CN110241202A - 视网膜色素变性突变位点及其应用 - Google Patents
视网膜色素变性突变位点及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110241202A CN110241202A CN201910553026.1A CN201910553026A CN110241202A CN 110241202 A CN110241202 A CN 110241202A CN 201910553026 A CN201910553026 A CN 201910553026A CN 110241202 A CN110241202 A CN 110241202A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- retinal pigment
- probe
- application
- gene
- pigment degeneration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 34
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 26
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 14
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000001353 Chip-sequencing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 238000012014 optical coherence tomography Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 101100428002 Homo sapiens USH2A gene Proteins 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 6
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 6
- 102200090524 rs137852498 Human genes 0.000 description 6
- 101000805941 Homo sapiens Usherin Proteins 0.000 description 5
- 238000002571 electroretinography Methods 0.000 description 5
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102100037930 Usherin Human genes 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 210000003733 optic disk Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 3
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 3
- 210000001210 retinal vessel Anatomy 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 101001104102 Homo sapiens X-linked retinitis pigmentosa GTPase regulator Proteins 0.000 description 2
- 201000003533 Leber congenital amaurosis Diseases 0.000 description 2
- 208000035719 Maculopathy Diseases 0.000 description 2
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 102100040092 X-linked retinitis pigmentosa GTPase regulator Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000028250 allosomal inheritance Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 101150024923 da gene Proteins 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000002189 macula lutea Anatomy 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 102100035344 Cadherin-related family member 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026328 Ciliogenesis and planar polarity effector 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029362 Cone-rod homeobox protein Human genes 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 102100029141 Cyclic nucleotide-gated cation channel beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 241001269238 Data Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000594506 Homo sapiens Acyl-coenzyme A diphosphatase NUDT19 Proteins 0.000 description 1
- 101000737767 Homo sapiens Cadherin-related family member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000855375 Homo sapiens Ciliogenesis and planar polarity effector 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000919370 Homo sapiens Cone-rod homeobox protein Proteins 0.000 description 1
- 101000771075 Homo sapiens Cyclic nucleotide-gated cation channel beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000960200 Homo sapiens Intraflagellar transport protein 140 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101001032837 Homo sapiens Metabotropic glutamate receptor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001105692 Homo sapiens Pre-mRNA-processing factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000781361 Homo sapiens Protein XRP2 Proteins 0.000 description 1
- 101000726148 Homo sapiens Protein crumbs homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001028804 Homo sapiens Protein eyes shut homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000801643 Homo sapiens Retinal-specific phospholipid-transporting ATPase ABCA4 Proteins 0.000 description 1
- 101000729271 Homo sapiens Retinoid isomerohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000611338 Homo sapiens Rhodopsin Proteins 0.000 description 1
- 101000609947 Homo sapiens Rod cGMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000659545 Homo sapiens U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase Proteins 0.000 description 1
- 101000667300 Homo sapiens WD repeat-containing protein 19 Proteins 0.000 description 1
- 101001104110 Homo sapiens X-linked retinitis pigmentosa GTPase regulator-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100039927 Intraflagellar transport protein 140 homolog Human genes 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 102100038300 Metabotropic glutamate receptor 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100034268 Neural retina-specific leucine zipper protein Human genes 0.000 description 1
- 101710181914 Neural retina-specific leucine zipper protein Proteins 0.000 description 1
- 208000001140 Night Blindness Diseases 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 102100021232 Pre-mRNA-processing factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100033154 Protein XRP2 Human genes 0.000 description 1
- 102100027331 Protein crumbs homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037166 Protein eyes shut homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100033617 Retinal-specific phospholipid-transporting ATPase ABCA4 Human genes 0.000 description 1
- 102100031176 Retinoid isomerohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100040756 Rhodopsin Human genes 0.000 description 1
- 102100039177 Rod cGMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101000733871 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L4-A Proteins 0.000 description 1
- 101000733875 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L4-B Proteins 0.000 description 1
- 101000942604 Sphingomonas wittichii (strain DC-6 / KACC 16600) Chloroacetanilide N-alkylformylase, oxygenase component Proteins 0.000 description 1
- 102100036230 U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase Human genes 0.000 description 1
- 102100039744 WD repeat-containing protein 19 Human genes 0.000 description 1
- 102100040089 X-linked retinitis pigmentosa GTPase regulator-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000832077 Xenopus laevis Dapper 1-A Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000003986 cell retinal photoreceptor Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013534 fluorescein angiography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 208000003580 polydactyly Diseases 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102200093278 rs201527662 Human genes 0.000 description 1
- 102200055168 rs398123040 Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及视网膜色素变性突变位点及其应用。本发明基于临床资源,借助基因捕获芯片及深度测序技术,通过遗传学、结合临床表现及人群验证,成功证实所检测到的35个突变位点为视网膜色素变性新致病位点,为该疾病的诊断提供了新的分子生物学基础,基于所述的35个突变位点可以开发视网膜色素变性的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断和基因检测领域,具体涉及35个视网膜色素变性突变位点及其应用。
背景技术
视网膜色素变性(retinitis pigmentosa;RP)是一组以视网膜光感受器(视杆细胞和视锥细胞)和色素上皮受损为特征的进行性可致盲遗传性眼底病。全球范围内RP的发病率为1/3000-1/5000,中国人群的发病率可高达1/1000。该病的主要临床特征是:进行性视野缺损、夜盲,视网膜骨细胞状色素沉着和视网膜电图异常等。发病年龄从出生到老年不等。大约20%-30%的RP患者存在包括听力丧失、肥胖、多指畸形和神经系统病变等眼外症状。这些眼外异常很容易被忽视或混淆。此外,RP的临床表现与许多其他遗传性视网膜疾病有部分重叠,包括Leber先天性黑蒙(LCA)、锥杆营养不良(CRD)、黄斑营养不良(MD)和先天性静止性夜盲症(CSNB)等。这为临床医生正确诊断和分类RP提供了巨大的挑战。该病的发病、进展和严重程度在大多数情况下由基因和遗传方式决定,同时还受外界环境的影响。RP的遗传方式主要包括常染色体显性、隐性和伴X性染色体遗传。少数与伴Y性染色体遗传、线粒体遗传、双基因遗传和基因印记等有关。目前发现有100个与RP相关的基因,其中比较明确的有87个。此外,专利文献CN106282197A还公开了一种RP致病突变SPP2p.Gly97Arg,专利文献CN108103066A还公开了一种RP致病突变CRB2p.R1249G。然而这些基因仅能解释60%的RP病例,且几乎不存在热点突变,仍有相当部分RP致病突变不能被解释。
基于临床的高通量二代测序(next-generation sequencing;NGS)技术已被证明是诊断遗传类疾病的有力工具,尤其在遗传类视网膜疾病中具有高度的准确性、敏感性和可重复性。基因检测结果不仅为疾病的临床诊断、预后和发病风险的评估提供支持,还为定制各种治疗方法和确定哪些患者将受益于基于基因的新疗法提供指导依据,对患者及其家庭都会产生非常积极的影响。然而,正如所有的医疗干预一样,基因检测也有一些特定的风险。比如目前在检测过程中经常遇到的一个问题就是多个突变位点致病性判断,即便目前有严格的致病性判断标准,如美国医学遗传学会ACMG标准,受限于多种因素(如:家系信息不全,未报道位点,基因异质性等),在临床工作中仍有大部分位点的致病性无法明确。例如,基因检测的假阳性结果可能影响病人的生育计划、使病人产生焦虑或内疚的情绪、甚至可能扰乱病人与其他家庭成员的关系。基因检测的假阴性结果耽误患者的诊疗,增加患病者的出生率等。因此,扩大对RP突变位点致病性的了解,以最大限度地提高基因检测的效益,减少与之伴随的风险,显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足,提供涉及20个基因的35个RP新致病位点。
第一方面,本发明提供了一种特异性检测受试者基因组DNA中是否存在以下任一种、两种或几种突变的试剂:
作为一个优选例,所述试剂选自:引物、引物对、探针、抗体和核酸芯片中的一种或几种。
第二方面,本发明提供了一种诊断视网膜色素变性的试剂盒,所述试剂盒含有如上所述的试剂。
第三方面,本发明提供了如上所述的试剂或如上所述的试剂盒的用途,所述用途选自:
1)在制备诊断或辅助诊断视网膜色素变性产品中的应用;
2)在制备筛查或辅助筛查视网膜色素变性患者产品中的应用;
3)在制备预测视网膜色素变性患病风险产品中的应用;
4)在制备检测与视网膜色素变性相关的基因是否突变产品中的应用;
5)在制备检测与视网膜色素变性相关的蛋白质是否突变产品中的应用。
第四方面,本发明提供了一种用于检测遗传性眼病的突变位点组合,所述突变位点组合至少包含一种如上所述的突变。
作为一个优选例,所述遗传性眼病选为视网膜色素变性。
第五方面,本发明提供了如上所述的突变位点组合在制备遗传性眼病诊断试剂盒中的应用。
第六方面,本发明提供了一种探针组合物,其包含特异性结合至目标基因的探针,所述探针至少能检测一种如上所述的突变。
作为一个优选例,所述探针组合物以混合物形式提供,或者以独立存在的形式提供。
第七方面,本发明提供了一种基因捕获芯片,所述探针至少能检测一种如上所述的突变。
第八方面,本发明提供了一种基因捕获试剂盒,包括如上任一所述的探针组合物。
第九方面,本发明提供了一种基因捕获方法,包括:
构建样本全基因组DNA文库;
与如上任一所述的探针组合物杂交;
洗脱非目标基因的DNA片段,获得目标基因的DNA片段。
第十方面,本发明提供了一种非诊断性检测方法,包括使用如上任一所述的探针组合物或如上所述的基因捕获芯片或如上所述的基因捕获试剂盒的步骤。
本发明优点在于:
虽然已有大量的致病位点被报道,但仍存在大量未知的致病位点。本发明提供了20基因(ABCA4,C5orf42,CDHR1,CNGB1,CRB1,CRX,EYS,GRM6,IFT140,NRL,PDE6A,PRPF6,RHO,RP2,RPE65,RPGR,RPGRIP1,SNRNP200,USH2A,WDR19)的35个新致病位点,为视网膜色素变性的诊断提供了新的分子生物学基础,基于所述的35个突变位点可以开发视网膜色素变性的诊断试剂盒。
附图说明
图1:先证者家系图。
图2:先证者眼底照(A)、视野(B)及双眼光学相干断层成像(C)。
图3:USH2Ac.14223_14224insC(p.Pro4741Profs39)和USH2Ac.7300+1G>T测序图。
图4:患者A家系图。
图5:患者A眼底照(A)、双眼光学相干断层成像(B)及视野(C)。
图6:患者B家系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1:对一个四代的患有视网膜色素变性(retinitis pigmentosa;RP)的家系进行基因突变检测
一、实验方法
1.该家系临床资源的采集及遗传资源库的建立
收集该家系中各成员的临床资料及血液样本,家系图见图1。临床资料主要包括个人病史、家族史、最佳矫正视力(best corrected visual acuities;BCVAs)、裂隙灯检查、眼底照、色觉检查、视野检查(Humphrey视野计)、视觉诱发电位检测(visual evokedpotentials;VEP)、全视野电生理检查(electroretinography;ERG)、眼底荧光血管造影检查(fundus fluorescein angiography;FFA)及光学相干断层成像检查(opticalcoherence tomography;OCT)等。提取患者及家系成员的外周血,并用血液基因组DNA提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取DNA。
2.借助于高通量二代测序技术检测该家系的致病突变
2.1设计并订制捕获芯片
2.1.1USH2A基因及转录本序列信息
该基因捕获芯片涵盖了762个遗传性眼病相关基因,其中包括我们USH2A基因。此芯片由华大基因设计。所参照的USH2A基因的转录本编号为:NM_206933.2,选择此转录本的原则是:首先考虑拥有CCDS编码蛋白的转录本,若一个基因有多个转录本均编码蛋白,则首选含氨基酸数最多的蛋白相对应的转录本,若多个转录本氨基酸含量相同,则进一步选择含碱基数最多的转录本。
2.1.2杂交探针的设计、目标区域捕获及深度测序
通过查阅OMIM数据库、眼病基因数据库、文献查询、临床眼病发病情况,筛选出762个基因作为眼病检测探针。在参考人类基因组Hg38下,选择上述762个基因的外显子序列,将外显子区向前和后延伸至30bp,降低重组的影响。探针序列的获取:从Hg38中获得762个基因的外显子序列及其侧翼±30bp。每个参考序列从参考序列的一端开始,并选择预定长度的参考序列来获得探针序列,以便最后探针覆盖参考序列至少一次,探针总长度是907nt,总覆盖目标区域为2.3M。此探针总覆盖深度可达到99.5%,探针设计过程中还增加了后续的样品质量控制环节。
①DNA提取:采用琼脂糖凝胶电泳法检测样品的完整性;
②文库准备:参照BGISEQ-500《BGI基因库建设指导手册》;
a)通过超声高性能样品处理系统(协变)随机打断合格的DNA样品,选择片段后得到150bp-250bp的片段;
b)修复DNA片段末端,3’末端加“A”;
c)与Illumina PE接头—寡核昔酸混合物相连接,连接产物经PCR富集,获DNA文库。片段扩增后,用于捕获富集、洗涤和脱去不富集的杂交文库和眼科基因;
d)扩增产物用于单链分离和循环处理,循环文库生成。采用Qbit检测进行质量控制。
③测序:质控合格后采用BGISEQ-500PE100+10进行测序。
表1.目标区域的覆盖范围
2.2对测序数据进行生物信息学分析,筛选出候选致病基因
2.2.1生物信息学分析
1)从测序仪获得原始数据(FASTQ数据);
2)过滤:原始FASTQ数据质量控制,除去低质量数据;
3)Mapping:使用Soap和BWA软件。以Hg38作为参考序列;
4)去除重复序列:基于Picard去重复算法,去除重复序列;
5)变异检测:数据的变异检测基于GATK;
6)变异注释:dbSNP、1K基因组数据库、ESP6500数据库、EXAC数据库、华大基因内部频率注释数据库。HGVS用于变量的标准命名。OIMIM、HGMD等疾病数据库用于突变的病因注释。
2.2.2将患者的测序结果所对应的基因序列进行比较和分析,优先分析插入/缺失突变、无义突变和错义突变,结果可分为三类,包括已知突变、已知基因的新突变和新基因的突变。
2.3经Sanger测序验证,鉴定致病突变
PCR法分别针对筛选出的突变位点及邻近DNA序列在相应家系中进行扩增,所用引物序列采用Primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/)引物设计软件设计。所用PCR的反应体系(20μL体系)为:5*buffer 4μL,25mM MgCl2 2μL,DNA1μL,正向引物F 1μL,反向引物R 1μL,10mM dNTPs 0.4μL,Taq酶0.1μL,ddH2O 10.5μL。PCR反应程序:98℃5min,35个循环(98℃10s,60℃15s,72℃1min),72℃7min,4℃5min。3%琼脂糖凝胶电泳检测,于紫外线切胶仪下切取PCR产物凝胶并纯化。对所有的PCR产物分别以正、反向引物测序,并对测序结果进行进一步分析,使用NCBI在线对比工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/),排除假阳性结果,并筛选出在家族中共分离的突变位点。
二、实验结果
1.家系临床资料
眼科临床专家对该家系中的6名患者进行详细全面的临床检查后,作出“视网膜色素变性”的临床诊断,下面以先证者为例,对其详细临床资料进行说明:
1)BCVAs:右眼0.02,左眼0.05;
2)裂隙灯检查:双眼晶状体轻混,余未见明显异常;
3)眼底照:双眼骨细胞样色素沉积,视盘蜡黄,视网膜血管变细以及周边部视网膜变性(图2中A);
4)视野检查:右眼管状视野,左眼视野消失(图2中B);
5)ERG:双眼视锥、视杆细胞反应均消失,呈熄灭波;
6)OCT:双眼黄斑周边部光感受器内、外均消失,视网膜色素上皮层萎缩(图2中C)。
2.该家系遗传检测结果
通过对家族中的两名患者3、4及两名正常人7、9进行了二代测序及生物信息学分析后,发现两位患者均携带有可疑的复合杂合突变USH2Ac.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)和c.503C>T(p.Thr168Ile),未发现其他可疑的致病基因突变位点。经Sanger测序验证证实该突变位点在该家族中表现为共分离,测序结果见图3。突变USH2Ac.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)位于1号染色体,物理位置为chr1:215640733的碱基由C突变为CA;RNA水平:USH2A基因编码RNA第14792位插入碱基A;蛋白水平:USH2A基因编码蛋白从4931位氨基酸发生移码,该基因相关的突变从未在RP患者中发现。突变USH2Ac.503C>T(p.Thr168Ile)位于1号染色体,物理位置为chr1:216418662的碱基由G突变为A;RNA水平:USH2A基因编码RNA第503位碱基由C变为T;蛋白水平:USH2A基因编码蛋白168位氨基酸由Thr变为Ile,该基因相关的突变从未在RP患者中发现。
根据我们所设计的筛选流程,借助我们所设计的基因芯片及深度测序技术,我们成功证实所检测到的该USH2A基因的两个突变位点c.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)和c.503C>T(p.Thr168Ile)为RP疑似致病位点。
实施例2:针对实施例1中所检测出的两个致病位点在RP人群中验证
一、实验方法
1.RP患者收集
对疑似RP患者进行全面的眼科检查,按照实施病例1中的方法对患者进行临床资源的采集及遗传资源库的建立。
2.按照实施例1中的方法对患者进行高通量二代测序,检测RP患者致病突变。
3.从1242例确诊的RP患者中检测出另外3个由c.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)及2个由c.503C>T(p.Thr168Ile)致病的患者,未发现其他可疑的致病基因突变位点。以下分别选一例进行说明。
4.患者A中检测出c.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)及一个已报道致病突变USH2A c.2802T>G p.Cys934Trp,家系图见图4。
1)临床资料
眼科临床专家对该患者进行详细全面的临床检查后,作出“视网膜色素变性”的临床诊断,下面对其详细临床资料进行说明:
①BCVAs:右眼0.2,左眼0.3;
②裂隙灯检查:双眼晶状体轻混,余未见明显异常;
③眼底照:双眼骨细胞样色素沉积,视盘蜡黄,视网膜血管变细以及周边部视网膜变性(图5中A);
④视野检查:管状视野(图5中B);
⑤ERG:双眼视锥、视杆细胞反应均消失,呈熄灭波;
⑥OCT:双眼黄斑周边部光感受器内、外节均消失,视网膜色素上皮层萎缩(图5中C)。
2)该家系遗传检测结果
经Sanger测序验证证实该突变位点在该家族中表现为共分离。
5.患者B中检测出c.503C>T(p.Thr168Ile)及一个已报道致病突变USH2Ac.8559-2A>G,家系图见图6。
1)临床资料
眼科临床专家对该患者进行详细全面的临床检查后,作出“视网膜色素变性”的临床诊断,下面对其详细临床资料进行说明:
①BCVAs:双眼0.1;
②裂隙灯检查:双眼晶状体轻混,玻璃体轻混,余未见明显异常;
③眼底照:双眼骨细胞样色素沉积,视盘蜡黄,视网膜血管变细以及周边部视网膜变性;
④视野检查:管状视野;
⑤ERG:双眼视锥、视杆细胞反应均消失,呈熄灭波;
⑥OCT:双眼光感受器细胞层、视网膜色素细胞层萎缩,仅黄斑中心凹残留小段IS/OS层。
2)该家系遗传检测结果
经Sanger测序验证证实该突变位点在该家族中表现为共分离。
6.综上,根据我们所设计的筛选流程,借助我们所设计的基因芯片及深度测序技术,通过遗传学、结合临床表现及人群验证,我们成功证实所检测到的该突变位点c.14792_14793insT(p.Leu4931Phefs2)和c.503C>T(p.Thr168Ile)为RP新致病位点。
本发明的其余RP新突变位点也已通过遗传学、结合临床表现及人群验证,成功证实确为RP新致病位点。因本发明相关内容的论文随时可能公开,为最大限度地保护本发明创造,特及时申请专利,计划于本专利申请日起十二个月内,就相同主题的发明创造再次提出专利申请并要求优先权。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种特异性检测受试者基因组DNA中是否存在以下任一种、两种或几种突变的试剂:
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂选自:引物、引物对、探针、抗体和核酸芯片中的一种或几种。
3.一种诊断视网膜色素变性的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有权利要求1所述试剂。
4.权利要求1所述的试剂或权利要求3所述的试剂盒的用途,其特征在于,所述用途选自:
1)在制备诊断或辅助诊断视网膜色素变性产品中的应用;
2)在制备筛查或辅助筛查视网膜色素变性患者产品中的应用;
3)在制备预测视网膜色素变性患病风险产品中的应用;
4)在制备检测与视网膜色素变性相关的基因是否突变产品中的应用;
5)在制备检测与视网膜色素变性相关的蛋白质是否突变产品中的应用。
5.一种用于检测遗传性眼病的突变位点组合,其特征在于,所述突变位点组合至少包含一种权利要求1中所述突变。
6.根据权利要求5所述的突变位点组合,其特征在于,所述遗传性眼病为视网膜色素变性。
7.权利要求5所述的突变位点组合在制备遗传性眼病诊断试剂盒中的应用。
8.一种探针组合物,其包含特异性结合至目标基因的探针,其特征在于,所述探针至少能检测一种权利要求1中所述突变。
9.根据权利要求8所述的探针组合物,其特征在于,所述探针组合物以混合物形式提供,或者以独立存在的形式提供。
10.一种基因捕获芯片,其包括固相载体和固定在固相载体上的探针的点阵,其特征在于,所述探针至少能检测一种权利要求1中所述突变。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910553026.1A CN110241202A (zh) | 2019-06-25 | 2019-06-25 | 视网膜色素变性突变位点及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910553026.1A CN110241202A (zh) | 2019-06-25 | 2019-06-25 | 视网膜色素变性突变位点及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110241202A true CN110241202A (zh) | 2019-09-17 |
Family
ID=67889303
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910553026.1A Pending CN110241202A (zh) | 2019-06-25 | 2019-06-25 | 视网膜色素变性突变位点及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110241202A (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110643690A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-03 | 四川省人民医院 | 检测rpgr基因突变的引物组、试剂盒和方法 |
CN111621521A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-09-04 | 福州大学 | 一种完全型先天性静止性夜盲果蝇模型的构建方法及应用 |
CN113403395A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-09-17 | 南京世和基因生物技术股份有限公司 | 房水cfDNA的提取方法、试剂盒以及在PVRL临床辅助检查中的应用 |
WO2021212686A1 (zh) * | 2020-04-21 | 2021-10-28 | 北京中因科技有限公司 | RHO-adRP基于基因编辑的方法和组合物 |
CN114868705A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-09 | 温州医科大学 | 一种视网膜色素变性小鼠模型及其构建方法 |
CN116497113A (zh) * | 2023-04-11 | 2023-07-28 | 温州谱希基因科技有限公司 | 用于检测视网膜色素变性的试剂盒 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040208847A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-10-21 | Fabienne Rolling | Method and vectors for selectively transducing retinal pigment epithelium cells |
CN103361373A (zh) * | 2012-03-26 | 2013-10-23 | 中国人民解放军总医院 | Snrnp200基因突变体及其应用 |
CN104774840A (zh) * | 2014-01-10 | 2015-07-15 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 基因突变体及其应用 |
CN106282197A (zh) * | 2015-05-15 | 2017-01-04 | 南京医科大学第附属医院 | 一种遗传性视网膜色素变性疾病的致病突变及其检测试剂 |
WO2018172961A1 (en) * | 2017-03-21 | 2018-09-27 | Ludwig-Maximilians-Universität München | Gene therapy for the treatment of cngb1-linked retinitis pigmentosa |
-
2019
- 2019-06-25 CN CN201910553026.1A patent/CN110241202A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040208847A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-10-21 | Fabienne Rolling | Method and vectors for selectively transducing retinal pigment epithelium cells |
CN103361373A (zh) * | 2012-03-26 | 2013-10-23 | 中国人民解放军总医院 | Snrnp200基因突变体及其应用 |
CN104774840A (zh) * | 2014-01-10 | 2015-07-15 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 基因突变体及其应用 |
CN106282197A (zh) * | 2015-05-15 | 2017-01-04 | 南京医科大学第附属医院 | 一种遗传性视网膜色素变性疾病的致病突变及其检测试剂 |
WO2018172961A1 (en) * | 2017-03-21 | 2018-09-27 | Ludwig-Maximilians-Universität München | Gene therapy for the treatment of cngb1-linked retinitis pigmentosa |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
FENG-JUAN GAO ET AL.: ""Genetic and Clinical Findings in a Large Cohort of Chinese Patients with Suspected Retinitis Pigmentosa"", 《OPHTHALMOLOGY》 * |
李淑贤等: ""常染色体隐性遗传视网膜色素变性患者致病突变基因分析"", 《解放军医学院学报》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110643690A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-03 | 四川省人民医院 | 检测rpgr基因突变的引物组、试剂盒和方法 |
WO2021212686A1 (zh) * | 2020-04-21 | 2021-10-28 | 北京中因科技有限公司 | RHO-adRP基于基因编辑的方法和组合物 |
CN111621521A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-09-04 | 福州大学 | 一种完全型先天性静止性夜盲果蝇模型的构建方法及应用 |
CN113403395A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-09-17 | 南京世和基因生物技术股份有限公司 | 房水cfDNA的提取方法、试剂盒以及在PVRL临床辅助检查中的应用 |
CN114868705A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-09 | 温州医科大学 | 一种视网膜色素变性小鼠模型及其构建方法 |
CN114868705B (zh) * | 2022-04-26 | 2024-02-06 | 温州医科大学 | 一种视网膜色素变性小鼠模型的构建方法 |
CN116497113A (zh) * | 2023-04-11 | 2023-07-28 | 温州谱希基因科技有限公司 | 用于检测视网膜色素变性的试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110241202A (zh) | 视网膜色素变性突变位点及其应用 | |
Stone et al. | Clinically focused molecular investigation of 1000 consecutive families with inherited retinal disease | |
KR102622305B1 (ko) | 염색체 상호작용 부위를 이용하는 검출 방법 | |
Wang et al. | Comprehensive molecular diagnosis of a large Chinese Leber congenital amaurosis cohort | |
Fu et al. | Next-generation sequencing–based molecular diagnosis of a Chinese patient cohort with autosomal recessive retinitis pigmentosa | |
Panicker et al. | Identification of novel mutations causing familial primary congenital glaucoma in Indian pedigrees | |
Hansen et al. | Comprehensive mutational screening in a cohort of Danish families with hereditary congenital cataract | |
Sullivan et al. | Genomic rearrangements of the PRPF31 gene account for 2.5% of autosomal dominant retinitis pigmentosa | |
Nishiguchi et al. | Exome sequencing extends the phenotypic spectrum for ABHD12 mutations: from syndromic to nonsyndromic retinal degeneration | |
CN104212806B (zh) | Alport综合征新的突变致病基因及其编码蛋白和应用 | |
Michaelides et al. | An early-onset autosomal dominant macular dystrophy (MCDR3) resembling North Carolina macular dystrophy maps to chromosome 5 | |
Avila-Fernandez et al. | CERKL mutations and associated phenotypes in seven Spanish families with autosomal recessive retinitis pigmentosa | |
Michaelides et al. | An autosomal dominant bull’s-eye macular dystrophy (MCDR2) that maps to the short arm of chromosome 4 | |
Zhang et al. | The 208delG mutation in FSCN2 does not associate with retinal degeneration in Chinese individuals | |
CN110551728B (zh) | Foxc1基因突变体及其应用 | |
CN106282197B (zh) | 一种遗传性视网膜色素变性疾病的致病突变及其检测试剂 | |
Zhang et al. | Mutational screening of 10 genes in Chinese patients with microphthalmia and/or coloboma | |
Mothobi et al. | Mutation analysis of congenital cataract in a Basotho family identified a new missense allele in CRYBB2 | |
CN104232650B (zh) | 特发性基底节钙化新的致病基因及其编码蛋白质和应用 | |
CN105624167B (zh) | 一种遗传性中心性晕轮状视网膜病变的致病突变及其检测试剂 | |
CN111304226A (zh) | 一种编码cyp1b1基因突变体的核酸及其应用 | |
Poloschek et al. | Syndromic choroideremia: sublocalization of phenotypes associated with Martin-Probst deafness mental retardation syndrome | |
CN113403379A (zh) | 一种眼科疾病相关snp位点引物组合物及应用 | |
CN110184340A (zh) | 遗传性卵黄样营养不良新致病突变及其应用 | |
CN106148528B (zh) | 一种遗传性Usher综合征的致病突变及其检测试剂 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190917 |