CN113403395A - 房水cfDNA的提取方法、试剂盒以及在PVRL临床辅助检查中的应用 - Google Patents

房水cfDNA的提取方法、试剂盒以及在PVRL临床辅助检查中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用房水cfDNA进行基因检测来辅助临床诊断，属于基因检测技术领域。本发明发现利用房水中的cfDNA进行检测，并比对于参考基因组上，获得的突变信息能够有效地对原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)进行诊断，检测结果显著优于从血浆中对cfDNA的检测准确性，能够实现早期诊断。

Description

房水cfDNA的提取方法、试剂盒以及在PVRL临床辅助检查中的 应用
技术领域
本发明涉及使用房水cfDNA进行基因检测来辅助临床诊断，属于基因检测技术领域。
背景技术
近年来，全球癌症发病率和死亡率不断上升，癌症已经成为全球范围内主要的公共健康问题。2020年，全球预计有近1930万新增癌症病例(男性1007万，女性923万)，以及约1000万因癌症而死亡的病例。乳腺癌已取代肺癌成为最常见的癌症，占全球每年新发病例的近12％。而癌症作为复杂和多样性的疾病，在分子遗传上具有很大的异质性，因此，对于癌症病人的个体化、精准化的诊疗至关重要。基因检测在癌症早期筛查，辅助癌症诊断/鉴别诊断，指导靶向治疗、免疫治疗，疗效评估、MRD监测等方面具有重要的意义。二代测序技术(NGS)能够实现高通量，同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序。在肿瘤临床应用中，NGS已经成为精准诊疗的重要环节。
游离DNA(cellfreeDNA，cfDNA)是机体细胞凋亡、坏死后释放或分泌到体液中的片段化DNA。癌症患者的cfDNA总体水平高于健康人。在癌症患者中，从肿瘤细胞释放的cfDNA通常被称为循环肿瘤DNA(cfDNA)，能够反映肿瘤细胞的基因组特征，包括基因突变、基因重排、拷贝数变异等。利用cfDNA进行液体活检，相比于组织活检，具有克服肿瘤组织的异质性、样本可及性高、样本类型多、微创等优点，故液体活检正迅速成为标准肿瘤活检的重要辅助手段。近年来，cfDNA液态活检在肿瘤的预后和生物标志物预测方面已经显示了巨大的前景。血液、尿液、脑脊液(CSF)、胸水和腹水等都可以用来作为液体活检样本。
原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)是指原发于眼内累及玻璃体、视网膜、或视神经等的原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)。大约95％的PVRL都属于弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。PVRL临床表现多样，常表现为反复发作的葡萄膜炎，早期难以识别，诊断困难，从出现眼部症状至确诊通常需要1年的时间。因PVRL和葡萄膜炎的两者临床症状类似，仅通过眼部症状无法区分，需借助眼内液的细胞病理学检查。临床上眼内液的细胞病理学主要是指玻璃体的病理学检测，是确诊的金标准。由于PVRL难以诊断和玻璃体液可能存在取样困难，因此迫切需要寻找适合PVRL患者的新的液体活检样本。
房水(Aqueoushumour)，又称水状液、神水，是充满眼球前房和后房，夹在角膜和晶状体之间的透明液体，由睫状体的无色素上皮细胞分泌，其总体积大约0.25mL，平均分泌的速度约每分钟2.5μL(0.0025mL)。房水的成分与血浆类似，但其中抗坏血酸、丙酮酸、乳酸等的浓度更高，而蛋白、糖和一些代谢废物的浓度更低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)的诊断过程中，存在着临床症状类似，诊断难度大；通过玻璃体取样存在着取样困难的问题。本发明提供了一种使用房水cfDNA进行基因检测来辅助临床诊断的方法。
本发明的第一个目的是提供了：
一种房水cfDNA的提取方法，包括如下步骤：
步骤1，对房水样本进行离心预处理，得到上清液；
步骤2，步骤1中的上清液经过第一次裂解、消化、第二次裂解处理；
步骤3，将步骤2中得到的裂解液进行DNA的析出处理；
步骤4，对步骤3中得到的DNA析出液采用柱吸附、洗脱处理后，得到cfDNA。
在一个实施方式中，步骤2中，第一次裂解和/或第二次裂解的步骤中，裂解液与样品溶液的体积比是1-3：1。
在一个实施方式中，步骤2中，消化处理中加入Carrier RNA和蛋白酶K。
在一个实施方式中，Carrier RNA的加入量是10-50μl/mL。
在一个实施方式中，蛋白酶K的加入量是200μl/mL。
在一个实施方式中，步骤3中，加入DNA析出液的量是样本体积的0.5-2倍。
在一个实施方式中，步骤4中，洗脱处理是指依次采用盐洗涤溶液、醇洗涤溶液和无水乙醇洗涤。
本发明的第二个目的是提供了：
一种房水cfDNA提取试剂盒，包括：裂解液、消化试剂、DNA析出液、洗脱液。
在一个实施方式中，所述的裂解液包括第一裂解液和第二裂解液。
在一个实施方式中，所述的消化试剂包括Carrier RNA和蛋白酶K。
在一个实施方式中，第一裂解液、第二裂解液、Carrier RNA和蛋白酶K的体积比是1：0.5-1.5：0.01-0.03：0.1-0.3。
本发明的第三个目的是提供了：
用于对房水cfDNA中突变检测的试剂在用于制备原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)诊断试剂中的应用；所述的突变检测的试剂中还包括上述的房水cfDNA提取试剂盒。
在一个实施方式中，所述的突变检测试剂是用于检测cfDNA中的单核苷酸变异(SNV)和插入缺失变异(Indel)。
有益效果
本发明发现利用房水中的cfDNA进行检测，并比对于参考基因组上，获得的突变信息能够有效地对原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)进行诊断，检测结果显著优于从血浆中对cfDNA的检测准确性，能够实现早期诊断。
附图说明
图1是P1患者CD79B突变位点测序结果图
图2是P3患者BTG2突变位点测序结果图
具体实施方式
本发明中的突变，是指指单核苷酸变异(SNV)和插入缺失变异(Indel)，具体而言：
单核苷酸变异(SNV)：单个碱基置换引起，导致编码氨基酸发生变化，如EGFR基因L858R。
插入缺失突变(Indel)：多个碱基插入或缺失导致编码氨基酸的增加/减少，这些类型的突变可能是“框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少，如EGFR基因第19号外显子缺失；或可导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短。
本发明中突变的检测过程中，通过对测序下机数据比对于参考基因组/参考序列上，获得存在突变的位点，这里的参考基因组/参考序列指任何生物体或病毒的任何具体的已知基因组序列(无论是部分的或完整的)，它可以用于对来自受试者的识别的序列进行参比。例如，用于人类受试者以及许多其他生物体的参考基因组可见于美国国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)，对于人的样品来说，参照序列可以是人基因组hg18或hg19的序列。目前hg19的相关数据库相对较多且hg19测出来的碱基量比hg18要多，即样品比对率会相对较高，所以优先选择hg19。
本发明采用了以下的由475个基因构成的基因组合来对样本的进行检测：
Figure BDA0003099747720000041
Figure BDA0003099747720000051
对比例对PVRL患者血浆cfDNA检测
由于临床上PVRL患者可能会缺乏玻璃体液样本，为了寻找新的适合PVRL患者的液体活检样本，随机选取了8例PVRL患者，来检测血浆cfDNA是否可以反应患者的基因突变状态，以口腔拭子作为阴性对照，同时检测玻璃体液样本作为参考。采用核酸提取试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)提取玻璃体液样本和血浆样本的cfDNA。
操作步骤如下：
取房水上清样本，经过离心处理后，与Buffer ACL Mix(QIAGEN)裂解液按照体积比1：2混合；再按照20μl/mL和200μl/mL的量加入Carrier RNA和蛋白酶K，消化处理；再与Buffer ACL Mix(QIAGEN)裂解液按照体积比1：2混合，于42℃下孵育12min；再按照2倍体积量加入Buffer ACB(QIAGEN)DNA析出液，混匀后，通过硅胶膜吸附柱进行DNA吸附；依次采用Buffer ACW1(QIAGEN)盐洗涤溶液、Buffer ACW1(QIAGEN)醇洗涤溶液、无水乙醇对吸附柱进行洗脱；吸附柱于3500rpm离心2min处理，向吸附柱中加入5-10μl无酶水，2000rpm离心45s，洗脱液再置于吸附管中，再加入无酶水，继续于3000rpm下离心3min，获得洗脱后的cfDNA。
对获得的cfDNA进行文库构建、富集、定量，随后使用Illumina HiSeq下一代测序系统，其原理是边合成边测序，最后生物信息学分析。
结果表明8例患者中只有2例患者的血浆样本中检测到突变，但都只检测到1个突变，相对应的玻璃体液样本中分别检测出13和16个突变(表1)。将8例患者玻璃体液样本检出突变总数和血浆样本检出突变总数进行配对t检验差异分析，两组之间具有显著性差异(p＝0.0002)。根据结果可以说明，对于PVRL患者，血浆样本不适宜用于液体活检来进行NGS检测。
表1 PVRL患者血浆cfDNA基因检测结果(+：阳性，-：阴性)
Figure BDA0003099747720000061
可以看出，血浆cfDNA检测不适合PVRL患者。
实施例PVRL患者房水cfDNA检测
由于房水成分类似血浆，并且充满眼球前房和后房，取样无创。选择房水样本来探究是否适合作为PVRL患者的液体活检样本，选取与上述的对比例中的4例PVRL患者获取房水样本进行检测，验证房水cfDNA是否可以反应患者的基因突变状态。
采用核酸提取试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)提取房水样本的cfDNA后，进行文库构建、富集、定量，随后使用Illumina HiSeq下一代测序系统，其原理是边合成边测序，最后生物信息学分析，发现对比例中4例患者房水样本检测均为阳性(表2)。将4例患者玻璃体液样本中检出突变总数和房水样本中检出突变总数进行配对t检验差异分析，两组没有显著性差异。将4例患者血浆样本中检出突变总数和房水样本中检出突变总数进行配对t检验差异分析，两组之间具有显著性差异(p＝0.0199)。根据结果可以发现，4例PVRL患者，房水样本的检测阳性和阴性结果和玻璃体液样本完全一致，并且对于PVRL的液体活检优于血浆样本，房水cfDNA检测适合PVRL患者。
表2 PVRL患者房水cfDNA基因检测结果(+：阳性，-：阴性)
Figure BDA0003099747720000071
玻璃体液和房水检测突变检出一致性对比
为了进一步探究玻璃体液和房水检测对突变反映的具体程度，我们比较了实施例1中4例患者中玻璃体液样本和房水样本中DLBCL发生频率较高基因的突变检出情况。
通过比对4例患者中5个常见的突变基因：CD79B、MYD88、PIM1、BTG2和BCL2的突变检出情况发现，与玻璃体液样本相比，该5个基因在房水样本中突变一致性高，检出敏感性为95％(38/40)。患者P11中CD79B突变在玻璃体液样本检出房水样本未检出，患者P12中BCL2突变在房水样本中检出玻璃体液样本中未检出。并且从实施例1中可以看到患者P12中玻璃体液样本中突变检出个数为16，而房水样本中突变检出个数为48，这可能是由于玻璃体样本取样问题，而房水样本中其余突变的检出可以作为玻璃体样本的有效补充。
表3高频突变基因具体检出情况(+：阳性，-：阴性)
Figure BDA0003099747720000072
玻璃体液和房水检测突变位点具体测序结果
为了验证突变基因在玻璃体样本和房水样本中检测一致性，我们随机选取了P1患者中CD79B突变位点和P3患者的BTG2突变位点查看测序结果。P1患者中CD79B突变位点位于12号染色体上，且有2个临近的突变位点。左边的位点碱基从T突变为A，右边的位点碱基从C突变为G(图1)。以该患者的口腔拭子作为阴性对照，从测序结果图1中可以看出玻璃体液样本和房水中两个位点测序结果几乎完全一致。P3患者的BTG2突变位点位于1号染色体上，碱基从T突变为G(图2)。以该患者的口腔拭子作为阴性对照，从测序结果图2中可以看出玻璃体液样本和房水中该位点测序结果几乎完全一致。
以上结果共同说明房水样本适合作为PVRL患者的液体活检样本。
房水cfDNA辅助疑似PVRL诊断
由于多数PVRL患者眼底可能会出现急性视网膜坏死、视网膜血管炎，甚至渗出性视网膜脱离，常被误诊为葡萄膜炎，临床上诊断存在困难性和挑战性。我们检测了3例疑似PVRL患者的房水样本，以口腔拭子作为阴性对照，这3例患者同时送检了血浆样本。
采用核酸提取试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)提取玻璃体液样本和血浆样本的cfDNA后，进行文库构建、富集、定量，随后使用Illumina HiSeq下一代测序系统，其原理是边合成边测序，最后生物信息学分析，发现3例患者中房水样本检测均为阳性，有2例患者血浆检测阳性，但是检出突变数均少于房水样本(表4)。将3例患者房水样本检出突变总数和血浆样本检出突变总数进行配对t检验差异分析，两组直接具有显著性差异(p＝0.0469)。房水样本相对于血浆样本，更能完整的反映这3例患者的突变特征。
因为这3例患者房水cfDNA检测均为阳性，结合突变图谱，临床结合细胞因子检查、影像学检查、细胞病理学检测等确认这3例患者都为PVRL。以临床细胞因子检查结果为例，这3例患者IL10水平升高，均大于150pg/ml，且IL-10/IL-6比值大于1(表4)，都进一步支持淋巴瘤的诊断。由此可以说明，房水样本可以辅助临床早期发现可疑PVRL病例，以免延误诊断和治疗，并且房水样本后续可以连续取样，可作为判断治疗效果和监测复发的工具。
表4 3例疑似PVRL患者NGS检测和细胞因子检测(+：阳性，-：阴性)
Figure BDA0003099747720000081
总之，本发明证实血浆样本不适宜作为PVRL患者的液体活检样本，同时发现房水样本适合PVRL患者进行液体活检。房水样本检测结果和玻璃体液样本检测结果，从突变检出个数和突变具体位点之间来看无显著差异。故当PVRL患者没有玻璃体液样本时，可以选择房水样本进行检测。另外由于玻璃体样本取样问题，房水样本中其余突变的检出可以作为玻璃体样本的有效补充。而且由于临床上PVRL患者难以确诊，房水cfDNA可以辅助临床疑似PVRL患者早期诊断；未来在PVRL患者的诊疗过程中，房水样本后续还可以连续取样，对患者进行疗效评估和复发监测，为患者带来更多临床获益。

Claims (10)

1.一种房水cfDNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，对房水样本进行离心预处理，得到上清液；
步骤2，步骤1中的上清液经过第一次裂解、消化、第二次裂解处理；
步骤3，将步骤2中得到的溶液进行DNA的析出处理；
步骤4，对步骤3中得到的DNA析出液采用柱吸附、洗脱处理后，得到cfDNA。
2.根据权利要求3所述的房水cfDNA的提取方法，其特征在于，步骤2中，第一次裂解和/或第二次裂解的步骤中，裂解液与上清液的体积比是1-3：1；
在一个实施方式中，步骤2中，消化处理中加入Carrier RNA和蛋白酶K；
在一个实施方式中，Carrier RNA的加入量是10-50μl/mL；
在一个实施方式中，蛋白酶K的加入量是200μl/mL。
3.根据权利要求3所述的房水cfDNA的提取方法，其特征在于，在一个实施方式中，步骤3中，析出处理中所加入DNA析出液的量是溶液体积的0.5-2倍。
4.根据权利要求3所述的房水cfDNA的提取方法，其特征在于，在一个实施方式中，步骤4中，洗脱处理是指依次采用盐洗涤溶液、醇洗涤溶液和无水乙醇洗涤。
5.一种房水cfDNA提取试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、消化试剂、DNA析出液、洗脱液。
6.根据权利要求7所述的房水cfDNA提取试剂盒，其特征在于，在一个实施方式中，所述的裂解液包括第一裂解液和第二裂解液。
7.根据权利要求7所述的房水cfDNA提取试剂盒，其特征在于，所述的消化试剂包括CarrierRNA和蛋白酶K。
8.根据权利要求9所述的房水cfDNA提取试剂盒，其特征在于，第一裂解液、第二裂解液、Carrier RNA和蛋白酶K的体积比是1：0.5-1.5：0.01-0.03：0.1-0.3。
9.用于对房水cfDNA中突变检测的试剂在用于制备原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)诊断试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的突变检测试剂是用于检测cfDNA中的单核苷酸变异(SNV)和插入缺失变异(Indel)。
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ELISABETTA MISEROCCHI: "MYD88 L265P MUTATION DETECTION IN THE AQUEOUS HUMOR OF PATIENTS WITH VITREORETINAL LYMPHOMA", 《RETINA》 *
HUIMIN SHI等: "Clinical Relevance of the High Prevalence of MYD88 L265P Mutated Vitreoretinal Lymphoma Identified by Droplet Digital Polymerase Chain Reaction", 《OCUL IMMUNOL INFLAMM.》 *
QIAGEN: "QIAamp Circulating Nucleic AcidHandbook", 《HTTPS://WWW.QIAGEN.COM/US/PRODUCTS/DISCOVERY-AND-TRANSLATIONAL-RESEARCH/DNA-RNA-PURIFICATION/DNA-PURIFICATION/CELL-FREE-DNA/QIAAMP-CIRCULATING-NUCLEIC-ACID-KIT/》 *
SEONGHEE CHOI: "Serial Detection of MYD88 L265P Mutation in the Aqueous Humor of a Patient with Vitreoretinal Lymphoma for Disease Monitoring", 《OCUL IMMUNOL INFLAMM》 *
XIAOXIAO WANG等: "A pilot study of the use of dynamic analysis of cell-free DNA from aqueous humor and vitreous fluid for the diagnosis and treatment monitoring of vitreoretinal lymphomas", 《HAEMATOLOGICA》 *

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CN113403395B (zh) 2023-03-24

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