CN112226512A - 一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合与方法 - Google Patents

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CN112226512A CN202011134852.1A CN202011134852A CN112226512A CN 112226512 A CN112226512 A CN 112226512A CN 202011134852 A CN202011134852 A CN 202011134852A CN 112226512 A CN112226512 A CN 112226512A
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Abstract

本发明公开一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合与方法，淋巴瘤液体活检技术是通过血液样本检测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)的一种无创手段。本发明提供包括93个恶性淋巴瘤相关的基因组合，以及它们在高通量测序检测恶性淋巴瘤中的应用。本方法所需ctDNA量低，一次采血即可满足需求，临床可操作性强，可快速检测恶性淋巴瘤相关分子学异常；本发明具有取材方便，特异性强，灵敏性高，特别是淋巴结病理取材困难或无法取材时突显优势；本方法基于基因突变对淋巴瘤进行分子亚型分型、基因分型预后分层、动态检测微小残留病灶、耐药和复发等，有助于推动恶性淋巴瘤个体化精准治疗的发展。

Description

一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合与方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体是一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合与方法。
背景技术
恶性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是一组起源于淋巴结和淋巴组织的免疫系统恶性肿瘤，其发生大多与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化产生的某种免疫细胞恶变有关。淋巴瘤是最早发现的血液系统恶性肿瘤之一。根据病理、临床特点以及预后转归等将淋巴瘤分为非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)和霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)两类。其主要临床表现是无痛性淋巴结肿大等，全身各组织器官均可受累。HL的病理学形态特点为Reed-Steinberg(R-S)细胞，是一种预后较好的淋巴瘤，随着医学技术的发展其治愈率较高。NHL是一组具有较强异质性的淋巴细胞异常增殖性疾病的总称，具有不同的组织学特点和起病部位，其发病率远高于HL。
根据NHL的自然病程，可以分为三大临床类型，即高度侵袭性、侵袭性和惰性淋巴瘤。根据淋巴细胞起源的不同，又可分为B细胞、T细胞和自然杀伤 (natural killer，NK)细胞淋巴瘤。单克隆抗体、细胞遗传学和分子生物学等技术在NHL诊断、预后评估发挥重要作用。目前NHL一线标准治疗方案为免疫联合化疗，但仍有约40％患者面临不可避免的疾病进展及复发。在长周期治疗过程中对患者疗效评估主要依赖于影像学检查如CT、PET-CT等，影像学结果的准确性因医师水平、仪器设备等外在因素波动。目前急需开发新型的简便精准的检测方法用于淋巴瘤诊断、动态微小残留病灶(MRD)监测、识别耐药及复发潜在的生物标志物。
现阶段，患者临床症状结合实验室、影像学和病理检查是诊断恶性淋巴瘤的重要手段。其中组织病理学和免疫组化结果仍是临床上恶性淋巴瘤确诊的金标准，PET/CT通过半定量及定量分析监测组织的代谢改变鉴别残留病灶并显示病灶的代谢情况，调整临床分期，指导下一步治疗方案。但组织病理活检技术是一种有创性检查，对难以取材的较深部位淋巴结和术中发现已不能切除的病变无法进行全面诊断，同时取材不合规范或未取到病变组织易造成诊断困难和漏误诊。有时为取得满意的病理组织需反复活检，创伤性大、繁琐且延误时间。不仅如此，因淋巴结良性增生病变组织学复杂多变，可出现正常组织结构的紊乱、大细胞增生、核分裂象增多等假恶性征象，而有些恶性淋巴瘤在细胞形态上反而缺乏异形性，导致淋巴组织良性增生与恶性淋巴瘤鉴别诊断十分困难。对于疑难切片，其诊断准确性取决于病理专家的经验和水平，这也是导致临床诊断困难和漏误诊的原因之一。
除此之外，PET/CT评价淋巴瘤疗效仍具有不可忽视的局限性：PET/CT对微淋巴结侵犯、糖代谢低下的病灶检出率较低，延误临床治疗最佳时机。但炎症、肉芽肿、活动性肺结核、手术创口等可占用过多的葡萄糖代谢，呈假阳性，误导临床治疗决策。综上所述，恶性淋巴瘤的诊断、鉴别诊断和预后评估仍是目前临床的难题之一。
液体活检是一种非侵入性检查，对恶性淋巴瘤外周血ctDNA进行检测。循环游离DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)包含所有凋亡或坏死细胞释放到循环中的DNA片段，肿瘤细胞释放的DNA片段也存在于血浆中，构成ctDNA。 ctDNA携带着肿瘤细胞所有类型的遗传学异常(包括单核苷酸变异，插入/缺失、易位等)，因此可作为肿瘤的高度特异性标志。近年来，ctDNA在无法活检的癌症检测以及预后或预测性研究中显示出了广阔的前景。在实体瘤中应用液体活检技术可发现有意义的生物标志物。
在淋巴瘤中，ctDNA可更好地反映肿瘤空间异质性。液体活检在淋巴瘤中虽不能代替病理活检作为诊断的金标准，但在许多情况下可作为有效的补充诊断，特别是对难以取得病理活检或取材失败的患者。不仅如此，ctDNA检测可在疾病诊断时提供靶向治疗方向，或在疾病治疗中指导调整治疗方案、发现耐药相关的生物学标志物。此种新型检测技术联合影像学检查可用于临床预后评估。但ctDNA检测在淋巴瘤中的应用仍处于初步探索阶段，检测基因组合较少、探针设计困难、方法技术不成熟等导致一定的漏检率和假阳性率。鉴于以上难点，液体活检技术目前未能在恶性淋巴瘤筛查、MRD动态监测、耐药及复发监控中广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合与方法，针对恶性淋巴瘤存在的诊断困难、疗效评估精准性差、复发监控不及时、耐药机制不清、耗时、创伤性大、漏检率高等问题，设计了基于探针杂交技术，可用于检测目前最全面的恶性淋巴瘤液体活检的93种基因组合及方法，方法中所涉及到的93种基因组合经过多次优化筛选，特异性高，对疾病监测意义重大，对临床恶性淋巴瘤精准诊断、动态监测MRD、预测耐药及复发等方面具有重要的指导意义。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合，基因组合包括93种检测基因，所述93种检测基因及其检测区域包括：
Figure RE-GDA0002816721920000041
Figure RE-GDA0002816721920000051
进一步地，所述基因组合的DNA文库建库方法：
S1、恶性淋巴瘤患者外周血浆的分离；
S2、血浆游离DNA的提取；
S3、DNA文库的构建；
S4、Pre-PCR反应，Pre-PCR反应包括：
S41、反应体系如下：
Figure RE-GDA0002816721920000052
S42、将步骤S41中Mix震荡短离；
S43、上PCR仪，反应条件如下：
Figure RE-GDA0002816721920000053
S5、PCR扩增后纯化；
S6、DNA文库杂交洗脱Post-PCR。
进一步地，所述S3的DNA文库的构建方法：
S31、末端修复，3'端加A
S311、反应体系如下：
试剂 体积
cfDNA(30ng)+NF水 50μL
End Repair&A-Tailing Buffer 5μL
End Repair&A-Tailing Enzyme Mix 3μL
S312、将以上Mix加入0.2ml试管中，震荡短离；
S313、上PCR仪，反应条件如下：
Figure RE-GDA0002816721920000061
S32、接头连接；
S321、反应体系如下：
试剂 体积
Adapter stock 5μL
NF水 5μL
Ligation Buffer 30μL
DNA Ligase 10μL
DNA Ligase无需化冻；
S322、将Mix加入步骤S2中提取的DNA样品中，震荡短离；
S323、上PCR仪反应，反应体系如下：
阶段 温度 时间
无热盖 20℃ 15min
冷却 4℃ 冷却
S33、接头连接后纯化。
进一步地，所述S6的构建方法：
S61、样品探针杂交；
S62、捕获磁珠准备；
S63、捕获目标区域DNA文库；
S64、Post-PCR反应；
S65、上机测序；
S66、生信分析
先用Ion Report软件过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19使用Torrentn Variant Caller子程序检测突变位点，然后对找出的突变SNP和Indel使用ANNOVAR软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因。
进一步地，所述S31和S32的全程均需在冰盒上操作。
进一步地，所述S33中的接头连接后钝化方法：
S331、新取1.5mLEP管加入88μL XP磁珠；
S332、将步骤32得到的样本转移到磁珠管内，震荡混匀，无需离心；
S333、室温放置10min，短离，上磁力架；
S334、移除上清，加200μL 80％乙醇；
S335、移除上清，加200μL 80％乙醇；
S336、移除上清，晃动溶液，用10μL移液器吸去残留；
S337、晾干，并加22μL NF水，吹打混匀，
S338、室温静置2min，上磁力架；
S339、吸取20μL上清至新0.2ml管中。
进一步地，所述S5中PCR扩增后纯化方法：
S51、新取试管加入50μL XP磁珠；
S52、将步骤S4得到的样本加入磁珠管内，震荡混匀；
S53、室温放置10min，离心，上磁力架，移上清；
S54、加200μL 80％乙醇，移上清；
S55、移除上清，加200μL 80％乙醇；
S56、移上清，甩一下，用10μL移液器吸去残留；
S57、晾干，并加入31μL NF水，吹打混匀；
S58、室温放置2min,上磁力架；
S59、吸30μL上清到新的1.5ml EP管中；
S510、测浓度：用于DNA文库的构建及高通量测序。
进一步地，所述S61中样品探针杂交方法：
S611、杂交取用(μL)＝600ng/pre-PCR纯化后浓度，若不够，则全取29 μL；
S612、混制B管：杂交取用加入混Mix：
试剂 体积
HybHuman Block 5μL
Hyb index Block-8 5μL
Hyb Block-A0 1μL
S613、计算杂交时间：杂交取用+11-10/1.45；
S614、将B管放入浓缩仪，控制好时间，浓缩至10μL以下；
S615、浓缩后，在冰盒上分别将剩余的样品补水至10μL转入新的0.2mL 管中，混匀，短离，标记为B；
S616、将Hyb Buffer平衡至室温，混匀后65℃孵育，溶解后分别取20μL 转入新的0.2mL管中，标记为D，继续孵育；
S617、取5μL Rnase Block+2μL Probe置0.2mL管中，混匀，短离，防止冰上待用，标记为C；
S618、打开PCR仪，设置程序：
阶段 温度 时间
预变性 95℃ 5min
延伸 60℃ 16h
S619、将B放PCR仪上，开盖运行；
S6110、PCR仪降至65℃时，将D放PCR仪上孵育，盖上热盖；
S6111、3min后，将C放PCR仪上孵育，盖上热盖；
S6112、2min后，从D中吸取13μL溶液至C中，吸取全部B溶液至C。
进一步地，所述S62和S63的构建方法：
S621、将T1磁珠从4℃取出，震荡混匀，平衡至室温，分装50μL，上磁力架，移除上清；
S622、加200μL Binding Buffer，震匀，短离，上磁力架，移除上清，重复操作2次；
S623、从磁力架取下，加200μL Binding Buffer，震匀待用；
S631、将分装的Wash Buffer 2在65℃下预热；
S632、将PCR管C加入到步骤S62获得的磁珠管溶液中，吹打混匀，旋转仪上混匀30min，短离；
S633、上磁力架，移上清，加200μL Wash Buffer 1，吹打混匀，旋转仪上清洗15min，短离，上磁力架，移除上清；
S634、加65℃预热的WB2200μL，吹打混匀，65℃孵育10min，转速800 转/min进行清洗，短离，上磁力架，移除上清；
S635、重复操作3次，最后一次离心后上磁力架，用10μL移液器吸干；
S636、加200μL80％乙醇，前后颠倒，移上清，短离，用10μL移液器吸干；
S637、晾干，加入30μL NF水，吹打混匀，全部磁珠用于Post-PCR反应。
进一步地，所述S64中Post-PCR反应操作方法：
S641、混合Mix：
Figure RE-GDA0002816721920000091
Figure RE-GDA0002816721920000101
S642、取步骤S63所得溶液30μL加入到Mix管中，上PCR仪；
Figure RE-GDA0002816721920000102
S643、分装XP磁珠各55μL：将PCR结束后获得的样本加入到磁珠中，吹打混匀；
S644、室温放置10min，短离，上磁力架，移除上清；
S645、加200μL80％乙醇，前后颠倒，移除上清；
S646、再加200μL80％乙醇，前后颠倒，短离，移除上清；
S647、晾干，并加入27μLNF水，从磁力架取下，吹打混匀，静置2min；
S648、短离，上磁力架，吸取26μL至新的1.5mLEP管中，测浓度。
本发明的有益效果：
1、本发明给难以获得病理活检或取材失败的淋巴瘤患者提供补充诊断，有效解决肿瘤MRD监测准确性差、复发及耐药监控困难、筛查方法繁琐、耗时和不规范的问题；
2、本发明临床仅一次采血，利用液体活检技术即可完成最全面的、最具特异性的、与淋巴组织肿瘤相关的基因突变检测，相对于传统依赖于医师经验和技术水平的影像学监测，液体活检可及时、准确地完成恶性淋巴瘤患者MRD动态评估，提供高特异性的生物标志物；
3、本发明指导临床对恶性淋巴瘤患者进行预后动态评估，耐药及复发监控，推进恶性淋巴瘤个体化精准治疗的进程。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合，基因组合包括93种检测基因， 93种检测基因及其检测区域具体如下：
Figure RE-GDA0002816721920000111
Figure RE-GDA0002816721920000121
一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，基因组合的DNA文库建库方法，具体如下：
S1、恶性淋巴瘤患者外周血浆的分离；
S11、将采血管(9ml)配平后置于低速离心机中，3000rpm×10min；
S12、离心后缓慢吸取上层血浆置于新EP管内，分装血浆和白细胞，并做好标记；
S13、将配平后的血浆置于高速离心机中，14000g×10min，温度：4℃；
S14、吸取上层血浆置于新15ml离心管内，勿触及管底沉淀，在管壁标注日期、编号和患者姓名。
S2、血浆游离DNA(cfDNA)的提取：DNA提取采用德国Qiagen公司(QIAampCirculating Nucleic Acid Kit)试剂盒，具体如下：
S21、向50ml离心管管底加入200μL蛋白酶K，4℃保存；
S22、加入2ml制备好的恶性淋巴瘤患者血浆；
S23、加入配置好浓度1.6ml Buffer ACL和5μL Carrier RNA，震荡混匀；
S24、水浴56℃20min，水浴锅提前预热；
S25、再加入36ml Buffer ABC，震荡混匀；
S26、冰浴5min；
S27、安装真空泵，将混合溶液倒入收集管内，启动真空泵，待压力值达到 -800～-900时，关闭真空泵，待液体落至管底后排气；
S28、加600μL Buffer ACW1，打开开关，待压力在-800～-900时，关掉开关，待液体流下去后放气；
S29、加750μL Buffer ACW2，打开开关，待压力在-800～-900时，关掉开关，待液体流下去后放气；
S210、加750μL无水乙醇，打开开关，待压力在-800～-900时，关掉开关，待液体流下去后放气；
S211、将吸附柱放入收集管中，空甩，20000g×3min；
S212、取出吸附柱，并将吸附柱放入洁净1.5ml EP管中，56℃：5min，开盖；
S213、取出吸附柱，再次放入洁净的1.5ml EP管中，加60μL Buffer AVE，室温3min，离心20000g 1min(过柱两次)；
S214、测浓度，用于DNA文库的构建以及高通量测序；
SS3、DNA文库的构建，具体如下：
S31、末端修复，3'端加A，此步骤均在冰盒上操作，具体如下：
S311、反应体系如下：
试剂 体积
cfDNA(30ng)+NF水 50μL
End Repair&A-Tailing Buffer 5μL
End Repair&A-Tailing Enzyme Mix 3μL
S312、将以上Mix加入0.2ml试管中，震荡短离；
S313、上PCR仪，反应条件如下：
Figure RE-GDA0002816721920000141
S32、接头连接，接头连接需全程在冰盒上操作，具体如下；
S321、反应体系如下：
试剂 体积
Adapter stock 5μL
NF水 5μL
Ligation Buffer 30μL
DNA Ligase 10μL
DNA Ligase无需化冻；
S322、将Mix加入步骤S2中提取的DNA样品中，震荡短离；
S323、上PCR仪反应，反应体系如下：
阶段 温度 时间
无热盖 20℃ 15min
冷却 4℃ 冷却
S33、接头连接后纯化
S331、新取1.5mLEP管加入88μL XP磁珠；
S332、将步骤S32得到的样本转移到磁珠管内，震荡混匀，无需离心；
S333、室温放置10min，短离，上磁力架；
S334、移除上清，加200μL 80％乙醇；
S335、移除上清，加200μL 80％乙醇；
S336、移除上清，晃动溶液，用10μL移液器吸去残留；
S337、晾干，并加22μL NF水(取下)，吹打混匀，
S338、室温静置2min，上磁力架；
S339、吸取20μL上清至新0.2ml管中；
S4、Pre-PCR反应
S41、反应体系如下：
Figure RE-GDA0002816721920000151
S42、将步骤S41中Mix震荡短离；
S43、上PCR仪，反应条件如下：
Figure RE-GDA0002816721920000152
S5、PCR扩增后纯化
S51、新取试管加入50μL XP磁珠；
S52、将步骤S4得到的样本加入磁珠管内，震荡混匀；
S53、室温放置10min，离心，上磁力架，移上清；
S54、加200μL 80％乙醇，移上清；
S55、移除上清，加200μL 80％乙醇；
S56、移上清，甩一下，用10μL移液器吸去残留；
S57、晾干，并加入31μL NF水(取下)，吹打混匀；
S58、室温放置2min,上磁力架；
S59、吸30μL上清到新的1.5ml EP管中；
S510、测浓度：用于DNA文库的构建及高通量测序。
S6、基因组合的DNA文库杂交洗脱Post-PCR流程，具体如下：
S61、样品探针杂交
S611、杂交取用(μL)＝600ng/pre-PCR纯化后浓度，若不够，则全取29 μL；
S612、混制B管：杂交取用加入混Mix(共11μL)：
试剂 体积
HybHuman Block 5μL
Hyb index Block-8 5μL
Hyb Block-A0 1μL
S613、计算杂交时间：杂交取用+11-10/1.45；
S614、将B管放入浓缩仪，控制好时间，浓缩至10μL以下；
S615、浓缩后，在冰盒上分别将剩余的样品补水至10μL转入新的0.2mL 管中，混匀，短离，标记为B；
S616、将Hyb Buffer平衡至室温，混匀后65℃孵育，溶解后分别取20μL 转入新的0.2mL管中，标记为D，继续孵育；
S617、取5μL Rnase Block+2μL Probe(探针)置0.2mL管中，混匀，短离，防止冰上待用，标记为C；
S618、打开PCR仪，设置程序：
阶段 温度 时间
预变性 95℃ 5min
延伸 60℃ 16h
S619、将B放PCR仪上，开盖运行；
S6110、PCR仪降至65℃时，将D放PCR仪上孵育，盖上热盖；
S6111、3min后，将C放PCR仪上孵育，盖上热盖；
S6112、2min后，从D中吸取13μL溶液至C中，吸取全部B溶液至C中。
S62、捕获磁珠准备
S621、将T1磁珠从4℃取出，震荡混匀，平衡至室温，分装50μL，上磁力架，移除上清；
S622、加200μL Binding Buffer，震匀，短离，上磁力架，移除上清，重复操作2次；
S623、从磁力架取下，加200μL Binding Buffer，震匀待用。
S63、捕获目标区域DNA文库
S631、将分装的Wash Buffer 2在65℃下预热；
S632、将PCR管C加入到步骤62获得的磁珠管溶液中，吹打混匀，旋转仪上混匀30min，短离；
S633、上磁力架，移上清，加200μL Wash Buffer 1，吹打混匀，旋转仪上清洗15min，短离，上磁力架，移除上清；
S634、加65℃预热的WB2200μL，吹打混匀，65℃孵育10min，转速800 转/min进行清洗，短离，上磁力架，移除上清；
S635、重复操作3次，最后一次离心后上磁力架，用10μL移液器吸干；
S636、加200μL80％乙醇，前后颠倒，移上清，短离，用10μL移液器吸干；
S637、晾干，加入30μL NF水，吹打混匀，全部磁珠用于Post-PCR反应。
S64、Post-PCR反应(捕获后扩增)
S641、混合Mix：
试剂 体积
Post PCR Buffer 18μL
Post PCR Primer 1μL
Post DNA Polymerase 1μL
S642、取步骤S63所得溶液30μL加入到Mix管中，上PCR仪；
Figure RE-GDA0002816721920000171
Figure RE-GDA0002816721920000181
S643、分装XP磁珠各55μL：将PCR结束后获得的样本加入到磁珠中，吹打混匀；
S644、室温放置10min，短离，上磁力架，移除上清；
S645、加200μL80％乙醇，前后颠倒，移除上清；
S646、再加200μL80％乙醇，前后颠倒，移除上清(短离，用10μL移液器)；
S647、晾干，并加入27μLNF水，从磁力架取下，吹打混匀，静置2min；
S648、短离，上磁力架，吸取26μL至新的1.5mLEP管中，测浓度。
S65、上机测序
S66、生信分析
先用Ion Report软件过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19使用Torrentn Variant Caller子程序检测突变位点，然后对找出的突变SNP和Indel使用ANNOVAR软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因。
实施例1
本实施例通过检测一例临床患者的样本来验证本发明所述93种基因组合和方法的特异性和敏感性。
该患者是一例弥漫大B细胞淋巴瘤的患者，男性，48岁，因“陈旧性脑梗塞8月，右下肢疼痛1周”就诊，盆腔CT平扫示：骶骨右侧及S1椎体附件骨质破坏伴软组织肿块形成，考虑恶性占位；腹主动脉及髂血管周围淋巴结可见。上腹部CT平扫提示腹膜后多发淋巴结肿大；脾脏巨大占位。
因该患者浅表淋巴结无肿大，腹部深部位淋巴结难以取材，行骶骨病变穿刺活检，病理及免疫组化结果提示弥漫大B细胞淋巴瘤，CD20(-)，Bcl-6(约 60+)，CD10(-)，Mum-1(+)，Bcl-2(约15％+)，c-Myc(约60％+)，符合非生发中性起源(GCB亚型)。FISH检测：BCL6、c-Myc阴性。患者诊断为漫大 B细胞淋巴瘤Ⅳ期A组(IPI 2分，中低危)，予DA-EPOCH方案化疗四疗程， CT评估脾脏病灶较前明显缩小，腹腔部分淋巴结较前缩小；行自体造血干细胞移植术，术后定期随访1年半。后患者因发热再次住院治疗，ctDNA液体活检发现患者存在BCL2突变：c.392C>A：p.A131D 15.03％。而CT平扫提示脾脏病灶较前缩小，腹腔淋巴结部分缩小，其余较前变化不大。骨髓细胞形态学未见明显异常，遂予抗感染等对症支持治疗，20天后再次复查CT提示腹膜后、右侧锁骨上窝、心膈角淋巴结新发，两侧胸膜增厚进展；脾内低密度灶较明显缩小；腹膜后淋巴结部分缩小、部分增大。考虑患者淋巴瘤复发，后予Hyper-CVAD方案化疗，效果不佳，最终患者死亡。
根据2018年新英格兰医学杂志及2020年Cancer Cell对弥漫大B细胞淋巴瘤的新基因分型预后分层和治疗的指导，该例患者BCL2突变属于EZB型，且 BCL2突变在传统的GCB亚型中预后较差。本实施例ctDNA液体活检结果远远早于影像学检查检测出患者分子生物学异常，预测患者临床复发，发现导致转化的隐性突变。其预后价值可独立于IPI和中期影像，同时指导进一步治疗可采用新型的BCL2抑制剂进行靶向治疗。
本实施例取病人血浆检测，Qubit定量，测序：BCL2突变：c.392C>A：p.A131D15.03％。
由此实施例可见本发明提供的93种基因组合、试剂和方法可成功检测出患者BCL2突变：c.392C>A：p.A131D 15.03％，发现致病位点，相对于传统影像学检查能较早预测患者临床复发、指导新药靶向治疗，该实施例提示本发明操作可行性、灵敏性和结果可信度较高。
实施例2
本实施例通过检测一例临床患者的样本来进一步验证本发明所述试剂和方法的特异性和敏感性。
该患者是一例T淋巴母细胞淋巴瘤的患者，男性，30岁，因“咳嗽半月，胸痛1周”入院，CT平扫提示右肺门及纵隔软组织影，右肺多发小结节；纵隔多发肿大淋巴结。于超声引导下经支气管镜针吸活检：送检凝血块内见挤压损伤的淋巴细胞，未见明确恶性成分。免疫组化结果提示送检组织中细胞成分较少，挤压性损伤严重，微细结构不清，无法明确诊断。支气管刷:未见恶性肿瘤细胞。ctDNA液体活检检测到3个基因突变：ATM:c.C6503T:p.S2168L 49.55％； TP53:.cG524A:p.R175H 6.65％；NRAS:c.G37T:p.G13C 4.92％；ATM和TP53为抑癌基因，此两种基因突变强烈提示恶性病变且预后不佳，NRAS位于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中，其突变在恶性肿瘤中较常见。经肺穿刺病理活检验证该患者为T淋巴母细胞性淋巴瘤。后骨髓提示异常细胞占18.4％，血片未见异常，诊断为T淋巴母细胞性淋巴瘤IV期A组(IPS3分)，行Hyper-CVAD 方案化疗1疗程，复查增强CT较前变化不大，患者治疗效果不佳，后失访。
该实施例ctDNA液体活检在无法取得准确的病理结果时提供了重要的诊断依据和预后预测。TP53、ATM、NRAS突变在T淋巴母细胞性淋巴瘤中出现的频率较高，ATM和TP53为抑癌基因，NRAS为MAPK信号通路因子，该两种类型突变在T淋巴母细胞性淋巴瘤中相对于阴性组预后较差。该例患者三种基因突变作为不良的遗传变异提示淋巴瘤侵袭性高和较差的预后。本实施例患者1疗程的Hyper-CVAD治疗效果不佳，如若联合TP53抑制剂等新药则可改善预后。
本实施例取病人血浆检测，Qubit定量，测序：ATM:c.C6503T:p.S2168L 49.55％；TP53:c.G524A:p.R175H 6.65％；NRAS:c.G37T:p.G13C 4.92％。
由此实施例可见本发明提供的93种基因组合、试剂和方法成功检测出在病理活检失败情况下具有重要诊断意义的基因突变，对疾病的诊断、疗效和预后进行精准的预测。本发明克服淋巴瘤的时空异质性，在病理诊断失败或难以获得时补充诊断，指导疾病诊断、治疗方向，揭示疾病预后，并且本方法操作简单，创伤小，操作灵敏性和结果可信度高，具有很高的临床实用价值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (10)

1.一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合，基因组合包括93种检测基因，其特征在于，所述93种检测基因及其检测区域包括ALK-Exon 23～25、ARID1A-CDS区、ARID1B-CDS区、ATM-CDS区、B2M-CDS区、BCL2-CDS区、BCL6-Exon1、BCOR-CDS区、BCR-CDS区、BIRC3-Exon 6～9、BRAF-Exon 5、BTK-Exon15、CARD11-Exon 5～9、CCND1-Exon 1、CCND2-Exon 1、CCND3-Exon 5、CD274-CDS区、CD28-CDS区、CD58-CDS区、CD79A-CDS区、CD79B-Exon 5～6、CDKN2A-CDS区、CDKN2B-CDS区、CREBBP-Exon 25～27、CTLA4-CDS区、CXCR4-Exon 2、CXCR5-CDS区、DDX3X-CDS区、DUSP22-CDS区、DNMT3A-Exon 19～23、EP300-Exon 23～30、EPHA7-CDS区、ERBB4-CDS区、ETV6-CDS区、EZH2-CDS区、FAS-CDS区、FBXW7-Exon9～10、FGFR1-CDS区、FOXO1-Exon 1、GATA3-Exon 4-5、GNA13-CDS区、ID3-CDS区、IDH2-Exon 4、IKZF1-CDS区、IRF4-CDS区、IRF8-CDS区、ITK-CDS区、JAK1-Exon14和17～19、JAK2-Exon 12、14、16、20和21、JAK3-Exon 11～16、KIT-Exon 8、11和17、KLHL6-CDS区、KMT2A-CDS区、KMT2D-CDS区、KRAS-CDS区、MAP2K1-Exon2～3、MEF2B-Exon 2～3、MTOR-CDS区、MYC-CDS区、MYD88-Exon 5、NOTCH1-Exon26～27和34、NOTCH2-Exon 34、PAX5-CDS区、PCLO-CDS区、PDCD1LG2-CDS区、PDGFRB-Exon 18、PHF6-CDS区、PIK3CA-Exon 10和21、PIM1-CDS区、PLCG2-CDS区、PRDM1-CDS区、PTEN-CDS区、RB1-CDS区、RELN-CDS区、RHOA-Exon 2、SETD2-CDS区、SF3B1-Exon 14～16、SGK1-CDS区、SMARCA4-CDS区、SOCS1-CDS区、STAT3-Exon21、STAT5B-Exon 15～16、STAT6-Exon 12、13和16、SYK-CDS区、TCF3-Exon 17、TET2-CDS区、TNFAIP3-CDS区、TNFRRSF14-Exon1～3、TP53-CDS区、TP63-CDS区、WHSC1-Exon 18～19、WT1-Exon 7～9、XPO1-Exon 15。
2.根据权利要求1所述的一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，其特征在于，所述文库建库方法包括：
S1、恶性淋巴瘤患者外周血浆的分离；
S2、血浆游离DNA的提取；
S3、DNA文库的构建；
S4、Pre-PCR反应；
S5、PCR扩增后纯化；
S6、DNA文库杂交洗脱Post-PCR。
3.根据权利要求2所述的一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，其特征在于，所述S3中DNA文库的构建方法：
S31、末端修复，3'端加A；
S32、接头连接；
S33、接头连接后纯化。
4.根据权利要求2所述的一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，其特征在于，所述S6的构建方法：
S61、样品探针杂交；
S62、捕获磁珠准备；
S63、捕获目标区域DNA文库；
S64、Post-PCR反应；
S65、上机测序；
S66、生信分析。
5.根据权利要求2所述的一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，其特征在于，所述S31和S32的全程均需在冰盒上操作。
6.根据权利要求3所述的一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，其特征在于，所述S33中的接头连接后钝化方法：
S331、新取1.5mL试管加入88μL XP磁珠；
S332、将步骤S32得到的样本转移到磁珠管内，震荡混匀，无需离心；
S333、室温放置10min，短离，上磁力架；
S334、移除上清，加200μL 80％乙醇；
S335、移除上清，加200μL 80％乙醇；
S336、移除上清，晃动溶液，用10μL移液器吸去残留；
S337、晾干，并加22μL NF水，吹打混匀，
S338、室温静置2min，上磁力架；
S339、吸取20μL上清至新0.2ml管中。
7.根据权利要求4所述的一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，其特征在于，所述S5中PCR扩增后纯化方法：
S51、新取试管加入50μL XP磁珠；
S52、将步骤S4得到的样本加入磁珠管内，震荡混匀；
S53、室温放置10min，离心，上磁力架，移上清；
S54、加200μL 80％乙醇，移上清；
S55、移除上清，加200μL 80％乙醇；
S56、移上清，甩一下，用10μL移液器吸去残留；
S57、晾干，并加入31μL NF水，吹打混匀；
S58、室温放置2min,上磁力架；
S59、吸30μL上清到新的1.5mlEP管中；
S510、测浓度。
8.根据权利要求7所述的一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，其特征在于，所述S61中样品探针杂交方法：
S611、杂交取用＝600ng/pre-PCR纯化后浓度；
S612、混制B管：杂交取用加入混Mix：
S613、计算杂交时间：杂交取用+11-10/1.45；
S614、将B管放入浓缩仪，控制好时间，浓缩至10μL以下；
S615、浓缩后，在冰盒上分别将剩余的样品补水至10μL转入新的0.2mL管中，混匀，短离，标记为B；
S616、将Hyb Buffer平衡至室温，混匀后65℃孵育，溶解后分别取20μL转入新的0.2mL管中，标记为D，继续孵育；
S617、取5μL Rnase Block+2μL Probe探针置0.2mL管中，混匀，短离，防止冰上待用，标记为C；
S618、打开PCR仪，设置程序环境：
S619、将B放PCR仪上，开盖运行；
S6110、PCR仪降至65℃时，将D放PCR仪上孵育，盖上热盖；
S6111、3min后，将C放PCR仪上孵育，盖上热盖；
S6112、2min后，从D中吸取13μL溶液至C中，吸取全部B溶液至C中。
9.根据权利要求8所述的一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，其特征在于，所述S62和S63的构建方法：
S621、将T1磁珠从4℃取出，震荡混匀，平衡至室温，分装50μL，上磁力架，移除上清；
S622、加200μL Binding Buffer，震匀，短离，上磁力架，移除上清，重复操作2次；
S623、从磁力架取下，加200μL Binding Buffer，震匀待用；
S631、将分装的Wash Buffer 2在65℃下预热；
S632、将PCR管C加入到步骤62获得的磁珠管溶液中，吹打混匀，旋转仪上混匀30min，短离；
S633、上磁力架，移上清，加200μL Wash Buffer 1，吹打混匀，旋转仪上清洗15min，短离，上磁力架，移除上清；
S634、加65℃预热的WB2200μL，吹打混匀，65℃孵育10min，转速800转/min进行清洗，短离，上磁力架，移除上清；
S635、重复操作3次，最后一次离心后上磁力架，用10μL移液器吸干；
S636、加200μL80％乙醇，前后颠倒，移上清，短离，用10μL移液器吸干；
S637、晾干，加入30μL NF水，吹打混匀，全部磁珠用于Post-PCR反应。
10.根据权利要求4所述的一种用于恶性淋巴瘤液体活检的基因组合的建库方法，其特征在于，所述步骤S64中Post-PCR反应方法：
S641、混合Mix：
S642、取步骤S63所得溶液30μL加入到Mix管中，上PCR仪；
S643、分装XP磁珠各55μL：将PCR结束后获得的样本加入到磁珠中，吹打混匀；
S644、室温放置10min，短离，上磁力架，移除上清；
S645、加200μL80％乙醇，前后颠倒，移除上清；
S646、再加200μL80％乙醇，前后颠倒，短离，移除上清；
S647、晾干，并加入27μLNF水，从磁力架取下，吹打混匀，静置2min；
S648、短离，上磁力架，吸取26μL至新的1.5mLEP管中，测浓度。
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