瘀的目的。丹参作为传统的活血化瘀中药，也是现代医学研究的主要中药之一。可治疗多种疾病，如心肌梗塞、脑缺血中风。
丹参是活血化瘀的中药，具有改善微循环，增加毛细血管，降低毛细血管脆性使微血管周围渗出减少或消失，王合森研究发现，丹参不仅具有抑制凝血；激活纤溶系统的作用，而且对纤溶有调节作用，它可使低凝状态者升高，高凝状态者降低，由于侧支循环开放，毛细血管网增加，出血部位血管压力下降，有利于防止再出血。
公开号为CN 1615914A的专利申请公开了一种用于治疗中风病的药，是由下列原料按重量混合而成的：水蛭850g－1200g、丹参140g－320g。制造方法是：取水蛭1000g、丹参220g，将丹参粉碎成细粉，备用；将水蛭碎断，加水(90℃)提取三次，第一次加水蛭14倍量的水，第二、三次分别加水蛭12倍量的水，各提取两小时，合并提取液，滤过，将滤液浓缩至相对密度为1.18-1.22(50℃) 的浸膏，喷雾干燥，得浸膏粉，将水蛭的浸膏粉和丹参的细粉混合均匀，过筛，装入胶囊，制成1000粒，即得(每粒0.35克的蛭丹络活胶囊)。然而，该申请的方法中仅仅是采用了水提的方法，缺少对有效物质的纯化以及产品的检验方法，导致有效物质没有被充分提取，且产品质量以及稳定性不高。
为此，本发明提出了一种新的通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的制备方法及其质量检测方法，一方面提供了产品的检验方法，另一方面增加了超微粉碎工艺，水蛭提取物分离纯化工艺，提高了产品质量和稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的制备方法及其质量检测方法，已解决现有方法提取效率不高、产品质量以及稳定性不高等问题。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的制备方法，所述的中药组合物是由500～2000重量份的水蛭以及50～500重量份的丹参通过以下步骤制备得到：
1)称量、干燥、粉碎：按所述重量份称取丹参饮片，75-85℃干燥4-6h，粉碎成粗粉；
2)超微粉碎、过筛、混合：将丹参粗粉，超微粉碎30-45min，过筛，将过筛后的丹参粉置混合机混合15-30min，包装，备用；
3)称量、切制：按所述重量份称取水蛭，切成5-10mm段；
4)提取：将水蛭投入提取罐内，加水85-95℃提取三次，第一次加13-15倍重量的水，第二、三次分别加11-13倍重量的水，各提取1.5-2.5小时，合并提取液，滤过，得到滤液和滤渣；
5)滤渣酶解：取步骤4)得到的滤渣，加入1-5倍重量的水，匀浆，调整pH 至7～9，按每1g滤渣加入2000～20000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度 30℃～60℃，酶解2～12小时，冷却至室温；向上述酶解液中加入1～5倍体积的乙醇冷藏沉淀1～2次，过滤，取滤液减压回收，滤渣加水溶解，过滤，得到滤液；
6)分离纯化：将步骤4)得到的滤液与步骤5)得到的滤液合并，通过分子截留量为10000Da的超滤膜，收集超滤液，将超滤液的pH调整至7.5～9.5，通过阴离子交换树脂，先用pH7～9、0.01～0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以0.1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐；
7)浓缩：控制浓缩温度60-70℃，将脱盐后的洗脱液浓缩至50℃下相对密度为1.18-1.22的浸膏；
8)喷雾干燥：将浓缩后的浸膏进行喷雾干燥，进口温度95-105℃，出口温度80-90℃，得浸膏粉，备用；
9)称量、混合：将所得到的浸膏粉与丹参超微粉混匀，过100目筛，然后将混合后细粉装入洁净容器内；
10)充填、抛光：将混匀后的细粉装入胶囊，抛光，即得。
其中，优选的，所述的中药组合物是由850～1200重量份的水蛭以及140～ 320重量份的丹参制备得到。
其中，优选的，所述的制备方法还包括对制备得到的中药组合物中的丹参酮ⅡA以及丹酚酸B的含量进行测定的步骤，包括：
(1)对丹参酮ⅡA含量进行测定
对照品溶液的制备：精密称取丹参酮ⅡA对照品10mg，置50mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1mL中含丹参酮ⅡA16ug的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取供试品装量差异项下的内容物0.65g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取1小时，放冷后，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5uL，注入液相色谱仪，测定；其中，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为15:5的甲醇-水为流动相；检测波长为270nm，理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算，应不低于 2000；
每粒供试品中含丹参以丹参酮ⅡA(C19H18O3)计，不得少于0.39mg；
(2)对丹酚酸B含量进行测定
对照品溶液的制备：精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％w/v甲醇制成每 1mL含0.14mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取供试品装量差异项下的内容物0.35g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％w/v甲醇50mL，称定重量，超声提取1小时，放冷后，再称定重量，用75％w/v甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定；其中，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为30:10:1:59 甲醇-乙腈-甲酸-水为流动相；检测波长为286nm；理论塔板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；
每粒供试品中含丹参以丹酚酸B(C36H30O16)计，不得少于4.5mg。
其中，优选的，所述的制备方法还包括对制备得到的中药组合物中的原料——水蛭以及丹参进行鉴定的步骤，包括：
(1)取供试品内容物2.5g，置具塞试管中，加乙醚10mL，振摇，放置1小时，滤过，药渣备用，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60-90℃的体积比为8:2的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱对应的位置上，应展开相同颜色的斑点，在于对照品色谱相应的位置上，应显相同的暗红色斑点；
(3)取鉴别(1)中的药渣，加甲醇10mL，回流提取10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；领取水蛭对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4:1:1:2的正丁醇-乙醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％w/w茚三酮溶液，105℃烘至斑点颜色清晰、置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
其中，优选的，对水蛭药材的鉴别还可以采用以下步骤进行：
(1)水蛭有效成分的提取：称取干燥的水蛭粗粉5g，在室温下，用0.9％为 w/w生理盐水50mL浸泡24min，匀浆，冷冻24h后缓冻，再冷冻24h后缓冻，如此共3次后，离心10min，收集上清液，得到水蛭提取液；
(2)水蛭液的紫外鉴别：用移液管移取水蛭提取液2mL，于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，同时做空白试验，用紫外分光光度计进行扫描，在波长 251-252nm处有最大吸收峰；
(3)薄层色谱鉴别氨基酸：
(a)薄层板制备：取1份硅胶和3份0.1％w/v羧甲基纤维素钠溶液研磨混合，倒在玻板上涂布，晾干，于110℃烘干，备用；
(b)供试品溶液和对照药材溶液制备：取水蛭提取液2mL，置水浴蒸干，加50％w/v乙醇1mL使溶解，即得供试品溶液；取水蛭药材0.1g加50％w/v乙醇 1mL，研磨10min，超声处理20min，离心10min，收集上清液，得到对照药材溶液；
(c)点样：吸取供试品溶液和对照药材溶液各5uL，分别点三次，以体积比为3.5:2.0:4.5正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％w/w茚三酮溶液，105℃烘至斑点颜色清晰、置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
进一步的，本发明还提出了按照以上任一项所述的制备方法制备得到的通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物。以及
所述的中药组合物在制备通过经络康复法治疗脑血管病的药物中的用途。
其中，优选的，采用本发明所述的中药组合物为主，辅助加以其他产品，如维生素E、硒维生素C维生素E、消栓口服液及B族维生素、辅酶Q10、鱼油、降脂袋泡茶等，再结合“高压氧舱”的物理疗法，用于治疗脑血管病恢复期及后遗症期的肢体麻木、半身不遂、口眼歪斜、语言不清、呛水呛食；并且，所述的药物能够用于改善患者神经功能、行动能力，同时还具有预防脑血管病复发的作用。
缺血性脑卒中属中医学中风范畴，是指由于各种原因引起脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起脑组织坏死、软化，而出现半身不遂、言语謇涩或不语、口舌喁斜及偏身麻木等临床表现，一般意识清楚，或仅有轻度或短暂性意识障碍，亦称缺血性卒中，相当于现代医学缺血性脑血管病范畴，包括脑梗死、脑血栓形成和短暂性脑缺血发作等，有高发病率、高死亡率及高致残率等特征。缺血性脑卒中多是在内伤积损的基础上，复因劳逸失度、情志不遂、饮酒饱食或外邪侵袭等触发，引起脏腑阴阳失调，气血逆乱。病理因素主要为风、火、痰、气及瘀。刘新举等认为气虚血瘀是缺血性中风的重要病理机制。丹参，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神的功效。水蛭，具有破血通经，逐瘀消癥。用于血瘀经闭，癥瘕痞块，中风偏瘫，跌扑损伤等症。因此，二者合用，对于脑血管病(中风)恢复期及后遗症期治疗有很好的疗效。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1.本发明的一种通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物配方原料由水蛭、丹参两味药材组成，原料少，工艺操作简单、成本低廉、疗效确切。
2.本发明一种通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物主要经粉碎、提取、浓缩、喷雾干燥，混匀等工艺制得。工艺操作简单、生产周期短，成本较低，适合工业化大生产。
3.本发明建立了通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物的完整高效的液相含量测定方法，可有效，快速，准确地测定出丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量，保证了产品的质量和有效性。
4.本发明增加了对通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物的鉴别方法，该方法排除了干扰物质，最大限度地保留了待测物质。可快速、有效进行产品的鉴别，方法简单，专属性强。
5.由于药材粉碎时间过短，粉末粒径过大，影响药材的利用率。本发明采用超微粉碎技术可以避免上述缺陷，提高药物的有效成分的生物利用率。
6.本发明增加了对通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物的有效成分含量测定方法，供试品溶液的制备项下，采用了超声处理，丹参酮ⅡA和丹酚酸 B的得率，确保了产品的检验准确性。
7.本发明建立了水蛭药材的紫外鉴别和薄层色谱鉴别方法，两种方法均可以鉴别水蛭中的氨基酸、多肽有效成分，方法简单，为控制水蛭药材质量提供了试验依据。
8.本发明在原有提取工艺的基础上增加了滤渣酶解、分离纯化等步骤，弥补了原有提取工艺的不足，减少了生物活性物质的损失，提高了产品的功效。采用超滤、离子交换层析等生物制药技术对样品进行纯化，从而得到纯度高、生物活性强的水蛭提取物，提高了药材的利用率。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1提取工艺的建立
1、超微粉碎工艺的确定
取80℃干燥4h后的丹参饮片进行粗粉和超微粉碎，并在超微粉碎5min、 15min、30min、45min时取样，分别测定粗粉和超微粉样品的粒径、水溶性浸出物含量、丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量，实验结果如下表1所示。
表1超微粉碎工艺实验结果
Figure BDA0003097637270000081
从实验结果可知，随着粉碎时间的延长，粉末的粒径逐渐减小，且减小的幅度越来越小；经过超微粉碎后的水溶性浸出物的含量增加，其中超微粉碎30min 的含量最大，不同粒径的丹参粉醇溶性浸出物含量无显著差异；不同粒径的丹参粉末丹参酮ⅡA含量无显著差异。超微粉碎后的丹参中丹酚酸B含量增加。由此说明超微粉碎的程度影响着药材浸出物和有效成分的提取物。药材粉碎时间过短，粉末粒径过大，影响药材的利用率。粉碎时间过长，会造成能源浪费。因此综合考虑，选择超微粉碎30-45min。
2、酶解与分离纯化工艺的确定
水蛭作为传统中药，临床应用很广泛，采用传统的提取方法，可能使有些成分分解、破坏，或提取不出来，因此本发明在原有提取工艺的基础上增加了酶解、分离纯化等步骤，弥补了原有提取工艺的不足，减少了生物活性物质的损失，提高了产品的功效。设计工艺如下：
工艺1：将水蛭加水提取(85-95℃)三次，合并提取液，滤过。滤液浓缩至相对密度为1.18-1.22(50℃)的浸膏。
工艺2：将水蛭加水提取(85-95℃)三次，合并提取液，滤过。滤液通过超滤膜，收集超滤液。将上述超滤液通过阴离子交换树脂洗脱后，滤液浓缩至相对密度为1.18-1.22(50℃)的浸膏。
工艺3：将水蛭投入提取罐内，加水提取(85-95℃)三次，合并提取液，滤过。滤渣加胰蛋白酶酶解，酶解液醇沉，滤液减压回收，滤渣加水溶解，过滤。取上述两部分滤液通过超滤膜，收集超滤液。将上述超滤液通过阴离子交换树脂洗脱后，滤液浓缩至相对密度为1.18-1.22(50℃)的浸膏。
分别测定三种不同工艺条件下水蛭提取物的抗凝活性、提取物得率。结果如下表2所示：
表2工艺变更前后实验结果
Figure BDA0003097637270000091
从实验结果可知，与工艺1、2相比，工艺3的水蛭提取物抗凝活性和提取物得率都有增加，由此说明酶解工艺使水蛭提取物中的大部分生物活性物质得以保留，减少了原有工艺中活性成分的损失，提高了产品的治愈效果。而分离纯化工艺提高了产品的抗凝活性和生物利用率。
3、纯化工艺超滤膜的确定
将水蛭投入提取罐内，加水提取(85-95℃)三次，合并提取液，滤过。滤渣加胰蛋白酶酶解，酶解液醇沉，滤液减压回收，滤渣加水溶解，过滤。
取上述两部分滤液分别通过分子截留量为5000Da、10000Da、30000Da的超滤膜，收集超滤液。将上述超滤液通过阴离子交换树脂洗脱后，分别测定不同实验条件下水蛭提取液的抗凝活性、提取物得率，选择合适的超滤膜，结果如下表 3所示。
表3超滤膜选择实验结果
Figure BDA0003097637270000101
从实验结果可知，选用相对分子质量5000Da的膜总抗凝活性最小，固形物得率也最小，10000Da和30000Da总抗凝活性接近，且10000Da的固形物得率小，因此综合考虑，选择10000Da的膜进行精制。通过实验数据对比，精制后的水蛭提取液抗凝活性明显增加，生物利用率得到大幅度提高。
实施例2一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的制备
所述的中药组合物是由1250g的水蛭以及250g的丹参通过以下步骤制备得到：
1.称量、干燥、粉碎：按所述重量称取丹参饮片，80℃干燥4h，粉碎成粗粉。
2.超微粉碎、过筛、混合：将丹参粗粉，超微粉碎30min，过筛，将过筛后的丹参粉置混合机混合20min。包装，备用。
3.称量、切制：按所述重量称取水蛭，切5-10mm段。
4.提取：将水蛭投入提取罐内，加水提取(90℃)三次，第一次加14倍重量水，第二、三次分别加12倍重量的水，各提取2小时，合并提取液，滤过，得到滤液和滤渣。
5.滤渣酶解：取上述滤渣，加入5倍重量的水，匀浆，调整pH至8，按每 1g滤渣加入10000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度40℃，酶解8小时，冷却至室温；向上述酶解液中加入4倍体积的乙醇冷藏沉淀2次，过滤，取滤液减压回收，滤渣加水溶解，过滤，得到滤液。
6.分离纯化：将上述两部分滤液合并，通过分子截留量为10000Da的超滤膜，收集超滤液。将上述超滤液的pH调整至8，通过阴离子交换树脂，先用pH8、 0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以1mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐。
7.浓缩：控制浓缩温度为60-70℃，将脱盐后的洗脱液浓缩至相对密度为 1.18-1.22(50℃)的浸膏。
8.喷雾干燥：将浓缩后的浸膏进行喷雾干燥，进口温度100℃，出口温度85℃，得浸膏粉，备用；
9.称量、混合：将得到的浸膏粉与丹参超微粉混匀，过100目筛，然后将混合后细粉装入洁净容器内。
10.充填、抛光：装入胶囊，制成1000粒，抛光，即得。
实施例3一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的制备
所述的中药组合物是由1500g的水蛭以及300g的丹参通过以下步骤制备得到：
1.称量、干燥、粉碎：按所述重量称取丹参饮片，75℃干燥6h，粉碎成粗粉。
2.超微粉碎、过筛、混合：将丹参粗粉，超微粉碎35min，过筛，将过筛后的丹参粉置混合机混合15min。包装，备用。
3.称量、切制：按所述重量称取水蛭，切5-10mm段。
4.提取：将水蛭投入提取罐内，加水提取(85℃)三次，第一次加15倍重量的水，第二、三次分别加13倍重量的水，各提取2小时，合并提取液，滤过，得到滤液和滤渣。
5.滤渣酶解：取上述滤渣，加入2倍重量的水，匀浆，调整pH至7，按每 1g滤渣加入5000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度60℃，酶解2小时，冷却至室温；向上述酶解液中加入3倍体积的乙醇冷藏沉淀2次，过滤，取滤液减压回收，滤渣加水溶解，过滤。
6.分离纯化：将上述两部分滤液合并，通过分子截留量为10000Da的超滤膜，收集超滤液。将上述超滤液的pH调整至8.5，通过阴离子交换树脂，先用pH8、 0.02mol/L的Tris-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以0.1mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐。
7.浓缩：控制浓缩温度60-70℃。脱盐后的洗脱液浓缩至相对密度为1.18-1.22(50℃)的浸膏。
8.喷雾干燥：将浓缩后的浸膏进行喷雾干燥，进口温度95℃，出口温度90℃，得浸膏粉，
9.称量、混合：将上述浸膏粉与丹参超微粉混匀，过100目筛，然后将混合后细粉装入洁净容器内。
10.充填、抛光：装入胶囊，制成1000粒，抛光，即得。
实施例4一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的制备
所述的中药组合物是由1200g的水蛭以及280g的丹参通过以下步骤制备得到：
1.称量、干燥、粉碎：按所述重量称取丹参饮片，80℃干燥5h，粉碎成粗粉。
2.超微粉碎、过筛、混合：将丹参粗粉，超微粉碎30min，过筛，将过筛后的丹参粉置混合机混合20min。包装，备用
3.称量、切制：按所述重量称取水蛭，切5-10mm段。
4.提取：将水蛭投入提取罐内，加水提取(90℃)三次，第一次加14倍重量的水，第二、三次分别加12倍重量的水，各提取2小时，合并提取液，滤过，得到滤液和滤渣。
5.滤渣酶解：取上述滤渣，加入4倍量水，匀浆，调整pH至8，按每1g滤渣加入5000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度40℃，酶解4小时，冷却至室温；向上述酶解液中加入3倍体积的乙醇冷藏沉淀1次，过滤，取滤液减压回收，滤渣加水溶解，过滤，得到滤液。
6.分离纯化：将上述两部分滤液合并，通过分子截留量为10000Da的超滤膜，收集超滤液。将上述超滤液的pH调整至7.5，通过阴离子交换树脂，先用pH7、 0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以0.1mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐。
7.浓缩：控制浓缩温度60-70℃。脱盐后的洗脱液浓缩至相对密度为1.18-1.22(50℃)的浸膏，
8.喷雾干燥：将浓缩后的浸膏进行喷雾干燥，进口温度100℃，出口温度80℃，得浸膏粉，
9.称量、混合：将上述浸膏粉与丹参超微粉混匀，过100目筛，然后将混合后细粉装入洁净容器内。
10.充填、抛光：装入胶囊，制成1000粒，抛光，即得。
实施例5一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的制备
所述的中药组合物是由1600g的水蛭以及320g的丹参通过以下步骤制备得到：
1.称量、干燥、粉碎：按所述重量称取丹参饮片，85℃干燥4h，粉碎成粗粉。
2.超微粉碎、过筛、混合：将丹参粗粉，超微粉碎35min，过筛，将过筛后的丹参粉置混合机混合30min。包装，备用。
3.称量、切制：按所述重量称取水蛭，切5-10mm段。
4.提取：将水蛭投入提取罐内，加水提取(95℃)三次，第一次加13倍重量的水，第二、三次分别加11倍重量的水，各提取1.5小时，合并提取液，滤过，得到滤液和滤渣。
5.滤渣酶解：取上述滤渣，加入3倍重量的水，匀浆，调整pH至7.5，按每 1g滤渣加入10000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度40℃，酶解5小时，冷却至室温；向上述酶解液中加入3倍体积的乙醇冷藏沉淀1次，过滤，取滤液减压回收，滤渣加水溶解，过滤。
6.分离纯化：将上述两部分滤液合并，通过分子截留量为10000Da的超滤膜，收集超滤液。将上述超滤液的pH调整至7.5，通过阴离子交换树脂，先用pH8、 0.03mol/L的Tris-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以0.2mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐。
7.浓缩：控制浓缩温度60-70℃。脱盐后的洗脱液浓缩至相对密度为1.18-1.22(50℃)的浸膏，
8.喷雾干燥：将浓缩后的浸膏进行喷雾干燥，进口温度105℃，出口温度85℃，得浸膏粉，
9.称量、混合：将上述浸膏粉与丹参超微粉混匀，过100目筛，然后将混合后细粉装入洁净容器内。
10.充填、抛光：装入胶囊，制成1000粒，抛光，即得。
实施例6一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的制备
所述的中药组合物是由2000g的水蛭以及500g的丹参通过以下步骤制备得到：
1.称量、干燥、粉碎：按所述重量称取丹参饮片，80℃干燥5h，粉碎成粗粉。
2.超微粉碎、过筛、混合：将丹参粗粉，超微粉碎45min，过筛，将过筛后的丹参粉置混合机混合30min。包装，备用
3.称量、切制：按所述重量称取水蛭，切5-10mm段。
4.提取：将水蛭投入提取罐内，加水提取(90℃)三次，第一次加14倍重量的水，第二、三次分别加12倍重量的水，各提取2小时，合并提取液，滤过。
5.滤渣酶解：取上述滤渣，加入2倍重量的水，匀浆，调整pH至7.5，按每 1g滤渣加入5000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度50℃，酶解4小时，冷却至室温；向上述酶解液中加入2倍体积的乙醇冷藏沉淀2次，过滤，取滤液减压回收，滤渣加水溶解，过滤。
6.分离纯化：将上述两部分滤液合并，通过分子截留量为10000Da的超滤膜，收集超滤液。将上述超滤液的pH调整至7.5，通过阴离子交换树脂，先用pH8、 0.02mol/L的Tris-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以0.1mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐。
7.浓缩：控制浓缩温度60-70℃。脱盐后的洗脱液浓缩至相对密度为1.18-1.22(50℃)的浸膏，
8.喷雾干燥：将浓缩后的浸膏进行喷雾干燥，进口温度95-105℃，出口温度 80-90℃，得浸膏粉，
9.称量、混合：将上述配方量浸膏粉与丹参超微粉混匀，过100目筛，然后将混合后细粉装入洁净容器内。
10.充填、抛光：装入胶囊，制成1000粒，抛光，即得。
实施例7一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的含量测定
1、丹参酮ⅡA
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水 (15:5)为流动相；检测波长为270nm，理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算，应不低于2000。
对照品溶液的制备：精密称取丹参酮ⅡA对照品10mg，置50mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1mL中含丹参酮ⅡA16ug)。
供试品溶液的制备：取供试品(实施例1制备)装量差异项下的内容物0.65g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取1小时，放冷后，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液即得。
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5uL，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：每粒含丹参以丹参酮ⅡA(C19H18O3)计，不得少于0.39mg。
b.丹酚酸B
色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈 -甲酸-水(30:10:1:59)为流动相；检测波长为286nm。理论塔板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备：精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成每1mL 含0.14mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取供试品(实施例1制备)装量差异项下的内容物0.35g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50mL，称定重量，超声提取1 小时，放冷后，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：每粒含丹参以丹酚酸B(C36H30O16)计，不得少于4.5mg。
2.超声处理方法
丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量测定方法，供试品溶液的制备中，样品均加入甲醇进行提取。本发明同时对甲醇提取的不同处理方法进行比较，实验结果如下表4和表5所示。
表4丹参酮ⅡA测定超声处理实验结果
Figure BDA0003097637270000161
表5丹酚酸B测定超声处理实验结果
Figure BDA0003097637270000162
结论：通过实验结果比较，采用了超声处理，该方法提高了丹参酮ⅡA和丹酚酸B的得率，确保了产品的检验准确性。
实施例8一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物的鉴别
1、取供试品(实施例1制备)内容物2.5g，置具塞试管中，加乙醚10mL，振摇，放置1小时，滤过(药渣备用)，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(8:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱对应的位置上，展开相同颜色的斑点，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点。
2、取鉴别1中的药渣，加甲醇10mL，回流提取10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取水蛭对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙醇-冰醋酸-水(4:1:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％茚三酮溶液，105℃烘至斑点颜色清晰、置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例9水蛭药材的鉴别
水蛭有效成分的提取：称取干燥的水蛭粗粉5g，在室温下，用0.9％生理盐水50mL浸泡24min，匀浆，冷冻24h后缓冻，再冷冻24h后缓冻，如此共3次后，离心10min，收集上清液。
水蛭液的紫外鉴别：用移液管移取水蛭提取液2mL，于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，同时做空白试验，用紫外分光光度计进行扫描，在波长 251-252nm处有最大吸收峰。
薄层色谱鉴别氨基酸：
(1)薄层板制备：取1份硅胶和3份羧甲基纤维素钠溶液(0.1％)研磨混合，倒在玻板上涂布，晾干，于110℃烘干，备用。
(2)样品溶液和对照药材溶液制备：取水蛭提取液2mL，置水浴蒸干，加 50％乙醇1mL使溶解，即得。对照药材溶液制备：取水蛭药材0.1g加50％乙醇 1mL，研磨10min，超声处理20min，离心(3000r/min)10min。
(3)点样：吸取上述两种溶液各5uL，分别点三次，以正丁醇-冰醋酸-水 (3.5:2.0:4.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％茚三酮溶液，105℃烘至斑点颜色清晰、置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例10一种以经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物
临床研究
一、一般资料
选取2018年至2019年，60例脑血栓形成患者，随机分为对照组与实验组各 30例。对照组男17例，女13例，年龄41～70岁；实验组男16例，女14例，年龄40～69岁。全部入选患者病历均符合脑血栓形成病的诊断标准。经脑CT扫描确诊，排除脑出血。两组年龄、性别、脑血管病危险因素、临床表现均不明显差异，具有可比性。
二、实验方法
实验组服用本发明产品(实施例1制备)，每次3粒，一日3次，口服。两组15天为一疗程，观察2个疗程。
对照组病例给予消栓通络片，每次6片、一日3次，口服。治疗天数、疗程数与治疗组相同，对两组高血压、糖尿病、心脏病患者给予相应治疗。
三、临床疗效评定标准
根据临床症状、体征将其分为：
痊愈：经治疗后临床症状消失，偏瘫肢体基本恢复
显效：临床症状大部分消失，偏瘫肢体部分恢复
好转：临床症状有所减轻，偏瘫肢体略有恢复
无效：治疗前后无变化或病情加重，痊愈加显效合计为总有效率。
四、观察结果
结果如表6所示。
表6两组患者治疗总有效率比较
组别 例数 治愈 显效 有效 无效 总有效率
实验组 30 12 11 5 2 93.33％
对照组 30 8 7 9 6 80％
可见，实验组临床总有效率明显高于对照组，二者差异具有显著性。
实施例11一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物临床研究
一、一般资料
选取2018年至2019年，接治患者60例，男32例，女28例，平均年龄46 岁；全部病历均按中风偏瘫、中风先兆即脑血管疾病临床表现为诊断标准确定。
二、实验方法
实验组服用本发明产品(实施例1制备)，每次3粒，一日3次，口服。两组15天为一疗程，观察2个疗程。
三、临床疗效评定标准
根据临床症状、体征将其分为：
痊愈：语言清晰、行动自如、生活自主，能做一般劳动。
显效：语言基本清晰、行动基本自如、能基本独立生活。
好转：语言基本清晰、但行动稍有不便。
无效：脑晕欲仆、偏身麻木、半身不遂、语言障碍。
四、观察结果
结果如表7所示。
表7治疗总有效率
例数 治愈 显效 有效 无效 总有效率
60 27 19 11 3 95％
通过临床疗效观察表明，本发明的一种通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物对语言表达，行动能力的恢复均有较好疗效。

Claims (8)

1.一种通过经络康复法治疗脑血管病的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述的中药组合物是由500～2000重量份的水蛭以及50～500重量份的丹参通过以下步骤制备得到：
1)称量、干燥、粉碎：按所述重量份称取丹参饮片，75-85℃干燥4-6h，粉碎成粗粉；
2)超微粉碎、过筛、混合：将丹参粗粉，超微粉碎30-45min，过筛，将过筛后的丹参粉置混合机混合15-30min，包装，备用；
3)称量、切制：按所述重量份称取水蛭，切成5-10mm段；
4)提取：将水蛭投入提取罐内，加水85-95℃提取三次，第一次加13-15倍重量的水，第二、三次分别加11-13倍重量的水，各提取1.5-2.5小时，合并提取液，滤过，得到滤液和滤渣；
5)滤渣酶解：取步骤4)得到的滤渣，加入1-5倍重量的水，匀浆，调整pH至7～9，按每1g滤渣加入2000～20000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度30℃～60℃，酶解2～12小时，冷却至室温；向上述酶解液中加入1～5倍体积的乙醇冷藏沉淀1～2次，过滤，取滤液减压回收，滤渣加水溶解，过滤，得到滤液；
6)分离纯化：将步骤4)得到的滤液与步骤5)得到的滤液合并，通过分子截留量为10000Da的超滤膜，收集超滤液，将超滤液的pH调整至7.5～9.5，通过阴离子交换树脂，先用pH7～9、0.01～0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以0.1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐；
7)浓缩：控制浓缩温度60-70℃，将脱盐后的洗脱液浓缩至50℃下相对密度为1.18-1.22的浸膏；
8)喷雾干燥：将浓缩后的浸膏进行喷雾干燥，进口温度95-105℃，出口温度80-90℃，得浸膏粉，备用；
9)称量、混合：将所得到的浸膏粉与丹参超微粉混匀，过100目筛，然后将混合后细粉装入洁净容器内；
10)充填、抛光：将混匀后的细粉装入胶囊，抛光，即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的中药组合物是由850～1200重量份的水蛭以及140～320重量份的丹参制备得到。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括对制备得到的中药组合物中的丹参酮ⅡA以及丹酚酸B的含量进行测定的步骤，包括：
(1)对丹参酮ⅡA含量进行测定
对照品溶液的制备：精密称取丹参酮ⅡA对照品10mg，置50mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1mL中含丹参酮ⅡA16ug的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取供试品装量差异项下的内容物0.65g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取1小时，放冷后，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5uL，注入液相色谱仪，测定；其中，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为15:5的甲醇-水为流动相；检测波长为270nm，理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算，应不低于2000；
每粒供试品中含丹参以丹参酮ⅡA(C19H18O3)计，不得少于0.39mg；
(2)对丹酚酸B含量进行测定
对照品溶液的制备：精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％w/v甲醇制成每1mL含0.14mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取供试品装量差异项下的内容物0.35g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％w/v甲醇50mL，称定重量，超声提取1小时，放冷后，再称定重量，用75％w/v甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定；其中，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为30:10:1:59甲醇-乙腈-甲酸-水为流动相；检测波长为286nm；理论塔板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；
每粒供试品中含丹参以丹酚酸B(C36H30O16)计，不得少于4.5mg。
4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括对制备得到的中药组合物中的原料——水蛭以及丹参进行鉴定的步骤，包括：
(1)取供试品内容物2.5g，置具塞试管中，加乙醚10mL，振摇，放置1小时，滤过，药渣备用，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液；
按照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60-90℃的体积比为8:2的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱对应的位置上，应展开相同颜色的斑点，在于对照品色谱相应的位置上，应显相同的暗红色斑点；
(2)取鉴别(1)中的药渣，加甲醇10mL，回流提取10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；领取水蛭对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4:1:1:2的正丁醇-乙醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％w/w茚三酮溶液，105℃烘至斑点颜色清晰、置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，其中水蛭药材的鉴别采用以下步骤进行：
(1)水蛭有效成分的提取：称取干燥的水蛭粗粉5g，在室温下，用0.9％为w/w生理盐水50mL浸泡24min，匀浆，冷冻24h后缓冻，再冷冻24h后缓冻，如此共3次后，离心10min，收集上清液，得到水蛭提取液；
(2)水蛭液的紫外鉴别：用移液管移取水蛭提取液2mL，于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，同时做空白试验，用紫外分光光度计进行扫描，在波长251-252nm处有最大吸收峰；
(3)薄层色谱鉴别氨基酸：
(a)薄层板制备：取1份硅胶和3份0.1％w/v羧甲基纤维素钠溶液研磨混合，倒在玻板上涂布，晾干，于110℃烘干，备用；
(b)供试品溶液和对照药材溶液制备：取水蛭提取液2mL，置水浴蒸干，加50％w/v乙醇1mL使溶解，即得供试品溶液；取水蛭药材0.1g加50％w/v乙醇1mL，研磨10min，超声处理20min，离心10min，收集上清液，得到对照药材溶液；
(c)点样：吸取供试品溶液和对照药材溶液各5uL，分别点三次，以体积比为3.5:2.0:4.5正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％w/w茚三酮溶液，105℃烘至斑点颜色清晰、置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
6.按照权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的中药组合物。
7.权利要求6所述的中药组合物在制备通过经络康复法(简称：康络法)治疗脑血管病的药物中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，采用权利要求6所述的中药组合物为主，辅助加以其他产品，如维生素E、硒维生素C维生素E、消栓口服液及B族维生素、辅酶Q10、鱼油、降脂袋泡茶等，再结合“高压氧舱”的物理疗法，用于治疗脑血管病恢复期及后遗症期的肢体麻木、半身不遂、口眼歪斜、语言不清、呛水呛食；并且，所述的药物能够用于改善患者神经功能、行动能力，同时还具有预防脑血管病复发的作用。
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